Le Tombac est une plante à fumer plantée au Liban, pays méditerranéen doté de conditions climatiques uniques reflétant une biodiversité particulière permettant la présence de nombreux habitats végétaux à différents niveaux de la mer. Cependant, cette variété de plante à fumer locale libanaise est principalement plantée dans la vallée d’Akkar (nord du Liban) du côté de la mer, ce qui lui confère une saveur et un arôme uniques qui la différencie du fameux tabac oriental de haute valeur aromatique qui est cultivé dans quelques-uns des très rares pays méditerranéens voisins. Étant donné que le Tombac a besoin de conditions de croissances particulières et afin de conserver son arôme et sa saveur uniques, une procédure de récolte et de séchage spéciale est supposée contribuer à la production de ses métabolites secondaires qui jouent un rôle important en tant que bio-pesticide végétal préliminaire. La production de feuilles sèches de Tombac au Liban est continue car elle est subventionnée par une entreprise gouvernementale appelée Régie Libanaise des Tabacs et Tombacs, sous la supervision du ministère des Finances, dans le but de réduire l'immigration des agriculteurs de leurs villages. Les plantes sèches de Tombac nécessitent un appareil à fumer spécial appelé pipe à eau (Shisha ou Arguilet en arabe), qui peut également être utilisé pour le tabac Mouassel (un mélange spécial contenant du saccharose et de la glycérine) après avoir changé le type de tête, où les feuilles sont séchées pour être fumées, elles sont ensuite trempées dans de l’eau et, après le rinçage, elles sont fixées sur la tête en forme de selle sur le tuyau d’eau avec des braises de charbon au-dessus. Le Tombac est considéré comme une plante cancérigène et dangereuse, non seulement pour la santé des fumeurs, mais également pour les mains et les parties du corps des agriculteurs et les travailleurs dans les champs ou dans les ateliers d’emballage qui sont en contact avec sa sève à tous les stades de la production en raison de l’effet de la maladie du tabac vert (MTV). De nos jours, les pesticides bio-essences dérivés de certains extraits de métabolites végétaux sont considérés comme l'une des solutions les plus prometteuses pour la lutte antiparasitaire respectueuse de l'environnement en agriculture. En raison de ces faits, un certain nombre d’études ont été menées sur la plante Tombac afin de la définir, de déterminer son origine, sa taxonomie, ses plantations, ses utilisations, ses effets sur la santé de l’homme, que ce soit pour les fumeurs ou les travailleurs, et en tant que source prometteuse d’utilisation écologique de Tombac comme bio-essence pour l’avenir par l’analyse chromatographique de cette huile. / Tombac is a smoking plant that is planted in Lebanon a Mediterranean country that has unique climatic conditions which reflect a special biodiversity allowing the presence of many plants habitats at different sea levels. However, this Lebanese local smoking plant variety is planted mainly in Akkar valley north of Lebanon and located on the sea side (Fig.1) giving it a unique smoking flavor and aroma which makes it different from the famous valuable high aromatic oriental tobacco that is grown in some of very few nearby Mediterranean countries. Since Tombac needs a special growing conditions, and in order to keep its unique aroma and flavor, a special harvest and drying procedures are performed that is believed to contribute in the production of its secondary metabolites that play an important role as a preliminary plant biopesticides. Tombac dry leaf production in Lebanon is continuous because it is subsidized by a governmental enterprise called Régie Libanaise des Tabacs & Tombacs under the supervision of the Ministry of finance in the purpose of reducing the immigration of the farmers from their villages. Tombac dry plants needs a special smoking apparatus known as water pipe or shisha (fig.2) that can be used also for tobacco Mouassel (a special mix contains sucrose and glycerine) after changing the head type (fig.2) where the dried leaves to be smoked are soaked in water and after rinsing it is fixed on the bowel-shaped head of the water pipe with the heated charcoal on it (fig.3). Tombac is considered a carcinogenic and hazardous plant not only on the health of their smokers , but also for the hands and body parts of those farmers and labors who work in the field, packaging, and get in contact with its sap(fig.4) in all the stages of production because of the effect of Green Tobacco Sickness (GTS). Nowadays, Bio-oil pesticide derived from some plant secondary metabolite extracts is considered one of the most promising solutions for Eco-friendly pest control in agriculture. Because of these facts, a number of studies were done on Tombac plant to define it, cover its origin, taxonomy, plantation, uses, effects on human health as smokers as well as workers and the alternative eco-friendly use of Tombac as promising source bio oil pesticide for the future.

Plants have evolved many mechanisms to defend against herbivores and pathogens. In many cases, these mechanisms took other duties. One example of such a neofunction- alisation would be carnivory. Carnivory evolved from the defence against herbivores. Instead of repelling the predator with a bitter taste, the plant kills it and absorbs its nutrients. A second example can be found in the pollination process. Many of the genes involved here were originally part of defence mechanisms against pathogens. In this thesis, I study these two examples on a genomic and transcriptomic level. The first project, Genomics of carnivorous Droseraceae, aims at obtaining annotated genome sequences of three carnivorous plants. I assembled the genome of Aldrovanda vesiculosa, annotated those of A. vesiculosa, Drosera spatulata and Dionaea muscipula and com- pared their genomic contents. Because of the high repetitiveness of the D. muscipula genome, I also developed reper, an assembly free method for detection, classification and quantification of repeats. With that method, we were able to study the repeats without the need of incorporating them into a genome assembly. The second large project investigates the role of DEFL (defensin-like) genes in pollen tube guidance in tobacco flowers. We sequenced the transcriptome of the SR1 strain in different stages of the pollination process. I assembled and annotated the transcriptome and searched for differentially expressed genes. We also used a method based on Hidden- Markov-Models (HMM) to find DEFLs, which I then analysed regarding their expression during the different stages of fertilisation. In total, this thesis results in annotated genome assemblies of three carnivorous Droser- aceae, which are used as a foundation for various analyses investigating the roots of car- nivory, insights into the role of DEFLs on a transcriptomic level in tobacco pollination and a new method for repeat identification in complex genomes. / Im Laufe der Evolution haben Pflanzen viele Methoden entwickelt, um sich gegen Fress- feinde und Pathogene zu verteidgen. Viele dieser Methoden wurden im Laufe der Zeit umfunktioniert. Ein Beispiel hierfür ist die Karnivorie, welche aus der Verteidigung ge- gen Fressfeinde entstanden ist. Anstelle einen Angreifer durch bitteren Geschmack zu vertreiben, tötet die Pflanze das Tier und nimmt seine Nährstoffe auf. Ein weiteres Bei- spiel ist der Bestäubungs- und Befruchtungsprozess. Viele der Gene, die hier involviert sind, stammen ursprünglich aus Mechanismen zur Verteidigung gegen Pathogene. In dieser Arbeit untersuche ich diese beiden Beispiele auf genomischer und transkrip- tomischer Ebene. Die Zielsetzung des ersten Projekts, Genomik von karnivoren Dro- seraceaen, ist es, assemblierte und annotierte Genome von drei karnivoren Pflanzen zu generieren. Ich habe dazu das Genom von Aldrovanda vesiculosa assembliert und dieses, sowie die Genome von Drosera spatulata und Dionaea muscipula annotiert und mit- einander verglichen. Aufgrund des hohen Anteils repetitiver Elemente im D. muscipula Genom habe ich reper, eine Methode zum Detektieren, Klassifizieren und Quantifizieren von Repeats, entwickelt. Mit dieser Methode ist es nun möglich, repetitive Elemente zu untersuchen, ohne diese in einem Genomassembly integrieren zu müssen. Das zweite große Projekt untersucht die Rolle von DEFL (defensin-like) Genen im Pollenschlauchwachstum in Tabakblüten. Dazu haben wir das Transkriptom der SR1 Variante zu verschiedenen Zeitpunkten im Befruchtungsprozess sequenziert. Ich habe dieses Transkriptom assembliert und annotiert und darin nach differentiell exprimierten Genen gesucht. Zudem haben wir mit einer auf Hidden Markov Modellen (HMM) ba- sierten Methode nach DEFL Genen gesucht und ich habe die Expression dieser in den verschiedenen Stadien untersucht. Zusammenfassend beinhalten die Ergebnisse dieser Thesis annotierte Genomassemb- lies von drei karnivoren Droseraceaen, Erkenntnisse über die Rolle von DEFL Genen bei der Befruchtung auf einer transkriptomischen Ebene und eine neue Software zur Analyse von repetitiven Elementen in komplexen Genomen.

This project is focused on transformation of Silene vulgaris mediated by Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes. S. vulgaris is a good model plant to study gynodioecy, an evolutionary step from bisexuality to dioecy. Gynodioecious plants form in some individuals bisexual flowers, while the others possess only female flowers. The aim of this research is do develop a technique to introduce foreign genes into this plant to study its developmental consequences. Using A. rhizogenes we successfuly prepared hairy root cultures, which unfortunately do not form shoot regenerants. We have prepared a protocol to induce plant regenerants from S. vulgaris leaf fragments. The first results do not confirm that A. tumefaciens infected plant regenerants harbor reporter transgenes. We used Nicotiana tabacum as a positive control.

The ability of the accumulation of thorium and study of the stress responses on his presence was tested on a selected cultivar of tobacco, La Burley 21. Plants were cultivated in Hoagland's hydroponic medium under artificial light. Except to the ability of accumulation and distribution of thorium in the all parts of plant was investigated the effect of selected organic and inorganic additions on accumulation. Among organic substances included citric acid, tartaric and oxalic acid in their presence was observed the increase of thorium in all parts of the plant. Were also tested products from the diamine and polyamines (putrescine, cadaverine, spermine and spermidin). These substances, also known for their antioxidant activity in plants, had an impact on reducing the accumulation of thorium, especially in the root system of plants. The most important factor influencing the accumulation of thorium was the absence of phosphate ions in a hydroponic medium, which caused the rise of the concentration of thorium about several levels in all parts of the plants. The initial decrease of pH after additions of organic acids or addition of high concentrations of thorium and the gradual increase of pH during cultivation had proved significant. It was also compared the uptake of accumulation and distribution of...

