Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 1997. / Spine title: Ca²⁺ sensitization of smooth muscle. Includes bibliographical references (108-130). Also available online through Digital Dissertations.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2007. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains vii, 114 p. : ill. (some col.). Includes abstract. Includes bibliographical references.

O carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço é uma neoplasia maligna de prognóstico desfavorável e baixa taxa de sobrevida. Entender os processos biológicos envolvidos na carcinogênese poderá ser de extrema importância para o desenvolvimento de novas tecnologias de tratamento e melhora do prognóstico em pacientes acometidos pela doença. A maior causa de insucessos clínicos em termos de terapia e prognóstico em pacientes com câncer é a invasão tecidual e o desenvolvimento de potencial metastático. A migração celular é indispensável para a progressão tumoral e as células apresentam motores moleculares desempenhados especialmente pela família da Miosina II não muscular (MNMII). Codificadas por diferentes genes, existem três isoformas conhecidas em células de mamíferos (MNMIIA, MNMIIB, MNMIIC). As MNMIIs estão envolvidas em funções celulares como migração, adesão e citocinese. Sendo o entendimento da migração, adesão celular e citocinese fatores chave na progressão tumoral, e que o a invasão tecidual e o desenvolvimento de potencial metastático são essenciais na definição do prognóstico dos pacientes, o objetivo deste estudo foi descrever o perfil e exposição à fatores de risco como álcool e fumo dos pacientes diagnosticados com CEC de cabeça e pescoço, graduação histológica, parâmetros clínicos tumorais (TNM), padrão de expressão das isoformas de MNMII (MNMIIA, MNMIIB, MNMIIC) no centro do tumor, zona de invasão e tecido epitelial não neoplásico adjacente ao tumor, relacionando a expressão e localização dessas proteínas com os dados descritos bem como evolução dos pacientes após 5 anos de acompanhamento. De acordo com os resultados sugere-se que a MNMIIB expressa no EA possa indicar o potencial de metástase regional do CEC e a MNMIIC presente na zona de invasão tumoral (ZI) seja um fator predictor de prognóstico ruim da doença. Sendo assim, é possível propor que a avaliação de imunorreatividade da MNMIIB no EA e MNMIIC na ZI seja utilizada na análise das peças operatórias, como complemento à análise morfológica de rotina. / Squamous cell carcinoma (SCC) of the head and neck is a malignant neoplasm of poor prognosis and low survival rate. Understand the biological processes involved in carcinogenesis can be extremely important for the development of new treatment technologies and improved prognosis in patients affected by the disease. The major cause of clinical failure in terms of therapy and prognosis in cancer patients is the development of tissue invasion and metastatic potential. Cell migration is essential for tumor progression and the cells have molecular motors especially formed from non-muscular myosin II family (NMMII). Encoded by different genes, there are three known isoforms in mammalian cells (NMMIIA, NMMIIB, NMMIIC). The NMMIIs are involved in cellular functions such as migration, adhesion, and cytokinesis. As the understanding of migration, cell adhesion and cytokinesis key factors in tumor progression, and that the tissue invasion and metastatic potential for development are essential in defining the prognosis of patients, the objective of this study was to describe the profile and exposure to risk factors such as alcohol and tobacco of patients diagnosed with head and neck SCC, histological grading, tumor clinical parameters (TNM), pattern of expression of isoforms NMMII (NMMIIA, NMMIIB, NMMIIC) in the center of the tumor (CT), tumor invasion zone area and not neoplastic adjacent to the tumor (AE), relating the expression and localization of these proteins with the data described and outcome of patients after 5 years of follow-up. According to the results it is suggested that the NMMIIB expressed in AE may indicate the potential regional metastasis of SCC and NMMIIC present in the tumor invasion zone (IZ) is a predictor factor of poor prognosis of the disease. Therefore, it is possible to propose that immunoreactivity assessment of NMMIIB in EA and NMMIIC in IZ could be used in the analysis of operative parts, as a complement to routine morphological analysis.

