Background: Human mast cells are capable of a wide variety of inflammatory responses and play a vital role in the pathogenesis of inflammatory diseases such as allergy, asthma, and atherosclerosis. We have reported that cigarette smoke extract (CSE) significantly increased IL-6 and IL-8 production in IL-1β-activated human mast cell line (HMC-1). Baicalein (BAI) has anti-inflammatory properties and inhibits IL-1β- and TNF-α-induced inflammatory cytokine production from HMC-1. The goal of the present study was to examine the effect of BAI on IL-6 and IL-8 production from CSE-treated and IL-1β-activated HMC-1.Methods: Main-stream (Ms) and Side-stream (Ss) cigarette smoke were collected onto fiber filters and extracted in RPMI-1640 medium. Two ml of HMC-1 at 1 × 10 6 cells/mL were cultured with CSE in the presence or absence of IL-1β (10 ng/mL) for 24 hrs. A group of HMC-1 cells stimulated with both IL-1β (10 ng/ml) and CSE was also treated with BAI. The expression of IL-6 and IL-8 was assessed by ELISA and RT-PCR. NF-κB activation was measured by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and IκBα degradation by Western blot.Results: Both Ms and Ss CSE significantly increased IL-6 and IL-8 production (p < 0.001) in IL-1β-activated HMC-1. CSE increased NF-κB activation and decreased cytoplasmic IκBα proteins in IL-1β-activated HMC-1. BAI (1.8 to 30 μM) significantly inhibited production of IL-6 and IL-8 in a dose-dependent manner in IL-1β-activated HMC-1 with the optimal inhibition concentration at 30 μM, which also significantly inhibited the enhancing effect of CSE on IL-6 and IL-8 production in IL-1β-activated HMC-1. BAI inhibited NF-κB activation and increased cytoplasmic IκBα proteins in CSE-treated and IL-1β-activated HMC-1.Conclusions: Our results showed that CSE significantly increased inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 production in IL-1β-activated HMC-1. It may partially explain why cigarette smoke contributes to lung and cardiovascular diseases. BAI inhibited the production of inflammatory cytokines through inhibition of NF-κB activation and IκBα phosphorylation and degradation. This inhibitory effect of BAI on the expression of inflammatory cytokines induced by CSE suggests its usefulness in the development of novel anti-inflammatory therapies.

Le CD40 ligand (CD40L) est une molécule thrombo-inflammatoire qui prédit des événements cardiovasculaires. Les plaquettes constituent la principale source du CD40L soluble (sCD40L) dans la circulation, avec la capacité d’influencer la fonction des plaquettes par l'intermédiaire de sa liaison à ses récepteurs plaquettaires : CD40, αIIbβ3 et α5β1. Nous avons précédemment démontré que la stimulation des plaquettes humaines avec le sCD40L induit une activation du nuclear factor kappa B (NF-κB), qui pourra jouer un rôle non génomique en amorçant les plaquettes. En effet, l’amorçage des plaquettes par le sCD40L augmente fortement l’activation et l’agrégation plaquettaire en réponse à des doses sous-optimales d’agonistes. Cependant, l’implication des différents récepteurs dans l’amorçage des plaquettes suite à l’activation du NF-κB par le sCD40L demeure inconnue. De plus, le transforming growth factor-B (TGF-B)-activated Kinase (TAK1), un régulateur majeur de l’inflammation, est activé par le sCD40L dans les cellules nucléées, et pourra ainsi être impliqué dans la signalisation sCD40L/NF-κB plaquettaire. D’autre part, le sCD40L se trouve en quantité élevée dans la circulation sanguine des patients coronariens. De plus, le traitement antiplaquettaire à l’Aspirine (ASA) est inefficace chez certains patients et son efficacité est réduite chez les patients à hauts risques d’évènements coronariens, ce qui augmente leur risque de sur-activation plaquettaire et de développer une thrombose. Des taux sanguins élevés de médiateurs thrombo-inflammatoires, tels que le sCD40L, peuvent expliquer de telles variabilités. Ainsi, ce projet a été entrepris dans le but d’élucider l’impact de l’axe sCD40L/NF-κB sur la fonction plaquettaire et sa modulation par l’ASA. Dans le premier volet de mon projet, nous avons identifié les récepteurs de sCD40L impliqués dans l'activation du NF-κB plaquettaire, leur signalisation en aval et leur implication dans l'agrégation plaquettaire. Nous avons montré que les plaquettes exprimaient les récepteurs du CD40L : CD40, αIIbβ3 et α5β1 et libéraient du sCD40L. Le sCD40L seul a induit une activation de NF-κB plaquettaire. Cet effet était absent des plaquettes de souris déficientes en CD40 (CD40-/-) et inhibé par le blocage de CD40, mais n'était pas affecté par le blocage de αIIbβ3 ou α5β1. L’axe sCD40L/CD40 