Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil piperidina-1-oxil) e outros nitróxidos cíclicos reduzem a injúria tecidual em modelos animais de inflamação por mecanismos que não são completamente entendidos. A mieloperoxidase (MPO) tem um papel fundamental na produção de oxidantes por neutrófilos e, portanto, é um importante alvo para anti-inflamatórios. Ao amplificar o potencial oxidativo do H2O2, a MPO produz HOCl e radicais livres através de seus intermediários oxidantes MPO-I [MPO-porfirina•+-Fe(IV)=O] e MPO-II [MPO-porfirina-Fe(IV)=O]. Esses fatos nos levaram a sintetizar e avaliar a capacidade inibitória sobre a atividade clorinante da MPO in vitro e in vivo do tempol e de três derivados hidrofóbicos substituídos na posição 4 do anel piperidina [(4-azido, 4-benzenosulfonil e 4-(4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)]. In vitro, todos os nitróxidos inibiram a clorinação da taurina mediada pela MPO a pH 7,4 com valores similares de IC50 (1,5-1,8 µM). As constantes cinéticas das reações do tempol com MPO-I (k = 3,5 x 105 M-1 s-1) e MPO-II, cuja cinética indicou um comportamento de saturação (K= 2,0 x 10-5 M; k = 3,6 x 10-2 s-1), foram determinadas. Modelagens cinéticas indicaram que, em presença de taurina, MPO não produz HOCl livre. Tomados conjuntamente, os resultados indicaram que o tempol age principalmente como um inibidor reversível da MPO por levar ao acúmulo de MPO-II e de complexo [MPO-II-tempol] que não participam do ciclo clorinante. Para examinar se nitróxidos inibem a atividade da MPO in vivo selecionamos como modelo a inflamação aguda induzida pela carragenina na pata de ratos. A atenuação da inflamação na pata mostrou correlação com a lipofilicidade do nitróxido em tempos iniciais, mas as diferenças nos efeitos foram pequenas (menor que 2 vezes) quando comparadas com as diferenças de lipofilicidade (maior que 200 vezes). Nenhuma inibição da atividade da MPO foi evidente in vivo porque os níveis de atividade nas patas dos ratos correlacionaram com os níveis de MPO. Do mesmo modo, em animais não-tratados ou tratados com nitróxidos, todos os parâmetros empregados para monitorar a inflamação (edema, níveis de proteínas oxidadas e nitradas e exsudação plasmática) correlacionaram com os níveis de MPO. Os efeitos dos nitróxidos in vivo foram também comparados com aqueles da hidrazida do ácido 4-aminobenzóico (ABAH) e da colchicina. Tomados conjuntamente, os estudos in vivo indicaram que os nitróxidos atenuam a inflamação induzida pela carragenina principalmente por inibirem a migração celular. De acordo com essa conclusão, estudos in vivo, mostraram que tempol diminuiu a migração de neutrófilos humanos e de cultura (HL-60 diferenciadas em neutrófilos) ativados com PMA ou fMLP com IC50 25 µM. Nesse caso, a polimerização da actina é inibida apenas quando as células são pré-incubadas com tempol por 30 min. Nesse intervalo de tempo, o tratamento com tempol promove a formação de O2•- via flavoenzimas de maneira dependente da concentração. Subsequente ativação dos neutrófilos de cultura com PMA resulta também em produção intracelular de O2•- e H2O2 que é inibida pelo pré-tratamento com tempol (IC50 = 38 µM). Esses estudos preliminares sugerem que o tempol interfere na migração celular de neutrófilos por atenuar a formação intracelular de ROS. A importância da atividade peroxidásica da superóxido dismutase (hSOD1) in vivo é certamente muito mais restrita do que a da MPO em processos inflamatórios no geral. Todavia, essa atividade peroxidásica da hSOD1 pode ter um papel na na patogenia da esclerose lateral amiotrófica (ELA). Por essa razão, os efeitos do tempol sobre as consequências da atividade peroxidásica da hSOD1 (oxidação, dimerização, desenovelamento e agregação da enzima) também foram examinadas. Foi demonstrado que o tempol não interfere no ciclo catalítico da hSOD1, porém, inibe a dimerização da enzima, protegendo-a de desenovelamento e agregação. O nitróxido foi consumido no processo reagindo com o radical triptofanila no peptídeo 31VWGSIK36 como comprovado por MS. No conjunto, nossos estudos contribuem para esclarecer