Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_nilton_azevedo_da_cunha_filho.pdf: 1341797 bytes, checksum: 3a24f48f5e86bbb452bd241d5e458c34 (MD5) Previous issue date: 2013-07-08 / Neospora caninum is causing great economic losses in cattle, due to abortion. It has been shown that the transmission of N. caninum is the primary route of infection in cattle, followed by horizontal transmission. Few studies demonstrate the outcome of this type of transmission in herd raised in pasture cattle. The first experiment aimed to evaluate the occurrence of vertical transmission of N. caninum in beef cattle and verify the relationship between seropositivity and abortion. Blood was collected from mothers in the pre-pregnancy and after, three more times in the gestation period, plus a sampling of calves at birth. The seroprevalence in the arrays found in the screening was 32.2% (29/90). The vertical transmission rate was 75.8% and all dams evaluated completed pregnancy, demonstrating that N. caninum is present on the property studied, with high transmission rates, but no apparent influence on the reproductive performance of dams. The second experiment aimed to demonstrate the importance of horizontal transmission in maintaining N. caninum in the same herd. Were accompanied by serological tests, 61 seronegative mothers during pregnancy thirds and their calves at birth (n = 61) and during the first year of life (n = 24). No seroconversion occurred in any of the dams. In calves, however, that seroconversion occurred, indicative of horizontal infection by N. caninum, 12.5% at the end of 12 months. This indicates that horizontal transmission interference occurred in this herd. The third experiment aimed to detect the presence of DNA of N. caninum in umbilical cord of calves positive of positive dams. Was collected the umbilical cord of 20 calves at birth for laboratory testing by PCR. The DNA of the parasite was confirmed by 1/20 (5.0%) umbilical cords. This is the first report of the detection of DNA from N. caninum in umbilical cord of calves by PCR. / Neospora caninum é causador de grandes perdas econômicas na bovinocultura, devidas ao aborto. Já foi demonstrado que a transmissão vertical de N. caninum é a principal rota de infecção entre bovinos, seguida pela transmissão horizontal. Poucos estudos demonstram qual o resultado desse tipo de transmissão em rebanho criado a campo. O experimento 1 teve o objetivo de avaliar a ocorrência de transmissão vertical de N. caninum em matrizes de criação extensiva de gado de corte e verificar a relação entre soropositividade e aborto. Foi coletado sangue das matrizes no período pré-gestacional e, após, em mais três momentos do período gestacional, além de uma coleta de seus bezerros ao nascer. A soroprevalência nas matrizes, constatada na triagem foi de 32,2% (29/90). O índice de transmissão vertical foi de 75,8% e todas as matrizes avaliadas levaram a gestação a termo, demonstrando que N. caninum está presente na propriedade estudada, com índices elevados de transmissão vertical, porém sem influência aparente no desempenho reprodutivo das matrizes. O experimento 2 objetivou demonstrar a importância da transmissão horizontal na manutenção de N. caninum nesse mesmo rebanho. Foram acompanhadas, através de exames sorológicos, 61 matrizes soronegativas durante os terços gestacionais e seus bezerros ao nascer (n=61) e durante o primeiro ano de vida (n=24). Não ocorreu soroconversão em nenhuma das matrizes. Nos bezerros, no entanto, ocorreu essa soroconversão, indicativa de infecção horizontal por N. caninum, em 12,5%, ao final dos 12 meses. Isso indica a interferência da transmissão horizontal nesse rebanho. O experimento 3 teve o objetivo de detectar a presença do DNA de N. caninum em cordão umbilical de bezerros soropositivos filhos de matrizes soropositivas. Coletou-se o cordão umbilical de 20 bezerros no momento do nascimento para os testes laboratoriais pela técnica de PCR. O DNA do parasito foi confirmado em 1/20 (5,0%) dos cordões umbilicais. Este é o primeiro relato da detecção de DNA de N. caninum em cordão umbilical de bezerros pela técnica de PCR.