Apesar de vários avanços no combate ao câncer, a incidência do câncer de pele tipo melanoma e a mortalidade relacionada a essa doença tem aumentado. Considerando-se que a radiação ultravioleta (UV) é o principal agente causador de diversos danos à pele, inclusive o câncer de pele, é de grande importância medir de forma adequada as propriedades fotoprotetoras dos filtros solares. Diante dos problemas provocados pelo uso de filtros solares, as pesquisas têm se voltado no sentido de encontrar produtos naturais com propriedades antioxidantes visto que já foi demonstrado que muitos desses agentes naturais possuem efeitos anticarcinogênico, e antimutagênico. Assim, um dos objetivos desse trabalho foi a avaliação de três formulações fotoprotetoras comerciais por meio de parâmetros bioquímicos não comumente utilizados, mas que refletem o efeito dessas formulações no sistema antioxidante natural da pele e também no processo inflamatório induzido pela radiação UV. Esses efeitos foram mensurados in vivo em camundongos sem pelos, utilizando-se como marcadores o antioxidante não enzimático glutationa reduzida (GSH), enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), a enzima mieloperoxidase (MPO) e as citocinas IL-1? e TNF-?. Outro importante objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de um extrato de soja biotransformado (ESB) pelo fungo A. awamori em células de melanoma humano das linhagens 451LU e A375, altamente metastáticas, e estudar os mecanismos de ação pelos quais o extrato induz a morte celular por apoptose nestas células e também avaliar o potencial desse extrato para a prevenção e tratamento do câncer de pele. Os resultados mostraram que com relação ao processo inflamatório induzido pela radiação UVB, verificou-se que o FPS, apesar de avaliar somente o eritema, é um bom indicador do nível de proteção da pele, uma vez que todas as formulações apresentaram um potencial protetor contra o aumento da atividade da MPO e liberação das citocinas pró-inflamatórias IL-1? e TNF-?. No entanto, as formulações não forneceram proteção contra a depleção do antioxidante endógeno GSH e, apesar de possuírem mesmo FPS 15 essas formulações apresentaram diferentes níveis de proteção com relação à redução da atividade da enzima SOD induzida pela radiação UV. Os resultados referentes ao estudo do ESB mostraram que o tratamento das células de melanoma altamente invasivas com o extrato resultou em inibição do crescimento/viabiliade das células associado com a indução de apoptose. As análises revelaram que o ESB resultou em indução da clivagem de PARP e ativação das caspases-3, -7 e -8; aumento da expressão de TNF-R2 e da expressão de TRAIL e do receptor DR4. Além disso, o tratamento das células de melanoma com o extrato ESB aumentou a fosforilação e ativação de IKK, degradação de I?B? e translocação de p65/NF?B para o núcleo. Apesar de ser geralmente aceito que a ativação do NF-?B seja responsável pela resistência à apoptose, neste estudo foi demonstrado que a estimulação da via do NF-?B é necessária pela indução da apoptose mediada pelo extrato ESB. Finalmente, conclui-se que as formulações fotoprotetoras devem ser avaliadas de forma mais profunda, empregando-se diferentes métodos a fim de se garantir formulações mais eficazes tanto contra os danos induzidos tanto pela radiação UVB quanto pela radiação UVA. Além disso, esses estudos identificaram uma atividade anticâncer do extrato ESB que é altamente relevante para a quimioprevenção/quimioterapia contra o câncer de pele tipo melanoma. / Despite several advances in fighting cancer, the incidence of melanoma type skin cancer and the mortality related to this disease have increased. Considering that ultraviolet radiation (UV) is the main causative agent of various skin damages, including skin cancer, it is of great importance to adequately measure the photoprotective properties of sunscreens. Considering the problems caused by the use of sunscreens, researches have been focused towards finding natural products with antioxidant properties as it has been shown that many of these natural agents possess anticarcinogenic and antimutagenic effects. Thus, an objective of this study was to evaluate three marketed photoprotective formulations through biochemical parameters not commonly used, but which reflect the effect of these formulations on the skin\'s natural antioxidant system and also in the inflammatory process induced by UV radiation. These effects were measured in vivo in hairless mice, employing as markers reduced glutathione (GSH), a non-enzymatic antioxidant; superoxide dismutase (SOD), an antioxidant enzyme; myeloperoxidase (MPO) enzyme and IL-1? and TNF-? cytokines. Another important objective of this study was to evaluate the effect of a biotransformed soy extract (BSE) by the A. awamori fungus against 451LU and A375 human melanoma cell