os múltiplos mecanismos pelos quais nitróxidos podem inibir processos oxidativos e inflamatórios. / Tempol (4-hydroxy-2 ,2,6,6-tetramethyl piperidine-1-oxyl) and other cyclic nitroxides reduce tissue injury in animal models of inflammation by mechanisms that are not fully understood. Myeloperoxidase (MPO) plays a key role in the production of oxidants by neutrophils and therefore is an important target for anti-inflammatory drugs. By amplifying the oxidative potential of H2O2, MPO produces HOCl and free radicals through its oxidizing intermediates MPO-I [MPO-porphyrin•+-Fe (IV)=O] and MPO-II [MPO-porphyrin-Fe (IV)=O]. In this context, we synthesized tempol and three more hydrophobic derivatives substituted in position 4 of the piperidine ring [(4-azido-4 benzenesulfonyl and 4-(4-phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)] and evaluated their ability to inhibit the chlorinating activity of MPO in vitro and in vivo. In vitro, all the nitroxides inhibited the chlorination of taurine mediated by MPO at pH 7.4 with similar IC50 values (1.5 to 1.8 µM). The kinetic constants of the reactions of tempol with MPO-I (k = 3.5 x 105 M-1 s-1) and MPO-II, whose kinetic indicated a saturation behavior (K = 2.0 x 10-5 M; k = 3.6 x 10-2 s-1), were determined. Kinetic modeling indicated that in the presence of taurine, MPO does not produce free HOCl. Taken together, the results indicated that tempol acts primarily as a reversible inhibitor of MPO leading to accumulation of MPO-II and of the complex [MPO-II-tempol], which do not participate within chlorinating cycle. To examine whether nitroxides inhibit the activity of MPO in vivo, the acute inflammation induced by carrageenan in the rat paw was selected as model. The attenuation of inflammation in paws was correlated with the lipophilicity of the nitroxide in early times, but the differences in effects were small (less than 2-fold) when compared to the differences in lipophilicity (higher than 200 times). No inhibition of MPO activity was evident because the levels of activity in rat paws correlated with the levels of MPO. Similarly, in animals not treated or treated with nitroxides, all parameters used to monitor inflammation (swelling, levels of oxidized and nitrated proteins and plasma exudation) correlated with the levels of MPO. The effects of nitroxides in vitro were also compared with those of 4-aminobenzoic acid hydrazide (ABAH) and colchicine. Taken together, the in vivo studies indicated that nitroxides attenuate carrageenan-induced inflammation mainly by inhibiting cell migration. According to this conclusion, in vitro studies showed that tempol decreased migration of human and culture neutrophils (HL-60 differentiation to neutrophils) activated with PMA or fMLP with IC50 = 25 µM. In this case, actin polymerization is inhibited only when cells are preincubated with tempol for 30 min. During this time interval, treatment with tempol promotes the formation of O2•- via flavoenzymes in a concentration-dependent manner. Subsequent activation of culture neutrophils with PMA also results in intracellular production of O2•- and H2O2, which is inhibited by pretreatment with tempol (IC50 = 38 µM). These preliminary studies suggest that tempol interfere in neutrophil chemotaxis by attenuating the formation of intracellular ROS. The relevance of the peroxidase activity of superoxide dismutase (hSOD1) in vitro is certainly much narrower than that of MPO. Nevertheless, this peroxidase activity may have a role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, the effects of tempol on the consequences of the hSOD1 peroxidase activity (oxidation, dimerization, unfolding and aggregation of the enzyme) were also examined. Tempol inhibited the dimerization of hSOD1, protecting it from unfolding and aggregation, but not interfered in its catalytic cycle. The nitroxide was consumed in the process by reacting with the tryptophanyl radical of the segment 31VWGSIK36 as evidenced by MS. Overall, our studies contribute to clarify the multiple mechanisms by which nitroxides can inhibit oxidative and inflammatory processes.