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andreia_lucas.pdf: 441722 bytes, checksum: dac4b1a81e107c0d74f5c96cdf4078ac (MD5) Previous issue date: 2007-06-25 / The seroprevalence of Neospora caninum and the associated risk factors in dairy properties were verified in Pelotas region. Blood serum of 1046 six months older females from 92 properties were analysed by indirect immunofluorescence Assay (IFA ≥100). Canine seroprevalence from 67 properties was also verified (IFA ≥ 50). An epidemiological questionnaire with neosporosis related issues was also applied to evaluate risk factors and statistical associations between the serological status of the livestock and the possible variables related to environment and handling, were evaluated by logistic regression (Statistx 8.0). The prevalence in bovines was 12,04%, in 47,6% of the analysed properties. Although at least one seropositive dog was found in 26,8% of the properties, none association was found between canine and bovine seroprevalences . The variables that presented statistic relation with the seropositivity to N. caninum in the studied were: access of others domestic animals to the bovine food (OR: 13,34; IC 95%: 1,60-111,57, P=0,0168), and monthly milk production until 5000l (OR: 2,77; IC 95%: 1,07-7,18, P= 0,0362). / Para verificar a prevalência de anticorpos para Neospora caninum e os fatores de risco associados em bovinos leiteiros provenientes de 92 propriedades localizadas na bacia leiteira da região de Pelotas, Rio Grande do Sul, foram coletadas 1046 amostras de soro sanguíneo de fêmeas com mais de seis meses de idade e aplicado um questionário epidemiológico, contendo questões ligadas a neosporose aos responsáveis pelas propriedades. As amostras foram avaliadas pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI ≥ 100). As associações estatísticas entre o status sorológico do rebanho e as possíveis variáveis ligadas ao ambiente e manejo, foram avaliadas por regressão logística (Statistx 8.0). Também foi verificada a soroprevalência dos cães (RIFI ≥ 50) em 67 propriedades. Em 26,8% (18/67) destas propriedades existia pelo menos um cão soropositivo para N. caninum. A prevalência entre os bovinos foi de 12,04%, distribuídos em 47,6% (43/92) das propriedades analisadas. A porcentagem de fêmeas soropositivas, por propriedade, variou de 2,6 a 100%. As variáveis: acesso de outros animais doméstico à comida dos bovinos (OR: 13,34; IC 95%: 1,60-111,57, P=0,0168) e produção leiteira até 5000 l/mês (OR: 2,77; IC 95%: 1,07-7,18, P= 0,0362) apresentaram associação estatística com a soropositividade para N. canium. Não foi observada associação entre a soropositividade dos cães e dos bovinos nos rebanhos estudados.

Os objetivos desse estudo foram avaliar a transmissão transplacentária por N. caninum em diferentes fases da gestação (Exp I) e avaliar diferentes tecidos de bovinos como meio de transmissão de N. caninum em cães jovens e adultos (Exp II). No Exp I, Três cadelas foram inoculadas com 108 taquizoítos de N. caninum na 3ª semana de gestação, três na 6ª semana e uma permaneceu como controle. Todas as cadelas infectadas, e pelo menos um de seus filhotes, apresentaram soroconversão a anticorpos anti-N. caninum pela Reação de Imunofluorescência Indireta. Verificou-se presença do parasita pela coloração de Hematoxilina-Eosina em Sistema Nervoso Central e pela PCR ITS-1 e RFLP em linfonodo, cérebro, coração e fígado. No Exp II, cães jovens e adultos receberam diferentes tecidos de bovinos naturalmente infectados com N. caninum, sendo coração, cérebro, masseter e fígado. Não houve soroconverteu. Apenas os cães jovens eliminaram oocistos de N. caninum ao ingerirem masseter (2 cães, 40%), coração (2 cães, 40%), fígado (1 cão, 33%) e cérebro (3 cães, 75%). / The objectives of this study were to evaluate transplacental transmission of N. caninum in different stages of pregnancy (Exp I) and evaluate different bovine tis.sues as means of transmission of N. caninum in young dogs and adults (Exp II). In Exp I, Three dogs were inoculated with 108 tachyzoites of N. caninum in the third week of gestation, three at 6 sixth week and one remained as a control. All infected dogs, and at least one of their offspring, seroconverted to anti-N. caninum antibodies by Immunofluorescence Assay. There was presence of the parasite by Hematoxylin- Eosine exam in Central Nervous System and by PCR and RFLP ITS-1 in lymph node, brain, heart and liver. In Exp II, young and adult dogs received different tissues of cattle naturally infected with N. caninum: heart, brain, liver and masseter. None seroconverted. Only the young dogs shed oocysts of N. caninum by eating masseter (2 dogs, 40%), heart (2 dogs, 40%), liver (one dog, 33%) and brain (3 dogs, 75%).

