Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão como hospedeiro definitivo e principalmente os bovinos como hospedeiros intermediários, causando nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, o que acarreta prejuízos significativos na pecuária mundial. O parasita necessita multiplicar de modo intra-celular, utilizando a descarga de proteínas contidas em organelas filo-específicas, como as micronemas que liberam proteínas relacionadas a adesão e invasão ativa, além das roptrias e os grânulos densos. Este trabalho foi realizado sobre um tipo de proteína micronêmica denominada proteína Anônima Relacionada à Trombospondina (TRAP), relacionada à adesão e ligação com o motor intracelular, responsável pelo processo ativo de invasão. TRAP 1 já havia sido descrita pela literatura e o objetivo deste trabalho foi a caracterização molecular do até então desconhecido homólogo TRAP 2, com expressão de suas formas recombinantes e o uso de seus respectivos anti-soros para ensaios funcionais e localização da proteína nativa. Com base em banco dados de ESTs e genômicos de N. caninum e fazendo uso de RLM-RACE (Reação mediada por RNA ligase- amplificação rápida dos términos de cDNA-RNA,) foi possível a obtenção da sequencia completa do gene NcTrap 2, que possui quatro éxons separados por três íntrons. Sua forma protéica, como seu homológo, é formado por um peptídeo sinal, uma integrina, cinco trombospondinas, uma região transmembrana e a cauda citoplasmática. A integrina e as trombospondinas são motivos relacionados à adesão para início do processo invasivo e foram os alvos deste trabalho. Foram expressos dois recombinantes a partir deste cerne funcional (integrina e trombospondinas), com 52 e 78 kDa, e seus respectivos anti-soros foram obtidos. Estes foram utilizados em western blots 1D e 2D para localização da forma nativa de NcTRAP 2 de aproximadamente 80 kDa no extrato total e de sua forma processada no ESA (extrato secretado, simulando o momento invasivo do taquizoíta) com 70 kDa. O soro contra o recombinante 1 teve a capacidade de inibir o processo invasivo em valores de 53 a 61%, dependendo do método utilizado (contagem manual ou real time PCR). NcTRAP 2 foi encontrada no complexo apical parasitário do taquizoíta por imunofluorêscencia confocal, evidenciando sua provável localização nas micronemas. A nova molécula, NcTRAP 2 possui características que a diferencia de NcTRAP 1 o suficiente para ser considerada homóloga. O soro contra sua forma recombinante detectou as formas nativas integral e secretada e demonstrou que NcTRAP 2 possui capacidade de inibir a invasão dos taquizoítas, o que a torna um interessante alvo vacinal. / Neospora caninum is an Apicomplexan protozoan, obligatory intracellular parasite that has the dog as definitive host and especially cattle as intermediate hosts, causing in the first ones encephalopathy and in the last ones abortion with fertility losses. Such facts lead to significant losses to livestock worldwide. The parasite must invade the cells for its development, using the discharge of proteins contained in phylum-specific organelles, like the micronemes proteins related with adhesion and active invasion, besides the proteins from rhoptries and dense granules. This work was performed on a type of micronemic protein, a thrombospondin-related anonymous protein (TRAP), related with adhesion and connection with the intracellular motor responsible for the active process of invasion. Based on the homologue previously described in the literature, TRAP 1, the aim of this study was the characterization of the undescribed TRAP 2 homologue, the expression of its recombinant forms, the use of its anti-sera for functional assays, and detection of its native form. Based on ESTs and genomic data from N. caninum, and using the RLM-RACE (ligase mediated rapid amplification of cDNA ends) technique, the complete sequence of NcTRAP 2 was obtained, which had four exons separated by three introns. As NcTRAP 1, the protein sequence is composed of a signal peptide, an integrin, five thrombospondin, a transmembrane region and a cytoplasmatic tail. The integrin and thrombospondin motifs are related to adhesion for initiation of the invasive process and were the targets of this work. We expressed two recombinant fragments from the functional core (thrombospondin and integrin), with 52 and 78 kDa, which were utilized for antisera production. The anti-sera localized the native form NcTRAP 2 which had approximately 80 kDa, and its processed form in ESA (Excreted/Secreted Antigen) with 70 kDa, both in western blot 1D and 2D. The serum against recombinant 1 had the ability to inhibit the invasive process from 53 to 61%, depending on the experimental method used (manual counting or real time PCR). NcTRAP 2 was localized at the apical complex of the parasite of the tachyzoites by confocal immunofluorescence, pointing towards its micronemal localization. The new molecule, NcTRAP 2, holds features that differentiates it from NcTRAP 1 in a substantial way to be considered homologue. The serum against the recombinant form detected the native full length and secreted forms of NcTRAP 2 and demonstrated that NcTRAP 2 has the ability to inhibit the invasion of tachyzoites, turning it into an interesting vaccine target to be investigated.