The HIV/AIDS pandemic has dramatically altered patterns of morbidity and mortality in sub-Saharan Africa during the last two decades. In the absence of HIV vaccine, microbicides may offer viable option for protection against HIV infection. Microbicides are products that are applied topically inside the vagina or rectum that act to impede transmission of HIV and other sexually transmitted diseases. Small human chemokines such as RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted) are currently been investigated as microbicides candidates. A number of N-terminally modified RANTES analogues such as 5P12 and 6P4 with a much higher antiviral potency have been developed and they have strong potential for use as microbicides. Since plants offer an alternative option for cost effective production of protein therapeutics, we evaluated the feasibility of expressing 5P12 and 6P4 in Nicotiana benthamiana species. 5P12 is considered the most promising candidate for use in the microbicide pipeline because it inhibits HIV infection through cellular receptor antagonism. Hence its feasibility of expression was also evaluated in Lycopersicon esculentum (tomato). The two analogues were transiently expressed in the selected plant species via agrobacterium-mediated transfection. For expression in N. benthamiana, two different vectors (pTRA and MagnICON) were used to deliver the two analogues for transient expression. About 6-8 weeks-old N. benthamiana plants were agroinfiltrated via needle injection and vacuum infiltration methods and targeted to four subcellular compartments viz: apoplast, chloroplast, cytosol and endoplasmic reticulum (ER). The agroinfiltrated leaves were replanted, grown in a tissue culture laboratory and harvested after different periods. For expression in L. esculentum, the MagnICON constructs were used to deliver the 5P12 gene into four different developmental stages of tomato fruits viz: mature green (MG), breaker (B), pink (P) and ripe (R) via needle injection. The agroinjected tomato fruits were incubated in a dark cupboard and harvested after different periods. xiii Proteins were extracted from the harvested material and evaluated for 5P12 and 6P4 expression. ELISA results showed expression of 5P12 and 6P4 in N. benthamiana leaves which was detectable at 3-9 days post infiltration (dpi). Similar results were obtained for 5P12 and 6P4, consequently only results for 5P12 are reported. The vacuum infiltrated leaves of both pTRA and MagnICON constructs led to higher yields than the needle injected leaves. The highest yields were obtained with the MagnICON constructs. The highest 5P12 expression level of 603 μg/kg fresh weight leaf tissues (~0.024% TSP) was obtained in the apoplast at 9 dpi. The pTRA constructs had the highest expression levels of 0.63μg/kg FW in the cytosol at 3 dpi. 5P12 was also detectable at 3-9 dpi in L. esculentum, based on ELISA results. The highest 5P12 expression of 23.56 μg/kg FW and pH 4.75 tissues was obtained at the MG stage in the apoplast at 9 dpi. Western blot analysis confirmed the size of plantmade 5P12. Moreover, the plant extracts had anti-viral activity and were not toxic to TZM-bl cells. Our results show that the RANTES can be made in both N. benthamiana and L. esculentum and that the levels are not different from other systems reported previously. Furthermore, this is the first report that a chemokine has been expressed in plants. The quantities expressed were low making the commercial development of a microbicide from these species impractical. However, production of bulky leaf material may enhance the quantities. / Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2013. / gm2013 / Paraclinical Sciences / unrestricted

Vakuoläre PPasen (V-PPase) in Landpflanzen dienen dem Transport von Protonen in die Vakuole und dem Aufbau eines elektrochemischen Gradienten, während sie gleichzeitig durch Hydrolyse eine Anreicherung des toxischen PPi im Cytosol verhindern. Zahlreiche Publikationen bewiesen bereits positive Effekte der stabilen V-PPase-Überexpression in Pflanzen. Unter anderem zeigte die Ackerschmalwand, Tabak, Reis und Tomate eine erhöhte Biomasse und gesteigerte Stresstoleranz auf Grund einer erhöhten stabilen V-PPase Ex-pression. Um die zugrundeliegenden Prozesse ohne potenzielle pleiotropische Effekte während der Pflanzenentwicklung zu analysieren, wurden in der vorliegenden Dissertation die physiologischen Auswirkungen einer transienten V-PPase-Überexpression in Nicotiona benthamiana Blättern und die Einflussnahme von NaCl quantitativ erfasst. Zu diesem Zweck wurden zwei endogene V-PPasen (NbVHP1 und NbVHP2) aus N. bentha-miana zunächst bioinformatisch und dann auf Transkriptionsebene mittels quantitativer Real-Time-PCR identifiziert. Die endogenen V-PPasen wurden mittels der Agrobakterien-Infiltrationstechnik transient in N. benthamiana Blättern und ihre vakuoläre Lokalisation mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern bestätigt. Die Protonenpump-Funktion der überexprimierten NbVHPs konnte mit der Patch-Clamp-Technik anhand des vier-fach erhöhten Protonenpump-stroms in den isolierten Mesophyllvakuolen verifiziert werden. Im Zuge der elektro-physiologischen Charakterisierung der endogenen N. benthamiana V-PPasen konnte die für V-PPasen typische Sensitivität gegenüber cytosolischem Calcium bestätigt werden, welche sich bei einem erhöhten Calcium-Spiegel in einer Hemmung der Pumpströme äußerte. Ferner wurde ihre gleichartige Substrataffinität (Km von 65 µM PPi) unabhängig des vakuolären pHs zwischen 5,5 und 7,5 festgestellt. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit analog durchgeführten Messungen an der bereits publizierten AtVHP1 von A. thaliana bestätigte die große Homo-logie der V-PPasen von Landpflanzen. Im Gegensatz zu den erwünschten Auswirkungen der stabilen V-PPase Überexpression resultierte diese starke transiente Überexpression nach drei Tagen im Absterben makroskopischer Blattbereiche. Das Ausmaß dieser Nekrosen wurde anhand des vorhandenen PhotosystemII in den transformierten Blättern mit der Puls-Amplituden-Modulations-Technik quantifiziert. Die analoge transiente Überexpression einer löslichen PPase (IPP1) führte allerdings zu keinerlei negativen Effekten für die Pflanze, wodurch die erhöhte Protonentransportaktivität im Gegensatz zur Hydrolyseaktivität der V-PPasen als Ursache des Zellsterbens verifiziert werden konnte. Aufgrund dieser unerwarteten negativen Auswirkungen der transienten V-PPase-Überex-pression auf die Blattvitalität wurde zusätzlich die Salzstresstoleranz der Blätter untersucht. Unter Berücksichtigung des kurzen Transformations- und damit Beobachtungszeitfensters wurde ein Salzapplikationsverfahren etabliert, bei dem simultan mit der Agrobakterien-infiltration 200 mM NaCl direkt in den Blattapoplasten eingeführt wurde. Anhand einer Zu-nahme in sowohl der Transskriptmenge der V-PPase als auch des PPi-induzierten Protonen-pumptransportes über den Tonoplasten wurde gezeigt, dass die NaCl-Anwesenheit im Blatt eine erhöhte Aktivität der endogenen V-PPasen des N. benthaminan Pflanzen bewirkte. Der gleichzeitige tendenzielle Rückgang der V-ATPase-Pumpaktivität in salzbehandelten Mesophyllvakuolen lässt vermuten, dass die V-PPasen eine größere Rolle bei der Bewahrung des vakuolären pH-Wertes und der protonenmotorische Kraft (PMF) unter Salzstress ein-nimmt. Interessanterweise führte die Salzapplikation bei einer V-PPase-Überexpression zu keinen additiven negativen Effekten, sondern verhinderte sogar das Auftreten der Nekrosen. Um dieses Phänomen zu ergründen, wurde zunächst mit Hilfe von Apoplastenwaschungen und Natrium-Konzentrationsmessungen bestätigt, dass das injizierte NaCl im Blatt verblieb und von den Blattzellen aufgenommen wurde. Für weitere Studien der Ursachen der Nekrosen wurden in-vivo-pH-, Membranpotenzial- und Metabolitmessungen durchgeführt. Während in V-PPase-überexprimierenden Zellen der vakuoläre pH-Wert zu Kontrollvakuolen signifikant sank, blieb er mit zusätzlicher Salzbehandlung auf Kontrollniveau. Des Weiteren schwächte die Salzapplikation die starke Depolarisation der Plasmamembran nach V-PPase-Über-expression um mehr als die Hälfte ab. Hingegen konnten keine nennenswerten Ver-änderungen im Metabolit- und Ionengehalt des Blattgewebes bei V-PPase-Überexpression festgestellt werden. Lediglich der Natrium- und Chlorid-Spiegel waren bei salz-behandelten Blättern erwartungsgemäß erhöht. Diese Ergebnisse bekräftigten, dass der stark erhöhte V-PPase-vermittelte Protonenpumpstrom und weniger metabolische Veränderungen für die Nekrosen von V-PPase-überexprimierte Pflanzen verantwortlich ist. Diese negativen Auswirkungen werden offensichtlich durch die Salzbehandlung stark vermindert, da die Aufnahme der Salz-ionen über Protonen-Na+/K+-Antiporter wie NHX antagonistisch auf die V-PPase verursachte Protonenanreicherung und die daraus folgende Veränderung des Membran-potentials und der PMF entgegenwirkt. In diese Arbeit wurde in einem neuen Blickwinkel deutlich, dass die natürliche Expressions-kontrolle der V-PPase in ausdifferenzierten Pflanzenzellen sich den Umweltbedingungen anpasst, um das Gleich-gewicht zwischen den positiven und negativen Auswirkungen der Pumpaktivität zu halten. / The plant vacuolar PPases (V-PPase) transport protons across the tonoplast from the cytosol into the vacuole. This establishes a trans-tonoplast electrochemical gradient and prevents the accumulation of toxic PPi in the cytosol. Many publications have already shown positive effects of stable V-PPase overexpression in plants. Arabidopsis, tobacco, rice and tomato for example, all showed increased biomass and greater stress tolerance with stable V-PPase overexpression. To understand the underlying processes without potential pleiotropic effects during plant development, we characterised V-PPase in Nicotiana benthamiana leaves using an electrophysiological approach, and investigated its physiology in overexpressing plants, concentrating on its regulation by NaCl. Two endogenous V-PPases (NbVHP1 and NbVHP2) from N. benthamiana were identified using bioinformatics and quantified with real-time PCR. Endogenous V-PPases were transiently overexpressed using Agrobacteria in N. benthamiana leaves, with their vacuolar localisation confirmed by fluorescence labelling. The proton pump activity of the NbVHPs was verified by a fourfold increase in the patch clamp-recorded proton current response of isolated mesophyll vacuoles. For the electrophysiological characterisation of the endogenous V-PPases, the V-PPase-typical cytosolic calcium sensitivity was confirmed; the proton pump became inhibited with increased calcium levels. Furthermore, their similar substrate affinity, a Km of 65 μM PPi, was found to be independent of the vacuolar pH between 5.5 and 7.5. Both attributes were comparable to the already published AtVHP1 of Arabidopsis thaliana, showing a high homology of plant V-PPases. The physiological effects of V-PPase overexpression was obvious from the time-delayed death of transformed cells. In contrast to the desired effects of stable V-PPase over-expression, this strong transient overexpression resulted in macroscopic dead leaf areas after three days. The extent of these necroses was quantified by counting the existing photosystems in the transformed leaves using the pulse-amplitude modulation technique (PAM). In contrast, no necrosis was found in plants where a soluble PPase (IPP1) was over-expressed. This supports the hypothesis that the increased proton transport activity of V-PPases, not the hydrolysis activity, is the cause of cell death. Because of these unexpected negative effects of transient V-PPase over-expression on leaf vitality, the salt stress tolerance of the leaves was also examined. The short transformation and observation time window meant we needed to establish a new way of salt application; we injected 200 mM NaCl directly into the leaf apoplast simultaneously with the agrobacterial material. Absorption of NaCl by leaf cells was confirmed by apoplast washing and sodium concentration measurements. The NaCl treatment increased the amount of transcripts of endogenous V-PPases in tobacco and increased the PPi-induced proton transport across the vacuolar membrane. The concomitant decline in V-ATPase pumping activity in saline-treated mesophyll vacuoles indicates that V-PPases have a significant role in maintaining the vacuolar pH and proton motive force (PMF) under saline conditions. Interestingly, simultaneous salt administration with V-PPase overexpression did not result in an additive negative effect but did prevent the occurrence of necrotic leaf areas. For further analysis of the necrosis, in vivo pH, membrane potential and metabolite measurements were performed. Under V-PPasen over-expression and salt treatment, the vacuolar pH remained constant and did not decrease as it did in non-salt-treated V-PPase over-expressing cells. Furthermore, the salt application attenuated the strong depolarisation of the plasma membrane by more than a half in V-PPase overexpressing plants, but no noteworthy changes in cell metabolism could be detected by metabolite and ion concentration measurements. Only the Na+ and Cl- levels were, as expected, increased in salt-treated leaves. This decrease in vacuolar pH alongside a membrane depolarisation confirms that the strong proton pump current of the V-PPase overexpressing vacuoles is the cause of the observed necrosis. These negative effects are obviously greatly reduced by salt treatment, since the uptake of the salt ions via proton:Na+/K+ antiporters such as NHX acts as an antagonist to V-PPase-induced proton accumulation in the vacuole and the consequent change in membrane potential and PMF. This work reveals in a new perspective, that the natural expression control of V-PPase in differentiated plant cells adapts to environmental conditions to balance the positive and negative effects of pumping activity.

Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt. / Stomata are small pores in the leaf surface that allow plants to adapt their water balance to changing environmental conditions. The turgor pressure of the guard cells determines the width of the stomatal aperture and is regulated by ion fluxes in or out of the guard cell. A network of different signal transduction pathways is necessary for the adaption of stomatal movements to ambient conditions. Many of these transduction pathways have been described in detail and many of their components have been identified. It is a well known fact that calcium acts as a second messenger in pathways regulating stomatal movements. However, the mechanisms that lead to transient elevations of the cytosolic calcium concentration are largely unknown. The molecular basis of the regulation of stomatal aperture in non-angiosperm species is also poorly understood. In order to gain new insights into these topics, mechanisms of calcium elevation and electrophysiological properties of guard cells were studied, focussing especially on the visualization of the cytosolic calcium concentration in guard cells. In the first part of this study, the application of hyperpolarizing voltage pulses by means of TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) was used to specifically trigger an increase in the cytosolic calcium concentration in individual guard cells in the angiosperm model plant Nicotiana tabacum. To visualize the dynamics of the cytosolic calcium concentration with high temporal and spatial resolution, a spinning disc system for confocal imaging was used simultaneously with the electrophysiological recordings. During the application of hyperpolarizing voltage pulses a transient increase in cytosolic volume was observed. This increase can be explained by an osmotically driven water flux caused by changes of the cytosolic ion concentration. These in turn are caused by the voltage-dependent activation of inward rectifying potassium channels in the guard cell plasma membrane and by the compensating current from the impaled microelectrode. Using the calcium-sensitive dye Fura-2, it could be shown that two mechanisms lead to the elevation of the cytosolic calcium concentration during the application of hyperpolarizing voltage pulses. The first mechanism is the activation of hyperpolarization-activated calcium permeable channels (HACCs) in the plasma membrane, which has already been described in 1998 by Grabov & Blatt. In addition to this mechanism of calcium release, a second previously unknown mechanism was discovered in which calcium is released into the cytosol from intracellular stores. This mechanism is related to the increase in cytosolic volume we described above and is probably caused by changes in membrane tension or osmolarity within the cell. These changes could lead to an activation of mechanosensitive calciumpermeable channels. The second part of this thesis deals with the molecular basis of the regulation of stomata in non-angiosperms. In guard cells of Polypodium vulgare voltage-dependent currents across the plasma membrane similar to those described in angiosperm model plants could be measured using TEVC. Furthermore, the application of hyperpolarizing voltage pulses induced increases in cytosolic calcium concentration in guard cells of Polypodium and Asplenium indicating the existence of voltage-dependent calcium permeable channels in the plasma membrane. The diffusion of iontophoretically injected fluorescent dyes into the neighboring guard cells in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris and Selaginella showed that in these species a symplastic connection between neighboring guard cells exists, which could not be observed in guard cells of angiosperms. Electron microscopic images of Polypodium glycyrrhiza guard cells showed that this connection is probably formed by plasmodesmata between adjacent guard cells. Analysis of the calcium dynamics in neighboring guard cells after hyperpolarizing voltage pulses revealed that calcium homeostasis seems to be regulated independently in both guard cells despite their symplastic connection. As part of the investigations on guard cells of ferns, a new method for the application of ABA was established, which allows the phytohormone to be charged iontophoretically into the apoplast with the aid of microelectrodes. In contrast to the guard cells of Nicotiana tabacum, which reacted with loss of turgor and subsequential stomatal closure to this method of ABA-application, no closure of the stomata could be induced in Polypodium vulgare in this way. However, since the ABA response of fern stomata is also dependent on other factors such as growth conditions (Hõrak et al., 2017), an ABA-responsiveness in this fern species can still not be completely excluded. The release of calcium from intracellular stores, as shown in this work, could play an important role for the regulation of stomatal aperture. To clarify this question, the identification of the channels involved in osmotically/mechanically induced calcium release from internal stores would be of great interest. Further studies on fern guard cells could clarify the physiological significance of ion channels known from angiosperms for the stomatal movements in early land plants, and thus contribute significantly to the understanding of the evolution of stomatal regulation. In addition, the question arises as to what role the symplastic connection of the neighboring guard cells through plasmodesmata plays for the function of stomata.

Los cítricos son el cultivo frutal económicamente más importante tanto en España como en el resto de los países productores. La clave para mantener la competitividad de este sector consiste en obtener material vegetal de alta calidad, para lo cual son indispensables los programas de mejora. La mejora de cítricos por métodos clásicos es muy complicada, por lo que hay que recurrir a las nuevas tecnologías para intentar acelerar y optimizar el procedimiento. La reciente secuenciación del genoma de dos especies de cítricos ha permitido identificar una larga lista de genes candidatos a participar en determinados procesos biológicos. Sin embargo, son necesarios nuevos análisis para asociar cada gen a un fenotipo específico o función biológica. El empleo de vectores virales para determinar la función de genes mediante silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) ha demostrado ser una herramienta muy útil para los estudios de genética reversa realizados en plantas. Este sistema presenta ventajas respecto a los métodos tradicionales para estudiar la función de genes como son la mutagénesis o la transformación genética, ya que permite ensayar la función de numerosos genes en un corto periodo de tiempo. Esto es especialmente crítico en el caso de los cítricos, que poseen largos periodos juveniles de entre 6 y 8 años y donde la transformación de plantas adultas es muy difícil. Además, permite estudiar la función de genes que son esenciales para el crecimiento o el desarrollo de la planta y cuyo análisis es inviable con los métodos tradicionales. Al comienzo de la tesis se había desarrollado un vector viral para cítricos basado en el virus de la tristeza de los cítricos (CTV) con el que se pueden expresar proteínas pero que no se ha ensayado para estudiar la función de genes mediante VIGS. En el laboratorio disponíamos de un clon infeccioso de cDNA del genoma completo del virus del manchado foliar de los cítricos (CLBV), un virus que infecta a todas las especies y variedades de cítricos ensayadas y es asintomático en la mayoría de ellas. Este clon infeccioso se ha modificado para obtener vectores virales basados en el genoma de CLBV que pueden servir tanto para expresar proteínas como para silenciar mediante VIGS genes de cítricos para la mejora genética de este cultivo. Para ello, se ha introducido un punto de corte único PmlI en dos zonas del genoma de CLBV: en el extremo 3¿ no traducible (vector clbv3¿) o en la zona intergénica localizada entre los genes de las proteínas de movimiento y cápsida (CP) (vector clbvIN). Para la expresión de secuencias foráneas mediante la formación de un nuevo RNA subgenómico (sgRNA) se delimitó la secuencia mínima promotora del sgRNA CP mediante clonación de fragmentos de distinta longitud en torno al origen de transcripción de dicho sgRNA en el vector clbv3'. El fragmento de 92 bases localizado entre los nt -42 y +50 respecto al inicio de transcripción del sgRNA CP contenía todos los elementos necesarios para la promoción de un nuevo sgRNA in vivo. Esta secuencia mínima promotora se clonó en los 2 vectores virales previamente desarrollados para generar los vectores clbv3¿pr y clbvINpr, respectivamente. Ambos vectores fueron capaces de producir un nuevo sgRNA y de expresar proteínas recombinantes. Para determinar la estabilidad de los vectores obtenidos se clonaron en ellos fragmentos de secuencias lineales de distinto tamaño, o en tándem invertido para la formación de una estructura en horquilla, y se inocularon en plantas de N. benthamiana y cítricos. Todas las construcciones derivadas del vector clbv3' se mostraron estables a lo largo de las diferentes brotaciones analizadas durante al menos 3 años, comprobándose la replicación viral e integridad del inserto. Sin embargo, no se detectó multiplicación viral con ninguna de las construcciones derivadas del vector clbvIN. La estabilidad de las construcciones derivadas de los vectores con el promotor duplicado dependía del tamaño del inserto. Con todas ellas se detectó replicación viral pero se observaron eventos de recombinación cuando se clonaban fragmentos superiores a 720 nt en el vector clbvINpr o 408 nt en el vector clbv3'pr. Un factor importante para determinar la eficiencia y funcionalidad de los vectores desarrollados es conocer cómo se mueve y se distribuye el virus en los distintos tejidos de la planta. Para ello se inocularon plantas de N. benthamiana y cítricos con la construcción clbv3¿pr-GFP, que expresa GFP en los tejidos donde se localiza el virus. En N. benthamiana, la observación de GFP permitió detectar la presencia de CLBV en la mayoría de tejidos, acumulándose preferentemente en óvulos y regiones meristemáticas. En cítricos no se pudo visualizar GFP pero el virus se detectó en regiones meristemáticas mediante RT-PCR a tiempo real e hibridación molecular. La acumulación de CLBV en tejidos meristemáticos explicaría la dificultad de eliminar este virus mediante microinjerto. Para evaluar la capacidad de los vectores clbv3'pr y clbvINpr para expresar proteínas se clonó en ellos la secuencia completa del gen gfp y se cuantificó la cantidad de proteína GFP sintetizada en las plantas infectadas. En N. benthamiana la cantidad de GFP estimada para el vector clbv3'pr fue de 16 µg de proteína por gramo de peso fresco, cantidad que resultó entre 5 y 6 veces superior a la estimada para el vector clbvINpr. Sin embargo, en cítricos, debido a la inestabilidad del vector clbv3'pr, sólo se pudo cuantificar la proteína expresada por la construcción del vector clbvINpr, estimándose en 0.6 µg de GFP por gramo de peso fresco. La efectividad de los vectores clbv3', clbv3'pr y clbvINpr para silenciar genes mediante VIGS se ensayó clonando fragmentos de genes tanto endógenos de plantas (pds, actina, sulfur) como el gen gfp introducido experimentalmente en plantas transgénicas. En cítricos todas las construcciones de los tres vectores indujeron fenotipo de silenciamiento del gen ensayado, aunque el vector clbv3' fue el más efectivo para el estudio de VIGS en este huésped. Sin embargo, en N. benthamiana sólo se desencadenó el silenciamiento en las plantas inoculadas con la construcción clbv3¿pr-hp58PDS, que expresa una horquilla de doble cadena de un fragmento de 58 nt del gen pds. En todas las plantas silenciadas se detectó una disminución del correspondiente mRNA del gen ensayado y una acumulación de siRNAs derivados tanto del mRNA del gen insertado como del RNA genómico del virus. Por otro lado, el fenotipo de silenciamiento de los genes ensayados se observó en sucesivas brotaciones, lo que confirma la gran estabilidad de los vectores basados en el genoma de CLBV. Los vectores virales desarrollados en esta tesis constituyen una herramienta eficiente para el estudio de la función de genes mediante genética reversa utilizando la técnica VIGS. También pueden ser útiles para estudio de genética directa mediante expresión de proteínas o para la protección del cultivo frente a enfermedades producidas por virus, bacterias y hongos o frente a plagas de invertebrados. / Agüero González, J. (2013). Desarrollo de vectores virales basados en el virus del manchado foliar de los cítricos (CLBV) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34342

Les plantes sont des hôtes prometteurs pour la production de protéines recombinantes d’intérêt médical et de nombreuses études ont été réalisées au cours des années pour optimiser le taux d’expression des transgènes ou la maturation des protéines en systèmes végétaux. En comparaison, les connaissances demeurent limitées au sujet de l’influence des facteurs environnementaux et des pratiques culturales sur l’expression et le rendement en protéines recombinantes dans les plantes. Les pratiques culturales courantes en serriculture, si elles permettent en général une production importante de biomasse et des rendements élevés en produits horticoles, ne sont pas nécessairement bien adaptés à la production de protéines recombinantes dans un contexte de moléculture. Dans cette étude, nous avons étudié les effets d’un enrichissement en CO2 atmosphérique, d’une forte irradiance sur le couvert végétal, d’une fertigation riche en ammonium et d’une densité de plantation élevée sur la croissance, le développement et le rendement en protéine recombinante chez l’hôte d’expression Nicotiana benthamiana utilisé pour la production du principe actif d’un vaccin contre la grippe, l’hémagglutinine H1 du virus de l’influenza. En bref, nos données ont montré les effets positifs (1) d’un enrichissement en CO2, d’une forte luminosité, d’un éclairage intercalaire dans la canopée végétale ou d’une solution nutritive riche en ammonium sur la production de biomasse et le contenu en protéines dans la plante; et (2) d’un éclairage intercalaire et d’une forte densité culturale sur le rendement en protéine H1 par unité de surface en culture. En revanche, le rendement en H1 n’a pas été altéré, ou l’a été négativement, sous de fortes concentrations en CO2 atmosphérique, sous une forte luminosité au-dessus du couvert végétal ou par une solution nutritive riche en ammonium. En somme, nos données indiquent que les conditions de culture optimales pour la production de produits horticoles en conditions confinées peuvent ne pas être appropriées dans un contexte de moléculture où l’objectif ultime est le rendement en protéine recombinante, non pas la production de biomasse foliaire, la teneur en nutriments ou le rendement en fruits ou en fleurs. / Plants are promising hosts for the production of medically-useful recombinant protein sand numerous studies have been done over the years to optimize transgene expression rates and protein maturation processes in plant systems. By comparison, little is still known about the influence of basic environmental factors and cultural practices on the expression and yield of heterologous proteins in plants. Current cultural practices in greenhouse settings, that generally allow for an increased biomass or food/flower product yield, are not necessarily well suited to recombinant protein production in a molecular farming context. In this study, we investigated the effects of CO2 enrichment, supplemental lighting, ammonium fertigation and plant culture density on growth, development and recombinant protein yield of the protein expression host Nicotiana benthamiana used to express the flu vaccine antigen influenza virus hemagglutinin H1. In brief, our data showed (1) atmospheric CO2 enrichment, high-light irradiance, supplemental LED inter-lighting in the plant canopy and high-ammonium fertigation to enhanced leaf biomass production and endogenous protein content on a plant basis, and (2) LED inter-lighting or elevated plant density to increase recombinant protein yield on a whole-crop area basis. On the other hand, H1 content was not influenced or negatively affected by CO2 enrichment, high-light irradiance or high-ammonium supply on a leaf fresh weight basis. Overall, our findings indicate that the optimal cultural practices for the production of horticultural food products or ornementals in controlled environment settings may not be optimal in molecular farming settings, where the ultimate goal is recombinant protein yield and quality, not leaf biomass, nutrient content, fruit yield or flower quality.

Tnt1 is a transcriptionally active LTR-retrotransposon, present in over 600 copies in the Nicotiana tabacum genome. Under normal growth conditions, Tnt1 expression is limited to basal levels, but its expression is further induced under biotic and abiotic stresses. Transgenic tobacco plants (HP plants) expressing a Tnt1 reverse transcriptase hairpin were generated. These showed pleiotropic phenotypes such as cell death spots on the leaves and callose deposition and other severe abnormal development in aerial and underground portions. RNA sequencing of leaves with cell death spots revealed a rewiring of transcriptional regulatory networks related to stress responses exclusive to HPs. Among the positively modulated genes were ethylene synthesis and response cascade genes. The objective of the present work was to unravel the relation observed between Tnt1 and ethylene, generating a model. The results obtained suggest that HP seedlings and plants have increased ethylene synthesis when compared to the wildtype. Folding prediction of Tnt1 messenger RNA allowed the identification of ethylene-responsive sequences in putative stem loop locations. Thus it is possible that Tnt1 expression can produce small RNAs targeted to sequences present in the Tnt1 retrotransposon itself as well as at the promoter region of other ethylene responsive genes. Quantification of the expression of Tnt1 and ethylene related genes revealed \"phase opposition\" expression kinetics in the HPs, which led us to hypothesize that there might be an antagonistic relationship between the expression of Tnt1 and the expression of ethylene responsive genes involved in plant defense responses. Our findings suggest that Tnt1 could generate sRNAs that exerts transcriptional control over itself as well as other genes. Our model establishes a completely new biological role for a retrotransposon: Tnt1 would provide feedback control to ethylene-mediated gene regulation in tobacco defense responses, bringing the system back to a homeostatic condition and turning the defense responses down. / Tnt1 é um retrotransposon com LTR transcricionalmente ativo, e está presente em mais de 600 cópias no genoma de Nicotiana tabacum. Em condições normais de crescimento Tnt1 é expresso em níveis basais. No entanto, sua expressão é induzida pelo estímulo de estresses bióticos e abióticos. Plantas de tabaco transgênicas (chamadas de HP) expressando um grampo da transcriptase reversa de Tnt1 foram geradas. Estas apresentaram fenótipos como: pontos de morte celular e deposição de calose nas folhas e severas anomalias de desenvolvimento severas nas porções aérea e radicular das plantas. Sequenciamento de RNA de folhas com os pontos de morte celular revelou uma reorganização de redes de regulação transcricional relacionadas a resposta a estresses. Essas novas redes surgiram exclusivamente nas plantas HP. Entre os genes modulados positivamente estavam genes de síntese e de resposta ao etileno. O presente trabalho teve como objetivo elucidar a relação observada entre Tnt1 e o fitormônio etileno gerando um modelo de atuação. Os resultados obtidos permitiram demonstrar que plântulas e plantas HP adultas tem um aumento na síntese de etileno quando comparadas à selvagem. A predição do dobramento do RNA mensageiro de Tnt1 permitiu a identificação de sequências responsivas ao etileno localizadas em posição potencial para formar grampos. Desta forma, é possível que a expressão de Tnt1 leve à produção de pequenos RNAs que tem como alvo sequências responsivas a etileno presentes tanto no próprio elemento quanto em regiões promotoras de outros genes. A quantificação da expressão de Tnt1 versus genes relacionados ao etileno revelou um padrão em \"oposição de fase\" nas HPs, o que nos levou a hipotetizar que talvez ocorra uma relação antagonista entre a expressão de Tnt1 e a expressão de genes responsivos ao etileno envolvidos em respostas de defesa vegetais. Nossos resultados sugerem que Tnt1 pode gerar pequenos RNAs que exercem controle transcricional sobre Tnt1 e outros genes endógenos. Nosso modelo estabelece um novo papel biológico para um retrotransposon: Tnt1 agiria como um modulador da indução de genes mediada por etileno nas respostas de defesa de tabaco, trazendo o sistema de volta à condição homeostática e encerrando as respostas de defesa.