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Neospora caninum is an intracellular parasite that has the dog as its definitive host and other mammals, especially cattle, as intermediate hosts. Economically, neosporosis is an important disease in Veterinary medicine due to the induction of relevant clinical signs, as abortions in cattle and neuromuscular paralysis in dogs. The aim of this study was to evaluate the role of the TLR adaptor protein TRIF in the resistance against N. caninum infection. For this, in vitro experiments with bone marrow derived macrophages (BMDMs) from C57BL/6 wild-type (WT) and TRIF knockout (TRIF-/-) mice, stimulated by tachyzoites and in vivo infections, were performed in order to investigate the production of cytokines and antibodies, cellular and tissue parasitism, histological changes during different phases of infection and survival analysis. We observed that TRIF-/- BMDMs presented notable defects in inflammatory cytokine production in relation to WT macrophages. Additionally, we found that the concentration of NO, IL-12p40, IFN-y and TNF were decreased in peritoneal fluids and lungs of TRIF-/- mice, while IL-2, IFN-γ, TNF and IL-17 were reduced in sera of these animals compared to WT mice. Higher parasite burden was observed in peritoneal cells, lungs and brain during the acute and chronic phases of infection, which were associated with inflammatory changes in the analyzed tissues, while TRIF-/- mice survival rate decreased 2-fold compared to WT. In conclusion, our results show that TRIF is required for resistance against the infection induced by N. caninum, regulating the production of key Th1 cytokines and participating in the control of the tissue parasitism and inflammatory lesions induced against the parasite. / Neospora caninum é um parasito intracelular que tem como hospedeiro definitivo o cão e outros mamíferos, especialmente bovinos, como hospedeiros intermediários. Economicamente, a neosporose é uma doença de grande importância na medicina veterinária por induzir relevantes sinais clínicos, como abortos em bovinos e paralisia neuromuscular em cães. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da molécula adaptadora TRIF da via de sinalização dos TLRs na resistência contra a infecção por N. caninum. Para isso, experimentos in vitro com macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs) obtidos de camundongos do tipo selvagem (WT) e TRIF knockout (TRIF-/-) estimulados com taquizoítos e infecções in vivo foram realizadas a fim de se investigar a produção de citocinas e anticorpos, parasitismo celular e tecidual, alterações histológicas durante diferentes fases da infecção e análise de sobrevida. Nós observamos que BMDMs TRIF-/- apresentaram reduções significativas na produção de citocinas inflamatórias em relação a macrófagos WT. Adicionalmente, foi visto que as concentrações de NO, IL-12p40, IFN- e TNF foram diminuídas no lavado peritoneal e nos pulmões de camundongos TRIF-/-, enquanto que IL-2, IFN-γ, TNF e IL-17 foram reduzidas no soro desses animais em comparação aos WT. Alta carga parasitária foi encontrada nas células peritoneais, pulmões e cérebro durante as fases aguda e crônica da infecção, associada com alterações teciduais inflamatórias significativas nos pulmões. Além disso, camundongos TRIF-/- tiveram uma taxa de sobrevida 2 vezes menor quando comparada aos animais WT. Concluindo, nossos resultados mostram que TRIF é requerido para a resistência contra a infecção induzida por N. caninum, regulando a produção de citocinas chave do perfil Th1 de resposta imune e participando no controle do parasitismo tecidual e das lesões inflamatórias oriundas desta infecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Debora_G_Melo.pdf: 804977 bytes, checksum: 2854d8486722eba4b2703a8a3bd9eab0 (MD5) Previous issue date: 2008-08-14 / The objective of this work was to obtain new isolates of N. caninum and characterize the same pathogenically. In Nerópolis (Goiás, Brazil), two Holstein-Friesian male calves, aged four months, positive for indirect immunoflourescence for Neospora with a titre of 1:400 and 1:800 