Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 111-139).

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2006. / Full text release at OhioLINK's ETD Center delayed at author's request

Introdução: O Diabetes Mellitus é doença que apresenta elevada incidência e prevalência na população em diversas partes do mundo. Estudos experimentais sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão dela. Objetivo: Investigar os efeitos da utilização exógena do antioxidante orgoteína (SOD Cu/Zn) sobre o estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NFκB) e expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) hepática no modelo experimental de diabetes mellitus (DM). Métodos e Resultados: Foram utilizados 28 ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos: controle (CO), controle tratados com orgoteína (CO+ORG), diabéticos (DM) e diabéticos tratados com orgoteína (DM+ORG). A dose utilizada da ORG (orgoteína ®) foi de 13 mg/Kg de peso corporal durante os sete últimos dias de experimento através de injeção subcutânea. O DM foi induzido por injeção de estreptozotocina (i.p.,70 mg/kg) e, após sessenta dias, foi avaliada a lipoperoxidação hepática através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS- nmoles/mg de proteína), a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT-pmoles/mg de proteína), superóxido dismutase (SOD-U/mg de proteína) e glutationa peroxidase (GPx- nmoles/mg de proteína). Também foi realizada a medida de nitritos e nitratos (mM de NO2 e NO3). As expressões da p65 do NFκB e da iNOS foram avaliadas pela técnica de Western blot e quantificadas por densitometria em relação à percentagem do controle. Resultados: Houve aumento na lipoperoxidação hepática no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (0,36±0,15 vs 0,18±0,04; p<0,01). A atividade da enzima CAT apresentou aumento no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (p<0,001), enquanto a atividade da SOD e da GPx apresentaram redução no DM e aumento no grupo DM+ORG, respectivamente (p<0,001 e p<0,05). A medida de nitritos e nitratos apresentou redução no DM e aumento no grupo DM+ORG (1,47±0,61 vs 2,29±0,20; p<0,05) enquanto a expressão da iNOS foi 32% maior no grupo DM em relação ao grupo CO e 53% maior no grupo DM+ORG, quando comparado com o grupo DM (p<0,01). A p65 foi 37% mais expressa no DM (p<0,05) e sem diferença estatística, quando comparado o grupo DM com o grupo DM+ORG. Conclusão: O tratamento com orgoteína reduziu o estresse oxidativo hepático em animais diabéticos, mesmo não alterando o fator de transcrição nuclear NFкB. A orgoteína também aumentou a bioatividade do NO, provavelmente, devido ao aumento da atividade, dismutando o radical superóxido, e devido ao aumento da expressão da iNOS. / Aim: To investigate the effects of exogenous antioxidant orgoteína on oxidative stress, activation of nuclear transcription factor kappa B (NFκB), and hepatic expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the experimental model of diabetes mellitus (DM). Methods: 28 male Wistar rats divided in four groups were used: control (CO), controls treated with orgoteína (CO+ORG), diabetics (DM), and diabetics treated with orgoteína (DM+ORG). Orgoteína (orgotein®, 13 mg/Kg body weight was administered subcutaneously for the last 7 days of the trial. DM was induced by a single streptozotocin injection (i.p.,70 mg/kg), and 60 days later, we evaluated liver lipoperoxidation through thiobarbituric acid reactive substances (TBARS- nmoles/mg of protein) and activity of antioxidant enzymes catalase (CAT-pmoles/mg of preotein), superoxide dismutase (SODU/ mg of protein) and glutathione peroxidase (GPx- nmoles/mg of protein). Nitrites e nitrates (mM NO2 and NO3) were also measured, and p65 of NFκB and iNOS expressions were evaluated by Western blot and quantified by densitometry as compared to control percentage. Results: Liver peroxidation was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (0.36±0.15 vs 0.18±0.04; p<0.01). CAT activity was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (p<0.001), whereas SOD and GPx activity were decreased in the DM group and increased in the DM+ORG group, respectively (p<0.001 and p<0.05). Nitrite and nitrate measures were reduced in the DM and increased in the DM+ORG group (1.47±0.61 vs 2.29±0.20; p<0.05), while iNOS expression in the DM group was 32% greater than in the CO and 53% greater in the DM+ORG group than in the DM group (p<0.01). P65 expression was 37% higher in the DM (p<0.05), and there was no significant difference between the DM and DM+ORG groups. Conclusion: Orgoteína treatment reduced liver oxidative stress in diabetic animals, even though it did not change NFкB. Orgoteína also increased NO bioactivity, probably by the increased dismutation of the superoxide radical and by increase in iNOS expression.