Neospora caninum é um protozoário parasita de grande importância em todo o mundo, sendo considerado a principal causa de abortamento bovino em algumas localidades. Enquanto a implicação deste parasita em distúrbios reprodutivos na espécie bovina seja conhecida, as informações disponíveis com a espécie bubalina são escassas. Este estudo avaliou e comparou as consequências da infecção experimental por N. caninum em búfalas e vacas, no estágio inicial da gestação, o de maior importância no que se refere à ocorrência de morte fetal. Protocolos de inseminação artificial em tempo fixo foram utilizados para maior controle da fecundação. Foram utilizados para inoculação dois isolados distintos, Nc-Bahia e Nc-1, possibilitando a comparação entre o isolado nacional e o isolado padrão. Todos os animais foram inoculados com 5 x 108 taquizoítos, pela via endovenosa, no 70º dia de gestação. Três búfalas e cinco vacas foram infectadas com o isolado Nc-Bahia, sendo detectado abortamento 42 dias pós-infecção (DPI) em somente uma das vacas inoculadas. Três búfalas e duas vacas foram inoculadas com o isolado Nc-1 e morte fetal foi detectada 35 DPI em todas as búfalas e vacas. Uma búfala e uma vaca permaneceram como controles negativos, sem infecção. A transmissão vertical foi verificada por semi-nested PCR nos animais infectados com Nc-Bahia e Nc-1. Diferentes graus de inflamação não-supurativa foram detectados em tecidos maternos, fetais e placentários. Todas as fêmeas inoculadas apresentaram resposta humoral frente à infecção. Embora a infecção estivesse mais disseminada pelo organismo das búfalas (p<0,05), a resposta humoral foi menor (p<0,05) e as lesões histológicas foram menos frequentes (p<0,05), indicando haver maior adaptação entre N. caninum e as búfalas, em comparação com os resultados obtidos nas vacas. O isolado Nc-Bahia foi menos patogênico que o Nc-1, por causar menos abortamentos (p<0,05) e menor frequência de lesões histológicas (p<0,05). A patogenicidade do agente na espécie bubalina foi confirmada, consideradas as lesões encontradas na análise histopatológica e a detecção da presença do agente por semi-nested PCR nos diversos tecidos estudados, além da positividade por imunoistoquímica em placenta e cérebro fetal bubalino. Esta é a primeira detecção de abortamento causado por N. caninum na espécie bubalina, em fêmeas infectadas experimentalmente com o protozoário, confirmando que problemas reprodutivos podem ser causados pelo N. caninum em búfalas. / Neospora caninum is a protozoan parasite with big importance all over the world, being considered the main cause of bovine abortion in some locations. While the implication of this parasite in bovine reproductive disorders is known, the available information within the buffalo species is scarce. This study evaluated and compared the consequences of experimental infection with N. caninum in buffaloes and cows on the initial stage of pregnancy, the most important regarding to the occurrence of fetal death. Protocols for fixed-time artificial insemination were used for greater control of fertilization. Two different isolates, Nc-Bahia and Nc-1, were utilized for inoculation, allowing the comparison between the national isolate and the standard isolate. All animals were inoculated with 5 x 108 tachyzoites, by endovenous route, at the 70th day of pregnancy. Three buffaloes and five cows were infected with the isolate Nc-Bahia and abortion was detected 42 days post-infection (DPI) in only one inoculated cow. Three buffaloes and two cows were inoculated with the isolate Nc-1 and fetal death was detected 35 DPI in all buffaloes and cows. A buffalo and a cow remained as negative controls, without infection. Vertical transmission was verified by semi-nested PCR in animals infected with Nc-Bahia and Nc-1. Different degrees of nonsuppurative inflamation were detected in maternal, foetal and placental tissues. All inoculated females showed humoral response against the infection. Although the infection was more disseminated withn the body of buffaloes (p <0.05), the humoral response was lower (p <0.05) and histological lesions were less frequent (p <0.05), indicating bigger adaptation between N. caninum and the buffaloes, in comparison with the results obtained in cows. Nc-Bahia isolate was less pathogenic than the Nc- 1, as it caused less abortions (p <0.05) and lower frequency of histological lesions (p<0.05). The pathogenicity of the agent in the bubaline species was confirmed, considering the lesions found on histopathology analysis and the detection of the agent´s presence by semi-nested PCR in the different studied tissues, in addition to the positivity by immunohistochemistry test in bubaline placenta and foetal brain. This is the first detection of abortion caused by N. caninum in buffalo species, in females experimentally infected with the protozoan, confirming that reproductive disorders can be caused by N. caninum in buffaloes.