xii, 107 p. : ill. (some col.) A print copy of this thesis is available through the UO Libraries. Search the library catalog for the location and call number. / Non-muscle myosin II generates contractile forces for processes such as cytokinesis, motility, and polarity. Contractility requires assembly of myosin molecules into bipolar mini-filaments through electrostatic interactions between coiled-coil tail domains of the heavy chains. Analyses of myosin II from various organisms have revealed "assembly domains" within the C-terminal portion of the tail domain that mediate filament formation. However, it has been unclear precisely how assembly domains interact with one another, or otherwise contribute to tail-tail interactions, to form the bipolar mini-filament structure. To understand tail domain interactions, we first identified a 90-residue region (1849-1940) of the Drosophila non-muscle myosin II tail domain that was necessary and sufficient for filament formation, using salt-dependent solubility and a novel fluorescence energy transfer assay. We identified residues within this "assembly domain" that were critical for filament assembly by analyzing the effect of point mutations. We found that single point mutations in specific positively charged regions completely disrupt filament assembly. Surprisingly, none of the negatively charged regions within the assembly domain are required for assembly. Most of the mutations in positively charged residues that disrupted filament assembly clustered within a 15-residue segment (1880-1894) that appears to form a critical interaction surface. Using this information, along with known geometrical constraints and electrostatic calculations, we constructed a structural model of the bipolar mini-filament. This model features one favored anti-parallel tail overlap and multiple slightly less stable alternative overlaps. The ability of the positive segment to interact with multiple negative regions explains the lack of required negatively charged residues in the assembly domain. To our knowledge, this structural model of the non- muscle myosin II bipolar filament is consistent with all physical observations and provides a framework for understanding the detailed mechanism by which this fundamental cellular structure is generated. This dissertation contains previously published and unpublished co-authored material. / Committee in charge: Tom Stevens, Chairperson, Chemistry; Kenneth Prehoda, Advisor, Chemistry; J. Andrew Berglund, Member, Chemistry; Christopher Doe, Member, Biology; Karen Guillemin, Outside Member, Biology

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Leishmania é responsável por um grupo de parasitoses que podem variar desde lesões auto-limitadas até severa injúria de tecido. Estes protozoários são parasitos obrigatoriamente intracelulares, tendo o macrófago como célula hospedeira. Durante o processo de fagocitose os macrófagos utilizam a maquinaria presente em seu citoesqueleto, a qual compreende a participação de miosinas e actinas, para a formação do fagossoma. Estas proteínas estão envolvidas em processos como citocinese, tráfego intracelular de organelas e vesículas, podendo interferir com a penetração do parasito. Alguns trabalhos vêm sendo realizados visando analisar a expressão, localização e o papel de miosina e de actina em Leishamania. Estudos associados à participação destas proteínas motoras em processo vitais para a biologia do parasito podem auxiliar na compreensão de seu ciclo e permitir a geração de conhecimentos que apontem novos alvos para intervenções terapêuticas. Uma vez que a miosina é necessária no transporte intracelular, alguns estudos tentam analisar a expressão e a localização intracelular de miosinas na Leishmania. Estudos mostram a presença de atividades cinásicas do tipo CK2 em diversos tripanossomatídeos, ligadas ao crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos. Desta maneira, como objetivo desta tese temos o estudo da participação das miosinas, actina e CK2 na infectividade da Leishmania braziliensis. Além disso, investigamos a influência destas proteínas na produção de citocinas pelos macrófagos e em sua atividade microbicida. Lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de, pelo menos, 50% no crescimento de L. braziliensis. A CK2 secretada pelo parasito foi purificada de seu sobrenadante através de coluna de HPLC e a fração 44 mostrou ser a fração correspondente a esta enzima. A lipoxina e o TBB promoveram a inibição da atividade desta enzima ao contrário da latrunculina que forneceu aumento dessa atividade. O pré-tratamento dos parasitos ou dos macrófagos com lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de cerca de 50% no índice de associação entre Leishmania e macrófagos não-ativados ou ativados por LPS e IFN-γ. Latrunculina e TBB aumentaram a produção de NO em macrófagos não ativados e não infectados enquanto que em macrófagos ativados à exceção do TBB, todas as drogas diminuíram a produção de NO. A liberação de IL-10 foi diminuída após tratamento com todas as drogas em macrófagos não ativados em ausência de promastigotas e ativados em presença do parasito. Para a produção de TNF-α há uma redução significativa em macrófagos ativados não infectados tratados com latrunculina, nocodazol e TBB. Quando ativados e infectados, os