strains, highly metastatic, and to study the action mechanisms by which the extract induces cell death by apoptosis in these cells; in addition it was intended to evaluate the potential of this extract for the prevention and treatment of skin cancer. The results demonstrated that regarding the inflammatory process induced by UVB irradiation, it was found that the FPS, although only assessing the erythema, is a good indicator of the level of skin protection, since all formulations showed a protector potential against the increased MPO activity and the release of IL-1? and TNF-? pro-inflammatory cytokines. Nevertheless, the formulations did not provide protection against the depletion of the GSH endogenous antioxidant and, despite having the same nominal SPF (SPF=15), these formulations showed different levels of protection with respect to the reduction of SOD activity induced by UV radiation. The results of the BSE study demonstrated that the treatment of highly invasive melanoma cells with the extract resulted in the cell growth/viability inhibition associated with the induction of apoptosis. The analysis revealed that BSE resulted in induction of PARP cleavage and activation of caspase-3, -7 and -8, increased expression of TNF-R2 and expression of TRAIL and DR4 receptor. Furthermore, the treatment of melanoma cells with BSE extract increased phosphorylation and activation of IKK, degradation of I?B? and translocation of p65/NF?B to the nucleus. Although it is generally accepted that the activation of NF-kB is responsible for resistance to apoptosis, this study demonstrated that the stimulation of NF-?B is required for the induction of apoptosis mediated by BSE extract. Finally, it is concluded that the photoprotective formulations should be more deeply evaluated, using different methods in order to ensure more effective formulations against damages induced both by UVB radiation and UVA radiation. In addition, these studies identified an anticancer activity of the BSE extract that is highly relevant to chemoprevention/chemotherapy against melanoma type skin cancer.

Em decorrência da destruição da camada de ozônio pela poluição, a incidência da radiação ultravioleta sobre a Terra tem aumentado, e consequentemente, o número de casos de câncer de pele tem elevado cada vez mais. Diversos estudos têm demonstrado que os danos causados pela radiação solar à pele são causados frequentemente pela geração de radicais livres e ativação de mediadores do processo inflamatório. Estudos têm concluído que os filtros solares são capazes de penetrarem na pele e agirem como fontes de formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) quando submetidos à radiação ultravioleta, o que leva a uma preocupação de que as moléculas fotoprotetoras podem ser geradoras de EROs ao invés de prevenir a formação dessas espécies pelo bloqueio da radiação solar. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos dos filtros solares 3- benzofenona (3-BZ), octilmetoxicinamato (OMC) e salicilato de octila (OS) na pele de camundongos sem pêlos submetida ou não à radiação UVB. Além disso, a retenção cutânea dos filtros solares foi avaliada in vitro utilizando pele de orelha de porco em células de difusão e in vivo em pele de camundongos sem pêlos. Os resultados de retenção cutânea in vitro demonstraram que a formulação gel creme promoveu maior retenção dos filtros solares na pele em comparação às formulações loção e creme. Além disso, a 3-BZ apresentou a maior retenção na pele quando comparadas as retenções dos filtros solares veiculados na mesma formulação. Todos os filtros solares penetraram na pele de camundongos sem pêlos após 1 hora da aplicação da formulação gel creme, o que garantiu a presença dos filtros solares na derme e epiderme no momento da exposição à radiação UVB. A formulação adicionada dos filtros solares preveniu em 76% a depleção de GSH induzida pela radiação UVB. Entretanto, o tratamento dos animais com a formulação contendo os filtros solares não foi capaz de impedir o aumento das atividades da metaloproteinase-9 e mieloperoxidases induzido pela radiação. Além disso, a utilização da formulação adicionada dos filtros solares em associação à exposição à radiação UVB provocou uma diminuição da atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase presente na pele. Desta forma, considerando os parâmetros avaliados neste estudo, a formulação fotoprotetora parece não proteger a pele contra os danos causados pela radiação UVB quanto deveria. Além disso, estes filtros parecem ser instáveis frente à radiação o que comprometendo assim a eficácia e segurança dos mesmos. / Due to the destruction of the ozone layer by pollution, the incidence of ultraviolet radiation on Earth has enlarged and, consequently, the number of cases of skin cancer has increased even more. Several studies have shown that the damages caused by solar radiation to the skin are usually caused by free radical generation and activation of inflammatory mediators. Several studies have concluded that sunscreens are able to penetrate the skin and act as sources of formation of reactive oxygen species (ROS) under ultraviolet radiation exposition, leading, therefore, to the concern regarding the possibility of sunscreen molecules generate ROS instead of preventing the formation of these species by blocking sunlight. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of benzophenone-3 (3-BZ), octylmethoxycinnamate (OMC) and octyl salicylate (OS) sunscreens in the skin of hairless mice exposed or not to UVB radiation. Furthermore, the sunscreen skin retention was in vitro assessed using pig ear skin in diffusion cells and in vivo assessed using hairless mice. The results demonstrated that the cream gel rendered higher epidermal concentrations of the evaluated filters compared to the lotion and cream formulations. Comparing the skin retention amounts of each filter in the same formulation, 3-BZ showed higher skin retention ability than OMC and OS. In addition, all sunscreens penetrated the skin of hairless mice after 1 hour of the applied gel cream formulation, which guaranteed the presence of sunscreen in the dermis plus epidermis at the time of UVB exposure. The formulation of sunscreens prevented by 76% the GSH depletion induced by UVB radiation. However, the treatment of the animals with the sunscreens loaded-formulation was not able to inhibit the increase of metalloproteinase-9 and myeloperoxidase activities induced by radiation. Furthermore, the use of sunscreens loaded-formulation in combination with UVB radiation exposition caused the decrease in the amounts of the superoxide dismutase antioxidant enzyme present in skin. Thus, considering the parameters evaluated in this study, the sunscreens loaded-formulation does not seem to effectively protect skin against damages caused by UVB radiation as it was supposed to. Moreover, these filters seem to be unstable against the radiation and thus compromising their efficacy and safety.

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

Macrófagos recuperados de peritôneo de camundongos 48 horas após administração de concanavalina A (Con A) são ativados e possuem um conteúdo maior de mieloperoxidase (MPO) do que macrófagos residentes. Este aumento pode ser observado por immunobloting e pelo aumento da atividade peroxidásica. Esta atividade foi avaliada pela quimiluminescência desencadeada por homogenato de macrófagos e peróxido de hidrogênio, durante a oxidação de luminol e melatonina. Os macrófagos contendo MPO são capazes de gerar ácido hipocloroso quando estimulados com acetato de forbol miristato (PMA). O aumento do conteúdo de MPO em macrófagos é um processo que independe de interferon-γ (IFN-γ), uma vez que camundongos IFN-γ-\"knockout\" têm uma atividade ainda maior que camundongos \"wild type\". O contato entre macrófagos e neutrófilos in vivo, não é necessário para o incremento observado, visto que macrófagos de camundongos tratados com anticorpo anti-granulócitos preservam a atividade peroxidásica. Este achado é uma evidência de que em algumas condições a ativação de macrófagos é acompanhada por um aumento da atividade peroxidásica. Dentre o amplo espectro de ação da MPO, este processo pode ter um papel especial na inflamação. Também é de especial interesse o fato de macrófagos serem capazes de oxidar melatonina, um hormônio com vários efeitos imunomodulatórios. / Macrophages recovered from mice peritoneum 48 after concanavalin-A (Con A) administration are primed and have a higher content of myeloperoxidase (MPO) than resident cells. The increase of MPO is accompanied by an increment in peroxidase activity, evaluated by the chemiluminescence during the oxidation of luminol and melatonin triggered by macrophages homogenates plus hydrogen peroxide. MPO present in macrophages are able to generate hypochlorous acid when macrophages are stimulated with phorbol myristate acetate. Interferon-γ (IFN-γ) does not participate in the process that lead macrophages to become enriched in MPO, since IFN-γ knockout mice have an even higher peroxidase activity compared to the wild type. The contact of macrophages with neutrophil in vivo seems to be not necessary for the observed increment in peroxidase since macrophages recovered from mice treated with antigranulocyte antibody preserves the peroxidase activity. These finding provides evidences that, at least in some conditions, macrophage activation is accompanied by an increment in peroxidase activity. Given the broad spectrum of action of MPO, this process might play a special role in inflammation. Also of special interest is the finding that macrophages are able to oxidize melatonin, a hormone with several immunomodulatory effects.