a aussi activé TAK1 en amont de NF-κB. Dans les études fonctionnelles, le sCD40L seul n’a pas eu d’effet sur l’agrégation plaquettaire, mais a potentialisé l’agrégation en présence de doses sous-optimales de thrombine; cet effet a été aboli par des inhibiteurs de CD40, TAK1 et NF-κB. Cette première étude nous a permis de conclure que le sCD40L amorce les plaquettes via des voies de signalisation impliquant CD40/TAK1/NF-κB, ce qui prédispose les plaquettes à une activation et agrégation accrues en réponse à des stimuli thrombotiques. Dans le deuxième volet de mon projet, nous avons émis l’hypothèse qu’en présence de taux élevés de sCD40L, l’efficacité de l’ASA peut varier et avons visé à déterminer les effets de l’ASA sur la signalisation et l’agrégation des plaquettes en présence de sCD40L. Les effets de l'ASA sur les plaquettes humaines traitées au sCD40L, en réponse à des concentrations sous-optimales de collagène ou de thrombine, ont été évalués sur l'agrégation, la sécrétion de thromboxane A2 (TxA2) et la phosphorylation de p38 MAPK, NF-κB, TAK1 et la chaîne légère de la myosine (MLC). Le sCD40L a significativement augmenté la sécrétion de TxA2 par les plaquettes, en réponse à des doses sous-optimales de collagène et de thrombine; cet effet a été inversé par l'ASA. L'ASA n'a pas inhibé la phosphorylation de p38 MAPK, NF-κB, TAK1, que ce soit avec une stimulation plaquettaire par le sCD40L seul ou en présence des agonistes. Le sCD40L a potentialisé l'agrégation plaquettaire, un effet complètement inversé et partiellement réduit par l'ASA en réponse à une dose sous-optimale de collagène et de thrombine, respectivement. Les effets de l'ASA sur les plaquettes traitées au sCD40L avec du collagène étaient liés à l'inhibition du changement de forme des plaquettes et à la phosphorylation de la MLC. En résumé, l'ASA n'affecte pas la signalisation plaquettaire du sCD40L, mais empêche son effet sur la sécrétion de TxA2 et l'agrégation plaquettaire en réponse au collagène, via un mécanisme impliquant l'inhibition de la MLC. En conclusion, ce projet nous a permis de déterminer que l’amorçage des plaquettes par le CD40L via l’activation de NF-κB dépend du récepteur CD40 et la signalisation via TAK1. Ainsi, l’axe sCD40L/CD40/TAK1/NF-κB potentialise l’activation et l’agrégation en réponse à des stimuli thrombotiques, ce qui peut favoriser l’occurrence d’événements athéro-thrombotiques chez les patients coronariens. De plus, étant donné que l’ASA n’a pas d’effet sur la signalisation via l’axe sCD40L, le ciblage de cet axe dans les plaquettes peut avoir un potentiel thérapeutique chez les patients coronariens présentant des taux élevés de sCD40L et ne réagissant pas ou moins à l'ASA. / CD40 ligand (CD40L) is a thrombo-inflammatory molecule that predicts cardiovascular events. Platelets are the main source of soluble CD40L (sCD40L) in the circulation, with the ability to influence platelet function through its binding to platelet receptors: CD40, αIIbβ3, and α5β1. We have previously demonstrated that stimulation of human platelets with sCD40L induces activation of nuclear factor kappa B (NF-κB), which may play a non-genomic role in priming platelets. Indeed, platelet priming by sCD40L strongly enhances platelet activation and aggregation in response to suboptimal doses of agonists. However, the involvement of the different receptors in platelet priming following activation of NF-κB by sCD40L remains unknown. In addition, the transforming growth factor-B (TGF-B) -activated Kinase (TAK1), a major regulator of inflammation, is activated by sCD40L in nucleated cells, and may be involved in sCD40L/NF-κB signaling. On the other hand, sCD40L is high in the bloodstream of coronary patients, who receive Aspirin (ASA) for secondary prevention. However, antiplatelet therapy with ASA is ineffective in some patients and its efficacy is reduced in patients at high risk for coronary events, increasing their risk of platelet over-activation and developing thrombosis. High blood levels of thrombo-inflammatory mediators, such as sCD40L, may explain such variability. Thus, we undertake this project to elucidate the impact of the sCD40L/NF-κB axis on platelet function and its modulation by ASA. In the first part of our project, we aimed to identify the sCD40L receptors involved in the activation of platelet NF-κB, their downstream signaling and their involvement in platelet aggregation. We have shown that platelets express CD40L receptors: CD40, αIIbβ3 and α5β1 and release sCD40L. sCD40L alone induced activation of platelet NF-κB. This effect was absent in CD40-/- mouse platelets and inhibited by CD40 blockade, but was not