A histopatologia é considerada um dos recursos diagnósticos mais importantes na prática médica e caracteriza-se pelo estudo das alterações estruturais e morfológicas das células e dos tecidos causadas por doenças. Atualmente, o principal método utilizado no diagnóstico histopatológico de imagens microscópicas, obtidas por meio de amostras em exames convencionais, é a avaliação visual do patologista, a qual se baseia na experiência do mesmo. O uso de técnicas de processamento computacional de imagens possibilita a identificação de elementos estruturais e a determinação de características inerentes, subsidiando o estudo da organização estrutural das células e de suas variações patológicas. A utilização de métodos computacionais no auxílio ao diagnóstico visa diminuir a subjetividade do processo de avaliação e classificação realizado pelo médico. Diferentes características dos tecidos podem ser mapeadas por meio de métricas específicas que poderão ser utilizadas em sistemas de reconhecimento de padrões. Dentro desta perspectiva, o objetivo geral deste trabalho inclui a proposta, a implementação e a avaliação de um método para a identificação e a análise de estruturas histológicas, a ser utilizado para a análise de lesões neoplásicas do colo do útero (NICs) a partir de amostras histopatológicas. Este trabalho foi desenvolvido em colaboração com uma equipe de patologistas, especialistas do domínio. As imagens microscópicas digitalizadas foram adquiridas a partir de lâminas previamente fixadas, contendo amostras de biópsias. Para segmentação dos núcleos celulares, foi implementado um pipeline de operadores morfológicos. Métodos de segmentação baseados em cor também foram testados e comparados à abordagem morfológica. Foi proposta e implementada uma abordagem baseada em camadas para representação do tecido, adotando-se a Triangulação de Delaunay (TD) como modelo de grafo de vizinhança. A TD apresenta algumas propriedades particulares que permitem a extração de métricas específicas. Foram utilizados algoritmos de agrupamento e morfologia de grafos, adotando-se critérios de semelhança e relações de adjacência entre os triângulos da rede, a fim de se obter a fronteira entre as camadas histológicas do tecido epitelial de forma automática. As seguintes métricas foram extraídas dos agrupamentos resultantes: grau médio, entropia e taxa de ocupação dos triângulos da rede. Finalmente, foi projetado um classificador estatístico levando-se em consideração os diferentes agrupamentos que poderiam ser obtidos a partir das imagens de treinamento. Valores de acurácia, sensitividade e especificidade foram utilizadas para avaliação dos resultados obtidos. Foi implementada validação cruzada em todos os experimentos realizados e foi utilizado um total de 116 imagens. Primeiro, foi avaliado a acurácia da metodologia proposta na determinação correta da presença de anomalia no tecido, para isto, todas as imagens que apresentavam NICs foram agrupadas em uma mesma classe. A maior taxa de acurácia obtida neste experimento foi de 88%. Em uma segunda etapa, foram realizadas avaliações entre as seguintes classes: Normal e NIC-I; NIC-I e NIC-II, e, NIC-II e NIC-III, obtendo-se taxas de acurácia máximas de 73%, 77% e 86%, respectivamente. Além disso, foi verificada também, a acurácia na discriminação entre os três tipos de NICs e regiões normais, obtendo-se acurácia de 64%. As taxas de ocupação relativas aos agrupamentos representativos das camadas basais e superficiais, foram os atributos que levaram às maiores taxas de acurácia. Os resultados obtidos permitem verificar a adequação do método proposto na representação e análise do processo de evolução das NICs no tecido epitelial do colo uterino. / Histopathology is considered one of the most important diagnostic tools in medical routine and is characterized by the study of structural and morphological changes of the cells in biological tissues caused by diseases. Currently, the visual assessment of the pathologist is the main method used in the histopathological diagnosis of microscopic images obtained from biopsy samples. This diagnosis is usually based on the experience of the pathologist. The use of computational techniques in the processing of these images allows the identification of structural elements and the determination of inherent characteristics, supporting the study of the structural organization of tissues and their pathological changes. Also, the use of computational methods to improve diagnosis aims to reduce the subjectivity of the evaluation made by the physician. Besides, different tissue characteristics can be mapped through specific metrics that can be used in pattern recognition systems. Within this perspective, the overall objective of this work includes the proposal, the implementation and the evaluation of a methodology for the identification and analysis of histological structures. This methodology includes the specification of a method for the analysis of cervical intraepithelial neoplasias (CINs) from histopathological samples. This work was developed in collaboration with a team of pathologists. Microscopic images were acquired from blades previously stained, containing samples of biopsy examinations. For the segmentation of cell nuclei, a pipeline of morphological operators were implemented. Segmentation techniques based on color were also tested and compared to the morphological approach. For the representation of the tissue architecture an approach based on the