were utilized for the isolation. Two new isolates, NC- Goiás 1 and NC-Goiás 2, were obtained. NC-Goiás 2 was discarded, however, due to fungal contamination. In addition to characterization of isolate NC-Goiás 1, pathogenic characterizations were done for six Spanish isolates in female mice of the lineage Balb/c. Symptomatology and mortality caused by the isolates, parasitaemia, detection of parasite DNA in the brain and lungs were verified, as well as parasite load in the brain throughout the experiment. Further, the development of humoral immune response of the animals was verified. Statistical analysis was carried analysing the effect of isolate and the infection phase. Differences between percentages encountered through nested-PCR were analysed using the Chi-square test. When significant differences were observed (P<0,05), the groups were compared two by two. The difference between parasite loads, optical density values for IgG1, IgG2a and the relation IgG1/IgG2a between the isolates were analysed by the Kruskal-Wallis test. When statistically significant differences were observed (P<0,05), the groups were compared two by two using the Mann-Whitney U test. In blood and lungs, the parasite was detected mainly in the acute phase (P<0,05). The DNA of N. caninum was also detected in the brain mainly in the chronic phase (P<0,05). On comparing parasite loads between isolates, statistically significant differences were observed between them in the chronic phase (P< 0,05). Antibodies of class IgG1 and IgG2a were detected starting from day 16 P.I. and 4 P.I. respectively, increasing gradually and remaining high until day 64 P.I. An analysis of the relation IgG1/IgG2a demonstrated predominance of IgG2a on day 8 e 16 P.I. and highest levels of IgG1 were detected on day 32 and 64 P.I. The isolate NC-Goiás 1 is the first isolate obtained in Goiás and the first obtained from an infected calf, though clinically healthy, reported from South América. These results are the first of a study of the diversity of the protozoon, N. caninum, and indicate that these isolates are of low pathogenicity in mice as compared with other known isolates / A neosporose bovina foi reconhecida inicialmente em 1989 e a partir de seu reconhecimento e descrição da nova espécie Neospora caninum, a neosporose emergiu como uma séria enfermidade de bovinos e cães. Este trabalho teve como objetivo obter novos isolados de N. caninum e realizar a caracterização patogênica dos mesmos. Em Nerópolis (Goiás, Brasil) dois bezerros machos de quatro meses de idade, da raça Holandês, positivos por Imunofluorescência indireta para Neospora com título de 1:400 e 1:800, foram utilizados para isolamento. Dois novos isolados denominados NC-Goiás 1 e NC-Goiás 2 foram obtidos porém, o isolado NC-Goiás 2 foi perdido devido a contaminação por fungos. Além da caracterização do isolado NC-Goiás 1 foram feitas caracterizações biológicas de seis isolados espanhóis em camundongos fêmeas, da linhagem BALB/c. Foi verificada a sintomatologia e mortalidade provocada pelos isolados, a parasitemia, detecção de DNA do parasito no cérebro e pulmão e determinada a carga parasitária no cérebro ao longo do experimento. Além disso, também se verificou o desenvolvimento da resposta imune humoral dos animais. A análise estatística foi realizada para verificar a influência do isolado e a fase da infecção. As diferenças entre as porcentagens encontradas pela nested-PCR foram analisadas aplicando o teste de Qui-quadrado. Quando observadas diferenças estatisticamente significativas (P<0,05), os grupos foram comparados dois a dois. A diferença entre as cargas parasitárias, valores de densidade óptica para IgG1, IgG2a e a razão IgG1/IgG2a entre os isolados foram analisadas pela prova de Kruskal-Wallis. Quando observadas diferenças estatisticamente significativas (P<0,05), os grupos foram comparados dois a dois pelo teste de U de Mann-Whitney. No sangue e pulmão o parasito foi detectado principalmente na fase aguda (P<0,05). Quanto ao cérebro, foi detectado DNA de N. caninum principalmente na fase crônica (P<0,05). Ao comparar as cargas parasitárias entre