affected by αIIbβ3 or α5β1 blockade. The sCD40L/CD40 axis has also activated TAK1 upstream of NF-kB. In functional studies, sCD40L alone had no effect on platelet aggregation but potentiated aggregation in the presence of suboptimal thrombin doses. The inhibitors of CD40, TAK1 and NF-κB abolished this effect. This first study concluded that sCD40L primes platelets via CD40/TAK1/NF-κB signaling pathways, which predisposes platelets to increased activation and aggregation in response to thrombotic stimuli. In the second part of our project, we hypothesized that in the presence of high levels of sCD40L; the effectiveness of ASA may vary. Accordingly, we aimed at determining the effects of ASA on signaling and aggregation of platelets in the presence of sCD40L. The effects of ASA on human platelets treated with sCD40L, in response to suboptimal concentrations of collagen or thrombin, were evaluated on aggregation, thromboxane A2 (TxA2) secretion and phosphorylation p38 MAPK, NF-κB, TAK1 and myosin light chain (MLC). sCD40L significantly increased TxA2 secretion by platelets in response to suboptimal doses of collagen and thrombin; this effect has been reversed by the ASA. ASA did not inhibit the phosphorylation of p38 MAPK, NF-κB, TAK-1, with platelet stimulation by sCD40L either alone or in the presence of agonists. sCD40L potentiated platelet aggregation, an effect completely reversed and partially reduced by ASA in response to a suboptimal dose of collagen and thrombin, respectively. In addition, the effects of ASA on sCD40L-treated platelets with collagen related to inhibition of platelet shape change and phosphorylation of MLC. In summary, ASA does not affect platelet signaling via sCD40L, but prevents its effect on TXA2 secretion and platelet aggregation in response to collagen, via a mechanism involving inhibition of MLC. In conclusion, this project allowed us to determine that platelet priming by sCD40L via activation of NF-κB depends on the CD40 receptor and signaling via TAK1. Thus, the sCD40L/CD40/TAK1/NF-κB axis potentiates activation and aggregation in response to thrombotic stimuli, which may promote occurrence of atherothrombotic events in coronary patients. In addition, since ASA has no effect on platelet signaling via the sCD40L axis, targeting of this axis in platelets may have therapeutic potential in coronary patients with high levels of sCD40L that are none or less responding to ASA.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第21403号 / 生博第404号 / 新制||生||53(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 垣塚 彰, 教授 HEJNA,James, 教授 渡邊 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Cold shock Y-box binding protein-1 (YB-1) coordinates several molecular processes between the nucleus and the cytoplasm and plays a crucial role in cell function. Moreover, it is involved in cancer progression, invasion, and metastasis. As trophoblast cells share similar characteristics with cancer cells, we hypothesized that YB-1 might also be necessary for trophoblast functionality. In samples of patients with intrauterine growth restriction, YB-1 mRNA levels were decreased, while they were increased in preeclampsia and unchanged in spontaneous abortions when compared to normal pregnant controls. Studies with overexpression and downregulation of YB-1 were performed to assess the key trophoblast processes in two trophoblast cell lines HTR8/SVneo and JEG3. Overexpression of YB-1 or exposure of trophoblast cells to recombinant YB-1 caused enhanced proliferation, while knockdown of YB-1 lead to proliferative disadvantage in JEG3 or HTR8/SVneo cells. The invasion and migration properties were affected at different degrees among the trophoblast cell lines. Trophoblast expression of genes mediating migration, invasion, apoptosis, and inflammation was altered upon YB-1 downregulation. Moreover, IL-6 secretion was excessively increased in HTR8/SVneo. Ultimately, YB-1 directly binds to NF-κB enhancer mark in HTR8/SVneo cells. Our data show that YB-1 protein is important for trophoblast cell functioning and, when downregulated, leads to trophoblast disadvantage that at least in part is mediated by NF-κB.