tissue layers was proposed and implemented adopting the Delaunay Triangulation (DT) as neighborhood graph. The DT has some special properties that allow the extraction of specific metrics. Clustering algorithms and graph morphology were used in order to automatically obtain the boundary between the histological layers of the epithelial tissue. For this purpose, similarity criteria and adjacency relations between the triangles of the network were explored. The following metrics were extracted from the resulting clusters: mean degree, entropy and the occupation rate of the clusters. Finally, a statistical classifier was designed taking into account the different combinations of clusters that could be obtained from the training process. Values of accuracy, sensitivity and specificity were used to evaluate the results. All the experiments were taken in a cross-validation process (5-fold) and a total of 116 images were used. First, it was evaluated the accuracy in determining the correct presence of abnormalities in the tissue. For this, all images presenting CINs were grouped in the same class. The highest accuracy rate obtained for this evaluation was 88%. In a second step, the discrimination between the following classes were analyzed: Normal/CIN 1; CIN 1/CIN 2, and, CIN 2/CIN 3, which represents the histological grading of the CINs. In a similar way, the highest accuracy rates obtained were 73%, 77% and 86%, respectively. In addition, it was also calculated the accuracy rate in discriminating between the four classes analyzed in this work: the three types of CINs and the normal region. In this last case, it was obtained a rate of 64%.The occupation rate for the basal and superficial layers were the attributes that led to the highest accuracy rates. The results obtained shows the adequacy of the proposed method in the representation and classification of the CINs evolution in the cervical epithelial tissue.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:45Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10807.pdf: 786945 bytes, checksum: a640250d88b5bd045dc6f2f53834bd45 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Objetivos: Estudar a expressao imuno-histoquimica de topoisomerase IIƒ¿ e de caspase-3 ativada, marcadores de proliferacao e de apoptose, respectivamente, a deteccao de DNA HPV e a evolucao da lesao cervical em mulheres portadoras de lesao intra-epitelial escamosa de baixo grau (LBG). Metodos: Foram avaliadas 40 mulheres portadoras de LBG e 32 sem neoplasia cervical, diagnosticadas por exame cito-colpo-histopatologico, quanto a imunoexpressao de topoisomerase IIƒ¿ e de caspase-3 ativada e quanto a deteccao de DNA HPV por PCR consensual (GP5+/GP6+) em material de esfregaco cervico-vaginal. Os achados foram relacionados as variaveis clinicas das pacientes e a evolucao clinica das lesoes cervicais em 12 meses. As pacientes assinaram termo de consentimento livre e esclarecido. Resultados: A media percentual de celulas imunomarcadas por topoisomerase foi de 11,71% e 4,13%, no grupo com LBG e controle, respectivamente, com diferenca estatisticamente significante. Observou-se que houve expressao de caspase-3 em 17 (42,5%) e em 5 (15,63%) pacientes com e sem LBG, respectivamente, com diferenca estatisticamente significante. Foi detectado HPV DNA em 65% das pacientes com LBG e em 59,4% das pacientes sem lesao cervical, sem relacao com a expressao de topoisomerase IIƒ¿ ou caspase-3. Na presenca de DNA-HPV, a expressao de topoisomerase IIƒ¿ no grupo com LBG foi significativamente maior do que em fragmentos sem lesao. Nao foi observada diferenca quanto a evolucao da lesao cervical em 12 meses de acordo com a imunoexpressao de topoisomerase IIƒ¿. Com relacao a caspase-3 ativada, a maioria das pacientes com imuno-histoquimica negativa teve regressao da lesao cervical. Conclusoes: A imunoexpressao de topoisomerase IIƒ¿ e de caspase-3 ativada podem ser considerados marcadores de proliferacao e de apoptose em lesao cervical de baixo grau, sem relacao com a presenca de DNA-HPV. / Purpose: To evaluate the correlation between the expression of topoisomerase II alpha, active caspase-3 and infection with human papillomavirus in low-grade cervical intraepithelial lesion and in the normal cervix, and whether they might influence susceptibility to, or evolution of, cervical lesion. Patients and methods: Forty cervical biopsies patients with low-grade cervical intraepithelial lesion and thirty-two with normal cervix were stained by immunohistochemistry for topoisomerase IIá and active caspase-3 and were investigated for the presence of HPV on exfoliated cells by general primer GP5+/6+ PCR amplification of DNA. These findings were correlated with clinicopathological features of the patients including their clinical outcome after twelve months. Subjects provided written informed consent. Results: Low-grade CIN patients as a group had a significantly higher expression of topoisomerase II alpha compared to controls, without correlation to disease outcome at 12 months. Caspase-3 was expressed in 42.5% of CIN patients and in 15.63% without disease, and most of women without caspase-3 receded cervical lesion. HPV DNA testing was positive in 65% of the patients with cervical lesion, and in 59.4% of the control group and was not associated to the expression of topoisomerase IIá or active caspase-3. In the presence of a positive HPV DNA testing, women with cervical lesion had a significantly higher expression of topoisomerase II alpha compared to controls. Conclusion: Topoisomerase II alpha and active caspase-3 might be useful diagnostic and prognostic markers in low-grade cervical lesions, delaying a better follow-up. / CNPq: 134106/2005-9 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:31:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69587.pdf: 2997505 bytes, checksum: dc74916c69c19057bfb89c77256c2717 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Fernandes Figueira. Departamento de Ensino. Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Introdução: O câncer do colo do útero é a 3ª neoplasia mais frequente no Brasil e tem alto potencial de prevenção e de cura. Não conhecemos a frequência de doença invasiva em mulheres com diagnóstico citopatológico de lesão de alto grau não podendo excluir microinvasão (HSIL-micro). Objetivo: Estimar o risco, por meio da razão de prevalências (RP), de lesão pré-invasiva e de lesão invasiva em mulheres com exame citopatológico de HSIL-micro em comparação àquelas com lesão de alto grau (HSIL), bem como sua relação com os achados colposcópicos. Metodologia: Estudo de corte transversal em que mulheres com HSIL-micro encaminhadas para duas unidades de referência foram identificadas na base de dados do laboratório que centralizava esses exames no município do Rio de Janeiro, no período de junho de 2006 a junho de 2012. Para cada mulher com HSIL-micro foram identificadas quatro mulheres com diagnóstico de HSIL recebidas em datas mais próximas de cada uma com HSIL-micro e que preenchessem os critérios de inclusão. Os dados foram obtidos a partir de revisão dos prontuários. Resultados: Foram incluídas 47 pacientes com laudo de HSIL-micro e 188 pacientes com laudo de HSIL. Controlando para idade, mulheres com HSIL-micro apresentaram RP de lesões pré-invasivas e invasivas 1,25 (IC95% 1,10-1,42) vezes maior do que as com HSIL. Para lesão invasiva, a RP foi 3,67 (IC95% 2,30-5,85) vezes maior nas mulheres com HSIL-micro. Não encontramos associação significativa entre a presença de lesões e achados colposcópicos ou possibilidade de visão da Junção escamo-colunar. / Introduction: Cervical cancer is the 3rd most common cancer in Brazil and has a high potential for prevention and cure. We do not know the prevalence of invasive and pre–invasive disease in women with cytological diagnosis of high-grade lesion-can not exclude microinvasion (HSIL-micro). Objective: To estimate the prevalence ratio(PR)of pre-invasive and invasive lesions in women with HSIL-micro Pap smearcompared to those with high-grade lesion (HSIL), as well as their relationship with colposcopic findings. Methods: Cross-sectional study in which women with HSIL-micro and HSIL routed to two reference units were identified in the cytology lab database, from June 2006 to June 2012. For each woman with HSIL-micro, four women with a diagnosis of HSIL who fulfilled the inclusion criteria were identified. Data were obtained from review of medical records. Results: We included 47 patients with report of HSIL -micro and 188 patients with report of HSIL. Controlling for age, women with HSIL-micro presented a PR of pre-invasive and invasive lesions of 1.25 (95% CI 1.10 to 1.42) times greater than those with HSIL. For invasive lesion only, the PR was 3.67 (95%CI 2.30 to 5.85) times greater in women with HSIL micro. We did not find a significant association between the presence of lesions and colposcopic findings or possibility of vision of the squamocolumnar junction .

A história natural do câncer cervical invasivo começa com uma infecção produtiva pelo Papiloma vírus humana (HPV) na camada basal do epitélio. Infecções persistentes por vírus de HPVs de alto risco poderão provocar lesões que eventualmente darão origem ao carcinoma invasivo. Sabe-se que o infiltrado inflamatório pode ter um papel importante na evolução da doença. Neste trabalho, quantificamos e caracterizamos fenotipicamente linfócitos T, macrófagos e neutrófilos nas lesões precursoras assim como no carcinoma invasivo. Além disso, para determinar se existia alguma relação entre as populações foi realizada uma análise de correlação entres as populações descritas. Por outro lado, tentando determinar o efeito sistêmico do tumor avaliou-se a frequência de subtipos de monócitos circulantes e através de ensaios alogênicos foi avaliada a capacidade estimuladora das células dendríticas diferenciadas de monócitos circulantes. Os dados apresentados ajudarão a entender o papel que as células do sistema imune podem ter sobre a progressão da doença. / The natural history of cervical cancer begins with a human papilloma virus (HPV) infection of the cells of the basal layer of the epithelium. Persistent infection by high risk HPVs can originate precancerous lesions that may progress to invasive cancer. It has been established the role of the infiltrated inflammatory cells on the progression of the disease. In this work, the phenotype and the frequency of T lymphocytes, macrophages and neutrophils were characterized both in precursor lesions as in invasive carcinoma. In order to stablish a possible relation between the characterized cells, we made a correlation analysis. On the other hand, trying to determine the systemic effect of the tumor we evaluated the frequency of circulating monocyte subtypes and the capacity of dendritic cells to stimulate allogeneic T cells. The data presented will help to understand the role of the immune system cells on the progression of the disease.