O objetivo deste estudo foi infectar experimentalmente cães com oocistos esporulados de N. caninum, via oral e avaliar a ocorrência ou não da infecção. Os oocistos utilizados como inóculo foram obtidos através de bioensaio em cães, usando cérebro de búfalos soropositivos para anticorpos anti-N. caninum. Os oocistos obtidos foram confirmados ser de N. caninum por métodos moleculares e por bioensaio em gerbilos. Oocistos esporulados, com no máximo 90 dias, foram utilizados na infecção de quatro cães, com oito semanas de vida e negativos para anticorpos anti-N. caninum e Toxoplasma gondii. Os cães 1 e 4 receberam um inóculo com 10.000 oocistos esporulados cada um; o cão 2 um inóculo com 5.000 oocistos esporulados e o cão 3 recebeu 1.000 oocistos esporulados de N. caninum. O total de fezes foi coletado e examinado diariamente durante um período de 30 dias. Nenhum oocisto foi encontrado nas fezes desses animais. Durante seis meses os cães foram acompanhados para observar uma possível soroconversão e quando esta ocorria os animais eram eliminados do experimento. / The objective of this study was to evaluate the acquisition of infection in dogs experimentally infected with sporulated oocysts. The oocysts used as inoculum were obtained by bioassay in dogs using brain of buffaloes positive for anti-N. caninum antibodies. The oocysts were confirmed to be N. caninum by molecular methods and by bioassay in gerbils. Sporulated oocysts with a maximum of 90 days were used in the infection of four dogs. The dogs were eight weeks old and were negative for anti-N. caninum and Toxoplasma gondii antibodies. Dogs 1 and 4 received an inoculum of 10,000 sporulated oocysts each, dog 2 an inoculum with 5,000 sporulated oocysts and dog 3 received 1,000 sporulated oocysts of N. caninum. The total feces eliminated by the dogs were collected and examined daily for a period of 30 days. No oocysts were found in the feces of these animals. For six months the dogs were monitored to observe a possible seroconversion and when this occurred the animals were eliminated from the experiment.

Foram colhidas, de março a junho de 2004, amostras de sangue de 108 carneiros e 920 matrizes de 32 propriedades comerciais de ovinos do Distrito Federal, totalizando 1028 amostras. Os soros foram submetidos à reação de imunofluorescência indireta (RIFI), utilizando-se as diluições 1:64 e 1:50 como ponto de corte para, respectivamente, T. gondii e N. caninum. A prevalência observada para T. gondii foi de 38,22% (26,81% < IC 0,95 < 49,62%). Os títulos variaram de 64 a 65536, e o título com maior freqüência foi 2048 (21,15%). Para N. caninum, a prevalência foi de 8,81% (7,08% < IC 0,95 < 10,53%), com títulos variando de 50 a 51200, sendo o título mais freqüente 50 (21,11%). Ovinos reagentes a ambos os parasitas corresponderam a 4,67%. A análise dos possíveis fatores de risco não foi possível, pois todas as propriedades possuíam ao menos um animal positivo para T. gondii e a maioria (87,50%) das propriedades foram positivas para N. caninum. A prevalência para T. gondii foi significativamente maior entre os machos que entre as fêmeas. Utilizando-se reação em cadeia pela polimerase e enzimas de restrição para o locus SAG2, em uma amostra de cérebro dentre 11 colhidas em um abatedouro da região foi identificado T. gondii tipo I. Os resultados demonstram que as infecções pelos dois parasitas estão presentes e disseminadas no rebanho ovino do Distrito Federal. / From March to June 2004, serum samples from 108 rams and 920 ewes were collected from 32 herds within Distrito Federal, Brazil. The samples were tested by Immunofluorescent Antibody Test, using sera diluted 1:64 and 1: 50 as cut-off values for the detection of antibodies against Toxoplasma gondii and Neospora caninum, respectively. The observed prevalence for T. gondii infection was 38.22% (26.81%<IC 0,95<49.62%). The titers encountered ranged from 64 to 65536, with the most prevalent titer being 2048 (21.15%). The observed prevalence for N. caninum infection was 8.81% (7.08%<IC 0,95<10,53%). The titers ranged from 50 to 51200, being 50 the most frequent titer value (21.11%). The reactant sera to both pathogens corresponded to 4.67% of the samples. The risk factors for T. gondii and N. caninum infections were not determined because of the absence of negative herds for T. gondii infection and the high proportion of herds positive for N. caninum infection (87.50%). The prevalence for T. gondii infection was significantly higher among males than in females. By using the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of locus SAG2 on 11 brain samples collected in a regional slaughterhouse, only one sample was positive and proved to be archetype I. The results show that infection by both parasites is widespread in the ovine population from Distrito Federal.