Αν και η Αυχενική Σπονδυλωτική Μυελοπάθεια (ΑΣΜ) αποτελεί την πιο κοινή αιτία δυσλειτουργίας νωτιαίου μυελού στους ενήλικες άνω των 55 ετών, οι μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν άγνωστοι. Μέχρι σήμερα, πολλές προσπάθειες έχουν διενεργηθεί για την ανάπτυξη ενός αξιόπιστου πειραματικού μοντέλου AΣΜ. Ωστόσο, αρκετά μειονεκτήματα εμφανίζονται σε αυτές τις μελέτες. Στη παρούσα μελέτη έχουμε σκοπό τη δημιουργία ενός νέου, πρωτότυπου πειραματικού μοντέλου ΑΣΜ, το οποίο εξομοιώνει τα ιστολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά της ανθρωπίνης νόσου. Mεθοδολογία: Μετά από αφαίερεση του πετάλου του έβδομου αυχενικού σπονδύλου, ένα λεπτό τεμάχιο αρωματικού πολυαιθέρα τοποθετήθηκε κάτω από το πέταλο του έκτου αυχενκού σπονδύλου σε κόνικλους Νέας Ζηλανδίας (Ομάδα ΧΠΠ). Σε μία άλλη ομάδα πειραματόζωων ο αρωματικός πολυαιθέρας αφαιρέθηκε 30 δευτερόλεπτα μετά την εμφύτευση (ομάδα ελέγχου). Νευρολογική εκτίμηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη κλίμακα του Tarlov μετά το πέρας της χειρουργικής διαδικασίας και ακολούθως εβδομαδιαίως. Ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν στις 20 εβδομάδες μετά το χειρουργείο και πριν από τη θυσία των πειραματόζωων. Ακολούθησαν ιστολογικές και ανοσοιστοχημικές μελέτες. Αποτελέσματα: Τα πειραματόζωα που άνηκαν στην ομάδα ελέγχου δεν εμφάνισαν νευρολογικά ελλείμματα κατά τη διάρκεια της μελέτης. Αντιθέτως τα πειραματόζωα που άνηκαν στη ΧΠΠ εμφάνισαν νευρολογικά ελλείματα. Στους νωτιαίους μυελούς προερχόμενους από την ΧΠΠ ομάδα ανεδείχθησαν οι χαρακτηριστικές ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις της χρόνιας μυελοπάθειας. Ειδικότερα, ανεδείχθη σπογγώδης εκφύλιση της λευκής ουσίας, διάμεσο οίδημα και αποπλάτυνση των πρόσθιων κεράτων της φαιάς ουσίας. Επίσης ανεδείχθη κατακρήμνιση του μυελικού σάκου και διόγκωση του δακτυλίου της μυελίνης. Τέλος, η χρόνια πίεση του νωτιαίου οδήγησε σε ενεργοποίηση της απόπτωσης και διαταραχή της αρχιτεκτονικής του μικροαγγειακού συστήματος του νωτιαίου μυελού Συμπέρασμα: Το πρωτότυπο μοντέλο ΑΣΜ στους κονίκλους ποσομοιώνει το χωρικό και χρονικό προφίλ της ανθρώπινης νόσου στο σημείο της πίεσης του νωτιαίου μυελού. ΜΕΛΕΤΗ B Εισαγωγή: Η φλεγμονή, η δημιουργία ουλώδους ιστού και η διαταραχή του μικροαγγειακού συστήματος του νωτιαίου μυελού είναι ορισμένα από τα κύρια παθοφυσιολογικά φαινόμενα της ΑΣΜ. Ωστόσο οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτά τα φαινόμενα κάτω από τη χρόνια και προοδευτική πίεση του νωτιαίου μυελού παραμένουν ανεξερεύνητα. Mεθοδολογία: Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκε το πειραματικό μοντέλο ΑΣΜ που περιγράφεται στη μελέτη Α με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος του NF-κB και των πρωτεινών της εξωκυττάριας ουσίας στην ΑΣΜ. Εν συντομία, κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας (διαφορετικά πειραματόζωα από εκείνα της μελέτης Α) χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες: την ομάδα ΧΠΠ (n=15) και την ομάδα ελέγχου (n=15). Η έκφραση των πρωτεινών των υπομονάδων p50 και p65 του NF-kB, όπως επίσης και των ενζύμων διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας (MMP-2, MMP-9) και του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase-type plasminogen activator; u-PA) αξιολογήθηκαν σε τομές νωτιαίων μυελών προερχόμενων και από τις δύο ομάδες χρησιμοποιώντας ανοσοιστοχημική τεχνική. Στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS για Windows, release 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Αποτελέσματα: Σε τομές νωτιαίων μυελών που προέρχονταν από πειραματόζωα που έπασχαν από ΑΣΜ αναδείχθηκε στατιστικά σημαντικά αυξημένη έκφραση των υπομονάδων του NF-κB (p50 & p65), όπως επίσης και των ενζύμων MMP-2, MMP-9, and u-PA σε σύγκριση με εκείνες που προέρχονταν από την ομάδα ελέγχου. Τέλος, σημαντικά θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του NF-κB και εκείνων των MMP-9, MMP-2, and u-PA. Συμπέρασμα: Τα ευρήματα αυτά αποτελούν ισχυρές ενδείξεις πως η χρόνια και προοδευτική πίεση του αυχενικού νωτιαίου μυελού οδηγεί σε αυξημένη έκφραση των MMP-2, MMP-9 και u-PA πιθανόν μέσω της δράσης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Είναι βέβαιο ότι περισσότερες μελέτες απαιτούνται για την εξακρίβωση του ρόλου των πρωτεινών αυτών στην ΑΣΜ. / Although cervical spondylotic myelopathy (CSM) represents the most common cause of spinal cord impairment among individuals over 55 years old, the molecular mechanisms of the disease remain mainly unknown. To date, many experimental studies have been conducted to establish a reliable model of CSM, however most of them appear some limitations. In this study we aim to create a new animal model of CSM, which will reproduce the temporal course of the human disease and the local microenvironment at the site of spinal cord compression. Methods: Following C7 posterior laminectomy, a thin sheet of aromatic polyether was implanted underneath C5–C6 laminae of the New Zealand rabbits. A sham group in which the material was removed 30 sec after the implantation was also included. Motor function evaluation was performed after the material implantation and weekly thereafter using the