os isolados, foram observadas diferenças estatisticamente significativas na fase crônica (P< 0,005). Anticorpos da classe IgG1 e IgG2a foram detectados a partir do dia 16 P.I. e 4 P.I. respectivamente, aumentando gradualmente e se mantendo elevados até o dia 64 P.I. A análise da relação de IgG1/IgG2a mostrou predominância de IgG2a nos dias 8 e 16 P.I. e os níveis de IgG1 mais elevados foram detectados nos dias 32 e 64 P.I. O isolado NC-Goiás 1 é o primeiro isolado de N. caninum obtido em Goiás e o primeiro isolado obtido de um bezerro infectado porém clinicamente saudável relatado na América do Sul. Esses resultados são o início do estudo da diversidade do protozoário N. caninum e indicam que esses isolados são de baixa patogenicidade em camundongos quando comparados com outros isolados conhecidos

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_amanda_fernandes_pinheiro.pdf: 1197006 bytes, checksum: f76aeabc9ec7ff7c3ad7cdaa92c92c7f (MD5) Previous issue date: 2010-10-22 / The neosporosis is a disease caused by intracellular protozoa Neospora caninum, which is of great importance, especially in cattle, because it may cause abortion in infected animals, causing big economic losses for the cattle industry of many countries in the world. In the present study it was reported the expression, purification, and characterization of the protein NcSRS2 of N. caninum in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The gene ncsrs2 was cloned in the vector of expression pPICZαB, followed by the integration in the genome of yeast. The recombining protein NcSRS2 was shown in the supernatant of the culture, where later it was concentrated and purified. An indirect immunoenzymatic assay (ELISA) was developed, using seronegative and seropositive of cattle and sheep, naturally field-infected. It showed that the recombinant protein presented the antigenic characteristics of native protein, which allowed its recognition by the blood serum of different species of animals with neosporosis. The results were compared with the indirect immunofluorescence (IFI). The diagnosis test ELISA- NcSRS2 described in the present work is a specific and sensitive method for the detection of N. caninum in cattle and sheep. The results indicate that the recombinant protein produced in this work, can be used for the development of diagnosis methods with low-cost production, and in industrial scale, because they are necessary and important for the introduction of proper controlling measurements for this parasitosis in cattle flocks. / A neosporose é uma enfermidade causada pelo protozoário intracelular Neospora caninum esta é de grande importância principalmente em bovinos, pois pode ocasionar abortos nos animais infectados, causando grandes perdas econômicas para indústria pecuária de vários países do mundo. No presente estudo, foi relatada a expressão, purificação e a caracterização da proteína NcSRS2 de N. caninum na levedura metilotrófica Pichia pastoris. O gene ncsrs2 foi clonado no vetor de expressão pPICZαB seguindo de integração no genoma da levedura. A proteína recombinante NcSRS2 foi demonstrada no sobrenadante da cultura onde posteriormente foi concentrada e purificada. Um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) foi desenvolvido utilizando soros negativos e positivos de bovinos e ovinos naturalmente infectados a campo por N. caninum. Este demonstrou que a proteína recombinante apresentou as características antigênicas da proteína nativa o que permitiu o seu reconhecimento por soros de diferentes espécies de animais com neosporose. Os resultados foram comparados com a imunofluorescência indireta (IFI). O teste diagnóstico ELISA-NcSRS2 descrito no presente trabalho constitui um método específico e sensível para a detecção de N. caninum em bovinos e ovinos. Os resultados indicam que a proteína recombinante produzida neste trabalho pode ser utilizada para o desenvolvimento de métodos diagnósticos com menor custo de produção e em escala industrial, pois estes são necessários e importantes para a implantação de medidas de controle adequadas para esta parasitose nos rebanhos bovinos.