macrófagos tratados com lipoxina tiveram a produção dessa citocina aumentada, ao contrário do TBB em que houve redução. Quando avaliamos a integridade da actina verificamos que todos os compostos foram capazes de influenciar a distribuição dessa proteína, levando a uma redução no índice de associação. Ao transfectarmos a cauda da miosina Va fusionada a GFP nos macrófagos observamos que houve uma diminuição de 94% no índice de associação. Nossos dados confirmam a importância da CK2, actina e miosina Va no processo de interação parasito- macrófago. / The members of the genus Leishmania are responsible for a group of parasitic diseases that vary from self-limited lesions to severe tissue injury. These parasites are obligatory intracellular protozoa that use human macrophages as hosts. Their entry into macrophages occurs through phagocytosis that involves the cytoskeleton, comprised of actin and myosin, to form the phagosomes. Actin and myosin are also involved in other cellular processes including cytokinesis, intracellular trafficking of organelles and vesicles, which may interfere with parasite entry. Previous studies have analyzed the expression, localization and role of both actin and myosin in Leishmania. Their participation in various processes vital to the biology of the parasite suggests new targets for therapeutic intervention. Since myosin is required for intracellular transport, attempts have been made to examine the intracellular localization and expression of Leishmania myosin. Studies have shown the presence of kinase activity of CK2 in various trypanosomes linked to cell growth, morphology and infectivity of macrophages by promastigotes. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the role of myosin, actin and CK2 for infectivity of Leishmania brasiliensis. In addition, the influence of these proteins in cytokine production and microbiocidal activity in human macrophages was investigated. Drug-based inhibition using lipoxin, latrunculin, nocodozole and TBB caused at least a 50% decrease in growth of L. brasiliensis. The CK2 secreted by the parasite was purified from the supernatant of cultures by HPLC and fraction 44 was determined to correspond to this protein. Lipoxin and TBB were shown to inhibit CK2 activity, contrary to latrunculin that increased its activity. Pretreatment of parasites or macrophages with either lipoxin, latrunculin, nocodozole or TBB lead to a ~50% decrease in the association index between L. brasiliensis and macrphages, with or without preactivation with LPS and INF-γ. Latrunculin and TBB increased the NO in non-activated macrophages and parasites did not infect activated macrophages treated with latrunculin. The other drugs all decreased the production of NO. The release of IL-10 was decreased after treatment with all drugs in non-activated macrophages in the presence of parasites and in activated macrophages in the presence of parasites. For the production of TNF-α, there was a significant decrease in activated macrophages by latrunculin, nocodozole and TBB. When macrophages were activated and infected, treatment with lipoxin showed an increase in the production of this cytokine, opposite to the reduction observed with TBB. When evaluating the integrity of actin, all compounds were determined to influence the organization of actin leading to a decrease in the association index. The transfection of the tail of myosin Va fused to eGFP into macrophages was observed to decrease the association index by 94%. The data confirm the importance of CK2, actin and myosin Va in the process of interactions between parasites and macrophages.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T19:32:57Z : No. of bitstreams: 1 lima_arr_me_botfm.pdf: 825853 bytes, checksum: 593e370c7aa688abb20c1b7dda04672a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Estudos clínicos e experimentais têm sugerido que anormalidades da musculatura esquelética podem colaborar para a ocorrência precoce de dispnéia e fadiga em pacientes com insuficiência cardíaca crônica. Em músculos periféricos e respiratórios, frequentemente observa-se modificação na composição das cadeias pesadas da miosina (MyHC) na insuficiência cardíaca. Os mecanismos e vias intracelulares de sinalização responsáveis pela alteração das MyHCs ainda não estão completamente definidos. Na insuficiência cardíaca direita induzida por monocrotalina, foi verificado que a expressão dos fatores de regulação miogênica está associada a alterações no fenótipo das MyHC. Recentemente, foi verificado que o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) pode modular a expressão de proteínas miofibrilares. Não identificamos estudos que avaliaram o papel dos fatores de regulação miogênica e a influência do TNF-α na composição das MyHCs no músculo diafragma durante a insuficiência cardíaca. O objetivo deste estudo é determinar se modificações nas isoformas das MyHCs são selacionadas a alterações na expressão gênica dos fatores de regulação miogênica no músculo diafragma de ratos com infarto do miocárdio, com e sem insuficiência cardíaca. Adicionalmente, verificamos se as concentrações séricas de TNF-α e de IL-6 estão relacionadas a alterações das MyHCs e da expressão gênica dos fatores de regulação miogênica. Insuficiência cardíaca foi induzida pro infarto do miocárdio. Seis