A utilização de plantas com fins medicinais, para o tratamento, a cura e a prevenção de doenças é uma das formas mais antigas de prática medicinal da humanidade. A espécie Croton cajucara BENTH (CcB) é uma planta nativa e endêmica da região Amazônica, onde é popularmente conhecida como “sacaca”. É muito utilizada na medicina popular, sob a forma de chás da casca e de folhas no tratamento de diversas doenças, como o diabetes. Estudos experimentais e clínicos sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão do diabetes. Este estudo tem como objetivos avaliar os efeitos do extrato aquoso da casca do CcB sobre as alterações hepáticas, os níveis plasmáticos de glicose, triglicerídeos (TG) e colesterol, os efeitos genotóxicos, o estresse oxidativo, a concentração de nitritos e nitratos e a ativação da subunidade p65 do fator de transcrição nuclear Kappa B em fígado de animais diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). Foram utilizados ratos machos Wistar, divididos em seis grupos com dez animais cada: controle (CO); controle com tratamento durante cinco dias com CcB (CcB5D); controle com tratamento durante 20 dias com CcB (CcB20D); diabéticos (DM); diabéticos com tratamento durante cinco dias com CcB (DM5D); e diabéticos com tratamento durante 20 dias com CcB (DM20D). O DM foi induzido por administração intraperitonial de STZ na dose de 70mg/Kg. O extrato aquoso (EA) foi preparado com 5g da casca do CcB/100mL H2O e administrado na dose de 1,5mL intragástrica. Após 60 dias, foi coletado sangue do plexo retro-orbital para as análises das enzimas séricas: AST, ALT, FA e dosagem de glicemia, triglicerídeos e colesterol. Para avaliar a atividade genotóxica do extrato, foi utilizado o teste de micronúcleos (MN) em medula óssea. O homogeneizado do fígado foi utilizado para avaliação de lipoperoxidação (LPO) através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e para avaliação da atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GSH, avaliação dos metabólitos do óxido nítrico (nitritos e nitratos totais) e a expressão nuclear da subunidade p65 do NF-kB. A análise das enzimas séricas mostrou que houve aumento de ALT e FA nos animais DM em relação aos grupos CO, e que a ALT apresentou-se diminuida nos animas DM tratados durante cinco e 20 dias. O tratamento com CcB não diminuiu os níveis da glicemia e do colesterol, houve, porém, redução significativa nos níveis de TG nos animais diabéticos tratados durante cinco e 20 dias. O tratamento com CcB não diminuiu os níveis da glicemia e do colesterol, houve, porém, redução significativa nos níveis de TG nos animais diabéticos tratados durante cinco e 20 dias. O EA do CcB mostrou-se destituído de ação genotóxica. Houve aumento no TBARS e na SOD em animais DM e diminuição significativa nos animais diabéticos tratados durante cinco e 20 dias. Por outro lado, verificou-se aumento de TBARS e da atividade da SOD no grupo CO20D. A atividade da CAT e da GPx não apresentaram diferenças significativas entre os grupos estudados. A GSH apresentou-se diminuída nos animais diabéticos em relação aos controles e ao grupo DM5D. Os animais diabéticos apresentaram aumento nos níveis dos metabólitos do óxido nítrico em relação aos animais controles, e a administração do EA do CcB não reverteu essa situação. Houve ativação da expressão nuclear do p65 nos animais diabéticos que foi atenuada nos animais que receberam o EA do CcB. O tratamento dos ratos diabéticos com o EA de CcB parece melhorar os níveis de TG, não reduziu, no entanto, a glicemia e o colesterol, provavelmente por se tratar de um modelo de diabetes crônico. O tratamento diminuiu a LPO e a atividade da SOD, provavelmente devido à atividade antioxidante do EA do CcB como varredor de radicais ânion superóxido. Os resultados mostram que, em situações onde não há estresse oxidativo, o uso prolongado de CcB comporta-se como pró-oxidante e, em situações onde existe estresse oxidativo, o tratamento com o CcB pode