Neste estudo avaliamos a ativação de macrófagos por: (i) neutrófilos e (ii) melatonina e seus produtos de oxidação N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK) e N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK). Para estudarmos o papel dos neutrófilos na ativação de macrófagos utilizamos um modelo experimental onde camundongos C57BL/6 receberam anticorpo anti-granulócitos (i.v.) e após 36 horas receberam o mitógeno Con A. Verificamos que a depleção dos neutrófilos diminuiu a atividade do sistema NADPH oxidase e a capacidade fagocítica e microbicida dos macrófagos, entretanto não comprometeu a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase (iNOS). Para estudarmos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a ativação de macrófagos, avaliamos a produção de citocinas e a atividade microbicida destas células. Primeiramente, acompanhamos a liberação de citocinas em cultura de células mononucleares humanas. Melatonina, AFMK e AMK inibiram a liberação de TNF-α, IL-12 e IFN-γ, mas não afetaram a liberação de IL-10. Num estudo posterior, macrófagos murino ativados com IFN-γ e infectados com T. cruzi foram incubados com melatonina, AFMK e AMK. Esta incubação resultou na diminuição de NO e aumento da replicação intracelular do parasita T. cruzi. Em conclusão, mostramos duas maneiras nas quais a ativação de macrófagos pode ser modulada. A primeira mostra que a interação de neutrófilos com macrófagos, no foco inflamatório parece ser um fator determinante para a atividade microbicida de macrófagos. E a segunda mostra que a interação da melatonina e seus produtos de oxidação com macrófagos contribui para a desativação do processo inflamatório, ampliando o conhecimento sobre o papel imunomodulador descrito para melatonina. / This study we evaluate macrophage activation by (i) neutrophils and (ii) melatonin and its oxidation products N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) and N1-acetyl-5-methoxykynuramine (AMK). Neutrophils role in macrophage activation was studied by an experimental model when mice C57BL/6 was injected with antigranulocyte antibody and 36 hours later they received the mitogenic ConA. We verified that neutrophil depletion decreased NADPH oxidase system activity, macrophage phagocytic and microbicide capacity. However, mieloperoxidase (MPO) and nitric oxide sintase (iNOS) activity was not compromised. Melatonin, AFMK and AMK effect in macrophage activation was evaluated by the cytokines production and microbicide activity of theses cells. We verified cytokines release in human mononuclear cells culture. Melatonin, AFMK and AMK inhibited TNF-α, IL-12 and IFN-γ release, but IL-10 was not affected. After that, IFN-γ-activated murine macrophage was infected with T. cruzi and incubated with melatonin, AFMK and AMK. We verify NO decrease and that intracellular replication of the parasite T. cruzi increased. In conclusion, we showed that there is two modulation ways for macrophage activation. First, neutrophil -macrophage interaction in inflammatory site seems to be a determinant factor to macrophage microbicide activity. And second, macrophage interaction with melatonin hormone and its oxidation products leads to deactivation of the inflammatory process, raising knowledge of immunomodulatory role described to melatonin.