meses após a cirurgia, foram constituídos três grupos de animais: Sham (n=10), IM/IC- (animais infartados com disfunção ventricular e sem insuficiência cardíaca, n=10) e IM/IC+ (animais infartados com insuficiência cardíaca, n=10). As estruturas cardíacas e a função ventricular foram avaliadas por ecocardiograma... / Several clinial and experimental studies have suggested that skeletal muscle abnormalities can contribute to early fatigue and dyspnea in heart failure patients. Changes of myosin heavy chain (MyHC) isoforms have been frequently observed in peripheral and respiratory muscles during heart failure. Pathophysiological mechanisms and intracellular signaling pathways involved on MyHCs alterations are not completely defined. In monocrotaline-induced right heart failure, it was observed that the expression of myogenic regulatory factors is associated with MyHCs phenotype changes. Tumoral necrosis factor-alpha (TNF-α) has been recently described to modulate skeletal myofibril proteins. We did not find studies evaluating the influence of myogenic regulatory factors and TNF-α serum concentration on diaphragm MyHC isoforms during heart failure. In this study we tested the hypothesis that diaphragm MyHC isoforms changes are related to myogenic regulatory factors gene expression in chronic heart failure. Additionally, we measured TNF-α and interleukin-6 serum levels to examine their correlation with both MyHC isoforms and myogenic regulatory factors gene expression. A coronary ligation nodel was employed to induce heart failure. Six months after the surgical procedure, three groups of rats were studied: Sham (n=10), infarcted rats without heart failure (MI/HF-, n=10), and infarcted rats with heart failure (MI/HF+, n=10). Cardiac structures and ventricular function were assessed by transthoracic echocardiogram. MyHC isoforms were analyzed by protein electrophoresis. Muscle fiber cross-sectional area was measured in hematoxilin-eosin stained sections and in sections submitted to NADH-TR reaction. Myogenic regulatory factors miogenin, MyoD, and MRF4 gene expression was evaluated by real time RT-PCR; TNF-α and interleukin-6 serum levels werre quantified by... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by CRUZ ELENA ENRÍQUEZ VALENCIA null (crucita01@hotmail.com) on 2016-07-22T16:18:25Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 1054537 bytes, checksum: 7dec2790aa8a6f7dc9e2010c1e059d9f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-28T15:54:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 enriquezvalencia_ce_dr_jabo.pdf: 1054537 bytes, checksum: 7dec2790aa8a6f7dc9e2010c1e059d9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T15:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 enriquezvalencia_ce_dr_jabo.pdf: 1054537 bytes, checksum: 7dec2790aa8a6f7dc9e2010c1e059d9f (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / Pró-Reitoria de Extensão Universitária (PROEX UNESP) / Com o intuito de estudar o potencial de aplicação de genes candidatos na seleção animal para o melhoramento genético da qualidade de carne de bovinos Nelore (Bos indicus), o presente trabalho teve como objetivos principais: (1) Avaliar em bovinos Nelore e cruzamentos Nelore x Bos taurus a ocorrência de associações entre o SNP g.98535683A>G:BTAU7 do gene CAST e as características da carne produzida e (2) quantificar a expressão gênica e proteica da cadeia pesada da miosina em bovinos Nelore com características fenotípicas contrastantes de crescimento e maciez da carne. Para o desenvolvimento do primeiro objetivo, 500 animais foram genotipados para o SNP g.98535683A>G:BTAU7 e fenotipados para força de cisalhamento (FC), índice de fragmentação miofibrilar (MFI), área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e lipídeos totais (LIP). Associação significativa entre o SNP e a maciez da carne foi observada. O genótipo AA apresentou os melhores valores em relação a esta característica. As diferenças encontradas entre os genótipos AA e AG (AA - AG) foram de - 0,19 kg e 5,31 para FC e MFI, respectivamente. O SNP não mostrou associação significativa com AOL, EGS e LIP. Para a execução do segundo objetivo, 90 bovinos Nelore terminados em confinamento foram utilizados. Levando em consideração o peso final ao abate (PF) e a FC dos 90 animais, 24 indivíduos com características contrastantes de peso e maciez da carne foram selecionados e divididos em quatro grupos experimentais (6 animais/grupo). Os grupos corresponderam a animais leves com carne macia (PF = 493,50 kg e FC = 3,76 kg), animais leves com carne dura (PF = 515,66 kg e FC = 8,06 kg), animais pesados com carne macia (PF = 604,33 kg e FC = 3,99) e animais pesados com carne dura (PF = 605,33 kg e FC = 7,83 kg). Em cada grupo, foram avaliadas características fenotípicas como MFI, AOL, EGS, LIP, índice de marmorização (IM), coloração instrumental (L*, a*, b*) e perdas por cozimento (PT). A análise de expressão dos genes MYH7, MYH2 e MYH1 foi feita por PCR em tempo real (RT-qPCR). A caracterização e quantificação proteica das isoformas da MyHC (MyHC-I, MyHC-IIa e MyHC-IIx/d) foi realizada por eletroforese SDS-PAGE. Em todas as análises (qualidade da carne e expressão gênica e proteica) não foi observada interação significativa entre crescimento e maciez da carne. Nas características AOL, EGS, IM e LIP