Com o objetivo de identificar Toxoplasma gondii e Neospora caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) 217 roedores (quatro camundongos -Mus musculus, 20 ratazanas - Rattus norvegicus e 193 ratos de telhado - Rattus rattus) foram capturados entre abril de 2005 e fevereiro de 2008, para realização do diagnóstico biológico e molecular. Das 20 ratazanas (Rattus norvegicus) capturadas apenas uma foi positiva para T. gondii pelo bioensaio, correspondendo a 5% de positividade entre as ratazanas e 0,46% entre todos os roedores capturados. O isolado obtido dessa ratazana foi caracterizado como genótipo recombinante I, III e u-1 por PCR-RFLP, similar ao isolado previamente descrito e obtido de duas ovelhas e um gato, todos do Estado de São Paulo. Quatro amostras de roedores negativos ao bioensaio resultaram como positivas ao T. gondii pela nested PCR B1. Entretanto, quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) não houve confirmação desse resultado em três delas. Em relação ao N. caninum, amostras de tecido cerebral e cardíaco de 121 roedores foram examinadas por nested PCR Nc5, tendo sido encontradas 12 amostras positivas, provenientes de 10 roedores. Quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) N. caninum não foi confirmado em nenhuma das amostras. Este estudo conclui que a ocorrência de T. gondii e N. caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) é baixa, sugerindo que estes animais não possuem papel importante na cadeia epidemiológica como reservatórios desses agentes para predadores como os cães e gatos urbanos. / In order to identify Toxoplasma gondii and Neospora caninum in urban rodents from the Great São Paulo (SP) 217 rodents (four Mus musculus, 20 Rattus norvegicus and 193 Rattus rattus) were captured between April 2005 and February 2008 to biological and molecular diagnosis. One out of the 20 Rattus norvegicus was considered positive by bioassay in mice, corresponding to a 5% positivity among Rattus norvegicus and a 0.46% positivity considering all captured rodents. The isolate from this rat was characterized as a recombinant I, III and u-1 genotype by RFLP-PCR. This characterization had been previously described from isolates obtained from two sheep and one cat also from São Paulo state. Four samples from rodents with negative results by bioassay were positive to T. gondii by nested PCR B1. However, when tested with nested PCR ITS1 and RFLP these results were not confirmed in three of these samples. Regarding N. caninum, brain and heart samples of 121 rodents were examined by nested PCR Nc5 and 12 samples from 10 rodents were positive. When tested with nested PCR ITS1 and RFLP all of these samples turned out to be negative. This study concludes that T. gondii and N. caninum have low occurrence in urban rodents in the Great São Paulo area, and they are not important as T. gondii and/or N. caninum reservoirs to predators like urban cats and dogs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-04Bitstream added on 2014-06-13T18:53:47Z : No. of bitstreams: 1 sakamoto_kp_me_araca.pdf: 546031 bytes, checksum: 6e34a6b9bbf11432d68486ead636a2f8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Leishmaniose visceral é uma enfermidade que possui uma grande variabilidade de manifestações clínicas, em humanos como em cães. Cães cronicamente infectados podem desenvolver desordens neurológicas, contudo, há poucos relatos que caracterizam as lesões e elucidam a patogenia da leishmaniose cerebral canina. Considerando a imunossupressão associada à leishmaniose visceral e que os patógenos oportunistas Toxoplasma gondii e Neospora caninum podem colaborar para a ocorrência de lesões no sistema nervoso central de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi, as populações de linfócitos B (CD79+) e T (CD3+) foram avaliadas no tecido nervoso de cães portadores de leishmaniose visceral e que possuem soropositividade para T. gondii e N. caninum. Lesões inflamatórias, caracterizadas por acúmulos de células mononucleares compostos principalmente por linfócitos T CD3+ predominaram em diversas regiões encefálicas dos cães infectados (P = 0,0012). Linfócitos B CD79+ foram detectados em pequena intensidade, não havendo diferença entre os grupos (P = 0,3604). Os resultados obtidos sugerem que a co-presença de leishmaniose visceral, toxoplasmose e neosporose é importante para o agravamento das lesões encefálicas, e que a imunossupressão gerada pela infecção por Leishmania não somente favorece a infecção por outros patógenos, mas colabora com esses, ocasionando lesões mais severas no tecido nervoso / Visceral leishmaniasis is a disease with great variability regarding the clinical manifestations, in humans as in dogs. Chronically infected dogs may develop neurological disorders, however, there are few reports that characterise the lesions and make clear the pathogenesis of the canine cerebral leishmaniasis. Considering the immunossupression associated to visceral leishmaniasis and that the opportunist