Tarlov classification. At 20 weeks post-material implantation electrophysiological studies were also conducted. All the animals were sacrificed 20 weeks post-material implantation and histological and immunohistochemical studies were performed. Results: Clinical evaluation of animals after operation reveals no symptoms and signs of acute spinal cord injury. Moreover, no neurological deficits were noticed in the sham group during the course of the study. However, the animals which underwent implantation of compression material exhibited progressive neurological deficits throughout the study. Rabbits of the compression group experienced significant increased axonal swelling and demyelination, interstitial edema and myelin sheet fragmentation. Histological evaluation of C5 and C6 laminae (at the site of implantation) reveals osteophyte formation. Moreover, the chronic and progressive compression of the cervical spinal cord resulted in induction of apoptosis as well as in disruption of the basement membrane of vessels. Conclusion: The proposed rabbit CSM model reproduces the temporal evolution of the disease and creates a local microenvironment at the site of spinal cord compression, which shares similar features with that of human disease. STUDY B Introduction: Inflammation, glial scar formation and disruption of spinal cord microvasculature represent some of the principal neuropathological features of CSM. However, the molecular mechanisms which are implicated in these pathophysiological phenomena under the chronic and progressive compression of the cervical spinal cord remain interestingly unexplored. Methods: In this study (B) in order to evaluate the role of NF-κB and extracellular matrix proteins in cervical myelopathy we used the rabbit CSM model which was extensively characterized in study A. Briefly New Zealand rabbits (different cohort of animals than that of the study A) were randomly and blindly divided into the following two groups: CSM (n=15) and sham group (n=15). The expression pattern of p50 and p65 subunits of NF-kB, as well as that of MMP-2, MMP-9, and u-PA, was evaluated in spinal cord sections coming from both groups using immunohistochemistry technique. Statistical analysis was performed using SPSS for Windows, release 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Results: CSM animals exhibited statistically significant increased immuoreactivity in both NF-κB subunits, p50 and p65. Moreover, the levels MMP-2, MMP-9, and u-PA were found to be significantly increased in CSM animals compared to controls. Finally, strong positive correlation between NF-κB subunits immunoreactivity and that of MMP-9, MMP-2, and u-PA was demonstrated. Conclusion: The NF-κB pathway as well as the extracellular matrix proteins (MMP-2 and MMP-9) are involved in CSM. However, more studies are needed to clarify the functional role of these molecules in the pathobiology of CSM.

Type 1 diabetes is an autoimmune disease resulting in the selective destruction of the insulin producing β-cells in the pancreas. Pro-inflammatory cytokines and the free radical nitric oxide (NO) have been implicated in mediating the destruction of β-cells, possibly through activation of the mitogen activated protein kinases (MAPKs) JNK, ERK and p38. In addition to MAPKs, cytokine signaling also results in activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB (NF-κB). The upstream signaling events leading to MAPK and NF-κB activation in β-cells are not well known. The work presented in this thesis therefore aims at characterizing the regulation of MAPKs and NF-κB in human islets, with emphasis on the role of the MAPK activator MAP/ERK kinase kinase-1 (MEKK-1) in islet cell death. It was found that MEKK-1 was phosphorylated in response to the nitric oxide donor DETA/NONOate (DETA/NO), the β-cell toxin streptozotocin (STZ) and pro-inflammatory cytokines and that MEKK-1 downstream signaling in response to the same treatments involved activation of JNK but not ERK and p38. MEKK-1 was also found to be essential for cytokine-induced NF-κB activation. MEKK-1 downregulation protected human islet cells from DETA/NO-, STZ, and cytokine-induced cell death. Furthermore, overexpression of the NF-κB subunit c-Rel protected human islet cells from STZ and hydrogen peroxide-induced cell death indicating that NF-κB activity protects against cell death in human islets. In summary, these results support an essential role for MEKK-1 in the activation of JNK and NF-κB, with important consequences for human islet cell death and that strategies preventing human islets death by inhibition of the JNK pathway instead of NF-κB might be suitable.

Ο καρκίνος εκ του επιθηλίου επιφανείας των ωοθηκών είναι η 5η πιο κοινή αιτία θανάτου σε γυναίκες στο Δυτικό κόσμο και είναι υπεύθυνος για τους περισσότερους θανάτους από ότι όλες οι γυναικολογικές κακοήθειες μαζί. Τόσο ο μηχανισμός του νεοπλαστικού μετασχηματισμού όσο και τα μοριακά μονοπάτια που οδηγούν στο ωοθηκικό επιθηλιακό καρκίνωμα δεν έχουν εξακριβωθεί πλήρως. Ένα πρόσφατα αναγνωρισμένο γονίδιο, η μετατχερίνη (MTDH), γνωστή και ως AEG-1 ή LYRIC ενοχοποιείται ως πιθανός σημαντικός διαμεσολαβητής κατά την καρκινογένεση, την μετάσταση και την αντίσταση στις χημειοθεραπείες. Ωστόσο, η κλινική σημασία και ο βιολογικός ρόλος της μετατχερίνης (MTDH), στο επιθηλιακό καρκίνωμα των ωοθηκών δεν έχουν γίνει αποσαφηνισθεί πλήρως. Η υπερέκφραση της MTDH/AEG-1 μπορεί να ενεργοποιήσει πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως για παράδειγμα το NF-κΒ σηματοδοτικό μονοπάτι σε διάφορους καρκινικούς τύπους. Ο NF-κΒ έχει πρόσφατα συσχετισθεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων και επιπλέον τα διμερή του NF-κΒ ενισχύουν την έκφραση ποικίλων γονιδίων που αφορούν την κυτταρική αύξηση, τη διαφοροποίηση, τις φλεγμονώδεις αντιδράσεις και τη ρύθμιση της απόπτωσης. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε προκειμένου να διερευνηθεί η έκφραση των πρωτεϊνών MTDH και NF-kB (p65/p50) σε επιθηλιακά ωοθηκικά καρκινώματα (καλοήθεις, οριακής κακοήθειας και διηθητικά καρκινώματα). Για το σκοπό αυτό μελετήθηκαν τμήματα επιθηλιακών νεοπλασμάτων ωοθηκών από 76 ασθενείς (15/46 οριακής κακοήθειας όγκοι, 30/46 διηθητικά αδενοκαρκινώματα και 31/76 κυσταδενώματα), μονιμοποιημένα σε ουδέτερη φορμόλη και εγκλεισμένα σε παραφίνη με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας για την έκφραση των πρωτεϊνών MTDH και NF-κB (p50/p65). Επίσης εκτιμήθηκε η σχέση της MTDH/AEG-1 με τον NF-κB και με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους όπως ο βαθμός κακοήθειας του όγκου, το στάδιο, η μέγιστη διάμετρος του όγκου και η ηλικία της ασθενούς. Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας αναλύθηκαν με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS. Ο φυσιολογικός ωοθηκικός ιστός και τα κυσταδενώματα ήταν κυρίως αρνητικά για τις πρωτεΐνες MTDH/AEG-1 και NF-κB (p50, p65). Η έκφραση των MTDH/AEG-1 και NF-kappa B/ p50, πρωτεϊνών ήταν σημαντικά αυξημένες στα αδενοκαρκινώματα σε σχέση με τους οριακής κακοήθειας όγκους. Σε αντίθεση η έκφραση της NF-kappa B/ p65 πρωτεΐνης δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των οριακής κακοήθειας όγκων και των αδενοκαρκινωμάτων. Σημαντική στατιστική συσχέτιση παρατηρήθηκε στην έκφραση των πρωτεϊνών MTDH/AEG-1, NF-kappa B/p50 και NF-kappaB/p65 στα αδενοκαρκινώματα. Καμία στατιστική συσχέτιση δεν παρατηρήθηκε στην έκφραση μεταξύ του NF-κB, της MTDH πρωτεΐνης και κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η MTDH/AEG-1 ίσως παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του ανθρώπινου ωοθηκικού καρκίνου, πιθανώς μέσω της ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Επειδή η MTDH συσχετίζεται σημαντικά με την αντίσταση στη χημειοθεραπεία, θα μπορούσε ενδεχομένως να αποτελέσει σημαντικό στόχο για θεραπεία, ενισχύοντας την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας στον επιθηλιακό ωοθηκικό καρκίνο. / Epithelial ovarian cancer is the fifth most common cause of cancer death in women in the Western world and the leading cause of death from gynaecological malignancies. Little is known about the mechanism of neoplastic transformation and the molecular events leading to epithelial ovarian cancer are poorly understood. A recently discovered gene, metadherin (MTDH, also known as AEG-1 or LYRIC) has emerged as a potentially crucial mediator of tumor progression, metastasis, and resistance to chemotherapies. The clinical significance and biological role of metadherin (MTDH), in epithelial ovarian carcinoma however, remains unclear. Overexpression of MTDH/AEG-1 can activate several downstream pathways, including the NFκB pathway in various types of cancer cells. Recently, NF-kB has been related to cancer development and progression and NF-kB dimers (p50/p65) could induce the expression of various genes regarding cell growth, differentiation, inflammatory responses and the regulation of apoptosis. This study was designed in order to determine the expression of the MTDH and NF-kB (p65/p50) proteins in epithelial ovarian tumors (benign, borderline and malignant). Formalin-fixed and paraffin embedded tissue blocks from 76 patients with epithelial ovarian neoplasms (15/46 borderline tumors, 30/46 invasive adenocarcinomas and 31/76 cystadenomas) were studied. Expressions of MTDH/AEG-1, NF-κB (p50, p65) were investigated immunohistochemically. The relationship of MTDH/AEG-1 with NF-κB and clinicopathological parameters such as tumor grade, stage, tumor maximal diameter and patient age were evaluated. The results of immunohistochemistry were analyzed with the SPSS statistic analyze protocol. Normal ovarian tissue and benign ovarian cystadenomas were mostly MTDH/AEG-1, NF-κB (p50, p65) negative. The expression of MTDH/AEG-1 and NF-kappaB p50, proteins were significantly higher in adenocarcinoma tissue in comparison with borderline tumors. In contast NF-kappaB p65 expession shows no significant differences between borderline tumors and adenocarcinomas. A statistical significant correlation was observed between MTDH/AEG-1 and NF-kappaB p50, p65 protein expression in adenocarcinomas. No statistical correlation was observed between the NF-Kb and MTDH protein expression and clinicopathological parameters. In conclusion our data indicate that the upregulation of MTDH/AEG-1 may play an important role in the pathogenesis of human ovarian cancer possibly through activation of Nuclear factor-κB signalling pathway. Since MTDH has also a significant correlation with chemoresistance could be an important therapeutic target enhancing chemotherapy efficacy in ovarian epithelial cancer.

Abstract Wnt genes encode secreted signalling molecules that control embryonic development including organogenesis, while dysregulated Wnt signalling is connected to many diseases such as cancer. Specifically, Wnts control a number of cellular processes such as proliferation, adhesion, differentiation and aging. Many Wnt proteins activate the canonical β-catenin signalling pathway that regulates transcription of a still poorly characterized set of target genes. Wnts also transduce their signaling in cells via β-catenin-independent “non-canonical” pathways, which are not well understood. In this study, Wnt-11 signalling mechanisms in a mammalian model cell line and roles of Wnt-11 in heart development were analyzed in detail. In addition the aim was to identify new Wnt target genes by direct chromatin immunoprecipitation and Affymetrix GeneChip assays in the model cells exposed to Wnt-3a. Our studies reveal that Wnt-11 signalling coordinates the activity of key cell signalling pathways, namely the canonical Wnt/β-catenin, the JNK/AP-1, the NF-κB and PI3K/Akt pathways in the CHO cells. Analysis of the Wnt-11-deficient embryos revealed a crucial role in heart organogenesis. Wnt-11 signalling coordinates cell interactions during assembly of the myocardial wall and Wnt-11 localizes the expression of N-cadherin and β-catenin to specific cellular domains in the embryonic ventricular cardiomyocytes. Collectively these studies reveal that the mammalian Wnt-11 behaves as a non-canonical Wnt and that it is a critical factor in the coordination of heart development. Specifically, it controls components of the cell adhesion machinery. Analysis of the Wnt target genes revealed a highly context-dependent profile in the Wnt-regulated genes. Several new putative target genes were discovered. Out of the candidate Wnt target genes, Disabled-2 was identified as a potential new direct target for Wnt signalling.

The NF-κB family of transcription factors can be activated through canonical (classical) or non-canonical (alternative) signalling pathways, which are regulated by the redundant ubiquitin ligases, cellular inhibitor of apoptosis 1 and 2 (cIAP1 and cIAP2). While the canonical NF-κB pathway is needed for myoblast proliferation, it is inactivated during myoblast differentiation. However, the non-canonical NF-κB pathway is a major factor in promoting myoblast fusion, which is crucial to the processes of myogenesis and muscle repair. Ablation of cIAP1 levels through a chemical antagonist such as a SMAC- mimetic compound (SMC) activates non-canonical signalling to enhance myogenesis. The cytokine TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) has also been shown to activate primarily the alternative NF-κB pathway when signalling through its receptor Fn14. Here I show that alternative NF-κB signalling activity, stimulated by the addition of TWEAK or loss of cIAP1, can promote myogenesis. I also demonstrate that TWEAK is an endogenous myokine produced by myoblasts to promote their own differentiation, and suggest that targeting the alternative NF-κB pathway, with SMAC-mimetics or recombinant TWEAK for example, would be of therapeutic value in the repair and regeneration of muscle for various myopathies.

Les plaquettes sont la principale source de CD40L soluble (sCD40L), une molécule thrombo-inflammatoire dont les taux élevés chez les patients atteints des maladies coronariennes (CAD) prédisent des événements athérothrombotiques. Nous avons déjà démontré que le sCD40L active deux voies de signalisation dans les plaquettes, la p38 MAPK et le facteur nucléaire-κB (NF-κB), non affectées par l’activité antiplaquettaire de l'aspirine (ASA). Nous avons montré aussi que le sCD40L, en réponse à des doses sous-optimales d'agonistes plaquettaires comme la thrombine et le collagène, potentialise l'agrégation des plaquettes via le récepteur CD40 et son effecteur cible présent en aval le NF-κB. En effet, le NF-κB appartient à une famille de dimères cytoplasmiques inactivés par l'inhibiteur IκB et régulés par l’IκB kinase (IKK). Suite à des signaux immunologiques, l’IKK phosphoryle l’IκB, ce qui entraîne sa dégradation par le protéasome. Par conséquent, le NF-κB, une fois libre, se déplace vers les noyaux des cellules immunitaires où il agit sur le génome pour maintenir la survie et la prolifération cellulaires. Contrairement aux cellules immunitaires, la régulation et les fonctions de NF-κB dans les plaquettes, fragments cellulaires dépourvus de génome, sont moins bien comprises. Dans ce projet, nous proposons l'hypothèse que l’axe sCD40L/NF-κB/protéasome amorce les plaquettes en les prédisposant à une activation et une agrégation prononcées. Nos objectifs seront donc (i) d'étudier l'interaction entre le NF-κB et le protéasome en réponse au sCD40L et (ii) d'examiner les rôles de cet axe sur les fonctions plaquettaires. Pour cela, des plaquettes ont été fraîchement isolées à partir du sang des donneurs humains sains qui ne prennent pas des médicaments antiplaquettaires ou anti-inflammatoires. Ces plaquettes ont été par la suite stimulées par le sCD40L. En étudiant l'activation de NF-κB, l'analyse par Western blot a montré que le sCD40L induit la phosphorylation d’IκB et la dégradation de sa forme phosphorylée (p-IκB) dans un délai de 30 minutes, d'une manière similaire à l’action de la thrombine, l’agoniste plaquettaire le plus puissant. Le prétraitement des plaquettes avec deux classes d'inhibiteurs de NF-κB, le répresseur d’IKK (BAY 11-7082) et l’antagoniste du protéasome (MG132), a montré que l'activation du NF-κB dans les plaquettes est régulée par l’IKK et le protéasome, identiquement aux cellules nucléées. L'examen des événements de signalisation induits par le sCD40L a montré que l'inhibition du NF-κB plaquettaire n'affecte pas la phosphorylation de p38 MAPK ou le clivage protéasomique de la Taline-1 qui est impliquée dans le changement de la forme des plaquettes. Concernant les effets sur les fonctions plaquettaires, l'inhibition de NF-κB ou du protéasome n'a pas influencé l'agrégation des plaquettes induite par des doses élevées de collagène ou de thrombine. Cependant, elle a considérablement réduit l'agrégation plaquettaire suite à un amorçage avec le sCD40L, suivie d'une stimulation avec des doses sous-optimales de collagène ou de thrombine. Nous avons également constaté que le sCD40L exacerbe la rétraction des caillots fibrino-plaquettaire formés par de faibles doses de thrombine. Cet effet d'amorçage est régulé par l’axe NF-κB/protéasome. En bref, l’axe sCD40L/NF-κB/protéasome fonctionne de manière non génomique, en amorçant les plaquettes, induisant ainsi la potentialisation de l'agrégation plaquettaire et l'augmentation de la rétraction des caillots fibrino-plaquettaire. Par conséquent, le ciblage de cet axe dans les plaquettes pourrait avoir un rôle thérapeutique chez les patients atteints de CAD et dont les plaquettes ne répondent pas ou sont moins sensibles aux traitements antiplaquettaires conventionnels. / Platelets are the principal source of soluble CD40L (sCD40L), a thrombo-inflammatory molecule whose high levels in coronary artery disease (CAD) patients predict atherothrombotic events. We have previously demonstrated that sCD40L activates two signaling pathways in platelets, p38 MAPK and the nuclear factor-κB (NF-κB), both of which were unaffected by the anti-platelet activity of aspirin (ASA). We have also shown that sCD40L, in response to suboptimal doses of platelet agonists like thrombin and collagen, potentiates platelet aggregation through CD40 receptor and its downstream effector target NF-κB. Indeed, NF-κB belongs to a family of cytoplasmic dimers that are inactivated by the inhibitor IκB and regulated by IκB kinase (IKK). Following immunological signals, IKK phosphorylates IκB, driving the degradation of its phosphorylated form (p-IκB) by the proteasome. Consequently, NF-κB becomes free to translocate to the nuclei of immune cells where it acts genomically to maintain survival and proliferation. That is the case in immune cells, but in platelets which are devoid of genome, the regulation and functions of NF-κB are less understood. Herein, we hypothesized that sCD40L/NF-κB/proteasome axis primes platelets, predisposing them to pronounced activation and aggregation. We thus aimed to (i) assess the interplay between NF-κB and proteasome in response to sCD40L and (ii) investigate the roles of this axis at the level of platelet functions. For this purpose, platelets were freshly isolated from the blood of healthy human donors who are not on anti-platelet or anti-inflammatory medication and then stimulated with sCD40L. In monitoring the activation of NF-κB, western blot analysis showed that sCD40L induces the phosphorylation of IκB and the degradation of p-IκB during a 30-mins time window, in a similar fashion to the most potent platelet agonist thrombin. The pre-treatment of platelets with two classes of NF-κB inhibitors, an IKK repressor (BAY 11-7082) and a proteasome antagonist (MG132), showed that the activation of platelet NF-κB is regulated by IKK and the proteasome as in nucleated cells. The examination of the functional signaling events induced by sCD40L showed that NF-κB inhibition does not affect the phosphorylation of p38 MAPK or the proteasomal cleavage of shape change-involved Talin-1. In functional studies, NF-κB or proteasomal inhibition did not influence the aggregation of platelets induced by high doses of collagen or thrombin; however, it markedly reduced platelet aggregation primed with sCD40L followed by stimulation with sub-optimal doses of collagen or thrombin. We also found that sCD40L exacerbates the retraction of fibrin-platelet clots formed by low doses of thrombin. This priming effect was regulated by NF-κB/proteasome dyad. In brief, sCD40L/NF-κB/proteasome axis primes platelets and functions non-genomically, inducing the potentiation of platelet aggregation and augmenting the retraction of fibrin-platelet clots. Hence, targeting this axis in platelets might have a therapeutic potential in CAD patients whose platelets are not or less responsive to conventional antiplatelet therapies.