não foi observado efeito significativo do crescimento e a maciez da carne. Porém, os animais pesados apresentaram maiores valores de L*, a* e b* em relação aos animais leves. Na maciez, o grupo de carne macia mostrou maiores valores de L* (32,29 ± 2,78) que o grupo de carne dura (29,10 ± 2,61). Por outro lado, maiores PT foram observadas em animais com carne dura em relação a animais com carne macia. Nos resultados de expressão gênica, o gene MYH7 não mostrou diferenças entre animais leves e pesados. Entretanto, a expressão dos genes MYH2 e MYH1 foi significativamente menor nos animais pesados em relação aos animais leves. Quanto à maciez da carne, a expressão dos três genes não diferiram significativamente entre grupos de carne dura e macia. Na expressão proteica, as três isoformas (MyHC-I, IIa e IIx), não mostraram diferença significativa entre animais leves e pesados. No entanto, as proporções da MyHC-I foram significativamente maiores no grupo de carne dura (16,51 ± 5,47) em relação ao grupo de carne macia (9,12 ± 3,16) e pelo contrário, as proporções da MyHC-IIa foram maiores no grupo de carne macia (73,78 ± 4,45) em relação ao grupo de carne dura (65,45 ± 8,79). A isoforma MyHC-IIx/d não mostrou efeito significativo sobre a maciez. Os resultados deste trabalho mostraram o potencial de aplicação do SNP g.98535683A>G:BTAU7 do gene CAST e da isoforma MyHC-IIa na seleção de animais para o melhoramento da maciez da carne de bovinos Nelore, além de, manifestar o diferencial de expressão dos genes MYH1 e MYH2 entre animais pesados e leves. / In order to study the potential of application of candidate genes in animal selection for breeding meat of Nellore cattle, this work had as main objectives: (1) Assess in Nellore cattle (Bos indicus) and crosses Nellore x Bos taurus the occurrence of associations between the g.98535683A>G:BTAU7 SNP in the CAST gene and traits of the meat produced and (2) quantify the gene and protein expression of myosin heavy chain in Nellore cattle with contrasting phenotypic traits of growth and meat tenderness. For the development of first objective, 500 animals were genotyped for the g.98535683A>G:BTAU7 SNP and phenotyped for shear force (SF), myofibrillar fragmentation index (MFI), ribeye area (RA), backfat thickness (BT) and total lipids (TL). Significant association between the SNP and meat tenderness was observed. The AA genotype showed the best values in relation to this trait. The differences found between genotypes AA and AG (AA - AG) were – 0.19 kg and 5.31 for SF and MFI, respectively. The SNP did not show significant association with RA, BT and TL. For the execution of the second aim, 90 feedlot Nellore cattle were used. Considering the final slaughter weight (FW) and the SF of the 90 animals, 24 individuals with contrasting characteristics of weight and tenderness of meat were selected and divided into four experimental groups (6 animals / group). The groups corresponded to lightweight animals with tender meat (FW = 493.50 kg and SF = 3.76 kg), lightweight animals with tough meat (FW = 515.66 kg and SF = 8.06 kg), heavy animals with tender meat (FW = 604.33 kg and SF = 3.99) and heavy animals with tough meat (FW = 605.33 kg and SF = 7.83 kg). In each group, were evaluated phenotypic characteristics as MFI, RA, BT, TL, marbling índex (MI), instrumental color (L*, a*, b*) and cooking losses (CL). The expression analysis of the MYH7, MYH2 and MYH1 genes was performed by Real-Time PCR (RT-qPCR). The characterization and quantification of the MyHC isoforms (MyHC-I, MyHC-IIa and MyHC-IIx/d) was carried out by SDS-PAGE. In all analyzes (meat quality and gene and protein expression) there was no significant interaction between growth and meat tenderness. In the traits MFI, RA, BT, IM and TL it was not observed significant effect of the growth and the tenderness of meat. However, the heavy animals showed higher values of L*, a* and b* than lightweight animals. In the tenderness, the tender meat group showed higher values of the L* (32.29 ± 2.78) than the tough meat group (29.10 ± 2.61). On the other hand, higher CL were observed in animals with tough meat than animals with tender meat. In the results of gene expression, the MYH7 gene did not show differences between lightweight and heavy animals. However, the expression of the MYH2 and MYH1 genes was significantly lower in heavy animals than lightweight animals. As for meat tenderness, the expression of the three genes did not differ significantly between tough and tender meat groups. In the protein expression, the three isoforms (MHC-I, IIa and IIx), did not show significant difference between lightweight and heavy animals. Nevertheless, the MyHC-I proportions were significantly higher in the tough meat group (16.51 ± 5.47) than tender meat group (9.12 ± 3.16) and on the contrary, the proportions of the MyHC-IIa were higher in tender meat group (73.78 ± 4.45) than tough meat group (65.45 ± 8.79). The MyHC-IIx isoform did not show significant effect on tenderness meat. The results of this work showed the potential of application of the g.98535683A>G:BTAU7 SNP in gene CAST and the MyHC-IIa isoform in animal selection to improve meat tenderness of Nellore cattle, in addition, it showed the differential expression of MYH1 and MYH2 genes between heavy and lightweight animals.

Resumo: Estudos clínicos e experimentais têm sugerido que anormalidades da musculatura esquelética podem colaborar para a ocorrência precoce de dispnéia e fadiga em pacientes com insuficiência cardíaca crônica. Em músculos periféricos e respiratórios, frequentemente observa-se modificação na composição das cadeias pesadas da miosina (MyHC) na insuficiência cardíaca. Os mecanismos e vias intracelulares de sinalização responsáveis pela alteração das MyHCs ainda não estão completamente definidos. Na insuficiência cardíaca direita induzida por monocrotalina, foi verificado que a expressão dos fatores de regulação miogênica está associada a alterações no fenótipo das MyHC. Recentemente, foi verificado que o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) pode modular a expressão de proteínas miofibrilares. Não identificamos estudos que avaliaram o papel dos fatores de regulação miogênica e a influência do TNF-α na composição das MyHCs no músculo diafragma durante a insuficiência cardíaca. O objetivo deste estudo é determinar se modificações nas isoformas das MyHCs são selacionadas a alterações na expressão gênica dos fatores de regulação miogênica no músculo diafragma de ratos com infarto do miocárdio, com e sem insuficiência cardíaca. Adicionalmente, verificamos se as concentrações séricas de TNF-α e de IL-6 estão relacionadas a alterações das MyHCs e da expressão gênica dos fatores de regulação miogênica. Insuficiência cardíaca foi induzida pro infarto do miocárdio. Seis meses após a cirurgia, foram constituídos três grupos de animais: Sham (n=10), IM/IC- (animais infartados com disfunção ventricular e sem insuficiência cardíaca, n=10) e IM/IC+ (animais infartados com insuficiência cardíaca, n=10). As estruturas cardíacas e a função ventricular foram avaliadas por ecocardiograma... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Several clinial and experimental studies have suggested that skeletal muscle abnormalities can contribute to early fatigue and dyspnea in heart failure patients. Changes of myosin heavy chain (MyHC) isoforms have been frequently observed in peripheral and respiratory muscles during heart failure. Pathophysiological mechanisms and intracellular signaling pathways involved on MyHCs alterations are not completely defined. In monocrotaline-induced right heart failure, it was observed that the expression of myogenic regulatory factors is associated with MyHCs phenotype changes. Tumoral necrosis factor-alpha (TNF-α) has been recently described to modulate skeletal myofibril proteins. We did not find studies evaluating the influence of myogenic regulatory factors and TNF-α serum concentration on diaphragm MyHC isoforms during heart failure. In this study we tested the hypothesis that diaphragm MyHC isoforms changes are related to myogenic regulatory factors gene expression in chronic heart failure. Additionally, we measured TNF-α and interleukin-6 serum levels to examine their correlation with both MyHC isoforms and myogenic regulatory factors gene expression. A coronary ligation nodel was employed to induce heart failure. Six months after the surgical procedure, three groups of rats were studied: Sham (n=10), infarcted rats without heart failure (MI/HF-, n=10), and infarcted rats with heart failure (MI/HF+, n=10). Cardiac structures and ventricular function were assessed by transthoracic echocardiogram. MyHC isoforms were analyzed by protein electrophoresis. Muscle fiber cross-sectional area was measured in hematoxilin-eosin stained sections and in sections submitted to NADH-TR reaction. Myogenic regulatory factors miogenin, MyoD, and MRF4 gene expression was evaluated by real time RT-PCR; TNF-α and interleukin-6 serum levels werre quantified by... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Marina Politi Okoshi / Coorientador: Katashi Okoshi / Banca: Márcia Koike / Banca: Paula Schmidt Azevedo Gaiolla / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Leishmania é responsável por um grupo de parasitoses que podem variar desde lesões auto-limitadas até severa injúria de tecido. Estes protozoários são parasitos obrigatoriamente intracelulares, tendo o macrófago como célula hospedeira. Durante o processo de fagocitose os macrófagos utilizam a maquinaria presente em seu citoesqueleto, a qual compreende a participação de miosinas e actinas, para a formação do fagossoma. Estas proteínas estão envolvidas em processos como citocinese, tráfego intracelular de organelas e vesículas, podendo interferir com a penetração do parasito. Alguns trabalhos vêm sendo realizados visando analisar a expressão, localização e o papel de miosina e de actina em Leishamania. Estudos associados à participação destas proteínas motoras em processo vitais para a biologia do parasito podem auxiliar na compreensão de seu ciclo e permitir a geração de conhecimentos que apontem novos alvos para intervenções terapêuticas. Uma vez que a miosina é necessária no transporte intracelular, alguns estudos tentam analisar a expressão e a localização intracelular de miosinas na Leishmania. Estudos mostram a presença de atividades cinásicas do tipo CK2 em diversos tripanossomatídeos, ligadas ao crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos. Desta maneira, como objetivo desta tese temos o estudo da participação das miosinas, actina e CK2 na infectividade da Leishmania braziliensis. Além disso, investigamos a influência destas proteínas na produção de citocinas pelos macrófagos e em sua atividade microbicida. Lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de, pelo menos, 50% no crescimento de L. braziliensis. A CK2 secretada pelo parasito foi purificada de seu sobrenadante através de coluna de HPLC e a fração 44 mostrou ser a fração correspondente a esta enzima. A lipoxina e o TBB promoveram a inibição da atividade desta enzima ao contrário da latrunculina que forneceu aumento dessa atividade. O pré-tratamento dos parasitos ou dos macrófagos com lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de cerca de 50% no índice de associação entre Leishmania e macrófagos não-ativados ou ativados por LPS e IFN-γ. Latrunculina e TBB aumentaram a produção de NO em macrófagos não ativados e não infectados enquanto que em macrófagos ativados à exceção do TBB, todas as drogas diminuíram a produção de NO. A liberação de IL-10 foi diminuída após tratamento com todas as drogas em macrófagos não ativados em ausência de promastigotas e ativados em presença do parasito. Para a produção de TNF-α há uma redução significativa em macrófagos ativados não infectados tratados com latrunculina, nocodazol e TBB. Quando ativados e infectados, os macrófagos tratados com lipoxina tiveram a produção dessa citocina aumentada, ao contrário do TBB em que houve redução. Quando avaliamos a integridade da actina verificamos que todos os compostos foram capazes de influenciar a distribuição dessa proteína, levando a uma redução no índice de associação. Ao transfectarmos a cauda da miosina Va fusionada a GFP nos macrófagos observamos que houve uma diminuição de 94% no índice de associação. Nossos dados confirmam a importância da CK2, actina e miosina Va no processo de interação parasito- macrófago. / The members of the genus Leishmania are responsible for a group of parasitic diseases that vary from self-limited lesions to severe tissue injury. These parasites are obligatory intracellular protozoa that use human macrophages as hosts. Their entry into macrophages occurs through phagocytosis that involves the cytoskeleton, comprised of actin and myosin, to form the phagosomes. Actin and myosin are also involved in other cellular processes including cytokinesis, intracellular trafficking of organelles and vesicles, which may interfere with parasite entry. Previous studies have analyzed the expression, localization and role of both actin and myosin in Leishmania. Their participation in various processes vital to the biology of the parasite suggests new targets for therapeutic intervention. Since myosin is required for intracellular transport, attempts have been made to examine the intracellular localization and expression of Leishmania myosin. Studies have shown the presence of kinase activity of CK2 in various trypanosomes linked to cell growth, morphology and infectivity of macrophages by promastigotes. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the role of myosin, actin and CK2 for infectivity of Leishmania brasiliensis. In addition, the influence of these proteins in cytokine production and microbiocidal activity in human macrophages was investigated. Drug-based inhibition using lipoxin, latrunculin, nocodozole and TBB caused at least a 50% decrease in growth of L. brasiliensis. The CK2 secreted by the parasite was purified from the supernatant of cultures by HPLC and fraction 44 was determined to correspond to this protein. Lipoxin and TBB were shown to inhibit CK2 activity, contrary to latrunculin that increased its activity. Pretreatment of parasites or macrophages with either lipoxin, latrunculin, nocodozole or TBB lead to a ~50% decrease in the association index between L. brasiliensis and macrphages, with or without preactivation with LPS and INF-γ. Latrunculin and TBB increased the NO in non-activated macrophages and parasites did not infect activated macrophages treated with latrunculin. The other drugs all decreased the production of NO. The release of IL-10 was decreased after treatment with all drugs in non-activated macrophages in the presence of parasites and in activated macrophages in the presence of parasites. For the production of TNF-α, there was a significant decrease in activated macrophages by latrunculin, nocodozole and TBB. When macrophages were activated and infected, treatment with lipoxin showed an increase in the production of this cytokine, opposite to the reduction observed with TBB. When evaluating the integrity of actin, all compounds were determined to influence the organization of actin leading to a decrease in the association index. The transfection of the tail of myosin Va fused to eGFP into macrophages was observed to decrease the association index by 94%. The data confirm the importance of CK2, actin and myosin Va in the process of interactions between parasites and macrophages.

O carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço é uma neoplasia maligna de prognóstico desfavorável e baixa taxa de sobrevida. Entender os processos biológicos envolvidos na carcinogênese poderá ser de extrema importância para o desenvolvimento de novas tecnologias de tratamento e melhora do prognóstico em pacientes acometidos pela doença. A maior causa de insucessos clínicos em termos de terapia e prognóstico em pacientes com câncer é a invasão tecidual e o desenvolvimento de potencial metastático. A migração celular é indispensável para a progressão tumoral e as células apresentam motores moleculares desempenhados especialmente pela família da Miosina II não muscular (MNMII). Codificadas por diferentes genes, existem três isoformas conhecidas em células de mamíferos (MNMIIA, MNMIIB, MNMIIC). As MNMIIs estão envolvidas em funções celulares como migração, adesão e citocinese. Sendo o entendimento da migração, adesão celular e citocinese fatores chave na progressão tumoral, e que o a invasão tecidual e o desenvolvimento de potencial metastático são essenciais na definição do prognóstico dos pacientes, o objetivo deste estudo foi descrever o perfil e exposição à fatores de risco como álcool e fumo dos pacientes diagnosticados com CEC de cabeça e pescoço, graduação histológica, parâmetros clínicos tumorais (TNM), padrão de expressão das isoformas de MNMII (MNMIIA, MNMIIB, MNMIIC) no centro do tumor, zona de invasão e tecido epitelial não neoplásico adjacente ao tumor, relacionando a expressão e localização dessas proteínas com os dados descritos bem como evolução dos pacientes após 5 anos de acompanhamento. De acordo com os resultados sugere-se que a MNMIIB expressa no EA possa indicar o potencial de metástase regional do CEC e a MNMIIC presente na zona de invasão tumoral (ZI) seja um fator predictor de prognóstico ruim da doença. Sendo assim, é possível propor que a avaliação de imunorreatividade da MNMIIB no EA e MNMIIC na ZI seja utilizada na análise das peças operatórias, como complemento à análise morfológica de rotina. / Squamous cell carcinoma (SCC) of the head and neck is a malignant neoplasm of poor prognosis and low survival rate. Understand the biological processes involved in carcinogenesis can be extremely important for the development of new treatment technologies and improved prognosis in patients affected by the disease. The major cause of clinical failure in terms of therapy and prognosis in cancer patients is the development of tissue invasion and metastatic potential. Cell migration is essential for tumor progression and the cells have molecular motors especially formed from non-muscular myosin II family (NMMII). Encoded by different genes, there are three known isoforms in mammalian cells (NMMIIA, NMMIIB, NMMIIC). The NMMIIs are involved in cellular functions such as migration, adhesion, and cytokinesis. As the understanding of migration, cell adhesion and cytokinesis key factors in tumor progression, and that the tissue invasion and metastatic potential for development are essential in defining the prognosis of patients, the objective of this study was to describe the profile and exposure to risk factors such as alcohol and tobacco of patients diagnosed with head and neck SCC, histological grading, tumor clinical parameters (TNM), pattern of expression of isoforms NMMII (NMMIIA, NMMIIB, NMMIIC) in the center of the tumor (CT), tumor invasion zone area and not neoplastic adjacent to the tumor (AE), relating the expression and localization of these proteins with the data described and outcome of patients after 5 years of follow-up. According to the results it is suggested that the NMMIIB expressed in AE may indicate the potential regional metastasis of SCC and NMMIIC present in the tumor invasion zone (IZ) is a predictor factor of poor prognosis of the disease. Therefore, it is possible to propose that immunoreactivity assessment of NMMIIB in EA and NMMIIC in IZ could be used in the analysis of operative parts, as a complement to routine morphological analysis.