Introdução: Poucos estudos avaliaram marcadores inflamatórios associados à nitração da placa aterosclerótica no prognóstico da doença arterial coronariana (DAC). Assim, o objetivo deste estudo é analisar a influência dos níveis de atividade da mieloperoxidase (MPO) e nitrotirosina (NT) na sobrevida em curto e longo prazo, em uma coorte prospectiva de síndrome coronariana aguda (SCA), Estratégia de Registro de Síndrome Coronariana Aguda (estudo ERICO). Métodos: Avaliou-se a influência da atividade da MPO e dos níveis de NT, ambos dosados até 10 dias após a síndrome coronariana aguda (SCA), em relação à mortalidade em até 4 anos de seguimento. A atividade da MPO e os níveis de NT, coletados durante a fase aguda e subaguda do início dos sintomas da síndrome coronariana aguda (SCA) (infarto do miocárdio (IAM) com supra e sem supra do segmento ST e angina instável), foram avaliados em 342 pacientes. Em 180 dias, 1 ano, 2 anos e 4 anos foram calculadas as taxas de letalidade geral, assim como as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e os modelos de regressão logística de Cox com respectivas razões de risco (RR) cumulativas (intervalo de confiança de 95%; IC 95%), de acordo os tercis de atividade da MPO e de NT para mortalidade (geral, cardiovascular e por IAM fatal). As RR cumulativas para atividade da MPO e NT foram calculadas sem ajuste, ajustadas por idade e sexo e com ajuste adicional para tabagismo, diabetes, hipertensão e níveis de colesterol LDL e HDL. Resultados: No geral, o valor mediano para a atividade da MPO foi de 29,6 mU / ml (variação: 1,8 a 282,1 mU / ml) e NT foi de 208,33 nmol / L (variação: 3,09 a 1.500,00 nmol / L), independentemente do subtipo de SCA. Durante o seguimento de 4 anos, observamos 55 (16,1%) óbitos. A taxa de sobrevida global foi de 287 (83,9%) (tempo mediano de sobrevida foi 1.517, IIQ: 1.1391.904 dias). A atividade de MPO e os níveis de NT não se associaram com as taxas de letalidade e nem de sobrevivência (mortalidade geral, cardiovascular e por IAM fatal) pelas RR de 180 dias até 4 anos de seguimento. Conclusões: A atividade da MPO, assim como, os níveis de NT não foram preditores de morte após SCA em curto e longo prazo no estudo ERICO / Introduction: Few studies have evaluated inflammatory markers associated with atherosclerotic plaque nitration in the prognosis of coronary artery disease (CAD). Thus, the objective of this study is to analyze the influence of levels of myeloperoxidase (MPO) activity and nitrotyrosine (NT) on short- and long-term survival in a prospective cohort of acute coronary syndrome (ACS), Coronary Syndrome Registry Strategy Acute (ERICO study). Methods: The influence of MPO activity and NT levels, both dosed up to 10 days after acute coronary syndrome (ACS), was evaluated in relation to mortality up to 4 years of follow-up. The MPO activity and NT levels, collected during the acute and subacute phase of the onset of ACS symptoms (myocardial infarction (MI) with supra and non-ST-segment elevation and unstable angina), were evaluated in 342 patients. Overall, case-fatality rates, as well as, Kaplan-Meier survival curves and Cox logistic regression models with cumulative hazard ratios (HR) were calculated for 180 days, 1 year, 2 years and 4 years (range (95% confidence interval, 95% CI), according to tertiles of MPO and NT activity for mortality (overall, cardiovascular and fatal MI). Cumulative RRs for MPO and NT activity were calculated as crude, age and sex-adjusted, and with additional adjustment for smoking, diabetes, hypertension, and LDL and HDLcholesterol levels. Results: Overall, the median value for MPO activity was 29.6 mU / ml (range: 1.8 to 282.1 mU / ml) and NT of 208.33 nmol / L (range: 3, 09 to 1,500.00 nmol / L), regardless of the subtype of ACS. During the 4-year follow-up, we observed 55 (16.1%) deaths. The overall survival rate was 287 (83.9%) (median survival time was 1,517, IQR: 1,139-1,904 days). MPO activity and NT levels were nor associated with case-fatality neither survival rates (overall, cardiovascular and fatal MI mortality ) by HRs from 180 days to 4 years of follow-up. Conclusions: MPO activity, as well as, NT levels were not predictors of short- and long-term mortality after ACS in the ERICO study

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