Neospora caninum é um protozoário do filo Apicomplexa que causa infecções associadas com aborto, mortalidade neonatal e alterações neurológicas em várias espécies animais. O cão desempenha papel fundamental na epidemiologia da neosporose por ser o hospedeiro definitivo deste protozoário. A prevalência de anticorpos para este protozoário em cães tem sido avaliada em vários países, inclusive no Brasil, com índices que variam de 4,8% a 45%. O presente trabalho objetivou verificar a prevalência de anticorpos classe IgG para Neospora caninum em cães e os fatores de risco na área urbana do município de Porto Alegre- RS, utilizando a Técnica de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e aplicação de questionário epidemiológico com os responsáveis pelos animai. Os animais foram divididos em três grupos, animais domiciliados, errantes e de criatórios comerciais. A freqüência de anticorpos foi de 13,84% (36/260) de amostras positivas nas 260 amostras analisadas. Os títulos sorológicos observados variaram de 50 (44%) a 3200 (3%). Os dados obtidos no questionário foram analisados pelo Teste Exato de Fisher, e observou-se associação entre a positividade e os fatores alimentação e acesso a rua, com maior positividade para os animais que tinham acesso a rua (p<0.001) e recebiam alimentados com comida caseira. Os fatores idade, sexo e contato direto com outros cães não apresentaram diferença significativa em relação à positividade dos animais. Este estudo demonstra que o N. caninum está presente em cães da área urbana de Porto Alegre, necessitando de mais estudos nessa população que esclareçam os fatores de risco ao protozoário. / Neospora caninum is a protozoan of phylum Apicomplexa which causes infections associated with abortion, neonatal mortality and neurological changes in several animal species. Dogs play key role in the epidemiology of neosporosis for being the definitive host of this protozoan. The prevalence of antibodies to this protozoan in dogs has been assessed in several countries, including Brazil, with rates ranging from 4.8% to 45%. This work had as its main objective to verify the prevalence of IgG class antibodies to Neospora caninum in dogs and the risk factors in the urban area of the municipality of Porto Alegre-RS using the Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and applying an epidemiological questionnaire with those responsible for the animals. Animals were divided into three groups, domestic (pets) and wandering animals and those from commercial breeders. The frequency of antibodies was 13.84% (36/260) of positive samples in 260 samples which were analyzed. The serological titles observed varied from 50 (44%) to 3200 (3%). The data obtained in the questionnaire were analyzed by Fisher Exact Test, and some association between the positivity of IFAT and factors such as food and access to the street were observed. There was greater positivity for animals which had access to street (p < 0,001) and were fed with homemade food. Factors such as age, sex and direct contact with other animals have not showed any significant difference in relation to the positivity of the animals. This study demonstrates that Neospora caninum is present in dogs of the urban area of Porto Alegre which requires more studies in such population to clarify the risk factors to the protozoan.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-30T13:40:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_gizele_lima_de_sa.pdf: 1115362 bytes, checksum: 4fe5eecfaee189766be87ff59c7e2a47 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:13:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_gizele_lima_de_sa.pdf: 1115362 bytes, checksum: 4fe5eecfaee189766be87ff59c7e2a47 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:13:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_gizele_lima_de_sa.pdf: 1115362 bytes, checksum: 4fe5eecfaee189766be87ff59c7e2a47 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T19:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tese_gizele_lima_de_sa.pdf: 1115362 bytes, checksum: 4fe5eecfaee189766be87ff59c7e2a47 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / O Neospora caninum é um protozoário filogenéticamente relacionado a vários coccídeos de importância médico veterinária, além de ser um parasito intracelular obrigatório capaz de causar abortamentos em bovinos e paralisia neoromuscular em cães. A interação ligantes/receptores são requisitos que permitem que o parasito explore sua capacidade invasiva, sendo o contato inicial mediado por proteínas de superfície imunodominantes como Nc-p43 e Nc-p29. O estudo de antígenos e proteínas recombinantes de N. caninum gerou uma série de informações para aprimorar o diagnóstico e diferenciação deste protozoário e demais agentes a ele relacionados, principalmente com relação ao Toxoplasma gondii. No presente trabalho foi realizada uma revisão bibliográfica das proteínas