Orientadores: Luiz Carlos Zeferino, Silvia Helena Rabelo dos Santos / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:30:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Westin_MariaCristinadoAmaral_D.pdf: 3122088 bytes, checksum: 3d2afed3690cd3566bbb3fe26bb492a3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Introdução: O carcinoma escamoso do colo uterino é precedido pela neoplasia intraepitelial cervical grau 3 (NIC 3). A invasão tumoral envolve a degradação da matriz extracelular e membrana basal do epitélio por enzimas proteolíticas denominadas metaloproteinases (MMPs). Os inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMPs) também interferem no processo de invasão. Angiogênese é condição indispensável para a progressão tumoral. Objetivo: Analisar a expressão de MMP-2, MMP-9, MMP-14, TIMP-1, TIMP-2 e VEGF-A na NIC 3 e carcinoma do colo uterino. Sujeito e Métodos: Estudo do tipo comparativo observacional constituído de três grupos:- Grupo 1: 55 casos com diagnóstico de NIC 3, Grupo 2: 30 casos com NIC 3 e carcinoma associados e Grupo 3: 46 casos com carcinoma. A expressão protéica foi pesquisada separadamente nas células tumorais e estromais por reação imunoistoquímica. Para estabelecer a porcentagem de células imunopositivas utilizou-se software morfométrico. Análise Estatística: Aplicou-se o Teste T-pareado ou de Mann-Whitney ou Wilcoxon Signed Rank. Resultados: Em todos os grupos, a expressão tumoral de MMP-14 foi maior que a estromal. Inversamente, a expressão de TIMP-2 foi maior nas células estromais que nas tumorais, em cada grupo diagnóstico. A expressão de MMP-9 foi maior nas células estromais que nas tumorais, com exceção do componente invasor do Grupo 2. A expressão estromal de TIMP-1 foi maior que a tumoral no carcinoma e, ao contrário, sua expressão foi maior nas células tumorais da NIC 3. A expressão de VEGF-A foi maior apenas nas células tumorais da NIC 3. Comparando a expressão dos marcadores entre os grupos, foram encontradas as maiores diferenças entre grupos extremos, ou seja, entre NIC 3 e carcinoma. A expressão de MMP-2 nas células estromais foi maior no componente NIC 3 do Grupo 2 que no NIC 3 do Grupo 1. A expressão de VEGF-A nas células estromais do carcinoma foi maior que nas células estromais da NIC 3. Conclusões: Os resultados deste estudo sugerem que a expressão de TIMP-1 aumenta nas células do estroma e diminui nas células tumorais quando a NIC 3 progride para carcinoma invasor. MMP-9 e TIMP-2 tiveram expressão similar na NIC 3 e no carcinoma, o que limita inferências sobre seu papel na progressão neoplásica. O padrão imunoistoquímico da expressão das MMPs, TIMPs e VEGF-A na NIC 3 e no carcinoma invasivo, quando estas lesões estavam associadas, foi semelhante. A expressão do VEGF-A foi maior nas células tumorais do que nas estromais da NIC 3, porém quando esta lesão progride para carcinoma invasivo sua expressão aumenta nas células do estroma e não se altera nas tumorais. A expressão de MMP-14, MMP-2, TIMP-1 e VEGF-A aumentou com a gravidade da neoplasia / Abstract: Introduction: Squamous cell carcinoma of the cervix is preceded by cervical intraepithelial neoplasia grade 3 (CIN 3). Tumor invasion involves degradation of extracellular matrix and epithelium basement membrane by proteolytic enzymes called metalloproteinases (MMPs). Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) are also involved in the invasion process. Angiogenesis is a prerequisite for tumor progression. Objective: To analyze the expression of MMP-2, MMP-9 and MMP-14, TIMP-1, TIMP-2 and VEGF-A in CIN 3 and invasive carcinoma. Subject and Methods: This comparative observational study was consists of three groups: Group 1: 55 cases diagnosed with CIN 3, Group 2: 30 cases with CIN 3 associated with invasive carcinoma and Group 3: 46 cases with invasive carcinoma. Protein expression was investigated separately in tumor and stromal cells by immunohistochemistry and evaluated by the percentage of cells positive for immunostaining using morphometric software. Statistical Analysis: Was performed applying paired t-test or Mann-Whitney or Wilcoxon Signed Rank. Results: In each diagnostic group, expression markers were significantly higher: MMP-14 in tumor cells, and TIMP-2 in stromal cells; also MMP-9 expression was significantly higher in stromal cells, except in invasive component of group 2, and TIMP-1 had significantly higher expression in stromal cells of invasive carcinoma and in tumor cells of CIN 3. VEGF-A expression was significantly higher only in tumor cells CIN 3. Comparing the expression of markers between groups, two by two, we find the greatest differences between the extreme groups, i.e. between invasive carcinoma and CIN 3. The expression of MMP-2 was significantly greater in the stromal component CIN 3 in group 2 than in CIN 3 only. The expression of VEGF-A was significantly higher in the group stromal cell carcinoma when compared to stromal cells CIN 3. Conclusions: The results of this study suggest that the expression of TIMP-1 increases in the stromal cells and decreases in tumor cells when CIN 3 progresses to invasive carcinoma. MMP-9 and TIMP-2 had similar expression in CIN 3 and invasive carcinoma, which limits inferences about its role in neoplastic progression. The immunohistochemical pattern of expression of MMPs, TIMPs and VEGF-A in CIN 3 and invasive carcinoma, as these lesions were associated, was similar. The expression of VEGF-A was higher in tumor cells than in stromal cells in CIN 3, but when the lesion progresses to invasive carcinoma its expression increases in the stromal cells and the tumor cells does not change. The expression of MMP-14, MMP-2, TIMP-1 and VEGF-A was increased with the severity of the neoplasia / Doutorado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Doutora em Ciências da Saúde

Orientador: Júlio César Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T00:35:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paes_ElianaFerreira_M.pdf: 2469476 bytes, checksum: 7fdb355ac120c70d0bffe635016ba6af (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Introdução: O agente etiológico do câncer do colo do útero é um HPV de alto risco (hrHPV) e testes biomoleculares para detecção deste vírus em amostras do colo do útero tendem a ter um papel cada vez mais importante no rastreamento de lesões pré-câncer para o futuro. No momento, estes testes são de alto custo e de execução complexa. Objetivo: desenvolver e padronizar um teste de PCR multiplex marcado com fluorescência para detecção de DNA de hrHPV em amostras obtidas do colo do útero e comparar com um teste de referência. Metodologia: foi realizado um estudo piloto para descrição e padronização de uma metodologia de detecção e genotipagem de HPV, tipo PCR multiplex, com primers desenhados com base na região E7 de seis hrHPV (16, 18, 31, 33, 45 e 52), o teste `E7-HPV¿. Foi seguido um guia internacional para desenvolvimento de novos testes de HPV para rastreamento, que orienta uma avaliação inicial de 50 ou mais amostras de mulheres com NIC2+, comparação com um teste referência validado, e alcançar um índice de concordância kappa de 0,7, com sensibilidade de 90% da sensibilidade do teste referência. O teste referência adotado foi o cobas® HPV Test da Roche Diagnostics, chamado `cobas®¿, que identifica em grupo 12 hrHPV e genotipa os tipos 16 e 18, separadamente. Neste estudo foram utilizadas amostras de 60 pacientes, 55 com citologia ASCH/HSIL, coletadas entre Agosto e Setembro de 2013, que foram avaliadas por cada teste com cálculo da concordância dos resultados pelo índice de kappa e comparação da sensibilidade, com poder estatístico de 90%. Resultados: o teste teve sua descrição e padronização finalizada. Houve alta concordância entre os testes `E7-HPV¿ e cobas® na detecção do HPV 16 com kappa 0,972, com apenas um caso discordante, de paciente com NIC3 com cobas® negativo e com o teste `E7-HPV¿ positivo. Para o HPV18, os resultados dos testes demonstraram concordância total, com índice kappa=1,0. Quando comparadas as detecções dos tipos hrHPV não 16 e 18, seis casos foram positivos para o cobas® e negativos para o teste `E7-HPV¿, podendo ser decorrente da detecção do cobas® de tipos de HPV não contemplados no teste `E7-HPV¿. Ao contrário, o teste `E7-HPV¿ detectou dois hrHPV adicionais, com cobas® negativo (HPV31 e 52). A sensibilidade de detecção de NIC2+ foi igual para os dois testes avaliados. Conclusão: Foi possível desenvolver e padronizar uma técnica de PCR multiplex com metodologia para detecção de seis hrHPV. O desempenho do teste `E7-HPV¿ foi, pelo menos, equivalente ao teste referência (cobas® HPV Test) com kappa=0,972 e 100% da sensibilidade do teste referência na detecção de NIC2+ em pacientes sabidamente com lesões, superando os pré-requisitos necessários. Assim, os resultados satisfatórios do `E7-HPV¿ na primeira fase de avaliação possibilita a continuidade do desenvolvimento do mesmo, visando futura aplicação em maior escala / Abstract: Introduction: the etiologic agent of cervical cancer is a high-risk HPV (hrHPV) and biomolecular tests for detection of this virus in cervical samples tend to have an increasingly important role in screening for precancerous lesions for the future. At present, these tests are expensive and complex procedure. Purpose: to develop and standardize a multiplex PCR test, 'E7-HPV' test, to detect and genotyping of 6 hr-HPV DNA, tested in samples obtained from the cervix and compared with a reference test. Methods: A pilot study was performed to develop and standardize a methodology of the multiplex PCR with primers designed on the basis of six hrHPV E7 region (16, 18, 31, 33, 45 and 52) and labeled with fluorochrome 6-FAM. Viral detection was performed by capillary electrophoresis in automated sequencer. It was followed an international guide to development of new HPV testing for screening, which guides an initial assessment of 50 or more samples from women with CIN2+, and the results compared to a validated reference test to achieve a kappa index of 0.7, and 90% sensitivity of reference sensitivity test. The reference test adopted was the cobas® HPV Test from Roche Diagnostics, called 'cobas®', which identifies 12 hrHPV pooled and genotype HPV 16 and 18 separately. In this study, cervix samples were obtained from 60 women, 55 with ASCH/HSIL cytology, collected between August to September 2013. The samples were evaluated by each test, and a non-inferiority analysis was conducted in relation to the cobas® HPV Test, following international guidelines for the development of new tests with kappa index and sensitivity, with a statistical power of 90%. Results: The methodology of E7-HPV test was described and standardized. The 'E7-HPV' test and cobas® Test had a high concordance rate in HPV16 detection (kappa=0.972), with only one discordant case (CIN3 with negative cobas® and `E7-HPV¿ HPV16 positive) and total concordance in HPV18 detection (kappa=1.0). When comparing the detection of hrHPV not 16/18, six cases were positive for cobas® and negative for 'E7-HPV', maybe due to the detection for cobas® of HPV types not included in the 'E7- HPV ' test. Others three cases were `E7-HPV¿ positive (HPV16, 31 and 52) with negative cobas®. For diagnosis of CIN2 or worse, both tests had the same sensitivity. Conclusion: It was possible to develop and standardize a multiplex PCR methodology for detection and genotyping 6 hrHPV in cervical samples. The performance of 'E7-HPV' test was at least equivalent to the reference test for the detection of CIN2+, fulfilling the clinical validation criteria requirements. Thus, the satisfactory initial results of the 'E7-HPV' test evaluation indicate that the development can be continued, aiming future application on a larger scale / Mestrado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Mestra em Ciências da Saúde

Neste estudo avaliamos o papel do metabolismo do triptofano (Trp) na homeostasia, na vaginose bacteriana e nas lesões cervicais associadas ao HPV. A importância do metabolismo do Trp se deve a sua ação na proliferação de microrganismos e de células do sistema imune. O consumo de triptofano tem sido identificado como uma forma de controlar o crescimento bacteriano limitando a infecção. Por outro lado, a oxidação de Trp produz quinurenina (QUIN), que tem papel chave na tolerância imunológica. A formação de QUIN se dá através das enzimas indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) e triptofano 2,3- dioxigenase (TDO). A mais estudada delas no âmbito das infecções/ imuno escape é a enzima IDO. Mais recentemente, tem-se dado ênfase ao papel da TDO no câncer. Nesta dissertação, o interesse foi avaliar a expressão da IDO no epitélio cervicovaginal de mulheres com vaginose bacteriana e de IDO e TDO em amostras cervicais de mulheres com diferentes graus de lesão cervical associada ao HPV. Foram incluídas 165 mulheres atendidas no CAISM/UNICAMP, as quais foram divididas em dois grupos: grupo caso composto por mulheres com lesão de baixo ou alto grau e carcinoma invasor (n=42) e grupo controle composto por mulheres com citologia oncológica normal, independente de apresentar infecção genital (n=123). IDO foi avaliada por imunocitoquímica em citologia em base líquida e IDO e TDO em biópsias cervicais. Mulheres com vaginose bacteriana apresentaram expressão aumentada de IDO em células escamosas em comparação às mulheres sem vaginose bacteriana (OR=7.41; IC 95%= 2.50 a 21.4; p <0.0001). No epitélio vaginal normal com ou sem infecção por HPV houve uma expressão leve de IDO em células escamosas. Na presença de lesões ou carcinoma, houve um aumento no número de células escamosas displásicas e de leucócitos IDO-positivos; aumento de IDO também pôde ser observada em culturas de pele organotípicas transduzidas com as oncoproteínas E6/ E7 do HPV16. Nas lesões cervicais, assim como visto para a IDO, a TDO esteve expressa em leucócitos, especialmente os infiltrados na região estromal e na parede dos vasos sanguíneos. A expressão basal de IDO no epitélio cervical normal e sua regulação positiva na infecção por HPV e lesões associadas sugerem a participação do metabolismo do Trp nos mecanismos imunossupressores envolvidos na doença. Embora o papel do IDO já tenha sido abordada anteriormente, até onde sabemos esta é a primeira evidência da expressão de TDO no epitélio vaginal, na neoplasia intraepitelial cervical e carcinoma de células escamosas. Ainda, em leucócitos, especialmente aqueles com morfologia típica de polimorfonucleares, parecem ser importantes fontes de IDO na cérvix uterina. / In this study we evaluated the role of tryptophan (Trp) metabolism in cervix homeostasis, bacterial vaginosis and HPV-associated lesions. The importance of Trp metabolism is due to its action on microorganisms and immune cells. Tryptophan consumption has been identified as a way to controlling bacterial growth limiting infection. On the other hand, the oxidation of Trp produces kynurenine (Kyn) which plays a key role in immunological tolerance. The formation of Kyn occurs through the enzymes indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO). IDO is the most studied of them within the context of infections / immune escape. More recently, TDO has also been considered in studies of cancer progression. In this thesis, we were interested in cervicovaginal epithelium IDO expression in women with bacterial vaginosis and of IDO and TDO in cervical samples of women with different degrees of cervical lesion associated with HPV. A total of 165 women attended at CAISM/UNICAMP were divided into two groups: a case group composed of women with low or high grade lesions and invasive carcinoma (n = 42) and a control group composed of women with normal cytology, independent to present genital infection (n =123). IDO was evaluated by immunocytochemistry in liquid-based cytology and IDO and TDO in cervical biopsies. Women with bacterial vaginosis had increased IDO expression in squamous cells compared to women without bacterial vaginosis (OR = 7.41, 95% CI = 2.50- 21.74; p<0.0001). In normal vaginal epithelium with or without HPV infection there was a mild IDO expression in squamous cells. In the presence of cervical intraepithelial lesions or squamous cell carcinoma, there was an increase in the number of IDO-positive dysplastic squamous cells and leukocytes; increase in IDO can also be observed in organotypic skin cultures transduced with HPV-16 E6/E7 oncoproteins. In cervical lesions, as observed for IDO, TDO was expressed in leukocytes, especially infiltrates in the stromal region and in the wall of blood vessels. The basal expression of IDO in the normal cervical epithelium and its positive regulation in HPV infection and associated lesions suggests the participation of Trp metabolism in the immunosuppressive mechanisms involved in the disease. Although some previous data have already considered the role of IDO, as far as we know this is the first evidence of the participation of TDO in the vaginal epithelium, cervical intraepithelial neoplasia and squamous cell carcinoma. In addition, in leukocytes, especially those with a typical polymorphonuclear morphology, appear to be important sources of IDO in the uterine cervix.

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Neste estudo avaliamos o papel do metabolismo do triptofano (Trp) na homeostasia, na vaginose bacteriana e nas lesões cervicais associadas ao HPV. A importância do metabolismo do Trp se deve a sua ação na proliferação de microrganismos e de células do sistema imune. O consumo de triptofano tem sido identificado como uma forma de controlar o crescimento bacteriano limitando a infecção. Por outro lado, a oxidação de Trp produz quinurenina (QUIN), que tem papel chave na tolerância imunológica. A formação de QUIN se dá através das enzimas indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) e triptofano 2,3- dioxigenase (TDO). A mais estudada delas no âmbito das infecções/ imuno escape é a enzima IDO. Mais recentemente, tem-se dado ênfase ao papel da TDO no câncer. Nesta dissertação, o interesse foi avaliar a expressão da IDO no epitélio cervicovaginal de mulheres com vaginose bacteriana e de IDO e TDO em amostras cervicais de mulheres com diferentes graus de lesão cervical associada ao HPV. Foram incluídas 165 mulheres atendidas no CAISM/UNICAMP, as quais foram divididas em dois grupos: grupo caso composto por mulheres com lesão de baixo ou alto grau e carcinoma invasor (n=42) e grupo controle composto por mulheres com citologia oncológica normal, independente de apresentar infecção genital (n=123). IDO foi avaliada por imunocitoquímica em citologia em base líquida e IDO e TDO em biópsias cervicais. Mulheres com vaginose bacteriana apresentaram expressão aumentada de IDO em células escamosas em comparação às mulheres sem vaginose bacteriana (OR=7.41; IC 95%= 2.50 a 21.4; p <0.0001). No epitélio vaginal normal com ou sem infecção por HPV houve uma expressão leve de IDO em células escamosas. Na presença de lesões ou carcinoma, houve um aumento no número de células escamosas displásicas e de leucócitos IDO-positivos; aumento de IDO também pôde ser observada em culturas de pele organotípicas transduzidas com as oncoproteínas E6/ E7 do HPV16. Nas lesões cervicais, assim como visto para a IDO, a TDO esteve expressa em leucócitos, especialmente os infiltrados na região estromal e na parede dos vasos sanguíneos. A expressão basal de IDO no epitélio cervical normal e sua regulação positiva na infecção por HPV e lesões associadas sugerem a participação do metabolismo do Trp nos mecanismos imunossupressores envolvidos na doença. Embora o papel do IDO já tenha sido abordada anteriormente, até onde sabemos esta é a primeira evidência da expressão de TDO no epitélio vaginal, na neoplasia intraepitelial cervical e carcinoma de células escamosas. Ainda, em leucócitos, especialmente aqueles com morfologia típica de polimorfonucleares, parecem ser importantes fontes de IDO na cérvix uterina. / In this study we evaluated the role of tryptophan (Trp) metabolism in cervix homeostasis, bacterial vaginosis and HPV-associated lesions. The importance of Trp metabolism is due to its action on microorganisms and immune cells. Tryptophan consumption has been identified as a way to controlling bacterial growth limiting infection. On the other hand, the oxidation of Trp produces kynurenine (Kyn) which plays a key role in immunological tolerance. The formation of Kyn occurs through the enzymes indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO). IDO is the most studied of them within the context of infections / immune escape. More recently, TDO has also been considered in studies of cancer progression. In this thesis, we were interested in cervicovaginal epithelium IDO expression in women with bacterial vaginosis and of IDO and TDO in cervical samples of women with different degrees of cervical lesion associated with HPV. A total of 165 women attended at CAISM/UNICAMP were divided into two groups: a case group composed of women with low or high grade lesions and invasive carcinoma (n = 42) and a control group composed of women with normal cytology, independent to present genital infection (n =123). IDO was evaluated by immunocytochemistry in liquid-based cytology and IDO and TDO in cervical biopsies. Women with bacterial vaginosis had increased IDO expression in squamous cells compared to women without bacterial vaginosis (OR = 7.41, 95% CI = 2.50- 21.74; p<0.0001). In normal vaginal epithelium with or without HPV infection there was a mild IDO expression in squamous cells. In the presence of cervical intraepithelial lesions or squamous cell carcinoma, there was an increase in the number of IDO-positive dysplastic squamous cells and leukocytes; increase in IDO can also be observed in organotypic skin cultures transduced with HPV-16 E6/E7 oncoproteins. In cervical lesions, as observed for IDO, TDO was expressed in leukocytes, especially infiltrates in the stromal region and in the wall of blood vessels. The basal expression of IDO in the normal cervical epithelium and its positive regulation in HPV infection and associated lesions suggests the participation of Trp metabolism in the immunosuppressive mechanisms involved in the disease. Although some previous data have already considered the role of IDO, as far as we know this is the first evidence of the participation of TDO in the vaginal epithelium, cervical intraepithelial neoplasia and squamous cell carcinoma. In addition, in leukocytes, especially those with a typical polymorphonuclear morphology, appear to be important sources of IDO in the uterine cervix.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-17T21:35:19Z No. of bitstreams: 1 Mario Cezar Saffi Junior.pdf: 600477 bytes, checksum: 389162272a6d7d9eb1d1a097d21a6d9a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T21:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mario Cezar Saffi Junior.pdf: 600477 bytes, checksum: 389162272a6d7d9eb1d1a097d21a6d9a (MD5) Previous issue date: 2015-01-22 / The cervical cancer is the first cancer of the female genital tract in Brazil and HPV is essential factor for carcinogenesis. The Brazilian program tracking proposes conventional cervical cytology as the primary method to detect cervical cancer, despite its low sensitivity. Risk factors associated with the spread of HPV are despised and not rely on a biomolecular tool that can increase the program offered by the Ministry of Health. The aim of this study was to determine whether the risk factors for cervical cancer may contribute to the conventional cervical cytology to increase diagnostic sensitivity and assess whether the mRNA indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) and mRNA CDKN2A / p16 may increase the diagnostic yield of this neoplasm. The logistic regression analysis was based on clinical variables (risk factors), cytological and biomolecular to seek an association with pathological results. The proportion of explained variance (PVE) for each variable studied was calculated by the formula omega, whereas the sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value were calculated by the formulas of Galen and Gambino. We conclude that oral contraceptive showed greater predictive power of high-grade lesions compared to other risk factors, and that both the IDO mRNA as CDKN2A mRNA / p16 may help screening of cervical cancer, either when used alone, or in conjunction with conventional cervical cytology, increasing their sensitivity and maintaining a considerable specificity. / O câncer de colo uterino apresenta-se como a principal neoplasia do trato genital feminino no Brasil, sendo o HPV fator essencial para a carcinogênese. O programa brasileiro de rastreamento propõe a citologia oncológica cervical convencional como principal método para detectar o câncer do colo uterino, apesar da sua baixa sensibilidade. Os fatores de risco associados ao contágio do HPV são desprezados e não contamos com uma ferramenta biomolecular que possa incrementar o programa oferecido pelo Ministério da Saúde. O objetivo desse trabalho foi verificar se os fatores de risco para o câncer de colo uterino podem contribuir com a citologia oncológica cervical convencional para aumentar a sensibilidade diagnóstica e avaliar se o RNAm Indoleamine 2,3 dioxigenase (IDO) e o RNAm CDKN2A/p16 podem incrementar a capacidade diagnóstica dessa neoplasia. A análise de regressão logística foi baseada nas variáveis clínicas (fatores de risco), citológicas e biomoleculares a fim de buscar uma associação com o resultado anatomopatológico. A proporção de variação explicada (PVE) por cada uma das variáveis estudada foi calculada pela fórmula ômega, enquanto que a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e o valor preditivo negativo foram calculados pelas fórmulas de Galen e Gambino. Concluímos que o uso do contraceptivo oral mostrou um maior poder de predição de lesões de alto grau em relação aos demais fatores de risco, e que tanto a RNAm IDO quanto o RNAm CDKN2A/p16 poderem auxiliar no rastreamento do câncer de colo uterino, seja quando usados de forma isolada, seja conjuntamente com a citologia cervical convencional, elevando sua sensibilidade e mantendo uma considerável especificidade.