possuir ação antioxidante varredora de radicais livres. Além disso, os resultados parecem sustentar a hipótese de que o estresse oxidativo presente do DM estimula a expressão do NF-kB e que administração do EA do CcB reduz essa expressão. / The use of plants for medical purposes in the treatment, cure and prevention of diseases is one of the oldest medical practices of mankind. Croton cajucara BENTH (CcB) is a vegetal species that is native and endemic in the Amazonian region, where it is popularly known as “sacaca”. Bark and leaf infusions of sacaca are widely used in folk medicine to treat many diseases, such as diabetes. Experimental and clinical studies suggest that oxidative stress is involved in the pathogenesis and progress of diabetes. The present study was designed to evaluate the effects CcB aqueous extracts (AE) on hepatic changes, plasma levels of glucose, triglycerides (TG) and cholesterol, genotoxic effects, oxidative stress, nitrites and nitrates levels, and on activation of the p65 subunit of nuclear Kappa B transcription factor (NF-B) in the livers of animals made diabetic by streptozotocin (STZ) administration. Six groups of 10 male Wistar rats each were used as follows: controls (CO); controls with 5-day treatment with CcB (CcB5D); controls with 20- day treatment with CcB (CcB20D); diabetics (DM); diabetics with 5-day treatment with CcB (DM5D); and diabetics with 20-day treatment with CcB (DM20D). DM was induced by intraperitoneal administration of STZ (70mg/Kg). The aqueous extract was obtained using 5g of CcB bark for 100ml H2O and intragastrically administered at a dose of 1.5mL. After 60 days retro orbital blood samples were obtained for analysis of serum enzymes AST, ALT, FA and glucose, triglyceride and cholesterol levels determination. The genotoxic activity was evaluated using the micronucleus assay (MN) in bone marrow. The liver homogenates were used for evaluation of lipoperoxidation (LPO) through thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), antioxidant enzymes SOD, CAT, GPx and GSH, nitric oxide metabolites (total nitrites and nitrates) and nuclear expression of p65 of NF-kB. The analysis of serum enzymes showed that there was an increase in ALT and AP in DM animals as compared to CO groups, and ALT was decreased in DM animals treated for 5 and 20 days. The treatment with CcB did not reduce the glycemia and cholesterol level, but there was a significant reduction in the TG levels in DM animals treated for 5 and 20 days. The CcB aqueous extract failed to show any genotoxic action. TBARS and SOD were increased in DM animals and significantly decreased in diabetic animals treated for 5 and 20 days. On the other hand, TBARS and SOD activity were increased in the CcB20D group. CAT and GPx activities were not significantly different across the studied groups. GSH was decreased in the diabetic animals as compared to controls and the DM5D group. The diabetic animals presented an increase in the metabolite levels of nitric oxide as compared to controls, and the administration of CcB AE failed to reverse this situation. There was activation of p65 nuclear expression in the diabetic animals, which was attenuated in the animals receiving the CcB AE. The treatment of diabetic rats with CcB appears to improve TG levels, but it did not reduce glycemia and cholesterol levels, probably because the study dealt with a chronic diabetes model. The treatment decreased LPO and SOD activity, probably because of CcB’s antioxidant activity as scavenger of superoxide anion radicals. The results show that in situations where there is no oxidative stress the extended use of CcB behaves acts as a pro-oxidant and in situations where there is oxidative stress the treatment with CcB may be an antioxidant scavenger of free radicals. Furthermore, the results seem to support the hypothesis that the oxidative stress seen in DM stimulates NF-B expression and that CcB AE administration reduces such expression.

Resumo não disponível

A identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de glioblastomas multiformes (GBMs) se faz necessária devido ao mau prognóstico e ineficiência das terapias associadas a esses tumores. Nesta dissertação, avaliamos o envolvimento do Fator Nuclear kappaB (NFkappaB) e da via da PI3K/Akt no crescimento in vitro de glioblastomas, e o potencial uso dos inibidores de NFkappaB e de PI3K/Akt como possíveis agentes antitumorais. Com esta finalidade foram utilizados os inibidores farmacológicos de NFkappaB (partenolide), e de PI3K/Akt (quercetina e Ly294002), e o inibidor misto de NFkappaB/Akt (curcumina). Os inibidores de NFkappaB causaram uma significativa diminuição na viabilidade dos GBMs quando comparado com os inibidores de outras vias de sinalização (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr e JNK1/2), a qual foi tipo dose resposta. Além disso, os inibidores de NFkappaB apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura e perda de integridade da membrana plasmática que foi vista através da técnica do Iodeto de Propideo (PI). Já os inibidores de PI3K/Akt apresentaram um menor efeito do que o apresentado pelos inibidores de NFkappaB, não demonstrando uma curva do tipo dose resposta, ainda assim, diminuíram a viabilidade dos GBMs. Entretanto, não apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura, e não houve incorporação de PI, mostrando que, diferentemente do que ocorre com os inibidores de NFkappaB, a perda de viabilidade vista nas células tratadas com os inibidores de PI3K/Akt está preponderavelmente relacionada com uma diminuição na proliferação, e não com morte celular. Vimos também que os inibidores foram capazes de alterar o imunoconteúdo de fatores relacionados com morte e sobrevivência celular, tais como caspase 3, LC3 A/B, PARP e Hsp70, assim como o ciclo celular. Portanto, nossos resultados demonstram que a via da PI3K/Akt parece estar preferencialmente relacionada com a proliferação celular, enquanto a via do NFkappaB preferencialmente com sobrevivência. / The identification of new therapeutic targets for treatment of glioblastoma multiforme (GBMs) is necessary due to poor prognosis and ineffective therapies associated with these tumors. In this study we have assessed the role of Nuclear Factor-kappaB (NFkappaB) and the PI3K/Akt pathway in glioblastomas in vitro growth, and their inhibitors as potential antitumor agents. For this we used the pharmacological inhibitors of NFkappaB (Parthenolide), and PI3K/Akt (LY294002 and quercetin), and mixed inhibitor of NFkB / Akt (curcumin). NFkappaB inhibitors yielded a significant decrease in viability of GBMs compared to inhibitors of other signaling pathways (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr and JNK1 / 2), which was dose-dependent. Furthermore, inhibitors of NFkappaB showed LDH releasing in culture medium and membrane integrity losing, evaluated through the Propidium Iodide (PI)-based method. The PI3K/Akt inhibitors showed a smaller effect than NFkappaB inhibitors, also decreasing GBMs viability but playing no dose-dependence response. Despite there was not LDH releasing in culture medium and PI incorporation, showing that the loss of viability observed in cells treated with inhibitors of PI3K/Akt is associated with a decrease in the proliferation, unlike what happens with inhibitors of NFkappaB, no cell death was observed. We have also seen that the inhibitors were able to alter the contents of immune-related factors death and cell survival, such as caspase-3, LC3 A / B, PARP and Hsp70, as well as the cell cycle. Therefore, our results demonstrate that the PI3K/Akt pathway seems to be related to cell proliferation, while the NFkappaB pathway to survival.

A vitamina A e seus derivados, os retinóides, participam de processos celulares tais como desenvolvimento, proliferação, diferenciação e apoptose. Os efeitos da vitamina A, em sua maior parte, são atribuídos à ativação de receptores nucleares da família dos receptores esteróides, conhecidos como receptores de ácido retinóico (RAR) e receptores de retinóides (RXR). No entanto, o excesso de vitamina A, ou de retinóides, na dieta, ou devido a uso terapêutico, pode ser teratogênico. Diversos trabalhos tem demonstrado "in vitro" e "in vivo" que a vitamina A e seus metabólitos são moléculas redox ativas, isto é, podem agir como pró-oxidantes ou antioxidantes, dependendo da concentração e do ambiente em que se encontram. Nesse trabalho nós demonstramos que o tratamento com retinol, o qual é considerado o principal metabólito da vitamina A, em células da linhagem A549, a qual é derivada de um carcinoma de pulmão de não-pequenas células, levou a uma diminuição da expressão e do imunoconteúdo do receptor para produtos finais avançados de glicação (RAGE). O RAGE é constutivamente expresso nas células pulmonares, sendo que qualquer alteração na sua expressão ou imunoconteúdo induz alterações na homeostase do tecido pulmonar. Nós verificamos que a modulação do RAGE induzida pelo tratamento com retinol em nosso modelo foi redox dependente. O tratamento das células A549 com retinol induziu um aumento na produção de espécies reativas do oxigênio, o qual por consequência tornou o ambiente celular próoxidativo favorecendo a indução de danos a biomoléculas como lipídeos e proteínas. Além disso, o aumento na produção de espécies reativas do oxigênio levou a ativação da MAPK p38, por um mecanismo redox-dependente. A ativação da p38 subsequentemente levou à ativação do fator de transcrição NF-kB, o qual por consequência acabou por modular a expressão e imunoconteúdo do RAGE nessas células. Todos os efeitos ocasionados pelo tratamento com retinol foram bloqueados com o co-tratamento com Trolox® (análogo hidrofílico da vitamina E), o qual é uma molécula antioxidante. Portanto, nossos resultados demonstraram que o tratamento com retinol é capaz de induzir um estado pró-oxidativo nas células A549, o qual por consequência acaba por modular a expressão do RAGE de maneira redox-dependente e via a ativação da rota de sinalização da p38 - NF-kB. Então, a partir destes resultados e de outros dados já reportados na literatura, acreditamos que é necessário uma maior cautela no uso de vitamina A tanto a nível de suplementação quanto a nível terapêutico. / Vitamin A and its derivatives, the retinoids, participate in cellular processes such as growth, cell division and apoptosis. The effects of vitamin A, in part, are ascribed to gene transcription mediated by nuclear receptors from the family of the steroid receptors, known as retinoic acid receptors (RARs) and retinoid receptors (RXRs). However, excessive vitamin A, or retinoids, in the diet, or by therapeutic use, may be theratogenic. Several studies have shown "in vitro" and "in vivo" that vitamin A and its metabolites are redox active molecules, that is, may act as pro-oxidants and antioxidants, depending on the concentration and the environment in which they are. In this study we demonstrated that treatment with retinol, which is considered to be the principal metabolite of vitamin A, in cell lines of non-small cells lung carcinoma A549 led to a decrease in the expression and immunocontent of receptor for advanced glycation endproducts (RAGE). The RAGE is constitutively expressed in lung cells; a modulation in expression or immunocontent of RAGE is associated with alterations on homeostasis of lung tissue. Here, we found that the modulation of RAGE induced by retinol treatment in our model was redox dependent. Retinol treatment of A549 cells induced an increase in the production of reactive oxygen species, which consequently become the pro-cellular environment favoring the induction of oxidative damage to biomolecules such as lipids and proteins. Furthermore, the increase in production of reactive oxygen species led to activation of p38 MAPK by a redox-dependent mechanism. Activation of p38 subsequently led to activation of the transcription factor NF-kB, which consequently modulates the expression of RAGE in these cells. All effects caused by retinol treatment were blocked with Trolox ® (hydrophilic analogue of Vitamin E) co-treatment, which is an antioxidant molecule. Therefore, our results demonstrated that retinol treatment is able to induce a pro-oxidative status in A549 cells, and that modulation of RAGE expression by retinol is mediated by the redox-dependent activation of p38/NF-kB signaling pathway. Then, based on these results and other data already reported in the literature, we believe that greater care is needed in the use of vitamin A supplementation as therapeutic level.

Introdução: O Diabetes Mellitus é doença que apresenta elevada incidência e prevalência na população em diversas partes do mundo. Estudos experimentais sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão dela. Objetivo: Investigar os efeitos da utilização exógena do antioxidante orgoteína (SOD Cu/Zn) sobre o estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NFκB) e expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) hepática no modelo experimental de diabetes mellitus (DM). Métodos e Resultados: Foram utilizados 28 ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos: controle (CO), controle tratados com orgoteína (CO+ORG), diabéticos (DM) e diabéticos tratados com orgoteína (DM+ORG). A dose utilizada da ORG (orgoteína ®) foi de 13 mg/Kg de peso corporal durante os sete últimos dias de experimento através de injeção subcutânea. O DM foi induzido por injeção de estreptozotocina (i.p.,70 mg/kg) e, após sessenta dias, foi avaliada a lipoperoxidação hepática através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS- nmoles/mg de proteína), a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT-pmoles/mg de proteína), superóxido dismutase (SOD-U/mg de proteína) e glutationa peroxidase (GPx- nmoles/mg de proteína). Também foi realizada a medida de nitritos e nitratos (mM de NO2 e NO3). As expressões da p65 do NFκB e da iNOS foram avaliadas pela técnica de Western blot e quantificadas por densitometria em relação à percentagem do controle. Resultados: Houve aumento na lipoperoxidação hepática no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (0,36±0,15 vs 0,18±0,04; p<0,01). A atividade da enzima CAT apresentou aumento no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (p<0,001), enquanto a atividade da SOD e da GPx apresentaram redução no DM e aumento no grupo DM+ORG, respectivamente (p<0,001 e p<0,05). A medida de nitritos e nitratos apresentou redução no DM e aumento no grupo DM+ORG (1,47±0,61 vs 2,29±0,20; p<0,05) enquanto a expressão da iNOS foi 32% maior no grupo DM em relação ao grupo CO e 53% maior no grupo DM+ORG, quando comparado com o grupo DM (p<0,01). A p65 foi 37% mais expressa no DM (p<0,05) e sem diferença estatística, quando comparado o grupo DM com o grupo DM+ORG. Conclusão: O tratamento com orgoteína reduziu o estresse oxidativo hepático em animais diabéticos, mesmo não alterando o fator de transcrição nuclear NFкB. A orgoteína também aumentou a bioatividade do NO, provavelmente, devido ao aumento da atividade, dismutando o radical superóxido, e devido ao aumento da expressão da iNOS. / Aim: To investigate the effects of exogenous antioxidant orgoteína on oxidative stress, activation of nuclear transcription factor kappa B (NFκB), and hepatic expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the experimental model of diabetes mellitus (DM). Methods: 28 male Wistar rats divided in four groups were used: control (CO), controls treated with orgoteína (CO+ORG), diabetics (DM), and diabetics treated with orgoteína (DM+ORG). Orgoteína (orgotein®, 13 mg/Kg body weight was administered subcutaneously for the last 7 days of the trial. DM was induced by a single streptozotocin injection (i.p.,70 mg/kg), and 60 days later, we evaluated liver lipoperoxidation through thiobarbituric acid reactive substances (TBARS- nmoles/mg of protein) and activity of antioxidant enzymes catalase (CAT-pmoles/mg of preotein), superoxide dismutase (SODU/ mg of protein) and glutathione peroxidase (GPx- nmoles/mg of protein). Nitrites e nitrates (mM NO2 and NO3) were also measured, and p65 of NFκB and iNOS expressions were evaluated by Western blot and quantified by densitometry as compared to control percentage. Results: Liver peroxidation was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (0.36±0.15 vs 0.18±0.04; p<0.01). CAT activity was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (p<0.001), whereas SOD and GPx activity were decreased in the DM group and increased in the DM+ORG group, respectively (p<0.001 and p<0.05). Nitrite and nitrate measures were reduced in the DM and increased in the DM+ORG group (1.47±0.61 vs 2.29±0.20; p<0.05), while iNOS expression in the DM group was 32% greater than in the CO and 53% greater in the DM+ORG group than in the DM group (p<0.01). P65 expression was 37% higher in the DM (p<0.05), and there was no significant difference between the DM and DM+ORG groups. Conclusion: Orgoteína treatment reduced liver oxidative stress in diabetic animals, even though it did not change NFкB. Orgoteína also increased NO bioactivity, probably by the increased dismutation of the superoxide radical and by increase in iNOS expression.

A utilização de plantas com fins medicinais, para o tratamento, a cura e a prevenção de doenças é uma das formas mais antigas de prática medicinal da humanidade. A espécie Croton cajucara BENTH (CcB) é uma planta nativa e endêmica da região Amazônica, onde é popularmente conhecida como “sacaca”. É muito utilizada na medicina popular, sob a forma de chás da casca e de folhas no tratamento de diversas doenças, como o diabetes. Estudos experimentais e clínicos sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão do diabetes. Este estudo tem como objetivos avaliar os efeitos do extrato aquoso da casca do CcB sobre as alterações hepáticas, os níveis plasmáticos de glicose, triglicerídeos (TG) e colesterol, os efeitos genotóxicos, o estresse oxidativo, a concentração de nitritos e nitratos e a ativação da subunidade p65 do fator de transcrição nuclear Kappa B em fígado de animais diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). Foram utilizados ratos machos Wistar, divididos em seis grupos com dez animais cada: controle (CO); controle com tratamento durante cinco dias com CcB (CcB5D); controle com tratamento durante 20 dias com CcB (CcB20D); diabéticos (DM); diabéticos com tratamento durante cinco dias com CcB (DM5D); e diabéticos com tratamento durante 20 dias com CcB (DM20D). O DM foi induzido por administração intraperitonial de STZ na dose de 70mg/Kg. O extrato aquoso (EA) foi preparado com 5g da casca do CcB/100mL H2O e administrado na dose de 1,5mL intragástrica. Após 60 dias, foi coletado sangue do plexo retro-orbital para as análises das enzimas séricas: AST, ALT, FA e dosagem de glicemia, triglicerídeos e colesterol. Para avaliar a atividade genotóxica do extrato, foi utilizado o teste de micronúcleos (MN) em medula óssea. O homogeneizado do fígado foi utilizado para avaliação de lipoperoxidação (LPO) através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e para avaliação da atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GSH, avaliação dos metabólitos do óxido nítrico (nitritos e nitratos totais) e a expressão nuclear da subunidade p65 do NF-kB. A análise das enzimas séricas mostrou que houve aumento de ALT e FA nos animais DM em relação aos grupos CO, e que a ALT apresentou-se diminuida nos animas DM tratados durante cinco e 20 dias. O tratamento com CcB não diminuiu os níveis da glicemia e do colesterol, houve, porém, redução significativa nos níveis de TG nos animais diabéticos tratados durante cinco e 20 dias. O tratamento com CcB não diminuiu os níveis da glicemia e do colesterol, houve, porém, redução significativa nos níveis de TG nos animais diabéticos tratados durante cinco e 20 dias. O EA do CcB mostrou-se destituído de ação genotóxica. Houve aumento no TBARS e na SOD em animais DM e diminuição significativa nos animais diabéticos tratados durante cinco e 20 dias. Por outro lado, verificou-se aumento de TBARS e da atividade da SOD no grupo CO20D. A atividade da CAT e da GPx não apresentaram diferenças significativas entre os grupos estudados. A GSH apresentou-se diminuída nos animais diabéticos em relação aos controles e ao grupo DM5D. Os animais diabéticos apresentaram aumento nos níveis dos metabólitos do óxido nítrico em relação aos animais controles, e a administração do EA do CcB não reverteu essa situação. Houve ativação da expressão nuclear do p65 nos animais diabéticos que foi atenuada nos animais que receberam o EA do CcB. O tratamento dos ratos diabéticos com o EA de CcB parece melhorar os níveis de TG, não reduziu, no entanto, a glicemia e o colesterol, provavelmente por se tratar de um modelo de diabetes crônico. O tratamento diminuiu a LPO e a atividade da SOD, provavelmente devido à atividade antioxidante do EA do CcB como varredor de radicais ânion superóxido. Os resultados mostram que, em situações onde não há estresse oxidativo, o uso prolongado de CcB comporta-se como pró-oxidante e, em situações onde existe estresse oxidativo, o tratamento com o CcB pode possuir ação antioxidante varredora de radicais livres. Além disso, os resultados parecem sustentar a hipótese de que o estresse oxidativo presente do DM estimula a expressão do NF-kB e que administração do EA do CcB reduz essa expressão. / The use of plants for medical purposes in the treatment, cure and prevention of diseases is one of the oldest medical practices of mankind. Croton cajucara BENTH (CcB) is a vegetal species that is native and endemic in the Amazonian region, where it is popularly known as “sacaca”. Bark and leaf infusions of sacaca are widely used in folk medicine to treat many diseases, such as diabetes. Experimental and clinical studies suggest that oxidative stress is involved in the pathogenesis and progress of diabetes. The present study was designed to evaluate the effects CcB aqueous extracts (AE) on hepatic changes, plasma levels of glucose, triglycerides (TG) and cholesterol, genotoxic effects, oxidative stress, nitrites and nitrates levels, and on activation of the p65 subunit of nuclear Kappa B transcription factor (NF-B) in the livers of animals made diabetic by streptozotocin (STZ) administration. Six groups of 10 male Wistar rats each were used as follows: controls (CO); controls with 5-day treatment with CcB (CcB5D); controls with 20- day treatment with CcB (CcB20D); diabetics (DM); diabetics with 5-day treatment with CcB (DM5D); and diabetics with 20-day treatment with CcB (DM20D). DM was induced by intraperitoneal administration of STZ (70mg/Kg). The aqueous extract was obtained using 5g of CcB bark for 100ml H2O and intragastrically administered at a dose of 1.5mL. After 60 days retro orbital blood samples were obtained for analysis of serum enzymes AST, ALT, FA and glucose, triglyceride and cholesterol levels determination. The genotoxic activity was evaluated using the micronucleus assay (MN) in bone marrow. The liver homogenates were used for evaluation of lipoperoxidation (LPO) through thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), antioxidant enzymes SOD, CAT, GPx and GSH, nitric oxide metabolites (total nitrites and nitrates) and nuclear expression of p65 of NF-kB. The analysis of serum enzymes showed that there was an increase in ALT and AP in DM animals as compared to CO groups, and ALT was decreased in DM animals treated for 5 and 20 days. The treatment with CcB did not reduce the glycemia and cholesterol level, but there was a significant reduction in the TG levels in DM animals treated for 5 and 20 days. The CcB aqueous extract failed to show any genotoxic action. TBARS and SOD were increased in DM animals and significantly decreased in diabetic animals treated for 5 and 20 days. On the other hand, TBARS and SOD activity were increased in the CcB20D group. CAT and GPx activities were not significantly different across the studied groups. GSH was decreased in the diabetic animals as compared to controls and the DM5D group. The diabetic animals presented an increase in the metabolite levels of nitric oxide as compared to controls, and the administration of CcB AE failed to reverse this situation. There was activation of p65 nuclear expression in the diabetic animals, which was attenuated in the animals receiving the CcB AE. The treatment of diabetic rats with CcB appears to improve TG levels, but it did not reduce glycemia and cholesterol levels, probably because the study dealt with a chronic diabetes model. The treatment decreased LPO and SOD activity, probably because of CcB’s antioxidant activity as scavenger of superoxide anion radicals. The results show that in situations where there is no oxidative stress the extended use of CcB behaves acts as a pro-oxidant and in situations where there is oxidative stress the treatment with CcB may be an antioxidant scavenger of free radicals. Furthermore, the results seem to support the hypothesis that the oxidative stress seen in DM stimulates NF-B expression and that CcB AE administration reduces such expression.

A identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de glioblastomas multiformes (GBMs) se faz necessária devido ao mau prognóstico e ineficiência das terapias associadas a esses tumores. Nesta dissertação, avaliamos o envolvimento do Fator Nuclear kappaB (NFkappaB) e da via da PI3K/Akt no crescimento in vitro de glioblastomas, e o potencial uso dos inibidores de NFkappaB e de PI3K/Akt como possíveis agentes antitumorais. Com esta finalidade foram utilizados os inibidores farmacológicos de NFkappaB (partenolide), e de PI3K/Akt (quercetina e Ly294002), e o inibidor misto de NFkappaB/Akt (curcumina). Os inibidores de NFkappaB causaram uma significativa diminuição na viabilidade dos GBMs quando comparado com os inibidores de outras vias de sinalização (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr e JNK1/2), a qual foi tipo dose resposta. Além disso, os inibidores de NFkappaB apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura e perda de integridade da membrana plasmática que foi vista através da técnica do Iodeto de Propideo (PI). Já os inibidores de PI3K/Akt apresentaram um menor efeito do que o apresentado pelos inibidores de NFkappaB, não demonstrando uma curva do tipo dose resposta, ainda assim, diminuíram a viabilidade dos GBMs. Entretanto, não apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura, e não houve incorporação de PI, mostrando que, diferentemente do que ocorre com os inibidores de NFkappaB, a perda de viabilidade vista nas células tratadas com os inibidores de PI3K/Akt está preponderavelmente relacionada com uma diminuição na proliferação, e não com morte celular. Vimos também que os inibidores foram capazes de alterar o imunoconteúdo de fatores relacionados com morte e sobrevivência celular, tais como caspase 3, LC3 A/B, PARP e Hsp70, assim como o ciclo celular. Portanto, nossos resultados demonstram que a via da PI3K/Akt parece estar preferencialmente relacionada com a proliferação celular, enquanto a via do NFkappaB preferencialmente com sobrevivência. / The identification of new therapeutic targets for treatment of glioblastoma multiforme (GBMs) is necessary due to poor prognosis and ineffective therapies associated with these tumors. In this study we have assessed the role of Nuclear Factor-kappaB (NFkappaB) and the PI3K/Akt pathway in glioblastomas in vitro growth, and their inhibitors as potential antitumor agents. For this we used the pharmacological inhibitors of NFkappaB (Parthenolide), and PI3K/Akt (LY294002 and quercetin), and mixed inhibitor of NFkB / Akt (curcumin). NFkappaB inhibitors yielded a significant decrease in viability of GBMs compared to inhibitors of other signaling pathways (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr and JNK1 / 2), which was dose-dependent. Furthermore, inhibitors of NFkappaB showed LDH releasing in culture medium and membrane integrity losing, evaluated through the Propidium Iodide (PI)-based method. The PI3K/Akt inhibitors showed a smaller effect than NFkappaB inhibitors, also decreasing GBMs viability but playing no dose-dependence response. Despite there was not LDH releasing in culture medium and PI incorporation, showing that the loss of viability observed in cells treated with inhibitors of PI3K/Akt is associated with a decrease in the proliferation, unlike what happens with inhibitors of NFkappaB, no cell death was observed. We have also seen that the inhibitors were able to alter the contents of immune-related factors death and cell survival, such as caspase-3, LC3 A / B, PARP and Hsp70, as well as the cell cycle. Therefore, our results demonstrate that the PI3K/Akt pathway seems to be related to cell proliferation, while the NFkappaB pathway to survival.