envolvidas na interação hospedeiro-parasito utilizadas como alvos vacinais e na aplicação em testes diagnósticos devido a sua especificidade. Dentre as proteínas descritas, os antígenos de superfície Nc-p43 e Nc-p29 são amplamente estudados devido a sua especificidade e capacidade de induzer uma resposta imune protetiva, além de não apresentar reação cruzada com outros parasitos Apicomplexas quando utilizadas em ensaios diagnósticos. Frente a isso, propomos a expressão das proteínas específicas de N. caninum, Nc-p43 e Nc-p29 em sistema procarioto, para avaliar sua antigenicidade frente a soros de animais naturalmente infectados por N. caninum e especificidade quando testados frente a soros de animais infectados por T. gondii. A proteína rNc-p43 foi utilizada na produção de um anticorpo policlonal, que foi purificado, conjugado a peroxidase (HPR) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) afim de detectar as proteínas recombinantes e nativas Nc-p43, espectivamente. pAb e pAb/HRP foram capazes de reconhecer rNcp-43, enquanto pAb/FITC se mostrou eficiente na imunomarcação do complexo apical de taquizoítos. Um ensaio imunoenzimático de bloqueio (b-ELISA) foi realizado para avaliar a performance do pAb/HRP como ferramenta de diagnóstico. A porcentagem de inibição média para as amostras de soros positivos e negativos de bovinos com neosporose obteve diferença estatística (P <0,0001). Estes resultados sugerem que o pAb pode ligar-se aos mesmos epítopos da Ncp-43 que os anticorpos anti-N. caninum de amostras positivas testadas. O b-ELISA utilizando o pAb/HRP representa uma opção interessante aos testes de diagnóstico disponíveis para a neosporose, uma vez que menos passos estão envolvidos na sua realização e seu formato evita a reatividade cruzada com anticorpos anti-espécie específicos. Em resumo, este trabalho descreve a clonagem e expressão das proteínas Nc-p43 e Nc-p29 de N. caninum em sistema procarioto, a produção de um anticorpo policlonal monoespecífico contra a proteína recombinante Nc-p43 e a avaliação de sua aplicabilidade como ferramenta no diagnóstico para neosporose. / Neospora caninum is a protozoan phylogenetically related to several coccidia with importance in veterinary medicine. This obligate intracellular parasite causes abortions in cattle and neoromuscular paralysis in dogs. Interaction ligand/receiver are required that allow the parasite explore your ability invasive, being the initial contact mediated for immunodominant surface proteins as Ncp43 and Nc-p29. The study of antigens and recombinant proteins of N. caninum have generated a serie of informations aiming the improvement of diagnosis and differentiation of this protozoan and other agents related to it, especially Toxoplasma gondii.In the present work was carried out a literature review focusing in the proteins involved in host-parasite interaction used as vaccine targets and application in diagnostic tests due to its specificity. Among the described proteins, antigens of surface Nc-p43 and Nc-p29 are widely studied due to their specifity and ability to induzer a protective immunity, and not reported cross reaction with other Apicomplexa parasite when used in trials diagnostics. Furthermore, the expression of specific proteins of N. caninum, Ncp43 and Nc-p29, in prokaryote system, are here described, followed by their evaluating concerning their antigenicity, using sera from animals naturally infected with N. caninum; and their specificity through reaction with sera from animals infected with T. gondii. The rNc-p43 protein was used for polyclonal antibody production in rabbit, purified and conjugated to peroxidase (HPR) and fluorescein isothiocyanate (FITC), in order to detect the recombinant and native Nc-p43, respectivelly. pAb and pAb/HRP were able to recognize rNc-p43, which was evaluated by Dot blot and ELISA assays, while pAb/FITC was able to mark the apical complex of tachyzoites. A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (b-ELISA) was performed to evaluate the performance of pAb/HRP as diagnostic tool. The average percentage of inhibition for the positive sera pool and the negative sera pool of cattle neosporosis was significantly different (p <0.0001). These results suggest that pAb may bind to the same epitopes of Ncp43 and anti-N. caninum antibodies positive samples tested. b-ELISA using pAb/HRP is an interesting option for diagnostic tests that are available for neosporosis since fewer steps are involved in their implementation and their shape prevents cross-reactivity with anti-species-specific antibodies. In short, this work describes the cloning and expression of Nc-p43 and Nc-p29 proteins N. caninum in prokaryotic system, to produce a monnoespecific polyclonal antibody against the recombinant protein Nc-p43 and evaluation of its suitability as a tool in diagnosis of neosporosis.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2006. / Härtill 5 uppsatser.