Apesar de vários avanços no combate ao câncer, a incidência do câncer de pele tipo melanoma e a mortalidade relacionada a essa doença tem aumentado. Considerando-se que a radiação ultravioleta (UV) é o principal agente causador de diversos danos à pele, inclusive o câncer de pele, é de grande importância medir de forma adequada as propriedades fotoprotetoras dos filtros solares. Diante dos problemas provocados pelo uso de filtros solares, as pesquisas têm se voltado no sentido de encontrar produtos naturais com propriedades antioxidantes visto que já foi demonstrado que muitos desses agentes naturais possuem efeitos anticarcinogênico, e antimutagênico. Assim, um dos objetivos desse trabalho foi a avaliação de três formulações fotoprotetoras comerciais por meio de parâmetros bioquímicos não comumente utilizados, mas que refletem o efeito dessas formulações no sistema antioxidante natural da pele e também no processo inflamatório induzido pela radiação UV. Esses efeitos foram mensurados in vivo em camundongos sem pelos, utilizando-se como marcadores o antioxidante não enzimático glutationa reduzida (GSH), enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), a enzima mieloperoxidase (MPO) e as citocinas IL-1? e TNF-?. Outro importante objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de um extrato de soja biotransformado (ESB) pelo fungo A. awamori em células de melanoma humano das linhagens 451LU e A375, altamente metastáticas, e estudar os mecanismos de ação pelos quais o extrato induz a morte celular por apoptose nestas células e também avaliar o potencial desse extrato para a prevenção e tratamento do câncer de pele. Os resultados mostraram que com relação ao processo inflamatório induzido pela radiação UVB, verificou-se que o FPS, apesar de avaliar somente o eritema, é um bom indicador do nível de proteção da pele, uma vez que todas as formulações apresentaram um potencial protetor contra o aumento da atividade da MPO e liberação das citocinas pró-inflamatórias IL-1? e TNF-?. No entanto, as formulações não forneceram proteção contra a depleção do antioxidante endógeno GSH e, apesar de possuírem mesmo FPS 15 essas formulações apresentaram diferentes níveis de proteção com relação à redução da atividade da enzima SOD induzida pela radiação UV. Os resultados referentes ao estudo do ESB mostraram que o tratamento das células de melanoma altamente invasivas com o extrato resultou em inibição do crescimento/viabiliade das células associado com a indução de apoptose. As análises revelaram que o ESB resultou em indução da clivagem de PARP e ativação das caspases-3, -7 e -8; aumento da expressão de TNF-R2 e da expressão de TRAIL e do receptor DR4. Além disso, o tratamento das células de melanoma com o extrato ESB aumentou a fosforilação e ativação de IKK, degradação de I?B? e translocação de p65/NF?B para o núcleo. Apesar de ser geralmente aceito que a ativação do NF-?B seja responsável pela resistência à apoptose, neste estudo foi demonstrado que a estimulação da via do NF-?B é necessária pela indução da apoptose mediada pelo extrato ESB. Finalmente, conclui-se que as formulações fotoprotetoras devem ser avaliadas de forma mais profunda, empregando-se diferentes métodos a fim de se garantir formulações mais eficazes tanto contra os danos induzidos tanto pela radiação UVB quanto pela radiação UVA. Além disso, esses estudos identificaram uma atividade anticâncer do extrato ESB que é altamente relevante para a quimioprevenção/quimioterapia contra o câncer de pele tipo melanoma. / Despite several advances in fighting cancer, the incidence of melanoma type skin cancer and the mortality related to this disease have increased. Considering that ultraviolet radiation (UV) is the main causative agent of various skin damages, including skin cancer, it is of great importance to adequately measure the photoprotective properties of sunscreens. Considering the problems caused by the use of sunscreens, researches have been focused towards finding natural products with antioxidant properties as it has been shown that many of these natural agents possess anticarcinogenic and antimutagenic effects. Thus, an objective of this study was to evaluate three marketed photoprotective formulations through biochemical parameters not commonly used, but which reflect the effect of these formulations on the skin\'s natural antioxidant system and also in the inflammatory process induced by UV radiation. These effects were measured in vivo in hairless mice, employing as markers reduced glutathione (GSH), a non-enzymatic antioxidant; superoxide dismutase (SOD), an antioxidant enzyme; myeloperoxidase (MPO) enzyme and IL-1? and TNF-? cytokines. Another important objective of this study was to evaluate the effect of a biotransformed soy extract (BSE) by the A. awamori fungus against 451LU and A375 human melanoma cell strains, highly metastatic, and to study the action mechanisms by which the extract induces cell death by apoptosis in these cells; in addition it was intended to evaluate the potential of this extract for the prevention and treatment of skin cancer. The results demonstrated that regarding the inflammatory process induced by UVB irradiation, it was found that the FPS, although only assessing the erythema, is a good indicator of the level of skin protection, since all formulations showed a protector potential against the increased MPO activity and the release of IL-1? and TNF-? pro-inflammatory cytokines. Nevertheless, the formulations did not provide protection against the depletion of the GSH endogenous antioxidant and, despite having the same nominal SPF (SPF=15), these formulations showed different levels of protection with respect to the reduction of SOD activity induced by UV radiation. The results of the BSE study demonstrated that the treatment of highly invasive melanoma cells with the extract resulted in the cell growth/viability inhibition associated with the induction of apoptosis. The analysis revealed that BSE resulted in induction of PARP cleavage and activation of caspase-3, -7 and -8, increased expression of TNF-R2 and expression of TRAIL and DR4 receptor. Furthermore, the treatment of melanoma cells with BSE extract increased phosphorylation and activation of IKK, degradation of I?B? and translocation of p65/NF?B to the nucleus. Although it is generally accepted that the activation of NF-kB is responsible for resistance to apoptosis, this study demonstrated that the stimulation of NF-?B is required for the induction of apoptosis mediated by BSE extract. Finally, it is concluded that the photoprotective formulations should be more deeply evaluated, using different methods in order to ensure more effective formulations against damages induced both by UVB radiation and UVA radiation. In addition, these studies identified an anticancer activity of the BSE extract that is highly relevant to chemoprevention/chemotherapy against melanoma type skin cancer.

Em decorrência da destruição da camada de ozônio pela poluição, a incidência da radiação ultravioleta sobre a Terra tem aumentado, e consequentemente, o número de casos de câncer de pele tem elevado cada vez mais. Diversos estudos têm demonstrado que os danos causados pela radiação solar à pele são causados frequentemente pela geração de radicais livres e ativação de mediadores do processo inflamatório. Estudos têm concluído que os filtros solares são capazes de penetrarem na pele e agirem como fontes de formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) quando submetidos à radiação ultravioleta, o que leva a uma preocupação de que as moléculas fotoprotetoras podem ser geradoras de EROs ao invés de prevenir a formação dessas espécies pelo bloqueio da radiação solar. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos dos filtros solares 3- benzofenona (3-BZ), octilmetoxicinamato (OMC) e salicilato de octila (OS) na pele de camundongos sem pêlos submetida ou não à radiação UVB. Além disso, a retenção cutânea dos filtros solares foi avaliada in vitro utilizando pele de orelha de porco em células de difusão e in vivo em pele de camundongos sem pêlos. Os resultados de retenção cutânea in vitro demonstraram que a formulação gel creme promoveu maior retenção dos filtros solares na pele em comparação às formulações loção e creme. Além disso, a 3-BZ apresentou a maior retenção na pele quando comparadas as retenções dos filtros solares veiculados na mesma formulação. Todos os filtros solares penetraram na pele de camundongos sem pêlos após 1 hora da aplicação da formulação gel creme, o que garantiu a presença dos filtros solares na derme e epiderme no momento da exposição à radiação UVB. A formulação adicionada dos filtros solares preveniu em 76% a depleção de GSH induzida pela radiação UVB. Entretanto, o tratamento dos animais com a formulação contendo os filtros solares não foi capaz de impedir o aumento das atividades da metaloproteinase-9 e mieloperoxidases induzido pela radiação. Além disso, a utilização da formulação adicionada dos filtros solares em associação à exposição à radiação UVB provocou uma diminuição da atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase presente na pele. Desta forma, considerando os parâmetros avaliados neste estudo, a formulação fotoprotetora parece não proteger a pele contra os danos causados pela radiação UVB quanto deveria. Além disso, estes filtros parecem ser instáveis frente à radiação o que comprometendo assim a eficácia e segurança dos mesmos. / Due to the destruction of the ozone layer by pollution, the incidence of ultraviolet radiation on Earth has enlarged and, consequently, the number of cases of skin cancer has increased even more. Several studies have shown that the damages caused by solar radiation to the skin are usually caused by free radical generation and activation of inflammatory mediators. Several studies have concluded that sunscreens are able to penetrate the skin and act as sources of formation of reactive oxygen species (ROS) under ultraviolet radiation exposition, leading, therefore, to the concern regarding the possibility of sunscreen molecules generate ROS instead of preventing the formation of these species by blocking sunlight. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of benzophenone-3 (3-BZ), octylmethoxycinnamate (OMC) and octyl salicylate (OS) sunscreens in the skin of hairless mice exposed or not to UVB radiation. Furthermore, the sunscreen skin retention was in vitro assessed using pig ear skin in diffusion cells and in vivo assessed using hairless mice. The results demonstrated that the cream gel rendered higher epidermal concentrations of the evaluated filters compared to the lotion and cream formulations. Comparing the skin retention amounts of each filter in the same formulation, 3-BZ showed higher skin retention ability than OMC and OS. In addition, all sunscreens penetrated the skin of hairless mice after 1 hour of the applied gel cream formulation, which guaranteed the presence of sunscreen in the dermis plus epidermis at the time of UVB exposure. The formulation of sunscreens prevented by 76% the GSH depletion induced by UVB radiation. However, the treatment of the animals with the sunscreens loaded-formulation was not able to inhibit the increase of metalloproteinase-9 and myeloperoxidase activities induced by radiation. Furthermore, the use of sunscreens loaded-formulation in combination with UVB radiation exposition caused the decrease in the amounts of the superoxide dismutase antioxidant enzyme present in skin. Thus, considering the parameters evaluated in this study, the sunscreens loaded-formulation does not seem to effectively protect skin against damages caused by UVB radiation as it was supposed to. Moreover, these filters seem to be unstable against the radiation and thus compromising their efficacy and safety.

Macrófagos recuperados de peritôneo de camundongos 48 horas após administração de concanavalina A (Con A) são ativados e possuem um conteúdo maior de mieloperoxidase (MPO) do que macrófagos residentes. Este aumento pode ser observado por immunobloting e pelo aumento da atividade peroxidásica. Esta atividade foi avaliada pela quimiluminescência desencadeada por homogenato de macrófagos e peróxido de hidrogênio, durante a oxidação de luminol e melatonina. Os macrófagos contendo MPO são capazes de gerar ácido hipocloroso quando estimulados com acetato de forbol miristato (PMA). O aumento do conteúdo de MPO em macrófagos é um processo que independe de interferon-γ (IFN-γ), uma vez que camundongos IFN-γ-\"knockout\" têm uma atividade ainda maior que camundongos \"wild type\". O contato entre macrófagos e neutrófilos in vivo, não é necessário para o incremento observado, visto que macrófagos de camundongos tratados com anticorpo anti-granulócitos preservam a atividade peroxidásica. Este achado é uma evidência de que em algumas condições a ativação de macrófagos é acompanhada por um aumento da atividade peroxidásica. Dentre o amplo espectro de ação da MPO, este processo pode ter um papel especial na inflamação. Também é de especial interesse o fato de macrófagos serem capazes de oxidar melatonina, um hormônio com vários efeitos imunomodulatórios. / Macrophages recovered from mice peritoneum 48 after concanavalin-A (Con A) administration are primed and have a higher content of myeloperoxidase (MPO) than resident cells. The increase of MPO is accompanied by an increment in peroxidase activity, evaluated by the chemiluminescence during the oxidation of luminol and melatonin triggered by macrophages homogenates plus hydrogen peroxide. MPO present in macrophages are able to generate hypochlorous acid when macrophages are stimulated with phorbol myristate acetate. Interferon-γ (IFN-γ) does not participate in the process that lead macrophages to become enriched in MPO, since IFN-γ knockout mice have an even higher peroxidase activity compared to the wild type. The contact of macrophages with neutrophil in vivo seems to be not necessary for the observed increment in peroxidase since macrophages recovered from mice treated with antigranulocyte antibody preserves the peroxidase activity. These finding provides evidences that, at least in some conditions, macrophage activation is accompanied by an increment in peroxidase activity. Given the broad spectrum of action of MPO, this process might play a special role in inflammation. Also of special interest is the finding that macrophages are able to oxidize melatonin, a hormone with several immunomodulatory effects.