pathogens Toxoplasma gondii and Neospora caninum may collaborate to the occurrence of lesions in the central nervous system of dogs naturally infected by Leishmania chagasi, we evaluated the population of B (CD79+) and T (CD3+ ) lymphocytes in the nervous tissue of dogs with visceral leishmaniasis and with seropositivity to T. gondii and to N. caninum. Inflammatory lesions, characterised by mononuclear cellsaccumulation, composed mainly by CD3+ T lymphocytes predominated in several encephalic regions of the dogs from the infected groups (P=0.0012). CD79+ B lymphocytes were detected in very small intensity and presented no difference among groups (P=0.3604). The results presented herein suggest that the co-presence of visceral leishmaniasis, toxoplasmosis and neosporosis is important for the worsening of the encephalic lesions, and that the immunossupression caused by Leishmania infection not only propitiates the infection by other pathogens, but collaborate with them, causing more severe lesions in the brain

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-03-16T16:12:04Z No. of bitstreams: 1 PGCA17MA223.pdf: 789583 bytes, checksum: 826470c73aedad966296545af60b30b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-16T16:12:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA17MA223.pdf: 789583 bytes, checksum: 826470c73aedad966296545af60b30b8 (MD5) Previous issue date: 2017-02-10 / In order to assess the possibility of congenital transmission of Neospora caninum in the ovine species and the implications of the infection of the agent in different stages of pregnancy, eleven fertile, serologically negative to N. caninum and Toxoplasma gondii, were distributed in five groups (A = 3 animals, B, C, D and E = 2 animals each one). Group A was inoculated intravenously with 1x107 tachyzoites of N. caninum strain Nc-1, which was insufficient for the detection of seroconversion. The animals of groups B, C and D were inoculated with 2x107 tachyzoites. Group E was maintained as control (not inoculated). The animals of group A were inoculated 30 days before mating, and groups B, C and D at 65, 100 and 120 days of pregnancy, respectively. Animal blood samples were collected on days -2, 2, 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42 days postinfection (DPI) to perform complete blood count (CBC) and to obtain serum for the IgG antibody test by Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT). Clinical examinations (body temperature and heart and respiratory rates) were performed daily between -2 and 14 DPI and, thereafter, weekly until the end of the experiment (42 DPI). From lambs born alive, clinical examination, blood collection for IFAT and CBC were performed. After euthanasia, lambs were necropsied and organs (CNS, liver, heart, lung and placenta) were collected for histopathological examination. All the ewes of Groups B, C and D seroconverted. The animals of groups A and E remained seronegative throughout the experiment. No clinical or hematological changes were observed due to inoculation in the ewes, except for one ewe from group B that presented retained placenta. One lamb born from Group B was seroreagent (precolostral) to N. caninum by IFAT (1:400), indicating transplacental transmission, in addition to presenting hypothermia and low birth weight. Another lamb from group B and one from group C were also seropositive, but they drank colostrum. One lamb from Group C (100 days of gestation) and twin lambs from Group D (120 days of gestation) did not drink colostrum and were seronegative. One Group D lamb was seronegative even after ingesting colostrum. There were no haematological and pathological changes in any of the lambs of all groups. The results demonstrate the occurrence of transplacental transmission of N. caninum in a ewe inoculated at 65 days of gestation and suggest that the same occurred with two other ewes (inoculated at 65 and 100 days of gestation), however, higher specificity tests (PCR) are necessary for the confirmation of congenital transmission in these animals, which, although seropositive, drank colostrum prior to collection of blood / Com o objetivo de avaliar a possibilidade de transmissão congênita de Neospora caninum na espécie ovina e as implicações da infecção do agente em diferentes estádios da gestação, onze ovelhas férteis, sorologicamente negativas para N. caninum e Toxoplasma gondii, foram distribuídas em cinco grupos (A= 3 animais, B, C, D e E = 2 animais cada). O Grupo A foi inoculado intravenosamente com 1x107 taquizoítos da cepa Nc-1 de N. caninum, sendo esta dose insuficiente para a detecção de soroconversão. Os animais dos grupos B, C e D foram inoculados com 2x107 taquizoítos. O Grupo E foi mantido como controle (não inoculado). Os animais do grupo A foram inoculados 30 dias antes da cobertura, e os grupos B, C e D aos 65, 100 e 120 dias de gestação, respectivamente. Amostras de sangue dos animais foram colhidas nos dias -2, 2, 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42 dias pós-infecção (DPI) para realização de hemogramas e obtenção de soro para a pesquisa de anticorpos IgG por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Exames clínicos (temperatura corporal e frequências cardíaca e respiratória) foram realizados diariamente entre -2 e 14 DPI e, na sequência, semanalmente até o final do experimento (42 DPI). Dos cordeiros nascidos, realizou-se exame clínico, colheita de sangue para realização da RIFI e hemograma. Após eutanásia, os cordeiros foram necropsiados e órgãos foram colhidos (SNC, fígado, coração, pulmão e placenta) para exame histopatológico. Todas as ovelhas dos Grupos B, C e D soroconverteram. Os animais dos grupos A e E mantiveram-se soronegativos ao longo de todo o experimento. Não foram observadas alterações clínicas ou hematológicas decorrentes da inoculação nas ovelhas, com exceção de uma ovelha do grupo B que apresentou retenção de placenta. Uma cordeira nascida do Grupo B foi sororreagente (pré-colostral) para N. caninum pela RIFI (1:400), indicando transmissão transplacentária, além de apresentar hipotermia e baixo peso ao nascer. Outro cordeiro do grupo B e um do grupo C também foram soropositivos, entretanto mamaram colostro. Um cordeiro do Grupo C (100 dias de gestação) e os dois cordeiros gêmeos do Grupo D (120 dias de gestação) não mamaram o colostro e foram soronegativos. Um cordeiro do Grupo D apresentou-se soronegativo mesmo após ter ingerido o colostro. Não houve alterações hematológicas e patológicas em nenhum dos cordeiros de todos os grupos. Os resultados demonstram ocorrência de transmissão transplacentária de N. caninum em uma ovelha inoculada aos 65 dias de gestação e sugerem que o mesmo ocorreu com outras duas ovelhas (inoculadas aos 65 e aos 100 dias de gestação), no entanto, testes com maior especificidade (PCR) são necessários para a confirmação da transmissão congênita nestes animais que, embora soropositivos, mamaram o colostro antes da colheita do sangue

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-03-21T14:35:44Z No. of bitstreams: 1 PGCA17MA229.pdf: 654110 bytes, checksum: 5902ad01c6d4e8ebc529569a73b149aa (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-21T14:35:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA17MA229.pdf: 654110 bytes, checksum: 5902ad01c6d4e8ebc529569a73b149aa (MD5) Previous issue date: 2017-08-25 / Capes / Neosporosis is a disease that affects ruminants, horses, swine and wild animals, causing reproductive disorders and economic losses. The importance of infection in pigs has not yet been fully elucidated. The objective of the present study was to verify the prevalence of antibodies against Neospora caninum and the possible risk factors associated with infection in swine herds of commercial herds in the State of Santa Catarina, Brazil. A total of 498 blood samples were collected from western (five properties) and southern (four properties) regions and epidemiological questionnaire was used. After obtaining the serum, they were tested by means of the Indirect Immunofluorescence Reaction (IFAT), with a cut-off point of 1:50, using tachyzoites of the NC1 strain of the agent as antigen. The positive samples were diluted in multiples of two until the maximum reactive titre. The variables were analyzed using Fisher and Chi-square tests to verify correlation with seroprevalence. The overall prevalence was 18.9% (94/498), with a reciprocal distribution of the following: 27 (1:50), 26 (1: 100), 22 (1: 200), 10 (1: 400), 9 (1: 800). Of the 256 samples from the Western region, 80 (31.3%) were positive and 242 samples from the South region, 14 (5.8%), were positive. A significant statistical difference (p <0.01) was observed among the prevalences observed in the evaluated farms. Contact with dogs (OR= 3,97), presence of rodents (OR= 7,37), and water source (OR= 2,38) presented a positive statistical correlation (p <0.01) with seroprevalence. The use of anti-bird screen was identified as a protection factor for infection (OR= 0,36). The seroprevalence of antibodies against N. caninum in commercial swine herds in Santa Catarina was 18.9% (94/498), considered high in comparison with other results observed in Brazil / Neosporose é uma doença que acomete ruminantes, equinos, suínos e animais selvagens, causando transtornos reprodutivos e prejuízos econômicos. A importância da infecção em suínos ainda não está totalmente elucidada. O objetivo do presente trabalho foi verificar a prevalência de anticorpos contra Neospora caninum e os possíveis fatores de risco associados à infecção em matrizes suínas de rebanhos comerciais no Estado de Santa Catarina, Brasil. Foram colhidas 498 amostras de sangue em propriedades das regiões Oeste (cinco propriedades) e Sul do Estado (quatro propriedades) e aplicado questionário epidemiológico. Após a obtenção do soro, estes foram testados por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), com ponto de corte de 1:50, utilizando taquizoítos da cepa NC1 do agente como antígeno. As amostras positivas foram diluídas em múltiplos de dois até a máxima titulação reativa. As variáveis foram analisadas por meio dos testes exato de Fisher e do Qui quadrado para verificar correlação com a soroprevalência. A prevalência geral foi de 18,9% (94/498), com recíproca de títulos distribuída da seguinte forma: 27 (1:50), 26 (1:100), 22 (1:200), 10 (1:400), 9 (1:800). Das 256 amostras da região Oeste, 80 (31,3%) foram positivas e das 242 amostras da região Sul, 14 (5,8%), foram positivas. Foi observada diferença estatística significativa (p<0,01) entre as prevalências observadas nas granjas avaliadas. Contato com cães (OR= 3,97), presença de roedores (OR= 7,37) e a fonte de água proveniente de “olho d´água” ou mina (OR= 2,38) apresentaram correlação estatística positiva (p<0,01) com a soroprevalência. A utilização de tela antiaves foi identificada como fator de proteção para a infecção (OR= 0,36). A soroprevalência de anticorpos contra N. caninum em rebanhos comerciais de matrizes suínas em Santa Catarina foi de 18,9% (94/498), considerada alta em comparação com outros resultados observados no Brasil

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 58716 bytes, checksum: 8427f1a81ed09f080394210a61912045 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The Neospora caninum is a protozoan apicomplexan with implication in abortions in many countries. They are included in the economical losses, the abortament, the proportion of discarded cows and the replacement of new animals in the flock, the fall in the milk production, as well as in the fat production in the milk. It is known that the kits existent diagnoses in the healthy market of high cost and they are not produced at the national market, it is needed, to offer diagnosis alternatives reliable, and fast, with national technology. The proposal of the present work was the production of monoclonal antibodies (mAb) of high likeness against the Neospora caninum (sample Nc-1), for the use in immunodiagnostic tests as immunofluorescence, immunohistochemistry, ELISA and dot-ELISA. For the production of mAb the sonicated protozoan was used, originating from the culture in cells VERO and it was purified by filtration, it was used the tachyzoites for the immunization of the mice BALB/c, using as saponin adjuvant , what allowed the obtaining of polyclonal antibodies. The fusing of the esplenic cells of the immunized mice and the myelomas SP2/0 resulted in the obtaining of 72,4% of hybridomas secretors of antibodies anti-Nc-1. After the cloning for limiting dilution was obtained 78,2% of the clones secretors of antibodies anti-Nc- 1. After the recloning for limiting dilution, they were obtained 4 clones secretors of mAb of the class IgG. Obtained mAb IgG2a were capable to reveal the proteins of mass molecular 25 kDa and 70 kDa for "western blotting" to inhibit the multiplication of the taquyzoites in cells VERO. The monoclonal antibodies produced can be used in the development of more sensitive tests, in the epidemic studies of the neosporosis or they can be used in the identification of relevant proteins for the development of vaccines. / O Neospora caninum é um protozoário apicomplexa com implicação em abortamentos em muitos países. Estão inclusas nas perdas econômicas, os abortamentos, a proporção de vacas descartadas e a reposição de novos animais no rebanho, a queda na produção leiteira, bem como na produção de gordura no leite. Sabe-se que os kits diagnósticos existentes no mercado são de alto custo e não são produzidos no mercado nacional, necessita-se, oferecer alternativas de diagnóstico confiáveis, e rápidas, com tecnologia nacional. A proposta do presente trabalho foi a produção de anticorpos monoclonais (AcM) de alta afinidade contra o Neospora caninum (amostra Nc-1), para a utilização em testes de imunodiagnóstico como imunofluorescência, imunoistoquímica, ELISA e dot-ELISA. Para a produção dos AcM usou-se o protozoário sonicado, proveniente da cultura em células VERO e foi purificado por filtração, utilizaram-se os taquizoítos para a imunização dos camundongos BALB/c, usando como adjuvante a saponina, o que permitiu a obtenção de anticorpos policlonais. A fusão das células esplênicas, provenientes dos camundongos imunizados, com as células de mieloma SP2/0 resultou na obtenção de 72,4% de hibridomas secretores de anticorpos anti-Nc-1. Após a clonagem por diluição limitante obteve-se 78,2% dos clones secretores de anticorpos anti-Nc-1. Após a reclonagem por diluição limitante, foram obtidos 4 clones secretores de AcM da classe IgG. Os AcM IgG2a obtidos foram capazes de revelar as proteínas de massa molecular 25 kDa e 70 kDa por western blotting e inibirem a multiplicação dos taquizoítos em células VERO. Os anticorpos monoclonais produzidos poderão ser usados no desenvolvimento de testes mais sensíveis para estudos epidemiológicos da neosporose ou poderão ser utilizados na identificação de proteínas relevantes para o desenvolvimento de vacinas.

Little is known about the epidemiology of N. caninum infection in humans, particularly in populations with high T. gondii infection rates. This study aimed to investigate the presence of antibodies to N. caninum in Toxoplasma-seropositive and -seronegative individuals. Serum samples from 331 individuals were tested for the presence of IgG antibodies against N. caninum and T. gondii by indirect fluorescent antibody test (IFAT), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blot (WB). Serum samples were divided into 5 groups, as follows: 65 from HIV-positive patients; 62 from allograft transplantation patients; 87 from cancer patients; 53 from hemodialysis patients; and 64 from blood donors. Seroreactivity to N. caninum was confirmed by WB, and the criterion for positivity was the sera recognition of at least two out of three immunodominant antigens (17, 29 e 35 kDa) from the parasite. Seropositivity to N. caninum was predominantly seen in HIV-patients (28%), whereas significantly low seropositivity was detected in blood donors (5%). Intermediate rates were seen in cancer (13%), hemodialysis (11%), and allograft transplantation (7%) patients. Seropositivity to N. caninum in the three groups with higher seropositivity rates was significantly associated with seropositivity to T. gondii. The results of this study indicate the presence of N. caninum exposure and seroconversion in humans, particularly in HIV patients, who could have opportunistic and concurrent infections with T. gondii. These findings may bring a new concern for the unstable clinical health of HIV patients and the actual role of N. caninum infection in immunocompromised patients. / Pouco se sabe sobre a epidemiologia da infecção pelo N. caninum na espécie humana, particularmente, na população com altas taxas de infecção a T. gondii. O presente estudo teve como objetivo investigar a presença de anticorpos anti- N. caninum em pacientes imunodeprimidos. Um total de 331 amostras de soros provenientes de 5 grupos de indivíduos (65 pacientes HIV positivos, 62 pacientes transplantados, 87 pacientes apresentando neoplasias, 53 pacientes em processo de hemodiálise e 64 doadores de sangue) foi avaliado quanto a presença de anticorpos anti-N. caninum e anti-T. gondii pelos testes imunofluorescência (IFAT), imunoenzimático (ELISA) e Western blot (WB). Anticorpos IgG anti-N. caninum foram predominantemente detectados em pacientes HIV positivos (28%), enquanto que taxas de soropositividade menores foram encontradas nos demais grupos: pacientes oncológicos (13%), em hemodiálise (11%), transplantados (7%) e doadores de sangue (5%). Soropositividade para N. caninum foi significativamente associada com a soropositividade para T. gondii nos grupos de pacientes HIV positivos, oncológicos e em hemodiálise. A sororeatividade para N. caninum foi confirmada quando duas de três proteínas imunodominantes (17, 29 e 35 kDa) deste parasito foram reconhecidas nas amostras de soros pelo teste WB. Os resultados deste estudo indicaram uma maior taxa de soroconversão em pacientes imunodeprimidos quando expostos ao N. caninum, principalmente em pacientes HIV positivos. Esta soroconversão a N. caninum pode ser resultante de uma infecção oportunística e/ou recorrente, como ocorre também na infecção a T. gondii. Estes resultados revelam uma nova preocupação com pacientes imunodeprimidos que podem estar, de alguma forma, mais susceptíveis a desenvolverem infecções oportunistas por N. caninum. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas