Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das die Polymerisation von Tubulin fördert und die Mikrotubuli stabilisiert. Folglich wird angenommen, dass Tau essentiell für die neuronale Morphogenese ist, vor allem für die Axonenausbildung und -aufrechterhaltung. Mittels tangentieller Nissl-gefärbter Schnitte von Mäusegehirnen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Tau-knockout Mäuse die regelhafte thalamokortikale Barthaar-projektion („Barrel“ Konfiguration) entwickeln. Der Einfluss von Tau auf die Entstehung von Dendriten wurde anhand von Golgi-gefärbten Präparaten untersucht. Die Sholl-Analyse der gefärbten CA1-Pyramidenzellen zeigte, dass die Komplexität apikaler Dendriten durch das Fehlen von Tau reduziert wurde, während die Basaldendriten unbeeinflusst blieben. Das Tau-Protein scheint demzufolge unwesentlich für die Entstehung von axonalen Verbindungen im embryonalen Gehirn zu sein, ist aber beteiligt an der Steuerung des dendritischen Verzweigungsmusters. Ferner wurde beobachtet, dass sowohl die adulte Neurogenese, als auch die Mikrotubuli-Stabilität in den Apikal- und Basaldendriten und die Synapsen von dem Fehlen des Tau-Proteins unbeeinflusst blieben. In primären Zellkulturen aus dem Kleinhirn von Tau-knockout und Tau-wildtyp Mäusen konnten zwischen den zwei Genotypen keine signifikanten Unterschiede in der Länge oder im Verzweigungsmuster der Dendriten und der Axone von Körnerzellen beobachtet werden. Die Untersuchung der Effekte einzelner Tau-Isoformen auf die Morphologie von N2A-Zellen zeigte, dass es Unterschiede sowohl zwischen Tau-defizienten und Tau-positiven Zellen, als auch zwischen Zellen mit den verschiedenen Tau-Isoformen gibt. Das Tau-Protein übt demnach in vivo einen wichtigen Einfluss auf die Morphologie der Nervenzellen und besonders der Dendriten aus, welcher in vitro weiter analysiert wurde.:Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau 1 1.2 Bedeutung des Tau-Proteins beim Menschen: Tauopathien 3 1.3 Bedeutung des Tau-Proteins beim Menschen: Mikrodeletion des MAPT-Lokus 4 1.4 Ergebnisse aus bisherigen Studien mit Tau-knockout Tieren 6 1.5 Aufgabenstellung 7 2 Material und Methoden 9 2.1 Material 9 2.1.1 Versuchstiere 9 2.1.2 Chemikalien 9 2.1.3 Häufig verwendete Lösungen 10 2.1.4 Geräte 10 2.2 Histologie 11 2.2.1 Fixierung 11 2.2.2 Golgi-Einzelschnittimprägnierung 11 2.2.3 Gefrierschnitte 11 2.2.4 Nissl-Färbung 12 2.2.5 Immunhistochemische Markierungen 13 2.3 Morphometrie 15 2.3.1 Sholl-Analyse 15 2.3.2 Volumenbestimmung 16 2.3.3 Zellzahl (Neurogenese) 17 2.3.4 Synapsenzahl 17 2.4 Proteinbiochemie 19 2.4.1 Proben 19 2.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 19 2.4.3 Western Blot 20 2.4.4 Immundetektion am Western Blot 21 2.5 Transfektion von Nervenzellen in primärer Zellkultur 25 2.5.1 Primäre Zellkultur 25 2.5.2 Transfektion von primären Zellkulturen 25 2.5.3 Morphometrische Analyse von Körnerzellen des Kleinhirns 26 2.6 Klonierung von Tau-Protein-Isoformen 27 2.6.1 Klonierungsstrategie zur Herstellung eines pIRES-DsRed-Tau Vektors 27 2.6.2 Agarose-Gelelektrophorese 30 2.6.3 Gelextraktion der verschiedenen Tau-Isoform-Sequenzen 30 2.6.4 Herstellung chemisch kompetenter E.coli Zellen 31 2.6.5 Chemische Transformation kompetenter E. coli Zellen 32 2.6.6 Animpfen 32 2.6.7 Plasmid-DNA Purifikation aus 15ml Medium („Miniprep”) 32 2.6.8 Schneiden mit Restriktionsendonukleasen 33 2.6.9 Plasmidpräparation aus 100 ml Medium („Midiprep“) 33 2.6.10 Transfektion von N2A-Zellen mit pIRESRed-Tau 34 2.6.11 Rekonstruktion der transfizierten N2A-Zellen 35 2.7 Statistische Auswertung 36 3 Ergebnisse 37 3.1 Thalamokorticale Projektionen 37 3.2 Komplexität der Dendriten von CA1-Pyramidenzellen 37 3.3 Adulte Neurogenese im Hippocampus 41 3.4 Volumen des Hippocampus 43 3.5 Glia 45 3.6 Synapsen 46 3.7 Stabilität der Mikrotubuli 48 3.8 Mikrotubuli-assoziierte Proteine 50 3.9 Entwicklung in vitro 52 3.9.1 Primärkulturen 52 3.9.2 N2A-Zellkultur 54 4 Diskussion 58 4.1 Diskussion der Methoden 58 4.1.1 Herstellung von Tau-knockout Mäusen 58 4.1.2 Golgi-Einzelschnittimprägnierung und die dreidimensionale Zellrekonstruktion 59 4.1.3 Neurogenese 60 4.1.4 Volumenbestimmung von Hippocampus und Gyrus dentatus 61 4.1.5 Synaptische Marker 61 4.1.6 Western Blot 62 4.1.7 Transfektion von primären Zellkulturen 62 4.1.8 Transfektion von N2A-Zellen mit humanen Tau-Isoformen 63 4.2 Vergleich mit bekannten Daten aus der Forschungsliteratur 64 4.2.1 Axonogenese 64 4.2.2 Dendritogenese 64 4.2.3 Mikrotubuli-assoziierte Proteine und Mikrotubuli-Stabilität 67 4.2.4 Neurogenese 67 4.2.5 Synaptogenese 68 4.2.6 Rolle der einzelnen Isoformen 68 4.3 Bedeutung für die Medizin 71 4.4 Fazit 72 5 Zusammenfassung 73 6 Literaturverzeichnis 76 Posterpräsentationen 88 Danksagung 89 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 90 Lebenslauf 91

Adult hippocampal neurogenesis entails a continued recruitment of neural precursor cells (NPCs) into active cell cycle and their progressive transition into post-mitotic granule cells. These adult born neurons integrate into the existing circuitry and confer structural plasticity, which aids in key hippocampal functions. For sustained neurogenesis, the cell cycle entry of the NPCs has to be tightly controlled. Environmental cues strongly, and differentially, regulate this checkpoint. Voluntary physical activity represents such an established strong stimulus that results in enhanced proliferation within the neurogenic niche. However, mechanistic insights into the maintenance and regulation of quiescence and the responsiveness of the NPCs to acute physical activity, as a form of adaptive neurogenesis, are yet to be elucidated. In my doctoral studies, we identified redox regulation as a key pathway regulating the cellular state equilibrium. I further explored the role of cellular oxidative stress in the neurogenic course and in adaptive neurogenic responses. Our results show that non-proliferative precursors within the hippocampal dentate gyrus, unlike in other stem cell systems, are marked by high levels of cellular reactive oxygen species (ROS). Using cytometric methodologies, ex vivo bioassays and transcriptional profiling, we revealed that classifying cells based on intracellular ROS content identified functionally defined sub-populations of adult NPCs. We propose that a drop in intracellular ROS content precedes the transition of cellular states, specifically from quiescence to active proliferation. Acute physical activity involves the activation of non- proliferating cells through a transient Nox2-dependent ROS surge in high-ROS, quiescent NPCs. In the absence of Nox2, baseline neurogenesis was unaffected, but the activity- dependent response was abolished. These findings shed new light on the discrete cellular events, which maintain the homeostasis between distinct cellular states of NPCs within the adult murine hippocampus.:Zusammenfassung 3 Summary 4 Acknowledgements 5 Index 8 List of figures 10 List of tables 11 Abbreviations 12 Publications 14 Introduction 15 Adult hippocampal neurogenesis 16 Adult subventricular neurogenesis 21 Methods to study adult neurogenesis 23 Environmental regulation of neurogenesis 26 Redox regulation in a stem cell 29 Working hypothesis 31 Specific aims 31 Materials and methods 32 Mice 34 Physical activity paradigm 35 Thymidine labelling and tissue preparation 35 Fluorescence immunohistochemistry 35 DG and SVZ dissection and dissociation 36 Flow cytometry 36 Gating for ROS classes 36 Neurosphere culture 37 Generation of monolayer culture 37 Inducing quiescence through BMP4 treatment 38 Next Generation sequencing (NGS) 38 RNA extraction 38 Quality control and differential expression 39 Functional enrichment and expression profiles 41 RNA isolation and quantitative RTPCR (qRT-PCR) 43 Ki67 immunochemistry and quantification of in vivo proliferation 45 Quantification and statistical analysis 46 Data and software availability 48 Results 49 Intracellular ROS content functionally delineates subpopulations of neural precursor cells 49 Resolution of ROS profiles of DG and SVZ and neurosphere bioassay 49 Distribution of Nes-GFP cells into different ROS classes 54 Neural precursors of the different ROS classes have distinct molecular profiles 55 Changes in intracellular ROS content precede cell fate changes 65 ROS profiling of other cell types within the DG 70 ROS profiling of Astrocytes and type-1 cells 70 ROS profiling of Doublecortin (Dcx)positive cells of the neurogenic lineage 74 ROS profiling of microglial cells within the DG 77 Resolving the response of Nes-GFP subpopulations to environmental stimulus 78 Nes-GFP+ cells of the hiROS class specifically respond to physical activity 81 Changes in ROS content are not driven by mitochondrial activity 83 In vitro monolayer culture of NPCs as an independent corroboration 86 Discussion 89 The organization of an active stem cell niche with respect to redox content 89 Cytometric classification of cells within the DG 91 Establishing the cellular states of redox defined subsets of Nes-GFP+ adult precursors within the DG 95 Timeline of baseline proliferation within precursors and identifying the subset of precursors responsive to de novo physical activity 97 Monolayer culture to study cellular states and redox regulation 100 Nox2 dependency as a discriminatory feature of adaptive neurogenesis 101 Conclusion 103 References 104 Declarations 122 Anlage 1 122 Anlage 2 124

The hippocampus is a brain area fundamental for cognitive functions, such as learning, memory, spatial navigation and emotion regulation, and is mainly affected in Alzheimer’s disease (AD). AD is an irreversible neurodegenerative disease, characterized by pathological protein aggregations and cognitive impairments. To date, there is no treatment for Alzheimer’s disease. The search for a therapy is urgently needed to alleviate the suffering of patients and relieve the burden on society. Neural stem cells (NSCs) in the hippocampal neurogenic niche sustain continuous neurogenesis in adulthood. Adult hippocampal neurogenesis (AHN) is functionally associated with many cognitive and emotional functions in humans and rodents. In particular, hippocampal neurogenesis is impaired in AD patients and AD mouse models and may be a putative therapeutic target for curing AD. In my project, endogenous hippocampal neurogenesis is manipulated in the 3xTg AD mouse model by a chronic, genetically-driven expansion of hippocampal NSCs. Exploiting intrinsic NSCs potential to generate newborn neurons increases the neurogenesis in 3xTg AD mice. The boosted neurogenesis ameliorates the anxiety-like behavior, improves spatial navigational performances and restores the connectivity of the hippocampal network in AD. Altogether, this study demonstrates the beneficial effect of enhancing neurogenesis by exploiting the endogenous NSCs reserve to rescue AD phenotypes and elucidates the functional contribution of neurogenesis to learning and memory. The findings support and highlight the therapeutic potential of enhancing neurogenesis in the treatments of neurodegenerative diseases.

Einleitung: Innerhalb der Säugetiere ist ein Spektrum der entwicklungsgeschichtlichen Muster zur Geburt zwischen altrizial und präsozial bekannt. Nesthockende bzw. altriziale Arten bringen nach einer kurzen Trächtigkeit hilflose, unreife Jungtiere zur Welt. Nestflüchtende bzw. präsoziale Arten gebären nach einer langen Gestationsdauer gut entwickelte, reife Jungtiere. Vorläufige Daten deuten darauf hin, dass sich die Entwicklungsmuster des Neokortex zwischen nestflüchtenden und nesthockenden Spezies unterscheiden; ein detaillierter Vergleich der Gehirnentwicklung zwischen ihnen fehlt jedoch. Ziel der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war es, die Muster der Gehirnentwicklung, insbesondere der Neokortex-Neurogenese und -Reifung, zwischen zwei Spezies desselben Taxons, dem nestflüchtenden Meerschweinchen vom Dunkin Hartley Stamm (DH) und dem nesthockenden Farbenzwerg (FZ)- Kaninchen , zu vergleichen und ein besseres Verständnis der Evolution von Altrizialität und Präsozialität bei Säugetieren zu ermöglichen. Tiere, Material und Methoden: In die Untersuchung gingen insgesamt 18 Gehirne von pränatalen DH und 19 Gehirne von prä- und postnatalen FZ ein. Das Alter der Tiere reichte vom Tag 15 bis Tag 60 post conceptionem (p. c.). Die Gehirne wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Tissue-Tek eingebettet. Anschließend wurden vom Telencephalon 30 µm dicke Kryostatschnitte hergestellt. Die neuralen Vorläuferzellen (NPCs), postmitotischen Neurone sowie die charakteristischen Strukturen der Gliogenese und Neuronenreifung wurden mittels Immunhistochemie für die folgenden Marker untersucht: T-Box Gehirnprotein 1 (Tbr1) und 2 (Tbr2), gepaartes Box-Protein Pax6 (Pax6), Hu C/D- Protein (Hu C/D), Neurofilament H (NF), Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (Map2), Basisches Myelinprotein (MBP), Synaptophysin und saures Gliafaserprotein (GFAP). Die Fluoreszenzbilder wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop Leica SP8 aufgenommen und mit Fiji sowie Photoshop CS6 software (Adobe) prozessiert. Im Anschluss wurden die Zellen mit einem Fiji Multiclass Cell Counter plug-in quantifiziert und mit Prism ausgewertet. Die Summe der NPCs, sowie die Dicke der Kortikalplatte wurde von korrespondierenden Stadien der kortikalen Neurogenese (kN) des DH und des FZ mittels ungepaarten Student's t-Test statistisch ausgewertet, dabei wurden p-Werte unter 0,05 als signifikant angesehen. Die Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt und von der Landesdirektion Leipzig genehmigt (T 50/14, 48/16, 11/19). Ergebnisse: Zunächst wurde die kN der beiden Spezies untersucht. Der Beginn, der Höhepunkt und das Ende der kN wurden anhand des Auftretens Pax6-, Tbr2- und Tbr1 positiver Zellen festgestellt. Der FZ wies vom Tag 10/15 p. c. bis zum Tag 30/35 p. c. entsprechende NPCs auf, das DH hingegen vom Tag 20/25 p. c. bis zum Tag 40/50 p. c. Insgesamt zeigt das DH gemessen in p. c. Tagen also einen späteren Beginn und eine längere Dauer der kN. Das DH zeigte im Vergleich zum FZ zu Beginn der kN signifikant mehr Tbr2-positive/Pax6-negative NPCs und zum Ende signifikant mehr Pax6-positive/Tbr2-negative NPCs. Erstaunlich war, dass Unterschiede in den basalen Vorläuferzellen (BP)-Subtypen zwischen dem DH und dem FZ festgestellt wurden. Beim FZ wurde eine signifikant höhere Anzahl BPs gefunden, die Tbr2- und Pax6-positiv sind. Dies geht mit dem Ergebnis einher, dass auch die Anzahl der am Ende der kN generierten Neurone beim FZ höher ist als beim DH. Die Dicke der Kortikalplatte zum Ende der kN war hingegen beim DH signifikant dicker als beim FZ. Im zweiten Teil der Studie wurde die Gliogenese und Neuronenreifung der beiden Spezies untersucht. Hier konnten die Ergebnisse die grundlegende, den meisten Säugetieren gemeine, Abfolge des Auftretens der charakteristischen Strukturen für das DH und den FZ bestätigen. Der neurale Reifestatus zur Geburt zwischen den beiden untersuchten Spezies war deutlich unterschiedlich. Das DH verfügt im Gegensatz zum FZ zur Geburt bereits über Neurone mit gut entwickelten Dendriten und myelinisierte Axone sowie Astrozyten. Schlussfolgerungen: Die Studie liefert umfassende Daten zu den unterschiedlichen Mustern der Kortexentwicklung zwischen dem präsozialen DH und dem altrizialen FZ, die als empirische Referenzdaten in zukünftigen Studien dienen können und ein besseres Verständnis der Evolution von Altrizialität und Präsozialität bei Säugetieren ermöglichen. Während die grundsätzliche Reihenfolge der kortikalen Neuro- und Gliogenese und der Neuronenreifung während der Frühentwicklung in den untersuchten Spezies bestätigt wurde, unterscheidet sich ihr spezifischer Zeitpunkt in Bezug auf das p. c. Alter und den Zeitpunkt der Geburt deutlich. Interessanterweise deuten die Daten darauf hin, dass der Neokortex des FZ eine größere Menge an hochproliferativen BPs enthält als der des DH, was die Ursache für den höheren Neuronen-Output sein könnte. Der höhere Reifestatus des Neokortex des DH bei der Geburt ist ein Beleg für die Annahme, dass präsoziale Arten die morphologischen Voraussetzungen für ihren hohen Funktionszustand bei der Geburt erworben haben und dass die Gehirnexpansion bei ihren Neugeborenen größtenteils auf vorgeburtlich initiierte Prozesse der Gliogenese und Neuronendifferenzierung und nicht auf eine verstärkte Neurogenese zurückzuführen ist.:Inhalt Seite 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Aufbau und Entstehung des Neokortex 3 2.1.1 Makroskopisch- und mikroskopisch-anatomischer Aufbau des Großhirns, insbesondere des Neokortex 3 2.1.2 Nervenzelltypen und Gliazellen des Neokortex 7 2.1.3 Morphologische Entwicklung des Neokortex während der Embryonal- und Fetalperiode 9 2.1.4 Unterscheidung kortikaler Stammzellen 10 2.1.5 Pränatale Neurogenese des Neokortex 12 2.1.6 Migration der Neurone 15 2.1.7 Differenzierung und Reifung der Neurone 16 2.2 Altrizialität und Präsozialität 17 2.2.1 Grundlegende Merkmale altrizialer Spezies 17 2.2.2 Grundlegende Merkmale präsozialer Spezies 18 2.2.3 Unterschiede in der Gehirnentwicklung zwischen altrizialen und präsozialen Spezies 18 2.2.4 Indizes zur Differenzierung altrizialer und präsozialer Spezies 20 2.3 Der Farbenzwerg und das Meerschweinchen 22 2.3.1 Der Farbenzwerg 22 2.3.2 Das Meerschweinchen 25 2.3.3 Gemeinsamkeiten und Unterschiede 27 3 Publikationen 29 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 1 29 3.1.1 Publikation 31 4 Diskussion 53 4.1 Beginn und Dauer der kortikale Neurogenese 53 4.2 Output der kortikalen Neurogenese 54 4.3 Neuronaler Reifezustand, IND und Nestflüchter-Score 57 4.4 Ausgewählte evolutionsbiologische Aspekte 60 5 Zusammenfassung 64 6 Summary 66 7 Literaturverzeichnis 68

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Die vorliegende Arbeit beinhaltet verschiedene Aspekte der Embryogenese des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus (Chelicerata, Xiphosura), darunter die frühe Neurogenese, die Axogenese, eine Analyse der "Kopf"segmentierung bei Cheliceraten und anderen Arthropoden, sowie das Expressionsmuster des Homöoboxgens Distal-less insbesondere in neuronalen Zusammenhängen. Darüber hinaus wurde eine neue Embryonalstadieneinteilung geleistet. Markierungen mit Phalloidin sowie weiterer neurospezifischer Marker ergaben, daß die frühe Neurogenese bei Limulus polyphemus durch die Immigration von Zellclustern erfolgt. Die Zellen nehmen eine flaschenförmige Gestalt annehmen, bevor sie sich aus dem ventralen Neuroektoderm lösen. Die Anzahl der Zellen pro Zellcluster steigt mit fortschreitender Entwicklung. Die Zellcluster konzentrieren sich in in Zentrum jedes Hemisegmentes, und in ihrem dorsalen Bereich beginnt die rasch voranschreitende Axogenese. Die Untersuchung der "Kopf"segmentierung mittels alpha-Tubulin-Markierungen bei Limulus polyphemus, Triops cancriformis (Crustacea) und Lepisma saccharina (Hexapoda) ergab sowohl bei der Entwicklung des circumoesophagealen Neuropilringes und der Innervierung der dazugehörigen Anhangspaare als auch hinsichtlich des Verlaufs des Stomatogastrischen Nervensystems beachtliche Übereinstimmungen, die entgegen der klassischen Auffassung den Schluß zulassen, daß das Deutocerebrum der Cheliceraten keineswegs reduziert wurde oder mit dem Tritocerebrum verschmolzen ist, sondern die Chelicere innerviert. Somit wäre das Chelicerenneuromer homolog zum Deutocerebrum der Crustacea und Hexapoda (1. Antenne). Der Vergleich des Expressionsmuster des Homöoboxgens Distal-less bei Limulus und Lepisma saccharina ergab neben den typischen Expressionen in auswachsenden Extremitäten- und andern Anhangsknospen bei beiden Vertretern Expressionen in neuronalen Zusammenhängen (im Lobus opticus, Ganglien bei Limulus oder in das ZNS umgebende Zellen bei Lepisma), an den verschiedensten Positionen späterer Sinnesorgane wie Mechano- oder Chemorezeptoren. Doppelmarkierungen mit Synorf-1 deuten darauf hin, daß es sich bei den Dll-positiven Zellen zum größten Anteil um Glia-Zellen handelt. / The following study contains different aspects of the embryology of the horseshoe crab Limulus polyphemus (Chelicerata, Xiphosura) with the main focus on early neurogenesis, axogenesis and the "head"segmentation in chelicerates and other arthropods. The expression pattern of the homeobox gene Distal-less was examined with main focus on neuronal correlations. In addition, a new staging was provided. Phalloidin stainings and other markers showed that the early neurogenesis in Limulus polyphemus happens via immigration of cell clusters. Cellclusters in the prosoma contain cells that become bottle shaped before they immigrate from the ventral neuroectoderm. The number of these cells increases during further development, and the cells concentrate in the middle of each hemisegment. Axogenesis starts at the dorsal edge of these concentrated cellclusters and progresses quite fast building the typical ladder like CNS of arthropods. The investigation of the "head"segmentation using alpha-tubulin stainings in Limulus polyphemus, Triops cancriformis (Crustacea), and Lepisma saccharina (Hexapoda) showed remarkable similarities in the development of the circumesophageal neuropil ring, the related appendages, and the course of the stomatogastric nerves. These results lead to the thesis that the deutocerebrum of chelicerates is neither completely reduced nor totally merged into the tritocerebrum but innervates the chelicerae which contradicts the classical view. According to these results the neuromer of the chelicerae would be homologous to the deutocerebrum of Crustaceans and Hexapods (first antennae). The expression pattern of the homeobox gene Distal-less was examined and compared in Limulus polyphemus and Lepisma saccharina. Beside the typical expression pattern in the developing appendages a participation of the gene in development of the nervous system was observed. Dll positve cells were found in or at least in direct contact with the CNS (optical lobe, ganglia in Limulus or surrounding the entire CNS including the brain of Lepisma), at different positions of later mechano- and chemoreceptors (lateral spines, bristles, flabellum, Johnstons organ etc.). Double stainings using Dll and Synorf-1 showed that at least most of these Dll-postive cells are most likely glia cells.

Es wurde Zellneubildung im erwachsenen cerebralen Cortex der Maus in Abhängigkeit von Umweltbedingungen und Aktivitätsgrad untersucht. Es war bekannt, dass eine reizreiche Umgebung und körperliche Aktivität die Neubildung von Nervenzellen im erwachsenen Hippokampus steigern. Als Zellproliferationsmarker wurde BrdU appliziert und BrdU-inkorporierende Zellen 1 Tag und 4 Wochen nach BrdU-Gabe unter Verwendung immunhistochemischer Methoden zur Detektion BrdU-inkorporierender Zellen in verschiedenen kortikalen Regionen und Schichten quantifiziert. Die phänotypische Charakterisierung BrdU+ Zellen wurde durch kombinierte Verwendung immunhistochemischer Methoden und konfokaler Mikroskopie vorgenommen. Die im adulten murinen cerebralen Cortex proliferierenden Zellen differenzierten weit überwiegend glial. Keine der kortikalen BrdU+ Zellen zeigte zweifelsfreie Zeichen einer neuronalen Differenzierung. Damit scheint die adulte Nervenzellneubildung unter physiologischen Bedingungen eine regionale Spezialität des Hippokampus und anderer Strukturen zu sein. Weder körperliche Aktivität (RUN) noch eine reizreiche Umgebung (ENR) führten 1 Tag oder 4 Wochen nach BrdU zu einem signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe (CTR), was die Anzahl BrdU+ Zellen im gesamten Cortex zusamengefaßt betrifft. Dagegen konnten die vorbeschriebenen Effekte von RUN und ENR auf hippokampale BrdU-inkorporierende Zellen repliziert werden. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass die Verstärkung adulter Neurogenese durch RUN und ENR im Gyrus dentatus des Hippokampus eine hippokampus-spezifische Reaktion und nicht etwa Teil einer generalisierten zentralnervösen Reaktion ist. Jedoch konnte gezeigt werden, dass körperliche Aktivität und eine reizreiche Umgebung zur lokalen Beeinflussung kortikaler Zellneubildung in bestimmten Schichten und Regionen führten. So konnten bei RUN-Tieren signifikant mehr BrdU+ Zellen in Schicht I des cingulären, motorischen und visuellen Cortex als bei CTR-Tieren gefunden werden. ENR-Tiere hatten 4 Wochen nach BrdU signifikant mehr BrdU+ Zellen in Schicht II/III des visuellen Cortex als CTR-Tiere. Die Phänotypisierung BrdU+ Zellen in diesen kortikalen Bereichen ergab, dass RUN zu einer lokalen, deutlich ausgeprägten Verstärkung der Neubildung von Mikroglia führte, während ENR tendentiell lokal kortikale Astrozytogenese verstärkte (signifikant in Schicht I des motorischen Cortex 4 Wochen nach BrdU). Damit konnte erstmals berichtet werden, dass körperliche Aktivität zelltypspezifisch die Neubildung kortikaler Mikroglia stimuliert. Dieses Ergebnis ist zunächst überraschend, da mikrogliale Proliferation und Aktivierung klassischweise im Zusammenhang mit Schadenszuständen des ZNS gesehen werden. In der Tat ist dies einer der ersten Befunde, der eine mikrogliale Reaktion mit nicht-pathologischen, vollkommen physiologischen Bedingungen in Verbindung bringt. Dies könnte einen neuen Blickwinkel auf mikrogliale Funktionen eröffnen. / The effect of physical activity and enriched environment on cell genesis in the cerebral cortex of adult mice were investigated. It is well known that living under the conditions of an enriched environment and physical activity both enhance the generation of new neurons in the adult murine hippocampus. To label proliferating cells mice were injected with bromodesoxyuridine (BrdU). The number of BrdU incorporating cells in different regions and layers of the cerebral cortex was determined 1 day and 4 weeks after BrdU administration. To characterize cortical BrdU+ cells phenotypically immunohistochemistry and confocal microscopy were used. Adult-generated cortical cells were glial cells. None of all the examined cortical BrdU+ cells showed immunoreactivity for NeuN (expressed in mature neurons) unambiguously indicating that the generation of new neurons in the adult brain is a speciality of the hippocampus and other brain structures. Physical activity (RUN) and enriched environment (ENR) did not affect the number of BrdU+ cells in all cortical regions taken together compared to control animals (CTR), both 1 day and 4 weeks after BrdU. However, the known effects of RUN and ENR on hippocampal cell genesis were replicated suggesting that the enhancement of adult hippocampal neurogenesis by RUN and ENR is a hippocampus-specific reaction and not part of a generalized reaction of the adult cns. It was shown that physical activity and enriched environment had effects on cell genesis in distinct cortical layers and regions. RUN-animals had significantly more BrdU+ cells in layer I of the cingulate, motor and visual cortex than CTR. ENR-animals had significantly more BrdU+ cells in layer II/III of the visual cortex than CTR 4 weeks after BrdU. Phenotyping of BrdU+ cells in these cortical parts revealed that RUN led to a marked increase of the generation of microglia. ENR tended to enhance astrocytogenesis in several cortical parts (reaching significance in layer I of the motor cortex 4 weeks after BrdU). This is the first report that physical activity stimulates the generation of cortical microglia in a cell-type-specific and to some degree region-specific manner. This result is surprising because microglial proliferation and activation are generally thought to occur under conditions involving damage to the nervous system. In fact, this is one of the first reports linking a microglial reaction with an entirely physiological condition. This might shed a new light on microglial function.

Developmental biology adresses how cells are organised into functional structures and eventually into a whole organism. It is crucial to understand the molecular basis for processes in development, by studying the expression and function of relevant genes and their relationship to each other. A gene function can be studied be creating loss-of-function situations, in which the change in developmental processes is examined in the absense of a functional gene product, or in gain-of-function studies, where a gene product is either intrinsically overproduced or ectopically upregulated. One approach for a loss-of-function situation is the creation of specific mutants in single genes, and the zebrafish (Danio rerio) has proven to be an excellent model organism for this purpose. In this thesis, I report on two forward genetic screens performed to find new mutants affecting brain development, in particular mutants defective in development and function of the midbrain-hindbrain boundary (MHB), an organiser region that patterns the adjacent brain regions of the midbrain and the hindbrain. In the first screen, I could identify 10 specific mutants based on morphology and the analysis of the expression patterns of lim1 and fgf8, genes functioning as early neuronal markers and as a patterning gene, respectively. Three of these mutants lacked an MHB, and by complementation studies, I identified these mutants as being defective in the spg locus. The second screen produced 35 new mutants by screening morphologically and with antibodies against acetylated Tubulin, which marks all axonal scaffolds, and anti-Opsin, which is a marker for photoreceptors in the pineal gland. According to their phenotype, I distributed the mutant lines into 4 phenotypic subgroups, of which the brain morphology group with 18 mutant lines was studied most intensively. In the last part of my thesis, I characterise one of these brain morphology mutants, broken heart. This mutant is defective in axonal outgrowth and locomotion, and shows a striking reduction of serotonergic neurons in the epiphysis and in the raphe nuclei in the hindbrain, structures involved in serotonin and melatonin production. Studies in other model organisms suggested a role of factors from the floor plate and the MHB in induction of the serotonergic neurons in the hindbrain, and using broken heart, I show that Fgf molecules such as Fgf4 and Fgf8 can restore partially the loss of serotonergic neurons in the mutant. I conclude that forward genetic screens are an invaluable tool to generate a pool of mutations in specific genes, which can be used to dissect complex processes in development such as brain development.

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