Dois importantes fatores inter-relacionados estão envolvidos na patogênese da doença periodontal: ativação do sistema imune e produção de peroxidases. Os objetivos deste estudo foram comparar os níveis da atividade do sistema peroxidase presentes no fluido gengival (MPO/FG) e saliva da parótida (POS) em pacientes portadores de periodontite crônica em relação a pacientes periodontalmente saudáveis e avaliar o efeito do tratamento periodontal não cirúrgico nestes indivíduos nestes parâmetros enzimáticos. MATERIAL E MÉTODO: Foram coletados dados dos parâmetros clínicos periodontais e amostras de FG e saliva da glândula parótida de 17 pacientes clinicamente saudáveis (GC) e de 17 pacientes portadores de periodontite crônica generalizada (GP) antes e depois do tratamento periodontal pareados em idade e sexo. As atividades de MPO/FG e POS Parótida foram avaliadas por espectofotometria. RESULTADOS: O GP apresentou valores maiores nos parâmetros clínicos periodontais em relação ao GC, sendo que os mesmos foram reduzidos após tratamento periodontal. Além disso, o GP apresentou valores mais elevados de atividade de MPO no FG (p=0,04) do que o GC. Após tratamento periodontal os níveis de MPO/FG (p<0,001) e POS parótida (p=0,013) foram reduzidos significativamente. No GP houve correlação negativa e significativa entre POS da parótida e MPO no FG (r=-0,59, p=0,02). CONCLUSÕES: Na doença periodontal, as atividades de MPO no FG são maiores quando comparados ao grupo controle, e tanto de MPO/FG e POS parótida são reduzidas após tratamento periodontal. / Two important and interrelated factors are involved in the pathophysiology of periodontal diseases: the activation of immune system and the production of peroxidases. The objectives of this study were to examine the peroxidase activities present in Gingival Crevicular Fluid (MPO/GCF) and in Parotid Saliva (POS) in patients with generalized chronic periodontitis with healthy controls and to compare the effects of periodontal therapy on enzyme activities. MATERIAL AND METHOD: Periodontal clinical measurements, parotid saliva and GCF samples were obtained of 17 age-matched healthy controls (PC) and 17 patients with chronic periodontal disease (PD) before treatment and after periodontal treatment. The MPO/GCF and POS parotid activities were determined spectrophotometrically. RESULTS: In PD group, clinical parameters, MPO/GCF (p=0,04) activities presented higher values than controls. After periodontal treatment levels of MPO/GCF (p<0.001) and POS parotid (p=0,013) were significantly reduced. In PD there was significant negative correlation between POS and MPO in the parotid FG (r =-0,59, p=0,02). CONCLUSIONS: In periodontal disease MPO/GCF presented higher levels than controls and MPO/GCF and POS parotid are reduced after treatment.

This thesis comprised patients with chronic rheumatic diseases. The studies aimed to elucidate food sensitivity by measuring mucosal inflammatory reactivity and thereby a possible link between the gut and joints. In all the studies, the mucosal path technique was used to evaluate the rectal mucosal response to rectal challenge with gluten and/or cow’s milk protein (CM). In some patients with primary Sjögren’s syndrome (pSS) and the genetic susceptibility genes HLA DQ2, mucosal reactivity measured with nitric oxide (NO) was found after rectal gluten challenge without detectable serum antibodies to gluten or transglutaminase. This gluten sensitivity was not linked to coeliac disease. After rectal CM challenge, a rectal mucosal inflammatory response measured with NO and myeloperoxidase (MPO) was detected in 38% of pSS patients, all of whom fulfilled the criteria for irritable bowel syndrome. In a questionnaire study of self-experienced adverse reactions to food, 27% of patients with rheumatoid arthritis (RA) reported intolerance to various foods and CM in particular. After rectal CM challenge performed in RA patients (n=27), strong mucosal reactivity to CM was observed in a few patients and a moderate increase in 23%. After gluten challenge, a moderate increase in mucosal reactivity was found in 35% of patients. No correlation to self-perceived intolerance and mucosal reactivity measured with NO and MPO was seen. Inflammation of the gut is a prominent feature of spondyloarthropathies (SpA). After rectal challenges with CM protein and gluten, an increase in rectal NO production was seen in 26% and 19% respectively (p&lt;0.001). An increase in the mucosal release of MPO as a sign of neutrophil activation was seen in the CM- and gluten-sensitive patients. NO production in SpA patients was more enhanced compared with RA and pSS patients and could contribute to the increased barrier permeability described in SpA patients.

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Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil piperidina-1-oxil) e outros nitróxidos cíclicos reduzem a injúria tecidual em modelos animais de inflamação por mecanismos que não são completamente entendidos. A mieloperoxidase (MPO) tem um papel fundamental na produção de oxidantes por neutrófilos e, portanto, é um importante alvo para anti-inflamatórios. Ao amplificar o potencial oxidativo do H2O2, a MPO produz HOCl e radicais livres através de seus intermediários oxidantes MPO-I [MPO-porfirina&#8226;+-Fe(IV)=O] e MPO-II [MPO-porfirina-Fe(IV)=O]. Esses fatos nos levaram a sintetizar e avaliar a capacidade inibitória sobre a atividade clorinante da MPO in vitro e in vivo do tempol e de três derivados hidrofóbicos substituídos na posição 4 do anel piperidina [(4-azido, 4-benzenosulfonil e 4-(4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)]. In vitro, todos os nitróxidos inibiram a clorinação da taurina mediada pela MPO a pH 7,4 com valores similares de IC50 (1,5-1,8 µM). As constantes cinéticas das reações do tempol com MPO-I (k = 3,5 x 105 M-1 s-1) e MPO-II, cuja cinética indicou um comportamento de saturação (K= 2,0 x 10-5 M; k = 3,6 x 10-2 s-1), foram determinadas. Modelagens cinéticas indicaram que, em presença de taurina, MPO não produz HOCl livre. Tomados conjuntamente, os resultados indicaram que o tempol age principalmente como um inibidor reversível da MPO por levar ao acúmulo de MPO-II e de complexo [MPO-II-tempol] que não participam do ciclo clorinante. Para examinar se nitróxidos inibem a atividade da MPO in vivo selecionamos como modelo a inflamação aguda induzida pela carragenina na pata de ratos. A atenuação da inflamação na pata mostrou correlação com a lipofilicidade do nitróxido em tempos iniciais, mas as diferenças nos efeitos foram pequenas (menor que 2 vezes) quando comparadas com as diferenças de lipofilicidade (maior que 200 vezes). Nenhuma inibição da atividade da MPO foi evidente in vivo porque os níveis de atividade nas patas dos ratos correlacionaram com os níveis de MPO. Do mesmo modo, em animais não-tratados ou tratados com nitróxidos, todos os parâmetros empregados para monitorar a inflamação (edema, níveis de proteínas oxidadas e nitradas e exsudação plasmática) correlacionaram com os níveis de MPO. Os efeitos dos nitróxidos in vivo foram também comparados com aqueles da hidrazida do ácido 4-aminobenzóico (ABAH) e da colchicina. Tomados conjuntamente, os estudos in vivo indicaram que os nitróxidos atenuam a inflamação induzida pela carragenina principalmente por inibirem a migração celular. De acordo com essa conclusão, estudos in vivo, mostraram que tempol diminuiu a migração de neutrófilos humanos e de cultura (HL-60 diferenciadas em neutrófilos) ativados com PMA ou fMLP com IC50 25 &#181;M. Nesse caso, a polimerização da actina é inibida apenas quando as células são pré-incubadas com tempol por 30 min. Nesse intervalo de tempo, o tratamento com tempol promove a formação de O2&#8226;- via flavoenzimas de maneira dependente da concentração. Subsequente ativação dos neutrófilos de cultura com PMA resulta também em produção intracelular de O2&#8226;- e H2O2 que é inibida pelo pré-tratamento com tempol (IC50 = 38 µM). Esses estudos preliminares sugerem que o tempol interfere na migração celular de neutrófilos por atenuar a formação intracelular de ROS. A importância da atividade peroxidásica da superóxido dismutase (hSOD1) in vivo é certamente muito mais restrita do que a da MPO em processos inflamatórios no geral. Todavia, essa atividade peroxidásica da hSOD1 pode ter um papel na na patogenia da esclerose lateral amiotrófica (ELA). Por essa razão, os efeitos do tempol sobre as consequências da atividade peroxidásica da hSOD1 (oxidação, dimerização, desenovelamento e agregação da enzima) também foram examinadas. Foi demonstrado que o tempol não interfere no ciclo catalítico da hSOD1, porém, inibe a dimerização da enzima, protegendo-a de desenovelamento e agregação. O nitróxido foi consumido no processo reagindo com o radical triptofanila no peptídeo 31VWGSIK36 como comprovado por MS. No conjunto, nossos estudos contribuem para esclarecer os múltiplos mecanismos pelos quais nitróxidos podem inibir processos oxidativos e inflamatórios. / Tempol (4-hydroxy-2 ,2,6,6-tetramethyl piperidine-1-oxyl) and other cyclic nitroxides reduce tissue injury in animal models of inflammation by mechanisms that are not fully understood. Myeloperoxidase (MPO) plays a key role in the production of oxidants by neutrophils and therefore is an important target for anti-inflammatory drugs. By amplifying the oxidative potential of H2O2, MPO produces HOCl and free radicals through its oxidizing intermediates MPO-I [MPO-porphyrin&#8226;+-Fe (IV)=O] and MPO-II [MPO-porphyrin-Fe (IV)=O]. In this context, we synthesized tempol and three more hydrophobic derivatives substituted in position 4 of the piperidine ring [(4-azido-4 benzenesulfonyl and 4-(4-phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)] and evaluated their ability to inhibit the chlorinating activity of MPO in vitro and in vivo. In vitro, all the nitroxides inhibited the chlorination of taurine mediated by MPO at pH 7.4 with similar IC50 values (1.5 to 1.8 &#181;M). The kinetic constants of the reactions of tempol with MPO-I (k = 3.5 x 105 M-1 s-1) and MPO-II, whose kinetic indicated a saturation behavior (K = 2.0 x 10-5 M; k = 3.6 x 10-2 s-1), were determined. Kinetic modeling indicated that in the presence of taurine, MPO does not produce free HOCl. Taken together, the results indicated that tempol acts primarily as a reversible inhibitor of MPO leading to accumulation of MPO-II and of the complex [MPO-II-tempol], which do not participate within chlorinating cycle. To examine whether nitroxides inhibit the activity of MPO in vivo, the acute inflammation induced by carrageenan in the rat paw was selected as model. The attenuation of inflammation in paws was correlated with the lipophilicity of the nitroxide in early times, but the differences in effects were small (less than 2-fold) when compared to the differences in lipophilicity (higher than 200 times). No inhibition of MPO activity was evident because the levels of activity in rat paws correlated with the levels of MPO. Similarly, in animals not treated or treated with nitroxides, all parameters used to monitor inflammation (swelling, levels of oxidized and nitrated proteins and plasma exudation) correlated with the levels of MPO. The effects of nitroxides in vitro were also compared with those of 4-aminobenzoic acid hydrazide (ABAH) and colchicine. Taken together, the in vivo studies indicated that nitroxides attenuate carrageenan-induced inflammation mainly by inhibiting cell migration. According to this conclusion, in vitro studies showed that tempol decreased migration of human and culture neutrophils (HL-60 differentiation to neutrophils) activated with PMA or fMLP with IC50 = 25 &#181;M. In this case, actin polymerization is inhibited only when cells are preincubated with tempol for 30 min. During this time interval, treatment with tempol promotes the formation of O2&#8226;- via flavoenzymes in a concentration-dependent manner. Subsequent activation of culture neutrophils with PMA also results in intracellular production of O2&#8226;- and H2O2, which is inhibited by pretreatment with tempol (IC50 = 38 &#181;M). These preliminary studies suggest that tempol interfere in neutrophil chemotaxis by attenuating the formation of intracellular ROS. The relevance of the peroxidase activity of superoxide dismutase (hSOD1) in vitro is certainly much narrower than that of MPO. Nevertheless, this peroxidase activity may have a role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, the effects of tempol on the consequences of the hSOD1 peroxidase activity (oxidation, dimerization, unfolding and aggregation of the enzyme) were also examined. Tempol inhibited the dimerization of hSOD1, protecting it from unfolding and aggregation, but not interfered in its catalytic cycle. The nitroxide was consumed in the process by reacting with the tryptophanyl radical of the segment 31VWGSIK36 as evidenced by MS. Overall, our studies contribute to clarify the multiple mechanisms by which nitroxides can inhibit oxidative and inflammatory processes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / We investigated the action of butane-2,3-dione thiosemicarbazone oxime against the testicular damage caused by cadmium chloride (CdCl2) in mice swiss adult male. The animals received a single injection of CdCl2 at the dose of 5 mg/kg, intraperitoneally, and after thirty minutes, the oxime was administered subcutaneously at the dose of 10 mg/kg. Twenty four hours after administration of the oxime, the animals were euthanized the blood were collected and after killed the testes were removed for analysis. The parameters determined were δ-aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D), myeloperoxidase (MPO), glutathione-S-transferase (GST) and glutathione peroxidase (GPx) activities, in testicular tissue. The levels of thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), nonprotein thiols (NPSH), ascorbic acid and the quantity of cadmium in testes were also evaluated. In addition, levels of testosterone in serum and cytokines (proinflammatory, IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-γ and anti-inflammatory IL-10) were determined. Histological analysis of testicular tissue was also performed. Our results demonstrated that the oxime was effective in restoring partially the inhibition in δ-ALA-D activity induced by CdCl2. The activation of MPO and increase in IL-1, IL-6, TNF-α and IFN-γ levels induced by CdCl2 were also reduced by oxime. IL-10, which was reduced by cadmium, was partially restored by oxime administration. In addition, the oxime was effective in restoring the increase in TBARS levels and partially the reduction on NPSH levels induced by CdCl2. However, the oxime did not have action on the decreased levels of ascorbic acid induced by CdCl2 or on the decrease in enzymatic activity of GST and the increased enzymatic activity of GPx caused by CdCl2. Our results demonstrated that oxime was effective in restoring the histological alterations induced by CdCl2, preventing the loss of elongated spermatids. In addition, oxime was able to increase the testosterone levels reduced by cadmium exposure. In conclusion, the oxime tested was effective in reducing the testicular damage induced by CdCl2 in mice. The beneficial effects of this oxime are related to its antioxidant and anti-inflammatory action. / Investigamos a ação da oxima butano-2,3-dionatiossemicarbazona contra o dano testicular causado por cloreto de cádmio (CdCl2) em camundongos swiss adultos machos. Os animais receberam uma única injeção de CdCl2 na dose de 5mg/kg, intraperitonialmente e, após trinta minutos, foi administrada a oxima subcutâneamente na dose de 10 mg/kg. Vinte quarto horas após a administração da oxima, os animais foram anestesiados o sangue foi coletado, após a eutanásia tiveram os testículos removidos para as análises. Os parâmetros determinados foram as atividades das enzimas δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D), mieloperoxidase (MPO), glutationa-S-transferase (GST) e glutationa peroxidase (GPx), no tecido testicular. Os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), tióis não protéicos (NPSH), ácido ascórbico e quantidade presente de cádmio nos testículos também foram avaliados. Além dos níveis de testosterona no soro, onde também se quantificou as citocinas (pró-inflamatórias IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-γ e anti-inflamatória, IL-10). Também foi realizada a análise histológica de tecido testicular. Nossos resultados demonstraram que a oxima foi efetiva em restaurar parcialmente a inibição da atividade da enzima δ-ALA-D induzida por CdCl2. A ativação da MPO e o aumento dos níveis de IL-1, IL-6, TNF-α e IFN-γ induzidos por CdCl2 também foram reduzidos pela oxima. A IL-10, que foi reduzida pelo cádmio, teve seus níveis restaurados parcialmente pela oxima. Além disso, a oxima foi efetiva em restaurar o aumento nos níveis de TBARS e parcialmente a redução nos níveis de NPSH induzidos pelo CdCl2. Porém, não teve ação sobre a queda dos níveis de ácido ascórbico provocado pelo CdCl2, nem sobre a diminuição da atividade enzimática da GST e sobre o aumento da atividade enzimática da GPx causados pelo CdCl2. Nossos resultados demonstraram que a oxima foi efetiva em conter as alterações histológicas causadas pelo CdCl2, prevenindo a perda de espermátides alongadas. A oxima também foi capaz de aumentar os níveis de testosterona reduzidos pela exposição ao cádmio. Em conclusão, a oxima testada foi efetiva em reduzir os danos testiculares induzidos pelo CdCl2. Os efeitos benéficos desta oxima estão relacionados às suas propriedades antioxidantes e sua ação anti-inflamatória.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Guilherme Zolini1.pdf: 7663 bytes, checksum: 2f28c5d53aef01e6521ccd46bac0339d (MD5) Previous issue date: 2006-09-14 / This work was carried out in the Microorganism Fisiology Biology and Phytopharmacy laboratories of the José do Rosário Vellano University (UNIFENAS) The aim of the study was to evaluate some aspects related to the immunitary activity of neutrophils in rats treated with kefir a probiotic made from various microorganisms The tests were conducted to determine the level of cytokine TNF-alpha cell recruiting cellular metabolism neutrophils oxygen consumption hydrogen peroxide formation by neutrophils screening for myeloperoxidase positive neutrophils and assay of redox titration The tested groups consisted of albino male Wistar rats the test group received 1,0 ml of kefir solution the negative control received 1,0 ml of saline solution (NaCl 0,9 %) and the positive control received 100 mg/kg of tocopherol (Vit E) except for those on TNF-alpha and cell recruiting in which the positive control received 0,5 mg/kg of dexamethasone by 7 days gavage except for redox assay where the groups did not consist of animals The results were analyzed by means +- SEM using comparison test of Student Newman Keuls (SNK) except for respirometry assay for which t Student test was used Significant differences were found in kefir and negative control groups in cell recruiting assays (P<0,05) hydrogen peroxide formation stimulated by forbol ester (P<0,05) and identification of myeloperoxidase (P<0,01) given that both previously mentioned had the same index shown by the positive control For the cell recruiting assay the kefir the positive control and the negative control groups presented 12,0 +- 1,0 x 106, 7,3 +- 1,4 x 106 and 17,2 +- 1,9 x 106 neutrophils/mL respectively On the other hand in the hydrogen peroxide formation stimulated by forbol ester the kefir and the positive control groups presented averages of 1,46 +- 0,16 e 1,50 +- 0,22 femtomol/cell respectively showing no difference The negative control at 2,14 +- 0,18 femtomol/cell was considered statistically different from the kefir group In the assay for myeloperoxidase identification kefir and positive control groups were considered identical with indexes of 54,8 +- 3,0 % 47,3 +- 5,7 % respectively different from the negative control group with index of 74,0 +- 1,9 % positive MPO The other assays did not show significant effects In conclusion the ingestion of kefir was capable of diminishing cell recruiting inhibiting H2O2 production and suggests the reduction of the activity of MPO in the neutrophils / Este trabalho foi realizado nos laboratórios de Fitofármacos e Biologia e Fisiologia de Microrganismos da Universidade José do Rosário Vellano (UNIFENAS) com objetivo de avaliar alguns aspectos relacionados à atividade imunitária de neutrófilos em ratos tratados com que fir um probiótico composto por vários microrganismos Os ensaios foram realizados para se determinar o nível da citocina TNF-alpha recrutamento celular metabolismo celular consumo de oxigênio pelos neutrófilos formação de peróxido de hidrogênio pelos neutrófilos pesquisa de neutrófilos mieloperoxidase positivos e ensaio de titulação redox Os grupos foram formados por ratos Wistar albinos machos onde o grupo teste recebeu 1,0 mL de solução de quefir controle negativo 1,0 mL de solução salina (NaCl 0,9%) e controle positivo recebeu tocoferol (vit E) na dose de 100 mg/kg; nos ensaios de dosagem de TNF-alpha e recrutamento celular, contudo o controle positivo recebeu dexametasona na dose de 0,5 mg/kg por gavagem durante 7 dias exceto em ensaio redox onde grupos não foram formados por animais Os dados obtidos foram analisados por médias +- EPM seguindo teste de comparação de Student Newman Keuls (SNK) exceto para ensaio de respirometria que foi feito teste t de Student Foram encontradas diferenças significativas entre os grupos quefir e controle negativo nos ensaios de recrutamento celular (P<0,05) formação de peróxido de hidrogênio estimulado com ester de forbol (P<0,05) e identificação da mieloperoxidase (P<0,01) observando que ambos anteriormente citados apresentaram índices iguais ao controle positivo Para o ensaio de recrutamento celular os grupos quefir controle positivo e controle negativo apresentaram 12,0 +- 1,0 x 106 7,3 +- 1,4 x 106 e 17,2 +- 1,9 x 106 neutrófilos/mL respectivamente Já no ensaio de formação de peróxido de hidrogênio estimulado com ester de forbol os grupos quefir e controle positivo apresentaram médias de 1,46 +- 0,16 e 1,50 +- 0,22 femtomol/cel respectivamente não evidenciando diferença o controle negativo apresentou valor de 2,14 +- 0,18 femtomol/cel sendo considerado estatisticamente diferente ao grupo quefir No ensaio de identificação da mieloperoxidase o grupo quefir e controle positivo foram considerados iguais com índices de 54,8 +- 3,0 % e 47,3 +- 5,7 % respectivamente e diferentes do grupo controle negativo com índice de 74,0 +- 1,9 % MPO positivo Os demais ensaios não apresentaram efeitos significativos Concluiu-se que a ingestão do quefir foi capaz de diminuir o recrutamento de neutrófilos inibir a produção de H2O2 e sugere a diminuição da atividade de MPO nos neutrófilos

The phagocytic cells circulating in the bloodstream play a key role in both the defense of the body and the pathology of inflammatory diseases. Thus, targeting their functions has potential to modulate an immune response, especially during the inflammatory phase. This master's thesis was focused on the influence of electric pulses on the most abundant phagocyte population in human peripheral blood, namely neutrophils. The theoretical part describes the role of neutrophils in the development of the immune response and the effects of the electric field on various cells. Consequent part of the thesis was the optimization of the electrical stimulation of neutrophils using a unique platform with a network of gold electrodes. In stimulated cells by electrical pulses, activation of selected signaling pathways, degranulation, ROS production, citrullination of histone H3 and expression of surface markers were monitored. Overall, electrical stimulation was observed to induce neutrophil activation but only electrical pulses of size 1 V were found to be statistically significant in the case of ROS production and 10 mV and 100 mV electrical pulses in the case of metalloproteinase MMP8 degranulation. The absence of significant effects in the most observed parameters was probably due to unwanted activation of neutrophils in control samples.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第19871号 / 生博第352号 / 新制||生||47(附属図書館) / 32907 / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 稲葉 ｶﾖ, 教授 米原 伸, 教授 杉田 昌彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Mammalian heme peroxidases are fascinating due to their unique peculiarity of oxidizing (pseudo)halides under physiologically relevant conditions. These proteins are able either to incorporate oxidized halides into substrates adjacent to the active site or to generate different oxidized (pseudo)halogenated species, which can take part in multiple (pseudo)halogenation and oxidation reactions with cell and tissue constituents. The present article reviews basic biochemical and redox mechanisms of (pseudo)halogenation activity as well as the physiological role of heme peroxidases. Thyroid peroxidase and peroxidasin are key enzymes for thyroid hormone synthesis and the formation of functional cross-links in collagen IV during basement membrane formation. Special attention is directed to the properties, enzymatic mechanisms, and resulting (pseudo)halogenated products of the immunologically relevant proteins such as myeloperoxidase, eosinophil peroxidase, and lactoperoxidase. The potential role of the (pseudo)halogenated products (hypochlorous acid, hypobromous acid, hypothiocyanite, and cyanate) of these three heme peroxidases is further discussed