Der Cortex von Säugetieren ist der Hirnbereich, der fundamental für höhere kognitive Funktionen wie Lernen, Gedächtnis, Aufmerksamkeit und komplexes Denken ist. Die Entwicklung des Cortex wird von neuralen Vorläuferzellen gesteuert, die schnell proliferieren, um ihren Pool zu expandieren, bevor sie zu differenzierenden Zellteilungen wechseln, um alle Neuronen zu generieren, aus denen der reife sechs schichtige Neokortex besteht. Der schrittweise Wechsel von Selbsterneuerung zu Neurogenese ist ein zeitlich regulierter Prozess, dessen Fehler schwere lebenslange kognitive Erkrankungen verursachen können. Aus diesem Grund ist es enorm wichtig zu verstehen, welche Faktoren die Schicksalsentscheidung der neuralen Vorläuferzellen regulieren. In den letzten zwei Jahrzehnten haben mehrere Studien die Wichtigkeit von nicht-kodierenden RNAs, wie lange nicht-kodierende und micro RNAs, für diese zeitliche Regulierung hervorgehoben. Mithilfe der Generierung einer kombinatorischen RFP/GFP Reporter Mauslinie, die die Isolierung von proliferierenden und differenzierenden Vorläuferzellen und neugeborenen Neuronen erlaubt, wurde berichtet, dass die lange nicht-kodierende RNA Miat als ein Regulator des neuralen Vorläuferzellen-Schicksals mittels Spleißen fungiert. Die Arbeit dieser Thesis zeigt, dass die Überexpression von Miat den Wechsel der neuralen Vorläuferzellen von proliferierenden zu neurogenen Zellteilungen verzögert und etabliert eine Strategie, um Miat-gespleißte Ziele auf Einzelpopulationslevel während der Corticogenese zu entdecken. Außerdem wurde die doppelte Reporter Mauslinie genutzt, um einen umfassenden und kompletten Katalog von micro RNAs, die in neuralen Vorläuferzellen und Neuronen exprimiert sind, zu erstellen. Dies führte zur Identifizierung von miR-486-5p als ein neuer Regulator der neuralen Vorläuferzellen-Schicksalsentscheidung.

Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cells ou iPSCs). Desde o surgimento desta tecnologia diversos modelos animais foram gerados, ampliando as possibilidades de seu uso na pesquisa, como por exemplo, na criação de modelos para doenças genéticas humanas como esclerose lateral amiotrófica, autismo, esquizofrenia, doença de Parkinson e Alzheimer, além do aprimoramento de características relevantes para produção animal. O modelo suíno é considerado vantajoso sobre os outros modelos animais principalmente pela criação já bem estabelecida e similaridades fisiológicas com os humanos. O intuito deste projeto foi reprogramar fibroblastos embrionários suínos através do sistema integrativo à iPSCs, para então diferenciá-las em células progenitoras neurais (neural progenitor cells, NPCs). Para isso, os fibroblastos foram transduzidos com vetores contendo sequencias humanas ou murinas dos genes OCT4, SOX2, c-Myc e KLF4 (hOSKM ou mOSKM) para formação das iPSCs. Estas foram caracterizadas quanto a morfologia, presença de fosfatase alcalina, a expressão dos genes exógenos e endógenos (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) através de imunofluorescência e RT-qPCR e formação de corpos embrióides. Então foram submetidas durante 14 dias ao meio de indução neural sob matriz extracelular comercial, gerando células potencialmente similares às NPCs. Estas foram caracterizadas morfologicamente, por imunofluorescência das proteínas NESTINA, BETA TUBULINA III e VIMENTINA, além da expressão de NESTINA e GFAP por RT-qPCR. Foram produzidas com sucesso 3 linhagens de iPSC em diferentes estágios de reprogramação e células positivas para todos os marcadores neurais testados. Os resultados apresentados deverão contribuir para a utilização do modelo suíno em futuros estudos voltados à medicina regenerativa e translacional. / In 2006, Takahashi and collaborators reported the induction into pluripotency of somatic cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs). Since then, this technique has much been developed; many animal models have been created opening a new series of opportunities in research. They enable the creation of models for human genetic diseases, for example, amyotrophic lateral sclerosis, autism, schizophrenia, Parkinson´s disease, Alzheimer´s disease and the enhancement of relevant characteristics in agriculture. The swine model is considered to present many advantages over others, including the well-known production and maintenance and physiological similarities to humans. The aim of this project was to reprogram porcine embryonic fibroblasts (pEF) into iPSCs using the lentiviral integrative system, followed by its differentiation into neural progenitor cells (NPCs). The cells were reprogrammed using vector containing either the human sequences (hOSKM) or the mouse sequences (mOSKM) for the OCT4, SOX2, c-Myc and KLF4 genes to form the iPSCs. They were characterized regarding the presence of the Alkaline Phosphatase enzyme, expression of exogenous and endogenous genes (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) through immunofluorescence and RT-qPCR, and embryoid body formation. Then, the cells were cultured with neural induction media for 14 days in commercial extracellular matrix, generating cells potentially like NPCs. Those were characterized regarding their morphology, immunofluorescence for NESTINA, BETA TUBULIN III and VIMENTINA and gene expression of NESTINA and GFAP. iPSCs were successfully reprogramed, generating 3 cell lines at different stages of reprograming and cells positive for all the neural markers tested were produced. The results shown will contribute to the use of the porcine model in future regenerative and translational medicine research.

在成年的哺乳類動物大腦中有兩個區域，可以不斷的有新的神經細胞生成，一個位於大腦側腦室旁內側(Subventricular zone of anterior lateral ventricle ;SVZ)，另一個位於海馬迴(hippocampus)內的齒狀迴(Subgran- ular zone of dentate gyrus ;SGZ) ，其中海馬迴是本論文主要探討的腦區。 神經前驅細胞(Neural progenitor cells :NPC)因具有自我更新(self -renewal）、增殖(proliferative）、多能(multipotent）的能力以及遷移性(Migration)，所以可利用海馬迴內生性的神經前驅細胞(NPC)，促進其增殖以替代因損傷、老化或疾病而損失的神經細胞。神經前驅細胞經由細胞體外培養過程會形成神經球(Neurospheres)，神經球和神經前驅細胞同樣具有自我更新以及可以分化成其他神經細胞的能力。 本研究觀察到，對成年神經新生進行體外藥物的篩選中，化合物Chemical-X，有明顯的促進神經新生的能力。實驗中取健康成年雄性大鼠為實驗動物，分離出成年大鼠之海馬迴神經前驅細胞。用Chemical-X處理後，觀察神經球自我更新能力，以及再把新生成的神經球利用免疫螢光染色處理，瞭解神經前驅細胞經藥物處理後所新生成的細胞，是否仍維持在神經前驅細胞的狀態。進而評估藥物能否達到促進神經新生的目的。

The influence of immunosuppressive drugs on neural stem/progenitor cell fate in vitro.

The influence of immunosuppressive drugs on neural stem/progenitor cell fate in vitro.

[ES] La lesión medular traumática (LM) se refiere a una condición neurológica en la que un insulto mecánico interrumpe la adecuada comunicación de impulsos nerviosos a través del sistema nervioso central (SNC), resultando en la pérdida de función locomotora por debajo del área lesionada. Lamentablemente, en la actualidad aún no existe cura efectiva para restaurar la funcionalidad después de una LM. La búsqueda de un tratamiento eficiente sigue siendo un gran desafío debido a nuestra aún incompleta comprensión de la multitud de procesos biológicos desencadenados por la lesión. La terapia celular destaca como la aproximación más recurrente para el tratamiento de la LM. En las últimas décadas, se han explorado varias estrategias celulares, siendo una de las más prometedoras el trasplante de células progenitoras neurales (CPN). Muchos estudios preclínicos demostrado el potencial del trasplante de CPN para proporcionar una recuperación motora en modelos animales, sin embargo, las mejoras funcionales en ensayos clinicos humanos son limitadas. Por lo tanto, aún se deben realizar esfuerzos para descubrir la cascada precisa de procesos moleculares a lo largo de la fisiopatología de LM, así como el mecanismo subyacente de los CPN. En ese contexto, el Capítulo 1 del presente trabajo tuvo como objetivo proporcionar una caracterización de los cambios en el perfil transcripcional medular a lo largo de las diferentes etapas temporales de una lesión severa contusiva. Además, hemos descrito el impacto transcripcional del trasplante de CPN en ratas lesionadas. Hemos demostrado que mientras la LM conllevó una fuerte desregulación de varios componentes de señalización de AMPc (entre ellos EPAC2), el trasplante de CPN pudo restaurar estas alteraciones transcripcionales. Para explorar el papel de EPAC2 en el mecanismo terapéutico mediado por CPN, realizamos un experimento de inhibición sostenida de EPAC2 mediante la administración de ESI-05. En comparación con los animales solo trasplantados, los animales CPN +ESI-05 mostraron un aumento en el área de cicatriz, una exacerbación de la polarización de la microglía hacia un perfil inflamatorio y una ampliación de la brecha de neuronas preservadas a lo largo de la lesión, sugiriendo que el trnasplante de CPN en el contexto de LM implican un mecanismo dependiente de EPAC2, reduciendo la neuroinflamación y proporcionando un entorno neuro-permisivo. El Capítulo 2 explora el potencial del AMPc para la regeneración de la LM. Hemos diseñado una estrategia innovadora para inducir AMPc en las neuronas corticoespinales a través de la activación optogenética de un adenilato ciclasa foto-inducible (bPAC). La estimulación optogenética en ratas con una hemisección dorsal torácica promovió una recuperación locomotora en comparación con el grupo control. Además, la estimulación de bPAC aumentó el número de neuronas marcadas retrógradamente desde el segmento lumbar tanto en la corteza motora como en la formación rafe-reticular, pero no en el núcleo rojo.La inmunotinción del tracto rafespinal mostró que la estimulación de bPAC aumenta el ratio de axones serotonérgicos caudales a la lesión correlacionando con una mejora funcional. Por último, la depleción del sistema serotoninérgico mediante la administración de 5,7-Dihydroxytryptamina suprimió la abolió la mejora mediada por bPAC, confirmando la implicación de la vía serotoninérgica en la recuperación de los animales estimulados. En resumen, se han proporcionado nuevos conocimientos sobre los cambios transcripcionales que ocurren a lo largo de la progresión de la LM y tras el trasplante de CPN, con énfasis en la señalización de AMPc. La manipulación optogenética de AMPc en las neuronas corticoespinales después de la LM ha demostrado ser efectiva para la recuperación funcional y permitido descubrir una ruta cortical alternativa a través del tracto descendente serotoninérgico / [CA] Lesió medul·lar traumàtica (LM) es una condició neurològica en la qual un traumatisme interromp la comunicació adequada dels impulsos a través del sistema nerviós central (SNC), amb el resultat de la pèrdua de la funció locomotora per baix de la zona lesionada. Lamentablement, en l'actualitat encara no hi ha una cura efectiva per a restaurar completament la funcionalitat de la medul·la espinal després de la lesió. La recerca d'un tractament eficient per a la LM roman un repte complex a causa de la nostra comprensió encara incompleta de la gran quantitat de processos biològics desencadenats per la lesió primària. La teràpia cel·lular destaca com l'aproximació més recurrent per al tractament de la LM. En les dècades passades, s'ha explorat diverses estratègies basades en cèl·lules i una de les més prometedores és el trasplantament de cèl·lules progenitores neurals (CPN). Molts estudis preclínics han demostrat el potencial del trasplantament de CPN per proporcionar una recuperació motora en models animals, no obstant això, les millores funcionals en pacients humans tractats són limitades. Per tant, encara s'han de fer esforços per a descobrir la cascada precisa de processos moleculars al llarg de la fisiopatologia de la LM, així com el mecanisme subjacent dels CPN. El Capítol 1 del present treball va tindre com a objectiu proporcionar una caracterització dels canvis en el perfil transcripcional espinal al la llarga de les diferents etapes temporals de una lesió contusiva. A més, s'ha descrit l'impacte transcripcional del trasplantament d'CPN en animals lesionats. S'ha demostrat que mentre la LM va causar una forta desregulació de diversos components de senyalització de AMPc (sent EPAC2 el gen més regulat a la baixa), el transplantament de CPN van ser capaç de restaurar les alteracions derivades de la LM. Per a explorar el paper d'EPAC2 en el mecanisme terapèutic mediat per CPN, es va realitzar un experiment de inhibició sostinguda d'EPAC2 degut a l'administració d'ESI en animals lesionats. En comparació amb els animals només trasplantats, els animals CPN+ESI-05 van mostrar un augment de l'àrea de cicatriu, una exacerbació de la polarització de les micròglies cap a un perfil inflamatori i una ampliació de la bretxa de neurones preservades a través de la lesió.Aquests resultats suggereixen que el trasplantament de CPN en el context de la LM involucren un mecanisme depenent d'EPAC2, reduint la neuroinflamació i proporcionant un entorn més neuropermissiu. El Capítol 2 va tindre com objectiu explotar el potencial de regeneració de AMPc dissenyant una nova estratègia per a les induccions artificials de AMPc en les neurones corticoespinals mitjançant l'activació optogenètica d'una adenilat ciclasa fotoinduïble (bPAC). L'estimulació diària de AMPc en rates que pateixen una hemisècció dorsal toràcica va promoure una recuperació en comparació amb els control. L'estimulació de bPAC va augmentar el nombre de neurones marcades retrògradament des del segment lumbar, tant a l'escorça motora com a la formació rafe-reticular, però no al nucli roig. A més, la immunotinció del tracte rafespinal va mostrar que l'estimulació de bPAC va augmentar la ràtio d'axons serotoninèrgic cabals a la lesió, cosa que es va correlacionar significativament amb una millora dels paràmetres funcionals. Finalment, la depleció del sistema serotoninèrgic mitjançant l'administració de 5,7-Dihydroxytryptamina va abolir la millora mediada per bPAC, confirmant la implicació de la via serotoninèrgica en la recuperació. En resum, la investigació ha proporcionat coneixements sobre els canvis transcripcionals que tenen lloc a la llarga de la progressió de la LM i després del trasplantament de CPN, amb un èmfasi especial en la senyalització d'AMPc. La manipulació optogenètica d'AMPc a les neurones corticoespinals després de la LM ha demostrat ser efectiva per a la recuperació funcional i ha permès descobrir una ruta cortical alternativa a través del tracte descendent serotoninèrg / [EN] Traumatic spinal cord injury (SCI) refers to a neurological condition in which a mechanic insult disrupts the proper communication of the impulses through the central nervous system (CNS), resulting on the loss of locomotor function below the injured area. Unfortunately, nowadays there is still no effective cure to completely restore the functionality of the spinal cord after the injury. Cell therapy is the most recurring approach for SCI treatment. In the past decades several cell-based strategies have been explored, being one of the most promising the transplantation of neural progenitor cells (NPCs). Many pre-clinical studies evidenced the potential of the NPCs transplantation to provide a substantial motor recovery in animal models, yet functional improvements in clinical trials have been limited. Therefore, efforts still need to be made in disclosing the precise cascade of molecular processes along SCI pathophysiology as well as the NPCs underlying mechanism. In that context, Chapter 1 of the present work aimed to provide a comprehensive characterization of the spinal transcriptional changes along the different temporal stages of rats suffering a severe contusive injury. Additionally, we have described the transcriptional impact of acute and subacute NPCs transplantation in injured animals. Interestingly we have shown that while SCI caused a strong dysregulation of several cAMP-signaling components (being EPAC2 the most downregulated gene), NPCs was able to restore SCI-derived alterations over this pathway with EPAC2 significant upregulation. In order to further explore EPAC2 role in NPCs-mediated therapeutical mechanism we performed a loss-of-function experiment by sustained EPAC2 inhibition via ESI-05 administration along with NPCs transplantation after SCI. Compared with only transplanted animals, NPCs+ESI-05 animals showed increased scar area, exacerbated microglia polarization into an inflammatory profile and widened gaps of preserved neurons across the lesion. Overall, these results suggest that NPC therapeutic mechanisms in the context of SCI involve an EPAC2-dependent mechanism, reducing neuroinflammation and providing a neuro-permissive environment. Chapter 2 aimed to further explore cAMP potential for SCI regeneration. We designed a novel strategy for artificial cAMP inductions in corticospinal neurons via optogenetic activation of a photoinducible adenylyl cyclase (bPAC). Daily optogenetic cAMP stimulation in rats suffering a thoracic dorsal hemisection, which completely disrupt the dorsal aspect of the corticospinal tract (CST), promoted and early and sustained locomotor recovery compared to non-treated control animals. We have shown that bPAC stimulation increased the number of retrograde traced neurons from the lumbar segment both in the motor cortex and the raphe-reticular formation, but not in the red nuclei. Moreover, immunolabelling of the raphespinal tract by 5-HT showed that bPAC stimulation increased the ratio of descending serotoninergic axons caudal to the injury which significantly correlated with improved functional parameters. Our results from corticobulbar projection study, WGA trans-synaptic tracing, and P-CREB analysis suggest that bPAC modulation of cortico-serotonergic pathway might occurs at the brainstem level. Lastly, the serotonergic system depletion by 5,7-Dihydroxytryptamine administration suppressed bPAC-mediated recovery, confirming the implication of the serotonergic tract in the recovery of stimulated animals. In summary, our research has provided new insights into the transcriptional changes that occur along SCI progression and after NPCs transplantation with a special emphasis on cAMP signaling. Optogenetic cAMP manipulation in corticospinal neurons after SCI has proven to be effective for functional recovery and allowed to unveil a cortical rerouting pathway through the serotonergic descending tract. / This research was funded by FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-BC21/ERDF]. Part of the equipment employed in this work was funded by Generalitat Valenciana and cofinanced with ERDF funds (OP ERDF of Comunitat Valenciana 2014– 2020) and the UE; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) incluido en el Programa Operativo FEDER de la Comunidad Valenciana 2014-2020. B. MartinezRojas was supported by a grant from the Conselleria de Educación, Investigación, Cultura y Deporte de la Generalitat Valenciana and the European Social Fundation ACIF/2019/120. / Martínez Rojas, B. (2024). Transcriptional Insights for Spinal Cord Injury and Neural Precursor Cell Therapy: Toward a Novel Optogenetics-Based Treatment for cAMP Neuronal Induction [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202972

Le virus de la maladie de Borna (BDV) est un virus persistant dans le système nerveux central responsable de troubles du comportement chez l’animal et possiblement chez l’homme. En utilisant des cellules progénitrices neurales humaines, des travaux antérieurs à mon arrivée au laboratoire ont montré que BDV altère la neurogenèse humaine. Les objectifs de ma thèse étaient d’identifier les déterminants viraux responsables de cette altération et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avons montré que la phosphoprotéine (P) et la nucléoprotéine (N), mais pas la protéine X, induisent une inhibition spécifique de la neurogenèse humaine, la genèse des astrocytes n’étant pas altérée. Ensuite, focalisant notre étude sur P, nous avons montré qu’elle affectait particulièrement la genèse des neurones GABAergiques. La caractérisation moléculaire a ensuite révélé une diminution de l’expression de gènes impliqués dans la spécification (ApoE et Noggin) et dans la maturation (SCG10/Stathmin2 et TH) neuronale. En conclusion, nos résultats démontrent, pour la première fois, qu’une protéine virale perturbe la neurogenèse GABAergique humaine, un processus connu pour être dérégulé dans certaines maladies psychiatriques. Ils améliorent ainsi notre compréhension de la pathogenèse de ce virus persistant et de son rôle possible dans les maladies psychiatriques chez l’homme. / Borna disease virus (BDV) is a persistent neurotropic virus causing neurobehavioral disorders in animals and possibly humans. Using human neural progenitor cells, it had been shown, before my arrival in the laboratory, that BDV induces an alteration in human neurogenesis. Here, we aimed at identifying the viral determinants involved in BDV-induced impairment of neurogenesis and at characterizing the underlying molecular mechanisms. We demonstrated that the phosphoprotein (P) and the nucleoprotein (N), but not the X protein, reduce neurogenesis. Focusing on the role of P, we evidenced an impairment of GABAergic neurogenesis. Then, seeking for the molecular mechanisms responsible for P-induced inhibition of neurogenesis, we showed that it induces a decrease in the expression of cellular factors involved in either neuronal specification (ApoE, Noggin) or maturation (SCG10/Stathmin, TH). Thus, in this study, we demonstrated for the first time that a viral protein is capable of inhibiting GABAergic neurogenesis, a process that is dysregulated in some psychiatric diseases. Our results improve our understanding of the pathogenesis of this persistent neurotropic virus and of its possible role in psychiatric disorders.

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Retinoic acid (RA) is a well-known neurodevelopmental signaling molecule. It is reported to induce effects on neurite formation in differentiating neurons and to interfere with the actin cytoskeleton. Therefore, this project aimed to investigate the mechanisms behind effects of RA on the actin cytoskeleton of developing neurons using the C17.2 neural progenitor cells (NPCs) in vitro model. The goal was to evaluate the morphological effects the growth cone had upon exposure to RA agonist and antagonist, and to analyze the expression of three genes: Coronin actin-binding protein 1C(Coro1c), Cdc42 effector protein 4 gene (Cdc42), and Fibronectin (Fn1). These genes were selected because of their relation to actin dynamics and/or their regulation by the Wnt pathway, which regulates/affects actin reorganization. Since the Wnt pathway was also shown to be affected by RA, this study aimed to investigate the relationship between RA and actin through the Wnt pathway. Cdc42 and Fn1 are related to both the Wnt pathway and actin dynamics, whereas Coro1cis a known actin-related protein. The expressions showed significant increase with Coro1c, while Cdc42 and Fn1 had a similar overall trend increase with the RA agonist. The RA antagonist showed no significant effect, except a trend decrease in all the genetic expressions. All genetic expression effects subside with the increase of RA agonist and antagonist concentrations. The results suggest the changes in actin filaments are related to a low dose effect of RA. The findings indicate a possibility of a regulation mechanism that controls actin-related gene expression in response to RA. This mechanism is possibly not restricted to the Wnt pathway seeing that a non-Wnt related gene was affected as well.