Linfócitos T CD8 e células NK atuam no combate à infecções por bactérias intracelulares, vírus e células tumorais, provocando a morte dessas células por meio da secreção de grânulos citotóxicos. Proteínas RAB GTPase têm se destacado em estudos de tráfego intracelular, porém, são escassos dados sobre o papel destas proteínas em células citóxicas. Um estudo prospectivo de proteômica realizado por nosso grupo identificou a RAB2A, RAB5A, RAB17 e RAB18 em grânulos citotóxicos. Análises mais aprofundadas revelaram que a RAB2A está associada a proteínas como LAMP-1 e LAMP-2, enquanto que RAB5A, RAB17 e RAB18 estavam presentes na mesma linhagem em um contexto não contemplado neste estudo. Desenvolvemos ainda uma abordagem de silenciamento gênico da RAB2A, e por fim, adaptamos uma série de protocolos de simples execução e baixo custo para avaliar funções efetoras de células NK. O conhecimento da maquinaria secretória é fundamental, uma vez que defeitos nas vias de tráfego intracelular constituem a base de um grande número de doenças que desencadeiam quadros fatais. / CD8 T lymphocytes and NK cells fight against infections by intracellular bacteria, viruses and tumor cells by killing those cells through the secretion of cytotoxic granules. RAB GTPase has been highlighted in studies of intracellular trafficking, however there are scarce reports regarding the role of these proteins in cytotoxic cells. A proteomic study performed by our group identified RAB2A, RAB5A, RAB17 and RAB18 in cytotoxic granules. Further analysis revealed that RAB2A is associated with LAMP-1 and LAMP-2, while RAB5A, RAB17 and RAB18 were present in the same cell line, but in a context not included in this study. We also have developed a gene silencing approach for RAB2A and adapted a number of protocols, simple and low-cost, that can be used to evaluate effector functions of natural killer cells The knowledge of secretory machinery involved in the movement cytotoxic granules of cytotoxic cells is critical, since defects in intracellular trafficking pathways constitute the basis for a large number of diseases which trigger death.

There are multiple immune mechanisms identified for persistence of hepatitis B virus (HBV) infection. This thesis considers the vital role that inhibitory receptors play in contributing to impairment of the adaptive immune system in chronic hepatitis B (CHB), and the potential role they play in the innate immune system, focusing on the inhibitory receptor leucocyte-associated immunoglobulin-like receptor (LAIR)-1. The unique aspect of this work is that for the first time LAIR-1 expression has been investigated on natural killer (NK) cells in CHB. Our striking findings of increased LAIR-1 expression on peripheral NK cells in CHB and an inverse correlation between expression and effector function suggest this inhibitory receptor could have a potential role in exhaustion of NK cells in CHB. We therefore additionally explored the expression of LAIR-1 on circulating NK cells from patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). The particular relevance of LAIR-1 to liver disease is that one of its major ligands is collagen. We demonstrated a downregulation of LAIR-1 expression on intrahepatic NK cells, which we postulate might occur following repetitive engagement with abundant collagen within the liver. In line with this, intrahepatic NK cells with a liver-resident (CXCR6+) phenotype had even lower LAIR-1 expression than liver infiltrating (non-resident, CXCR6-) NK cells. Furthermore, preliminary experiments display attenuation of the cytotoxic degranulation capacity (CD107a) by circulating NK cells from CHB patients upon exposure to plate-bound collagen. We demonstrate differential expression of LAIR-1 on NK cells in viral hepatitis, HCC and NAFLD and between peripheral and intrahepatic NK cells. Preliminary experiments demonstrate a role in inhibiting NK cell function suggesting this as a novel therapeutic target to harness the capacity of NK cells to control chronic infection and cancer.

Natural killer (NK) cells are non-specific killer cells of the innate immune system that eliminate target cells based on discrimination between self and non-self. Activation is carefully regulated through integration of signals received through both activating and inhibitory receptors. During the course of a herpes simplex virus type-1 (HSV-1) infection, NK cells can influence host susceptibility to infection with severe infections occurring in individuals with genetic defects in the NK cell response. In response to HSV infection, NK cells are recruited to the inflammatory tissue where ensuing reciprocal interactions with accessory cells and proinflammatory cytokines induce NK cell activation, cytolytic activity, and cytokine production, contributing to innate immune response and ultimately influencing the adaptive immune response. The objective of this study was to elucidate the multiple roles of NK cells during the numerous steps in anti-HSV immune induction. Accordingly, we have demonstrated that NK cells are novel helpers that assist and influence an anti-HSV immune response via the secretion of cytokines that enhance HSV-specific CD8+ T cell effector function and cytokine production. Taken together, data from this study presented the critical importance of NK cells in mounting an essential and efficient anti-HSV immunity. The key findings of our study were: 1. In the absence of NK cells, dendritic cells have decreased capacity to prime HSV-specific T cells. 2. HSV infected NK cells can be directly activated via toll-like receptor (TLR) in a MyD88-dependent mechanism; however, interaction with HSV infected dendritic cells yields optimal NK cell activation and function (CD69 and IFNγ). 3. TRAIL-expressing NK cells eliminate antigen-bearing immature dermal DCs (CD11c+CD8α-DR5+), that migrate to draining lymphoid organs, to facilitate antigen transfer to lymphoid resident CD8α+ DC for T cell cross priming. 4. 'Helpless' CD8+ T cell function, generated in the absence of CD4+ T cells, can be partially restored to wild-type levels by NK cell supplementation. 5. Treatment of NK cells with anti-CD69 antibody results in a heightened NK activated state and augments the adaptive immune response, without increasing NK cell numbers. These findings may contribute to the potential revelation of avenues to manipulate NK cells for anti-viral therapies.

Healthy term pregnancy requires precisely timed coordination of multiple systems, including reproductive, neuroendocrine, immune and cardiovascular. Dynamic maternal alterations occur systemically as well as locally within the reproductive tract. Systemic cardiovascular changes during gestation are relatively conserved in mammals, permitting comparison. These physiological changes are relatively acute and reversible, in contrast to the pathological changes seen during cardiovascular disease development. Gestational hypertensive disorders, such as preeclampsia, are the leading causes of maternal and fetal morbidity and mortality. The pathogenesis of preeclampsia is not fully elucidated, but perturbation of the immune system is a fundamental component. The angiogenic and vascular properties of uterine NK lymphocytes have been well studied in mice and women, but their relationships to gestational blood pressure regulation and cardiovascular adaptations have not been addressed. In non-pregnant women and mice, T cells, but not B cells, have been found to alter cardiovascular functioning. NK cells in humans also possess these capabilities, but no functional studies have been completed. The aim of this thesis was to define the role of NK and T lymphocytes in cardiovascular adaptations during mouse gestation. Using chronic radiotelemetry, histology, post-mortem and other techniques, female inbred mice of differing genotypes that lack specific lymphocyte subsets were compared before and across gestation. In normal, immune competent mice, a five-phase gestational blood pressure profile was found. This dynamic profile corresponded to stages of placental development. In mice with a compound deficit in arterial modification and lymphocytes, no gestational hypertension was observed. To elevate the maternal challenge of pregnancy, studies of pregnant, autoimmune Type 1 Diabetic mice were conducted. Impaired spiral artery remodeling, dysfunctional lymphocytes and growth-restricted fetuses were identified. From mid-gestation, diabetic pregnant mice were hypotensive and bradycardic and showed signs of pre-renal failure (proteinuria and electrolyte imbalances). In pregnant mice lacking T cells, tachycardia was observed despite otherwise normal gestational outcomes. In pregnant mice lacking T cells with impaired NK cells, blood pressure was blunted and tachycardia was observed. These findings support the conclusion that impaired spiral artery remodeling is insufficient to cause gestational hypertension in mice. The data further identify a role for T and NK cells in cardiac function during gestation. / Thesis (Ph.D, Anatomy & Cell Biology) -- Queen's University, 2010-09-01 20:56:15.648

O transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (alo-TCTH) é uma opção de tratamento para uma variedade de doenças neoplásicas e não neoplásicas, principalmente de origem hematológica sendo doença do enxerto-contra-hospedeiro (DECH) a sua principal complicação. As células Natural Killer (NK) são os primeiros linfócitos a se recuperarem após o TCTH. Além da capacidade de promover o efeito enxerto-versus-leucemia (EVL), as células NK do doador parecem capazes de promover a pega do enxerto e de prevenir o desenvolvimento da DECH. As células NK compreendem aproximadamente 10% dos linfócitos do sangue periférico e são caracterizadas fenotipicamente pela expressão do antígeno de superfície CD56 (CD, cluster of differentiation) e pela ausência de CD3 (CD56+CD3-). O subtipo de células NK CD56dim (baixa densidade do antígeno) é naturalmente mais citotóxico que o subtipo CD56bright (alta densidade do antígeno) o qual é caracterizado pela capacidade de produção de citocinas. Com base nisso, o objetivo do trabalho é avaliar a presença de células NK nos dias 7, 14, 21 e 28 após o TCTH alogênico e autólogo, caracterizando sua frequência, seu imunofenótipo e a sua capacidade de produzir fatores de crescimento hematopoético e citocinas relacionadas. / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is an option of treatment for a variety of neoplastic and non-neoplastic diseases and graft-versus-host disease (GVHD) is its main complication. Natural Killer cells (NK) are the first lymphocytes to recover after HSCT. In addition to the ability to promote graft versus leukemia effect (GVL), donor NK cells appear to be capable of promoting engraftment and preventing the development of GVHD. NK cells comprise approximately 10% of peripheral blood lymphocytes and are characterized phenotypically by the expression of the CD56 surface antigen and absence of CD3 (CD56 + CD3-). The CD56dim (low density of antigen) NK cell subtype is naturally more cytotoxic than the CD56bright (high density of antigen) subtype which is characterized by the ability to produce cytokines. Based on this, the objective of the study is to evaluate the presence of NK cells on days 7, 14, 21 and 28 after allogeneic and autologous HSCT, characterizing their frequency, their immunophenotype and their capacity to produce hematopoietic growth factors and related cytokines.

O transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (alo-TCTH) é uma opção de tratamento para uma variedade de doenças neoplásicas e não neoplásicas, principalmente de origem hematológica sendo doença do enxerto-contra-hospedeiro (DECH) a sua principal complicação. As células Natural Killer (NK) são os primeiros linfócitos a se recuperarem após o TCTH. Além da capacidade de promover o efeito enxerto-versus-leucemia (EVL), as células NK do doador parecem capazes de promover a pega do enxerto e de prevenir o desenvolvimento da DECH. As células NK compreendem aproximadamente 10% dos linfócitos do sangue periférico e são caracterizadas fenotipicamente pela expressão do antígeno de superfície CD56 (CD, cluster of differentiation) e pela ausência de CD3 (CD56+CD3-). O subtipo de células NK CD56dim (baixa densidade do antígeno) é naturalmente mais citotóxico que o subtipo CD56bright (alta densidade do antígeno) o qual é caracterizado pela capacidade de produção de citocinas. Com base nisso, o objetivo do trabalho é avaliar a presença de células NK nos dias 7, 14, 21 e 28 após o TCTH alogênico e autólogo, caracterizando sua frequência, seu imunofenótipo e a sua capacidade de produzir fatores de crescimento hematopoético e citocinas relacionadas. / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is an option of treatment for a variety of neoplastic and non-neoplastic diseases and graft-versus-host disease (GVHD) is its main complication. Natural Killer cells (NK) are the first lymphocytes to recover after HSCT. In addition to the ability to promote graft versus leukemia effect (GVL), donor NK cells appear to be capable of promoting engraftment and preventing the development of GVHD. NK cells comprise approximately 10% of peripheral blood lymphocytes and are characterized phenotypically by the expression of the CD56 surface antigen and absence of CD3 (CD56 + CD3-). The CD56dim (low density of antigen) NK cell subtype is naturally more cytotoxic than the CD56bright (high density of antigen) subtype which is characterized by the ability to produce cytokines. Based on this, the objective of the study is to evaluate the presence of NK cells on days 7, 14, 21 and 28 after allogeneic and autologous HSCT, characterizing their frequency, their immunophenotype and their capacity to produce hematopoietic growth factors and related cytokines.

Os C/EBP (CCAAT/enhancer-binding proteins) são uma família de fatores de transcrição implicados numa variedade de processos da hematopoese, regulando tanto a diferenciação terminal como a proliferação celular. Dentre estes, sabe-se que o C/EBP gamma (C/EBPG) está envolvido na maturação funcional de células Natural Killer (NK). Entretanto, os mediadores dessa regulação não são conhecidos. As células NK são linfócitos com funções efetoras de citotoxicidade e de produção de citocinas, dependentes de um equilíbrio dinâmico entre a expressão de receptores ativatórios e inibitórios bem como de receptores de citocinas. As duas funções (citotóxica e secretora), fazem das células NK importantes componentes da hematopoese, capazes de eliminar alvos susceptíveis bem como de recrutar outras células e amplificar a resposta inflamatória. Diante de incompatibilidade entre as células-alvo e células NK efetoras, os efeitos citotóxicos preponderam; enquanto na ausência de incompatibilidade, os efeitos mediados por citocinas sobre as demais células hematopoéticas se sobressaem. Por exemplo, citocinas como IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF e IL-10, produzidas por células NK, são potenciais reguladoras da função das células-tronco hematopoéticas (CTH). Com o objetivo de estudar a regulação das células NK pelo C/EBPG, utilizamos células NK isoladas de animais transgênicos knockout (KO) para o C/ebpg e seus controles para analisar sua expressão gênica e função diferencial, com especial foco nos genes-alvo com potencial para regulação da hematopoese. Visando identificar potenciais genes-alvo do C/EBPG, isolamos células NK deficientes para o C/ebpg e controles, por meio de sorting, e realizamos posterior isolamento do RNA seguido de análise de expressão gênica em larga escala. A validação da expressão diferencial dos genes-alvo do C/ebpg, de interesse para a função secretória das células NK, foi realizada por PCR em Tempo Real para oito genes diferencialmente expressos na análise de expressão gênica em larga escala, a saber: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. Os dados referentes à expressão basal e estimulada com IL-2, destes genes em células NK de animais KO para o C/ebpg e seus controles, revelaram uma tendência ao aumento da expressão de Myd88 nos animais KO quando comparados aos controles. Foram verificados os níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF? and IFN? por meio de citometria de fluxo, utilizando o sobrenadante da cultura de NK de ambos os animais, observando-se que, após a ativação com IL-2, a produção de IFN? mostrou-se diminuída em células NKdeficientes para o C/ebpg em comparação aos controles. Para caracterizar as células NK Cebpg-deficientes, analisamos a sua frequência (células linhagem-/CD3- /NK1.1+) e expressão dos receptores NKG2D, Ly49D e NKG2A, não sendo observadas diferenças numéricas ou de expressão de receptores entre células NK deficientes ou não para o C/ebpg. Os subtipos funcionais destas células foram caracterizados de acordo com a expressão de CD27 e CD11b, que permitem identificar as subpopulações de células NK imaturas secretórias, secretórias, citotóxicas e tolerantes. Os animais KO mostraram maior percentagem de células secretórias e redução percentual e numérica de células citotóxicas quando comparadas às células NK dos controles. Para demonstrar a deficiência funcional realizamos um ensaio de ativação de células. Em concordância, após a coincubação de esplenócitos totais com células YAC-1, o ensaio de detecção do CD107 revelou que as células dos animais KO para o C/ebpg são cinco vezes menos ativadas do que células NK controles. Ademais, foi realizado um ensaio de citotoxicidade por citometria de fluxo utilizando o CTO (Cell Tracker Orange) como sonda fluorescente, o qual se incorpora às células-alvo da linhagem YAC-1. Como resultado, para a razão 10:1 NK: células-alvo, as células NK C/ebpg KO foram menos citotóxicas do que as células NK dos controles. Concluímos que as células NK de animais transgênicos KO para o C/ebpg têm função deficiente, menor potencial citotóxico e expressão de genes e citocinas alteradas em relação aos seus controles. Os mediadores apontados, em especial, o IFN?, são alvos importantes para a regulação da função secretória das células NK. / C/EBP (CCAAT/enhance-binding proteins) are a family of transcription factors involved in a variety of hematopoietic processes, regulating both terminal differentiation and cellular proliferation. Among these, it is known that C/EBP gamma (C/EBPG) is involved in the functional maturation of Natural Killer (NK) cells. However, the mediators of this regulation are unknown. NK cells are lymphocytes with effector functions of cytotoxicity and production of cytokines, both dependent on a dynamic equilibrium between the expression of activating and inhibitory receptors as well as cytokine receptors. The two functions (cytotoxic and secretory) make NK cells important components of hematopoiesis, able to eliminate susceptible targets as well as recruit other cells to amplify inflammatory responses. In face of incompatibility between target cells and NK effector cells, cytotoxic effects predominate; while in the absence of incompatibility, cytokine-mediated effects that influence other hematopoietic cells prevail. For example, cytokines such as IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF and IL-10, produced by NK cells, are potential regulators of hematopoietic stem cells (HSC). With the aim of studying the regulation of NK cells by C/EBPG, we isolated NK cells from transgenic C/ebpg knockout (KO) animals and controls to analyze their differential gene expression and function, with a special focus on hematopoiesis regulation. In order to identify potential C/EBPG target genes, we isolated C/ebpg-deficient and control NK cells by the use of sorting by flow cytometry and isolated RNA for gene expression analysis. Differential expression of C/ebpg target genes was performed by Real-time PCR for eight genes differentially expressed in the microarray analysis: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. When compared to controls, non-activated and IL-2-stimulated C/ebpg KO NK cells presented a tendency to have higher expression of Myd88. Cytokine levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17?, TNF? and IFN?, obtained from NK culture supernatants, were verified by flow cytometry, after IL-2 activation. Among these cytokines, the production of IFN? by C/ebpg-deficient NK cells was found to be reduced. To further characterize NK cells, we analyzed their frequency (Lineage- /CD3-/NK1.1+ cells) and the expression of the receptors NKG2D, Ly49D and NKG2A, and both analyses presented similar expression between control or C/epbg KO NK cells. The functional subtypes of these cells were characterized according to the expression of CD27 and CD11b, which allow the identification of NK subpopulationsas immature secretory, mature secretory, cytotoxic or tolerant. The KO animals showed higher percentage of secretory cells and percentual and numerical reduction of cytotoxic cells when compared to the NK control cells. In agreement, CD107a expression was 5-times lower in C/ebpg KO splenocytes than in control splenocytes after co-incubation with YAC-1 cells. In addition, a cytotoxicity assay by flow cytometry was performed. The fluorescent probe CTO (Cell Tracker Orange) was incorporated to YAC-1 cells, used as target cells. As a result, in the 10:1 NK:target cells ratio, C/ebp KO cells were less cytotoxic than NK control cells. We concluded that C/ebpg-deficient cells are dysfunctional, have a greater secretory potential and an altered expression of genes and cytokines as compared to their controls. The potential mediators revealed by our study, in particular, IFN?, may be important targets for the regulation of NK secretory function.

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lippe_ElianaMaraOliveira_M.pdf: 15998840 bytes, checksum: c90882b20fd79172ca6324e555698016 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o sucesso da implantação e do desenvolvimento embrionário no útero de humanos e roedores decorre de interações íntimas entre as células de origem materna e fetal, com a intermediação de citocinas e mediadores químicos em fino balanço estabelecendo um diálogo entre as diferentes populações celulares da interface materno-fetal. Este diálogo envolve do lado fetal as células trofoblásticas e do lado materno o estroma decidualizado, vasos sanguíneos e células leucocitárias do endométrio, numa complexa rede de sinalizações cujos mecanismos são apenas parcialmente conhecidos. Desequilíbrios neste balanço de sinalizações podem resultar na interrupção da gravidez sendo particularmente intrigante a participação das células natural killer uterinas (uNK) que constituem uma população linfocitária que estão presentes em grande quantidade no ambiente uterino exclusivamente durante a gestação. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão e participação das isoformas das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) como potencial indutor do desequilíbrio da homeostasia do microambiente uterino na interface materno-fetal envolvendo a produção do óxido nítrico (NO). Foram utilizados camundongos no 8° e 10° dia de gestação (dg) normal e grupos de animais cujos embriões foram lesionados mecanicamente por intervenção cirúrgica ou inoculados com lipopolissacarídios (LPS). Amostras uterinas de sítios embrionários foram coletadas nos períodos de 1, 2 e 6 horas pós-lesão mecânica, ou, 6 horas após inoculação com LPS e processados de acordo com as técnicas rotineiras para embebição em parafina, assim como, processados para obtenção de homogeneizados teciduais da região mesometrial destes sítios embrionários. Cortes de parafina foram submetidos à reação citoquímica com a lectina Dolichos biflorus (DBA) e às reações imunocitoquímicas para as isoformas iNOS, eNOS e nNOS e, para IFNa. Foram realizadas SDS-PAGE dos homogeneizados teciduais e Western-blot com os anticorpos anti-iNOS, anti-eNOS e anti-nNOS. A região mesometrial dos sítios embrionários lesionados mecanicamente apresentou hiperemia após 1 hora de lesão que evoluiu para um quadro de hemorragia nos períodos posteriores. No grupo submetido ao tratamento com LPS foi observado um quadro de hiperemia no período de 6 horas. Pela citoquímica com a lectina DBA constataram-se alterações na morfologia das células uNK destes sítios, sendo notória a perda de reatividade no conteúdo dos grânulos lisosomo-secretores. As avaliações imunocitoquímica para iNOS indicaram que as células uNK, as células deciduais e as células trofoblásticas gigantes expressam iNOS constitutivamente na gestação normal, o mesmo ocorrendo com as isoformas eNOS e nNOS. Nos sítios de lesão embrionária, as células uNK apresentam acentuada redução na marcação pela imunocitoquímica para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas, com recuperação parcial após 6 horas. Estas variações não foram constatadas em outras células da interface materno-fetal. A eNOS apresentou marcações constantes nas células uNK e nas células musculares lisas, sem variações nos grupos experimentais de lesão embrionária. Pelo Western-blot foi constatada uma redução signficativa para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas pós-lesão mecânica. Estes resultados demonstraram que as células uNK respondem às alterações do ambiente uterino induzido pela lesão embrionária ou pelo LPS, com rápida mobilização das isoformas iNOS e nNOS possivelmente na produção do NO. O NO liberado por estas células pode ser a causa da alteração da permeabilidade ou lesão vascular da região mesometrial provocando a hiperemia e hemorragia. A mobilização da atividade da iNOS nas células uNK não parece ser dependente do IFN-a. e portanto não ocorre o envolvimento das células dendríticas nesta via de sinalização / Abstract: The successful embryo implantation and development in human and rodents uteri is dependent of intimate interaction between maternal and fetal cells, with intervening of fine balance of cytokines and chemical mediators on cross-talks between cells in the maternal-fetal interface. This dialogue involves the cells of decidualized stroma, blood vessels and leukocytes from endometrium of maternal side and the trophoblast cells from embryo in a complex signaling network which mechanism is only partially understood. Unbalance of these signals could outcome in miscarriage being intriguing the participation of uterine natural killer cells (uNK) that com pose lymphocyte population accumulate in the uterine environment specifically during pregnancy. The aim of this work was to evaluated the participation of nitric oxide synthase (NOS) enzymes isoforms which arise in nitric oxide (NO) production, as potential inducer of unbalance of homeostasis in the uterine environment. It was used normal pregnant mice on 8° and 10° gestational days and groups of animais which embryos were surgically lesioned or inoculated with lipopolyssacharide (LPS). Uterine samples were colleted after 1, 2 and 6 hs of embryo lesion or 6hs after LPS inoculation and processed for conventional paraffin embedding, as so as, for tissue homogenates of mesometrial region from this uterine sites. Paraffin sections were processed for Dolichos biflorus (DBA) lectin cytochemistry and immunocytochemistry for iNOS, eNOS, nNOS and IFN-a. SDS-PAGE and Western blot were performed with tissue homogenates using anti-iNOS, anti-eNOS and antinNOS. The mesometrial region of embryo lesioned uterine sites showed hyperemia after 1 hr lesion and increased to hemorrhage after that. In the LPS treated animais was seen hyperemia after 6hr. The DBA cytochemistry showed morphological changes in the uNK cells found in this embryo lesioned sites being noticeable the lost of reactivity in the secretory-Iysosome granules contents. The immunocytochemical for iNOS pointed out the uNK, decidual and trophoblast cells expressing iNOS constitutively in the normal pregnancy, as did the eNOS and nNOS. In the embryo damaged sites the uNK cells showed remarkable reduction in the iNOS and nNOS labeling after 1 and 2 hr with partial recuperation after 6 hr. These variations were not seen in other cells. The eNOS showed constant labelling on uNK cells and smooth muscle cells without changes in the experimental groups of embryo lesion or treated with LPS. By Western blot, it was noted significant lowering for iNOS and nNOS in the periods of 1and 2 hr after lesion. These results showed acute response of uNK cells against the changes of uterine environment induced by embryo lesion and LPS treatment, with fast mobilization of iNOS and nNOS isoforms possibly in the production of NO. The NO released from these cells could be the cause of changes on vascular permeability or even lesion of blood vessels localized in the mesometrial region wich results in hyperemia and hemorrhage. The iNOS activation of uNK cells does not seem dependent of IFN-a and therefore without commitmentof dendritic cells in this signaling pathway / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T15:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Farias_AlineMacedo_M.pdf: 19526520 bytes, checksum: dc55dc97ad91bfacd185ea4b6bfb7e81 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o sucesso da implantação e desenvolvimento embrionário em animais de placentação do tipo hemocorial requer além da presençafísica do embrião/feto,uma dinâmica de alterações seqüenciais na interface materno-fetal do útero gestante. Tais alterações são mediadas e controladas pelas ações sincronizadas de uma série de fatores de efeito endócrino, parácrino e autócrino, com o comprometimento de diversas células presentes nesta interface. Dentre as peculiaridades do útero gestante, o recrutamento e o acúmulo de células uNK têm sido apontado como de fundamental importância na modulação da homeostase da interface materno-fetal para o desenvolvimento normal da gestação. Por outro lado, a complexidade das múltiplas interações célula-célula e citocinas-células que modulam a interação materno-fetal, dificulta a compreensão plena dos mecanismos envolvendo a participação das células uNK na imunomodulação do útero gestante. Portanto, procuram-se por procedimentos que permitam as análises do comportamento das células uNK em condiçõesexperimentais controladas,assim como, elucidar tanto as vias da ativação, quanto da inibição das atividades moduladorasdestas células na gestação. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer um modelo experimental de cultivo de células uNK avaliando desde a viabilidade das células isoladas do útero de camundongos gestantes e, testando diversas condições para manipulação e manutenção in vitro destas células. Foram aprimorados os procedimentos de isolamento positivo e purificação das células uNK de camundongos pelo método da esfera magnética revestida com lectina DBA. Foram conduzidos testes quanto aos efeitos dos componentes da matriz extracelular -fibronectina, laminina e colágeno I na sobrevida destas células e, quanto aos efeitos isolados e combinados das interleucinas IL-2, IL-15 e GM-CSF e, das quimiocinas MIP-1j3e CXCL10. Para otimização dos procedimentos destes ensaios, foi desenvovido um protocolo de cultivo em micro-spots, visando manipular células em escala mínima (5x103 células) com reprodutibilidade e sensibilidade que permitisse a padronização dos ensaios in vitro. Dentre os componentes da matriz extracelular testados, a fibronectina proporcionou a manutenção de maior número de células viáveis pelo período de até sete dias de cultivo, enquanto a citocina IL-15 promoveu a diferenciação das células uNK notadamente pelo aumento de grânulos citoplasmáticos. A quimiocina MIP-1j3 induziu a migração de células in vitro, enquanto a CXCL10 teve um efeito inibidor desta ação do MIP-1j3. Por outro lado, as análises quantitativas mostraram que a combinação da CXCL10 e IL-15 manteve o maior número de células uNK aderidas ao substrato de fibronectina em períodos prolongados de cultura, alem de promover a diferenciação destas células. A integridade e viabilidade das células uNK pode ser comprovada pela amplificação de transcriptomas isoladas de 5x103 células através do RT-PCR. Porém, as reações imunocitoquímicas com anti-PCNA não demonstraram qualquer atividade proliferativa nas células uNK mantidas nestas condições de cultivo.Estes resultados demonstram a adequação deste protocolo de cultivo em microspot para diversos ensaios in vitro com as células uNK isoladas de camundongos mesmo em pequenas quantidades e, um protocolo inovador para estudos da fisiologia destas células em situações experimentais controladas / Abstract: The success of embryo implantation and development in the animais of hemochorial type placentation requires beside the presence of the embryo/fetus properly,a dynamic sequential changes at the maternal-fetal interface in the pregnant uterus. These changes are mediated and controlled by synchronized actions of many endocrine, paracrine and autocrine factors with commitment of several cells present at this interface. Among the peculiar features of normal pregnant uterus, the uNK cells recruitment and accumulation has been hallmarked as essential to modulate the maternal-fetal interface homeostasis. Otherwise, the complexity of multiple cell-cell and cytokine-cells interactions involved at the maternal-fetal interaction of pregnant uterus, make difficult the fully understanding of mechanisms related to the participation of uNK cells in the immunomodulation of pregnant uterus. Therefore, it is widely expected to establish and experimental procedures that benefit the analysis of uNK cells behavior under controlled condition and those allowing elucidation of both activation and inhibition of modulator activities of these cells. The present work aimed to establish an experimental model of uNK cells culture evaluating since the viability of isolated from pregnant mouse uterus and testing several conditions for in vitro manipulation and maintenance of these cells. There were improved the procedures of positive isolation and purification of mouse uNK cells by OSAlectin coated magnetic-beadmethod. Tests regarding the effects of extracellular matrix components - fibronectin, lamminin and collagen I on surviving of these cells and effects of interleukin IL-2, IL-15 and GM-CSF and, chemokines MIP-1[3and CXCL10 alone or in combination were perfomerd.To optimize the procedures of these in vitro assays, it was set up a protocol of micro-spot culture for manipulation of minimal scale (5.103cells) of cells with reproducibility and sensibility. Among the extracellular matrix components, the fibronectin promoted the maintenance of highest proportion of viable cells during seven days culture, while the cytokine IL15 induced the uNK cell differentiation noticeable by increasing of cytoplasmatic granules. The chemokine MIP-1[3induced the cell migration in vitro, while CXCL-10 inhibited the effect on MIP-1[3.On the other hand, the quantitative analysis showed the combination of CXCL-10 and IL-15 maintained the largest number of uNK cells for longest time adhered on fibronectin-coated cultures, as so as, the differentiation of these cells. However, the PCNA immunocytochemistry did not show any proliferation activity of uNK cells in culture. The integrity and viability of uNK cells in culture was confirmed by RT-PCR of transcriptomes obtained from 5.103 cells. These results confirm the adequacy of micro-spot culture as new insight using small number of uNK cells for in vitro assays and the establishment of required conditions to maintain these cells in primary culture to study their physiology under controlled experimental conditions / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:21:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Degaki_KarinaYumi_M.pdf: 2877669 bytes, checksum: b1e725db393d6287fab125efb8b00e16 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As células natural killer uterinas (uNK) atuam na modulação da interface materno-fetal e homeostasia do útero gestante, sem desencadear a atividade citolítica típica de uma resposta imune inata. Contudo, ao provocar uma lesão cirúrgica no embrião (LCE) ocorrem alterações no comportamento das células uNK de camundongos e possível indução da atividade citolítica. O presente trabalho avaliou a expressão gênica de mediadores relacionados tanto com a ativação, quanto efetores da atividade citotóxica das células uNK no útero gestante de camundongos frente à anomalia provocada pela LCE. Foram avaliadas as expressões dos genes perforina, granzima-A, IFN-y, IL-15, IL-18, TNF-a, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L através do RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) semi-quantitativo, a partir do RNAtotal obtido de homogenados teciduais da região mesometrial (RM) dos sítios uterinos de camundongos no 9º dia de gestação normal e grupos de animais submetidos à LCE nos períodos de 0,5, 1, 2, 6, 12 e 24 horas pós-LCM e, de RNA obtido de células uNK isoladas de animais gestantes normais. Foram investigadas também as diferenças nas expressões dos genes DAP12, IFN-??e TNF-a ?em RNA extraídos de células uNK imaturas e maduras microdissecadas de criocortes da RM pela microscopia de captura a laser (LCM) e avaliadas pelo qRT-PCR (quantitative Real Time-PCR). Os resultados do RT-PCR confirmam a expressão de todos os genes avaliados nos homogenados da RM e nas células uNK isoladas não foram detectadas apenas os genes da IL-15 e IL-2. Pela análise semi-quantitativa dos amplicons do RT-PCR os genes das proteínas citolíticas, granzima-A e perforina, juntamente com citocinas pró-inflamatórias IFN- y ?e TNF-a ?apresentaram aumentos significativas em 1h após a LCE e redução para níveis próximos do animal normal nos períodos após 6h da LCE. O aumento na expressão destes genes relacionado com a resposta imune inata das células NK, sugere uma rápida mudança do comportamento das células uNK em resposta à LCE, cujas ativações podem envolver a expressão do gene DAP12 que também mostra tendências de aumento nos mesmos períodos pós-LCE. Por outro lado, a expressão dos genes IL-15, IL-2, IL-18 e IL-6 relacionada com a migração, proliferação e diferenciação das células uNK não teve uma variação significativa entre as amostras de gestação normal e pós-LCE. Do sistema Fas/FasL, a redução significante do FasL resulta na regulação negativa da indução de morte celular por apoptose das células uNK, podendo prolongar a viabilidade destas células no ambiente uterino alterado pela LCE. Estes resultados comprovam que a LCE induz uma rápida regulação positiva da expressão dos genes relacionados com mecanismos de citotoxicidade da resposta imune inata das células uNK. Pelas análises dos genes DAP12, TNF-??e IFN-y ?através do qRT-PCR do RNA extraído de células uNK isoladas pela LCM identificaram-se diferenças nas expressões destes genes entre as células uNK imaturas e maduras classificadas atualmente por critérios morfológicos. As diferenças de expressões comprovam a ocorrência de subpopulações com heterogenidade funcional não atribuível apenas a subtipos de estágios de diferenciação celular e com possíveis domínios de distribuição específica no ambiente uterino / Abstract: The uterine natural killer cells (uNK) actively modulate the maternal-fetal interface and homeostasis of pregnant uterus, without triggering the typical cytolytic activity of innate immune response. However, experimentally induced embryo lesion in the pregnant mouse uterus, changes the uterine homeostasis with commitment of uNK cell and possible induction of its cytolytic activity. The present work evaluated the gene expression of mediators related either to the activation and effectors molecules of uNK cells cytotoxic activity. It was evaluated the genes of perforin, granzyme-A, IFN-y, IL-15, IL-18, TNF-a, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), using RNA isolated from normal pregnant mice uterus on gestational day (gd) 9 and after 0.5, 1, 2, 6, 12 and 24h of abnormal pregnancy provoked by surgical lesion of the embryo (SLE) and also from RNA obtained from uNK cells isolated from normal pregnant mice. Differences in the DAP12, IFN-??and TNF-a ?genes expressions were also investigated with RNA isolated from immature and mature subtypes of uNK cells dissected from cryosections of mesometrial regions in the laser capture microscope (LCM) and evaluated by quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR). The results of RT-PCR confirmed the expression of all genes evaluated in the uterine tissue homogenates and in the uNK cells were not detected the only expression of IL-15 and IL-2 genes. By semi-quantitative analysis of RT-PCR amplicons, the genes of cytolytic proteins, granzymes-A and perforin all together with pro-inflammatory cytokines IFN-y ?and TNF-a ?showed significant increasing at 1h after SLE and decreasing to the level near of normal pregnancy after 6h of SLE. The increasing expression of these genes related to innate immune response of NK cells suggest the quick changes of uNK cells behavior in response to the SLE, which activation could involve the expression of DAP12 gene that also showed increasing at the same period after SLE. On the other hand, the expression of IL-15, IL-2, IL-18 and IL-6 genes related to the migration, proliferation and differentiation of uNK cells did not showed significant differences among the SLE samples and normal pregnancy. The significant decreasing of FasL after SLE could down regulate the triggering of apoptotic cell death pathway in the uNK cells and therefore, increasing the viability of these cells in the uterine microenvironment affected by SLE. These results prove that SLE induces fast up-regulation genes expression related to the cytotoxic pathway of uNK cells innate immune response ability. Based on analysis of qRT-PCR of DAP12, TNF-a ?and IFN-y ?genes performed with RNA obtained from uNK cells dissected in the LCM, it was identified differences in the expression of these genes between now a days classified as immature and mature forms of uNK cells. These expressions differences attest the occurrence of functionally heterogeneous subpopulations of uNK cells not restricted to the differentiation stages and possible specific distribution domains in the uterine environment / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural