Cette étude visait à évaluer l'impact, durant les phases de croissance pré-infiltration et d'expression transitoire post-infiltration, de différents déficits de pression de vapeur d'eau (DPV) et de fréquences d'irrigation sur la croissance, le développement et la production de protéines recombinantes de plants de Nicotiana benthamiana (Nb) cultivés en NFT (technique sur film nutritif). Le premier volet consistait à étudier les adaptations anatomiques de Nb face à un DPV plus ou moins contraignant sous deux gestions d'irrigation et à relier ces adaptations aux rendements en antigène de l'hémagglutinine 1 du virus de l'Influenza (H1). Nous avons répertorié une plus faible densité des tissus foliaires, une diminution de la conductance stomatique et une croissance inférieure des plants sous irrigation réduite. Nous avons aussi observé de meilleurs rendements en protéines recombinantes chez les plants cultivés sous un DPV élevé et une irrigation réduite. En outre, une gestion d'irrigation abondante ainsi qu'un faible DPV ont provoqué d'intenses symptômes de nécroses foliaires au terme de la période d'incubation des plants. À la lumière des résultats obtenus dans le premier volet, nous avons étudié dans un second volet l'effet de la température et de l'humidité relative de l'air durant la phase post-infiltration sur la progression dans le temps de symptômes des nécroses foliaires sur des plants précédemment cultivés sous des traitements de DPV contrastants et une gestion d'irrigation réduite. Nos résultats ont montré que, bien que la synthèse des protéines recombinantes soit accélérée par une température plus élevée, l'augmentation de l'humidité relative n'a pas permis d'atténuer la progression des symptômes de nécroses foliaires. Cependant, un DPV élevé durant la croissance a permis de diminuer l'importance des symptômes de nécroses, agissant comme un facteur de protection. Ce projet a permis de mettre en lumière d'importants défis entourant les conditions de croissance et d'expression en vue d'une moléculture à grande échelle en gouttières NFT.

Les furocoumarines constituent l'une des classes de métabolites secondaires dérivant de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Elles ont été décrites comme étant des phytoaléxines mais sont également très largement utilisées par l'Homme pour leurs propriétés thérapeutiques. Un certain nombre d'études biochimiques ont été réalisées afin d'en comprendre la biosynthèse mais peu de choses sont connues concernant leur déterminisme moléculaire. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation fonctionnelle de gènes appartenant aux prényltransférases aromatiques potentiellement impliquées dans cette voie de biosynthèse. Les prényltransférases catalysent la première étape de la voie de biosynthèse des furocoumarines linéaires ou angulaires. Elles permettent l'addition d'un groupement dimethylally pyrophosphate (DMAPP) sur l'umbelliférone. En utilisant SfN8DT-1, une prényltransférase aromatique récemment caractérisée, comme sonde, nous avons identifié 7 gènes candidats chez deux familles de plantes (Rutaceae et Apiaceae). Dans la mesure où il a été décrit que ces enzymes étaient des protéines membranaires, nous avons adapté un système d'expression hétérologue basé sur l'utilisation de N. benthamiana. Ce système a été validé par l'expression de deux protéines membranaires : un cytochrome P450 CYP98A22 et une prényltransférase déjà caractérisée SfN8DT-1. Nous avons ensuite utilisé ce système d'expression pour réaliser l'étude des 7 gènes nouvellement isolés. Ces travaux nous ont permis de caractériser la première umbelliferone prenyltransferase de Petroselinum crispum capable de catalyser in vitro et in vivo la prénylation du carbone 6 ou 8 de l'umbelliférone en présence de DMAPP permettant ainsi la synthèse respectivement de demethylsuberosin et d'osthenol. Par ailleurs, une étude réalisée in planta chez le persil a permis de mettre en évidence une relation positive entre le niveau d'expression du gène et la teneur en umbelliférone prénylée. L'étude de la surexpression du gène chez Ruta graveolens a permis de mettre en évidence un lien entre l'expression du gène et la disparition de l'umbelliférone. Enfin nous avons identifié la même activité pour une prényltransférase de Pastinaca sativa, ce qui nous amène à émettre l'hypothèse que l'étape de prénylation n'est pas une étape limitante dans la biosynthèse des furocoumarines angulaires, étant donné que le persil ne produit que des furocoumarines linéaires, tandis que le panais produit des furocoumarines linéaires et angulaires. L'utilisation de ces mêmes systèmes d'expression hétérologue de N. benthamiana et R. graveolens nous a également permis d'identifier une seconde prényltransférase aromatique capable de catalyser l'addition de géranylpyrophosphate (GPP) sur l'umbelliférone et sur l'esculétine / Furanocoumarins constitute one of the classes of secondary metabolites deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These molecules are described as phytoalexins in plants but are also used by humans for their pharmaceutical properties. A large number of biochemical studies were carried out to understand their biosynthetic pathway but little information was available concerning the genes involved in the pathway. In this study, we focused on the characterization of genes encoding for aromatic prenyltransferases which were described to be involved in this pathway. Prenlyltransferases catalyze the entry step to the linear or angular furanocoumarin pathway. Hence they catalyze the addition of a dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) prenyl moiety to umbelliferone. Using a recently characterized aromatic prenyltransferase (SfN8DT-1) as a probe, we isolated 7 different candidate genes from two plant families (Rutaceae and Apiaceae). As these enzymes were described as membrane bound proteins, we adapted a heterologous expression system made up of Nicotiana benthamian aand we validated its efficiency by using two membrane-associated enzymes: a cytochrome P450 (CYP98A22) and the already described prenyltransferase SfN8DT-1. Subsequently, this system was used to perform the functional characterization of the 7 newly identified proteins. This way we succeeded to characterize the first umbelliferone prenyltransferase of Petroselinum crispum that was able to catalyze both the 6-C and 8-C prenylation of umbelliferone with DMAPP producing demethylsuberosin and osthenol respectively. We made evidence that these reactions occurred both in vitro and in vivo. In addition, in planta studies performed in P.crispum showed a positive relationship between the gene expression level and the content of prenylated umbelliferone. The overexpression of this gene was investigated in Ruta graveolens and we could provide evidences of a link between the enzymatic activity and the disappearance of umbelliferone. We also reported a similar activity for a prenyltransferase isolated from Pastinaca sativa, which makes us assume that the prenylation step is not a rate limiting step in the biosynthetic pathway of angular furanocoumarins since parsley is producing only linear furanocoumarins whereas parsnip is producing both linear and angular furanocoumarins. In addition, using the same N. benthamiana and R. graveolens heterologous expression systems, we identified a second aromatic prenyltransferase able to catalyze the addition of geranyl pyrophosphate (GPP) both to umbelliferone and esculetin

Os solos ácidos recobrem, cerca de 40% da área terrestre, constituindo-se em um dos principais fatores limitantes à população à produção vegetal do planeta. No Brasil, os solos ácidos abrangem cerca de dois terços do território nacional. De um modo geral, a acidez do subsolo reduz a profundidade do sistema radicular, aumentando a susceptibilidade à seca e diminuindo o uso de nutrientes pelas plantas. Além da alta atividade de íon hidrogênio (H+), os solos ácidos geralmente apresentam níveis tóxicos de alumínio, sendo que a toxicidade por AI tem sido intensivamente investigada nos últimos anos. No entanto, a toxicidade por AI ocorre apenas a pH baixo e em condições onde a toxicidade por prótons geralmente também se manifesta. Apesar disto, trabalhos envolvendo a toxicidade por prótons são escassos. A sensibilidade de células a pH baixo depende da fase de crescimento e desenvolvimento em que estas se encontram. Em raízes, as células mais sensíveis são as da região de alongamento e em suspensões celulares as células na fase log de crescimento são mais sensíveis do que as células na fase estacionária. Este trabalho faz parte de uma linha de pesquisa que procura explorar as diferenças que existem entre células quanto à sensibilidade a pH baixo para melhor entender a toxicidade e tolerância a prótons. Foram utilizadas células da cultura de tabaco cv. BY-2, um sistema modelo que apresenta diversas vantagens sobre o uso de raízes para a realização deste trabalho. Os objetivos deste estudo foram de a) determinar condições apropriadas para a exposição destas células a acidez; b) caracterizar a resposta destas células a pH baixo, sob influência de diferentes fatores ambientais, quando se encontram em estados distintos de sensibilidade ao pH baixo; e c) verificar se mudanças na sensibilidade das células a pH baixo podem ser decorrentes de alterações na composição da membrana plasmática ou na atividade das ATPases. Vários testes iniciais foram realizados com o intuito de se definir algumas condições experimentais - o tempo de exposição, a composição do meio e o tampão a ser empregado. Optou-se por lavar as células e depois incubá-las por 1h em meio simples com pH desejado e contendo apenas Ca \'Cl IND. 2\' 2mM, KCl 10mM. E o tampão MES ou biftalato (10 mM). O biftalato foi testado porque o tampão MES, usado normalmente no meio de cultura completo, não é eficiente na faixa de pH abaixo de 5,0. O biftalato (pKa = 4,1) praticamente não afetou a viabilidade celular avaliada pela permeabilidade a trypan blue, mas inibiu o crescimento celular no meio de cultura completo. Mesmo assim, os dois tampões foram utilizados em paralelo em diversos experimentos e verificou-se que os resultados foram semelhantes. A viabilidade das células na fase log (2 dias) foi reduzida quando se abaixou o pH de 5,6 a 3,8, sendo que caiu mais acentuadamente até o pH de 4,8. As células da fase estacionaria (7d) foram insensíveis ao baixo pH. A um pH fixo de 4,2 aumentando-se a concentração de Ca \'Cl IND. 2\' para cerca de 8 a 16 mM praticamente aboliu o efeito deletério do pH baixo. Para se ter o mesmo efeito com a adição de KCl, foi necessário adicionar entre 80 e 160 mM. A adição de sacarose também amenizou os efeitos do pH\'sendo praticamente revertido a uma concentração de 100 Mm. Os resultados indicam a importância da força iônica e da osmolaridade da solução, mas o efeito de Ca não parece depender apenas destas duas propriedades. A inibição de ATPases, pelo uso de DCCD, não pareceu ter qualquer relação com a sensibilidade a pH baixo. Tanto células de tabaco na fase log quanto estacionárias foram sensíveis à aplicação de ortovanadato de sódio. Em células da fase estacionária, este efeito mais acentuado a pH 4,2, sugerindo que nestas células, as H+ ATPases do tipo P da membrana plasmática podem ter algum papel na tolerância destas células ao baixo pH. Encontrou-se diferenças no perfil protéico de frações enriquecidas em membrana plasmática entre células da fase log e estacionárias e entre células tratadas ou não a pH baixo. Estas diferenças precisam ser melhor estudadas. / Acid soils account for about 40 % of the surface area of the world and are one of the major factors limiting plant productivity. In Brazil, these soils comprise roughly two-thirds of its total territory. In general, soil acidity is detrimental because it limits the depth of the root system, increasing susceptibility to drought and decreasing the use of nutrients. In addition to the high levels of hydrogen ion activity, acid soils usually have Al toxicity hazards, a topic which has been intensely studied in the past years. However, Al toxicity only occurs at low pH, under conditions in which proton toxicity is also a problem. Despite this, studies of proton toxicity are lacking. The sensitivity of cells to low pH depends on their growth and developmental status. In roots, the most sensitive cells are those of the elongation zone and in cell cultures, cells in the log phase are more sensitive than those of the stationary phase. This study is part of a larger attempt to explore the differences that exist between cells with respect to their sensitivity to low pH to further understand toxicity and tolerance to protons. Cells of tobacco BY-2, a plant cell model system which has several advantages over the use of roots, was used in this study. The objectives were a) to determine the appropriate conditions to expose these cells to low pH; b) characterize the response of these cells to low pH, when different environmental factors are varied and at different stages of cellular sensitivity to acidity; and c) examine if changes in the sensitivity of cells to low pH are due to changes in the composition of plasma membranes or in the activity of ATPases. Several preliminary tests were performed to define the experimental conditions to be used ? the duration of exposure to low pH, the composition of the medium and the buffer to be used. A simple solution containing only CaCl2 2mM, KCl 10 mM and MES or phthalate buffer (10 mM) was chosen to wash and incubate the cells at the pH of interest. Phthalate was tested because MES, the buffer normally used in the culture medium, is not effective at pH values below 5.0. Phthalate (pKa = 4,1) had very little effects on cell viability as evaluated by membrane permeability to trypan blue, but it severely inhibited the growth of the cell culture in complete medium. Nevertheless, both buffers were used in several subsequent experiments, the results of which were found to be similar between both buffers. The viability of log-phase cells (2 day-old) was reduced when the pH was lowered from pH 5,6 to 3.8, but this was sharper down to pH 4,8. Cells in stationary phase (7 day-old) were insensitive to low pH. At a fixed pH of 4,2, increases in the concentration of CaCl2 up to 8 or 16 mM abolished most of the deleterious effects of low pH. To generate the same effect, KCl had to be added at concentrations between 80 and 160 mM. The addition of sucrose also alleviated the effects of low pH. The results suggest the importance of solution ionic strength and osmolarity on sensitivity to low pH, but the effects of Ca do not appear to depend only on these two properties. The inhibition of ATPases, by DCCD, did not appear to bear any relation to cellular sensitivity to low pH. Both log-phase and stationary-phase cells were affected by the addition of sodium orthophosphate. In stationary-phase cells, this effect was more pronounced at pH 4,2, suggesting that in these cells, P-type H+-ATPases of the plasma membrane may play a role in the tolerance of these cells to lo pH. Differences were found in the protein profile of enriched plasma membrane fractions both between log-phase and stationary-phase cells and between cells treated or not with low pH. These differences, however, need to be better examined.

O desenvolvimento dos órgãos vegetativos e florais das angiospermas depende da ação combinada e finamente regulada de eventos de proliferação e expansão celular. Estudar os genes envolvidos com a regulação destes processos permite ampliar nossa compreensão sobre o desenvolvimento da flor, de seus diferentes órgãos, do processo reprodutivo como um todo, além de permitir produzir modificações de interesse econômico. Um gene codificando uma proteína da família F-box foi identificado na biblioteca TOBEST de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). A maioria das proteínas F-box pertence ao complexo SCF (formado principalmente pelas proteínas SKP1, CUL1 e F-box), participando da marcação de proteínas alvo para a degradação pela via ubiquitina-proteassomo. O gene identificado no TOBEST demonstrou expressão preferencial nos órgãos florais e foi denominado FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Plantas de silenciamento e superexpressão deste gene indicaram alterações no tamanho dos órgãos florais, incluindo o pistilo, foco principal de estudo em nosso laboratório (Abbad, 2012). O screening de duplo-híbrido de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum identificou a interação com uma SKP1, indicando que a FEF1 poderia atuar junto ao complexo SCF (Abbad, 2012). No presente trabalho foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas em pistilos de plantas transgênicas da geração T1, que permitiram: 1) verificar a estabilidade dos transgenes e das alterações fenotípicas na descendência; 2) quantificar e analisar estatisticamente as alterações de tamanho do pistilo; e 3) verificar as alterações em nível celular, que resultaram nas alterações do tamanho do pistilo, ocorridas nas plantas transgênicas. As plantas de silenciamento apresentaram redução estatisticamente significativa do comprimento de pistilos e da largura dos ovários. As análises histológicas permitiram verificar que ocorreu a redução da proliferação celular na zona secretória do estigma e no parênquima do ovário destas plantas. Por outro lado, as plantas de superexpressão demonstraram aumento estatisticamente significativo do comprimento dos pistilos e da largura de estigmas e ovários. Nestas plantas, foi verificado o aumento do número de células na zona secretória do estigma e parênquima do ovário. A interação entre FEF1 e a SKP1 foi confirmada em experimento de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), corroborando a participação dessa F-box no complexo SCF. A interação entre estas proteínas ocorre no citoplasma das células vegetais, indicando que este é o local de atuação de FEF1. A participação no complexo SCF confere a essa F-box o papel de seleção dos alvos a serem poliubiquitinados pelo complexo. A análise de candidatos do screening revelou três novos parceiros de interação de FEF1, todos fatores de transcrição da classe I da família TCP, relacionados com a regulação da proliferação celular. Estas proteínas são candidatas à degradação no proteassomo, sinalizada pela marcação promovida pelo complexo SCFFEF1. Deste modo, propomos que a FEF1 desempenhe uma função na regulação do desenvolvimento e do tamanho final dos órgãos florais, mais especificamente do pistilo, através da regulação dos níveis de fatores de transcrição, como as TCPs aqui encontradas, envolvidas com o controle da proliferação celular. / Angiosperms vegetative and flowering organs development depends on a combined influence of finely regulated events of cell proliferation and expansion. The study of genes involved with the regulation of this processes allows the expansion of our knowledge about the flower and its organs development, of the reproductive process and allows the production of modifications of economic interest. One gene coding for an F-box family protein was identified in the TOBEST stigma/style cDNA library of N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). The majority of F-box proteins belong to the SCF (mainly composed of the SKP1, CUL1 and F-box proteins) complex, participating in the signalization of target proteins for degradation through the ubiquitin-proteasome pathway. The gene identified on TOBEST presented preferential expression on the floral organs and was named FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Transgenic plants silencing and overexpressing this gene indicated alteration of the floral organs, including the pistil, the main focus of study in our laboratory (Abbad, 2012). A yeast two-hybrid screening of a N. tabacum stigma/style cDNA library revealed the interaction with a SKP1 protein, indicating that FEF1 possibly functions with the SCF complex (Abbad, 2012). In the present work macroscopic and microscopic analysis of the pistils of T1 generation of transgenic plants were performed, which allowed us to: 1) Confirm the transgene and phenotypic stability through generations; 2) Quantify and statistically analyze the size alterations on the pistils; 3) Analyze the cellular modifications that produced the pistils size alterations observed in the transgenic plants. The plants silencing FEF1 presented a statistically significant reduction of the pistil length and ovary width. Histological analysis allowed the observation that a reduction in cell proliferation occurred in the secretory zone of the stigma and in the ovary parenchyma. On the other hand, overexpression plants presented statistically significant enlargement of pistil length and of stigma and ovary width. In these plants it was observed an increase in cell number in the stigma secretory zone and ovary parenchyma. The interaction between FEF1 and SKP1 was confirmed on a BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), reinforcing the participation of this F-box protein in the SCF complex. The interaction between these proteins was observed to occur in the cytoplasm of plant cells, indicating that this is the cellular compartment of FEF1 action. The participation in the SCF complex confers this F-box the role of selecting targets for polyubiquitination by the complex. The analysis of candidates of the screening revealed three new interaction partners of FEF1, all of them transcription factors of the class I TCP family, related to the regulation of cell proliferation. These proteins are candidates for degradation by the proteasome, signalized by the polyubiquitination promoted by the SCFFEF1 complex. We propose that FEF1 has a role in the regulation of the development and final size of the floral organs, particularly the pistil, by regulation the levels of transcription factors like the TCPs here revealed, involved with the control of cell proliferation.

O consumo de tabaco é uma das principais causas de doenças e morte prematuras no mundo; é a segunda droga mais consumida entre os adolescentes brasileiros, sendo considerado uma importante porta de entrada para o uso de drogas ilícitas. O Brasil é o segundo produtor mundial de tabaco e desde de 1993 destaca-se como o maior exportador. Os radionuclídeos naturais das séries do 232Th e 238U são encontrados no tabaco em baixas concentrações absorvidos diretamente do solo ou por deposição foliar. No ato de fumar ocorre a transferência desses radionuclídeos através da queima do tabaco para os tecidos e órgãos humanos podendo gerar lesões cancerígenas, sendo o mais relevante o câncer de pulmão. Existem poucos dados sobre a caracterização radiológica e elementar dos derivados do tabaco brasileiros, o que torna relevante o presente estudo que teve como objetivos a determinação da radioatividade natural e da concentração de elementos maiores e traços em derivados de tabaco produzidos e comercializados no Brasil. As técnicas analíticas empregadas foram alfa e beta total após separação radioquímica para os radionuclídeos 226Ra, 228Ra e 210Pb com determinação em detector proporcional de fluxo gasoso e baixa radiação de fundo, espectrometria alfa após separação radioquímica para o radionuclídeo 210Po, análise por ativação com nêutrons instrumental (INAA) e fluorescência por dispersão de raios X (EDXRF) para determinação de 238U, 232Th, elementos maiores e traços. Foram analisados produtos derivados da Nicotina tabacum L. de diferentes marcas adquiridas em tabacarias: cigarro não aromatizados, cigarro aromatizado, charuto, rapé, cigarro de palha e fumo de corda. Pela técnica de INAA foi possível determinar a concentração de 19 elementos e pela técnica de EDXRF de 31 elementos o que possibilitou uma ampla caracterização multielementar e as técnicas analíticas empregadas se mostraram complementares. Os elementos que apresentaram maiores valores de concentração foram o Ca e o K entre todas as amostras amostragem e entre todos os radionuclídeos naturais determinados o 228Ra apresentou maiores valores de concentração de atividade. A partir da concentração de atividade determinada foram calculadas a dose anual estimada e a dose anual efetiva para os radionuclídeos 210Pb e 210Po, levando-se em consideração um consumo anual de 3,65 kg de tabaco por ano. A dose anual efetiva variou de 69,5 μSv ano-1 à 121 μSv ano-1. Os produtos que apresentaram maiores valores de concentração e consequentemente maiores valores de dose anual efetiva, para a maioria dos radionuclídeos analisados, foram os cigarros de palha e fumos de corda. / Tobacco use is one of the leading causes of premature illness and death in the world; is the second most consumed drug among Brazilian adolescents, being considered an important gateway to the use of illicit drugs. Brazil is the second largest tobacco producer in the world and since 1993 it has been the largest exporter. The natural radionuclides from the 232Th and 238U series are found in tobacco at low concentrations absorbed directly from the soil or by foliar deposition. In the act of smoking occurs the transference of these radionuclides through the burning of the tobacco to the human tissues and organs and they can generate carcinogenic lesions, being the lung cancer the most relevant. There are few data on the elemental and radiological characterization of Brazilian tobacco products, which makes relevant the present study that had as objectives the determination of the natural radioactivity and the concentration of major and trace elements in tobacco products produced and marketed in Brazil. The analytical techniques employed were gross alpha and beta, after radiochemical separation for the radionuclides 226Ra, 228Ra and 210Pb with determination in a gaseous flow proportional detector of low background radiation, alpha spectrometry after radiochemical separation for the radionuclide 210Po, instrumental neutron activation analysis (INAA) and X-ray scattering fluorescence (EDXRF) for determination of 238U, 232Th, major and trace elements. Nicotine tabacum L. products from different brands acquired in cigar stores were analyzed: non-flavored cigarettes, flavored cigarettes, cigar, snuff, straw cigarettes and rope smoke. Using the INAA technique, it was possible to determine the concentration of 19 elements and with the EDXRF technique 31 elements, which enabled a wide multielementar characterization; the analytical techniques employed were complementary. The elements that presented the highest concentration values were Ca and K among all the samples and among all the natural radionuclides determined the 228Ra presented higher values of activity concentration. The estimated annual dose and annual effective dose for the 210Pb and 210Po radionuclides were calculated from the determined activity concentration, taking into account an annual consumption of 3.65 kg of tobacco per year. The effective annual dose ranged from 69.5 μSv y-1 to 121 μSv y-1. The products with the highest concentration values and hence the highest annual effective dose for the majority of the radionuclides analyzed were straw cigarettes and rope smoke.

Die Verfügbarkeit des Makroelementes Phosphor ist für Lebewesen eingeschränkt. Besonders bei der Pflanzenproduktion und der Tierernährung spielt die Phosphorverfügbarkeit eine wichtige Rolle bei der ökonomischen Nutzung der Ressourcen. In den Fokus der Wissenschaft zur Lösung des Phosphorproblems gerieten die Phytasen, da monogastrische Tiere nicht in der Lage sind das in den Pflanzensamen gespeicherte Phytat zu nutzen. Die gentechnische Veränderung von Pflanzen stellt eine effiziente Möglichkeit zur Produktion von phosphatfreisetzenden Enzymen, zur Erhöhung der Biomasseproduktion und zur Veränderung der Inhaltstoffe dar. In dieser Arbeit wurden erfolgreich transgene Pflanzen der Arten Nicotiana tabacum L. cv. Samsun und Hordeum vulgare L. cv. Golden Promise erzeugt, die in der Lage waren die Phytase aus Klebsiella sp. ASR1 bzw. aus Bacillus amyloliquefaciens FZB45 zu produzieren. Es wurde für jedes Protein eine Strategie zur Reinigung des aktiven Enzyms aus den verschiedenen Wirtsorganismen entwickelt und seine biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die β-Propeller-Phytase aus Bacillus im Gegensatz zur sauren Phytase aus Klebsiella durch die posttranslationale Modifikation teilweise ihre Eigenschaften ändert. Die Auswirkungen der heterologen Expression der Phytasen auf die Veränderung der Anteile von Phytinsäure und anorganischem Phosphor, in Relation zum gesamten Phosphor, in den Gerstensamen wurden untersucht. Es wurde eine Reduktion des Phytinsäuregehaltes um 19 % und eine Erhöhung des Gehalts anorganischem Phosphor zwischen 27 % und 78 nachgewiesen. Mit Hilfe von spezifischen Signalsequenzen gelang es die Phytaseproteine aus der Wurzel in das umgebende Medium zu sekretieren. Die Sekretion der Bacillus Phytase führte zu einer Steigerung der Biomasseproduktion von Nicotiana tabacum L. unter unsterilen Wachstumsbedingungen mit Phytat als einziger P-Quelle um 34 %. / Due to the bad availability of phosphorus in natural habitats the improvement of phosphorus accessibility to organisms became an important topic of research, particularly for agriculture and animal nutrition. In plant seeds phosphorus is bound to D-myo-inositol to form phytic acid that is indigestible for mono gastric animals. Therefore the use of phytases to hydrolyze the phytic acid and to mobilize the anorganic phosphorus came in focus to science. Genetic engineering gave the opportunity to improve the phosphorus availability. Genetic manipulation of plants is a suitable tool to produce phosphorus releasing enzymes, thereby increasing the biomass and decreasing the content of phytic acid in plants. In this work I generated transgenic plants of Nicotiana tabacum and Hordeum vulgare vulgare which successfully express the phytase gene phyK from Klebsiella pneumonia ASR1 and phyC from Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Chromatographically purification strategies were developed and biochemical properties were characterized for all phytase proteins. All enzymes were active and PhyC was posttranslational modified. The effect of the recombinant phytase activity to total phosphorus, phytic acid and anorganic phosphorus content of barley seeds were elucidated. The phyK-expression in barley seeds yield a reduction of phytic acid content of about 19 % and an increase of anorganic phosphorus of about 78 %. Transgenic barley seeds with phyC gene expression show an increase of anorganic phosphorus content from 27 % to 48 % but no decrease in phytic acid content. In growth experiments no special phenotypes of plant containing the recombinant protein were visible. The insertion of apoplastic signal sequences in front of the phytase genes resulted in secretion of the proteins into the rhizosphere. The secretion of PhyC led to an improved growth of Nicotiana tabacum under unsterile conditions with sodium phytate as single phosphorus source increasing the biomass up to 34 %.

Pour étudier le rôle de la mitochondrie dans la tolérance à la sécheresse, la réponse à la contrainte hydrique a été comparée entre une lignée sauvage (WT) et un mutant CMSII (Cytoplasmic Male Sterile) de Nicotiana sylvestris. Chez le mutant CMSII, le complexe I mitochondrial est absent et la respiration est assurée par les NAD(P)H déshydrogénases alternes et elle est maintenue à un niveau supérieur de l’ordre de 20 à 30% à celui du WT. La différence observée entre les plantes WT et CMSII met en jeu non seulement le fonctionnement mitochondrial, mais également le fonctionnement des chloroplastes. En effet, l’activité photosynthétique du mutant est plus faible que celui du WT et elle est corrélée avec une plus faible conductance stomatique (gs) et mésophyllienne (gm).Après l’arrêt de l’arrosage, on observe que le contenu relatif en eau (RWC) diminue plus lentement chez les feuilles du CMSII. Ceci n’était pas le résultat d’une plus petite surface de transpiration ou d’une masse racinaire d’absorption plus élevé puisque le rapport partie aérienne/racine et la surface foliaire totale ont été similaires au début de l’expérience chez les deux génotypes. De plus la mutation n’a pas induit des changements au niveau des paramètres hydriques (P0, PTLP, RWCTLP) ni au niveau de la densité stomatique. La tolérance des plantes CMSII a été le plus probablement la conséquence de sa plus faible transpiration en conditions bien hydratées et aux premiers jours de déshydratation et non pas d’une meilleure efficacité d’absorption de l’eau puisque le contenu en eau du sol reste plus élevé chez CMSII après l’arrêt de l’arrosage. La plus faible conductance stomatique chez le CMSII bien hydraté a été expliquée par sa plus faible conductance hydraulique. De plus, contrairement au WT, le niveau des acides aminés totaux diminue au cours de la déshydratation lorsque le contenu en protéines solubles augmente chez les feuilles du CMSII, suggérant une accélération de la remobilisation des acides aminés. D’autre part, il a été aussi montré que le mutant CMSII est capable de s’acclimater mieux à la sécheresse que le WT lorsqu’ils ont été maintenus à un RWC de 80 % sur plusieurs jours. Sous ces conditions, la photosynthèse reste plus élevée chez le mutant que chez le WT. Cette meilleure acclimatation corrèle avec une plus forte photorespiration du CMSII sous conditions bien hydratées et sous conditions d’acclimatation. La photorespiration chez CMSII et le WT a été estimée par le transport électronique dévolu à l’oxygénation de RuBP et en plus par l’accumulation des métabolites impliqués dans la photorespiration. D’une part, l’acclimatation à la sécheresse diminue gm plus fortement chez le WT que chez le CMSII. D’autre part, le WT accumule la glycine ce qui laisse supposer que le glycine décarboxylase mitochondrial est plus affectée chez le WT que chez le CMS et inhibe ainsi la photorespiration. En effet, cette plus faible photorespiration chez le WT affecte les réactions primaires de la photosynthèse par une accumulation d’un gradient de protons estimé par le quenching non-photochimique (NPQ) de la fluorescence chlorophyllienne ce qui induit une diminution du transport électronique des réactions primaires de la photosynthèse. / To investigate the role of mitochondria in drought stress, the response to water deprivation was compared between Nicotiana sylvestris wild type (WT) plants and the CMSII respiratory complex I mutant. In CMSII, alternative NAD(P)H-dehydrogenases bypassing complex 1 allow respiration.. The difference of mitochondrial function between WT and CMSII plants affect also photosynthesis. The CMSII has lower photosynthetic actitvity than the WT and lower stomatal (gs) and internal (gm) conductances to CO2. When watering of plants with similar leaf surface and similar shoot/root ratio was stopped the relative water content (RWC) declined faster in WT as compared to CMSII leaves. Furthermore, CMSII and WT leaves had the same osmotic potential at leaf saturation (P0) and at leaf turgor lost pressure (PTLP) and the same stomatal density. The slower decline of RWC in CMSII, compared to WT leaves, was most likely the consequence of the lower stomatal conductance (gs) under well-watered conditions and during the first days after withholding watering, The lower stomatal conductance of well-watered CMSII leaves correlated with a lower hydraulic conductance of leaves. Remarkably, total free amino acid levels declined and total soluble protein content increased in CMSII leaves, while the opposite was observed in WT leaves. This suggests protein synthesis in CMSII but protein degradation in WT leaves during drought stress. We also show that CMSII leaves better acclimate to drought stress than the WT leaves. After several days at 80 % RWC , photosynthesis is higher in the mutant than in WT. As compared to the WT, the mutant shows higher rates of photorespiration before and after acclimation to drought.The strong accumulation of glycine in the WT suggests that photorespiration may be limited at the level of glycine decarboxylase. In addition, after acclimation to drought gm declined markedly in WT but not in CMSII leaves, thus further limiting CO2 supply for photosynthesis in the WT. The resulting lower photosynthesis and photorespiration in WT leaves affect also the primary reaction of photosynthesis by increasing the non-photochemical fluorescence quenching (NPQ) and decreasing linear electron transport.

O consumo de tabaco é uma das principais causas de doenças e morte prematuras no mundo; é a segunda droga mais consumida entre os adolescentes brasileiros, sendo considerado uma importante porta de entrada para o uso de drogas ilícitas. O Brasil é o segundo produtor mundial de tabaco e desde de 1993 destaca-se como o maior exportador. Os radionuclídeos naturais das séries do 232Th e 238U são encontrados no tabaco em baixas concentrações absorvidos diretamente do solo ou por deposição foliar. No ato de fumar ocorre a transferência desses radionuclídeos através da queima do tabaco para os tecidos e órgãos humanos podendo gerar lesões cancerígenas, sendo o mais relevante o câncer de pulmão. Existem poucos dados sobre a caracterização radiológica e elementar dos derivados do tabaco brasileiros, o que torna relevante o presente estudo que teve como objetivos a determinação da radioatividade natural e da concentração de elementos maiores e traços em derivados de tabaco produzidos e comercializados no Brasil. As técnicas analíticas empregadas foram alfa e beta total após separação radioquímica para os radionuclídeos 226Ra, 228Ra e 210Pb com determinação em detector proporcional de fluxo gasoso e baixa radiação de fundo, espectrometria alfa após separação radioquímica para o radionuclídeo 210Po, análise por ativação com nêutrons instrumental (INAA) e fluorescência por dispersão de raios X (EDXRF) para determinação de 238U, 232Th, elementos maiores e traços. Foram analisados produtos derivados da Nicotina tabacum L. de diferentes marcas adquiridas em tabacarias: cigarro não aromatizados, cigarro aromatizado, charuto, rapé, cigarro de palha e fumo de corda. Pela técnica de INAA foi possível determinar a concentração de 19 elementos e pela técnica de EDXRF de 31 elementos o que possibilitou uma ampla caracterização multielementar e as técnicas analíticas empregadas se mostraram complementares. Os elementos que apresentaram maiores valores de concentração foram o Ca e o K entre todas as amostras amostragem e entre todos os radionuclídeos naturais determinados o 228Ra apresentou maiores valores de concentração de atividade. A partir da concentração de atividade determinada foram calculadas a dose anual estimada e a dose anual efetiva para os radionuclídeos 210Pb e 210Po, levando-se em consideração um consumo anual de 3,65 kg de tabaco por ano. A dose anual efetiva variou de 69,5 μSv ano-1 à 121 μSv ano-1. Os produtos que apresentaram maiores valores de concentração e consequentemente maiores valores de dose anual efetiva, para a maioria dos radionuclídeos analisados, foram os cigarros de palha e fumos de corda. / Tobacco use is one of the leading causes of premature illness and death in the world; is the second most consumed drug among Brazilian adolescents, being considered an important gateway to the use of illicit drugs. Brazil is the second largest tobacco producer in the world and since 1993 it has been the largest exporter. The natural radionuclides from the 232Th and 238U series are found in tobacco at low concentrations absorbed directly from the soil or by foliar deposition. In the act of smoking occurs the transference of these radionuclides through the burning of the tobacco to the human tissues and organs and they can generate carcinogenic lesions, being the lung cancer the most relevant. There are few data on the elemental and radiological characterization of Brazilian tobacco products, which makes relevant the present study that had as objectives the determination of the natural radioactivity and the concentration of major and trace elements in tobacco products produced and marketed in Brazil. The analytical techniques employed were gross alpha and beta, after radiochemical separation for the radionuclides 226Ra, 228Ra and 210Pb with determination in a gaseous flow proportional detector of low background radiation, alpha spectrometry after radiochemical separation for the radionuclide 210Po, instrumental neutron activation analysis (INAA) and X-ray scattering fluorescence (EDXRF) for determination of 238U, 232Th, major and trace elements. Nicotine tabacum L. products from different brands acquired in cigar stores were analyzed: non-flavored cigarettes, flavored cigarettes, cigar, snuff, straw cigarettes and rope smoke. Using the INAA technique, it was possible to determine the concentration of 19 elements and with the EDXRF technique 31 elements, which enabled a wide multielementar characterization; the analytical techniques employed were complementary. The elements that presented the highest concentration values were Ca and K among all the samples and among all the natural radionuclides determined the 228Ra presented higher values of activity concentration. The estimated annual dose and annual effective dose for the 210Pb and 210Po radionuclides were calculated from the determined activity concentration, taking into account an annual consumption of 3.65 kg of tobacco per year. The effective annual dose ranged from 69.5 μSv y-1 to 121 μSv y-1. The products with the highest concentration values and hence the highest annual effective dose for the majority of the radionuclides analyzed were straw cigarettes and rope smoke.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Chinese cabbage is a vegetable largely cultivated by organic farmers in the region of Santa Maria, RS. However, due to severe damage caused by the chrysomelid Microtheca ochroloma Stal, many of them are abandoning the crop. The use of botanical pesticides is an alternative for the control of these insect pests. Therefore, this study aimed to evaluate the action of commercial products and aqueous extracts of insecticide plants on the different stages of development, food consumption and biological aspects of M. ochroloma. In experiments conducted in laboratory, at a temperature of 25 ± 2ºC, relative humidity of 60 ± 10% and 14 hours of photophase, the effects of aqueous extracts of 10% w/v of Nicotiana tabacum L. (in the form of tobacco-powder), of leaves of Melia azedarach L., Eucalyptus citriodora Hook, Cedrella fissilis L., Trichilia claussenii C. DC., Blepharocalyx salicifolius (Kunth) O. Berg, Eugenia uniflora L., Cinnamomum camphora (L.) J. Presl, Syzygium cuminii L., Cymbopogon nardus (L.) Rendle, of leaves and twings of Ateleia glazioveana Baill, Senecio brasiliensis Less and Ruta graveolens L., of seeds of Azadirachta indica A. Juss, and the commercial products Organic Neem ®, 1 and 5% v / v, and Neem Azal T / S ®, 0.5 and 1% v / v, both elaborated from A. indica (neem) were assessed. The action of the treatments was tested on eggs up to 24 hours old; under direct contact and ingestion of three-day-old larvae, in which were assessed the viability of larvae and pupae, the larval period and the defective adults; and in adults with unknown age also under the action of contact and ingestion. In addition, leaf discs of Chinese cabbage were treated with different treatments and with distilled water (control) and offered to larvae and adults in free-choice and no-choice tests. The commercial products Neem Azal T / S and Organic Neem and the extracts of M. azedarach, of tobacco powder, of S. brasiliensis and of B. salicifolius, by causing mortality at different stages of development of M. ocrholoma and decrease in the consumption of treated leaves, and also the extract of E. uniflora due to its action in the biology of these insects, should be evaluated in field conditions as potential alternatives to be used for the control of M. ochroloma. / A couve-chinesa é uma hortaliça bastante cultivada por produtores orgânicos da região de Santa Maria, RS. Porém, devido a danos intensos causados pelo crisomelídeo Microtheca ochroloma Stal, muitos estão abandonando a cultura. A utilização de inseticidas botânicos é uma alternativa para o controle desses insetos-praga. O presente trabalho teve, portanto, o objetivo de avaliar a ação de produtos comerciais e de extratos aquosos à base de plantas inseticidas sobre as fases de desenvolvimento, o consumo alimentar e aspectos da biologia de M. ochroloma. Em experimentos realizados em laboratório, à temperatura de 25 ± 2ºC, umidade relativa de 60 ± 10% e fotofase de 14 horas, foram avaliados os efeitos dos extratos aquosos, a 10% p/v, de Nicotiana tabacum L. (sob a forma de pó-de-fumo), de folhas de Melia azedarach L., Eucalyptus citriodora Hook, Cedrella fissilis L., Trichilia claussenii C. DC., Blepharocalyx salicifolius (Kunth) O. Berg, Eugenia uniflora L., Cinnamomum camphora (L.) J.Presl, Syzygium cuminii L. Cymbopogon nardus (L.) Rendle, de folhas e de ramos de Ateleia glazioveana Baill, Senecio brasiliensis Less e Ruta graveolens L., de semente de Azadirachta indica A. Juss, além dos produtos comerciais Organic Neem®, a 1 e 5% v/v, e NeemAzal T/S®, a 0,5 e 1% v/v, ambos à base A. indica (nim). Foi testada a ação dos tratamentos sobre ovos; sob ação de contato e de ingestão em larvas com idade de três dias, nas quais foram avaliados a viabilidade larval e pupal, a duração da fase larval e os adultos defeituosos; e, também sob ação de contato e de ingestão, em adultos com idade desconhecida. Ainda, discos de folhas de couve-chinesa foram tratados com os diferentes tratamentos e com água destilada (testemunha) e oferecidos para larvas e adultos em testes com e sem chance de escolha. Os produtos comerciais NeemAzal T/S e Organic Neem e os extratos de M. azedarach, de pó-de-fumo, de S. brasiliensis e de B. salicifolius, por causarem mortalidade a diferentes fases de desenvolvimento de M. ochroloma e diminuição do consumo de folhas tratadas, e, ainda, o extrato de E. uniflora, pela ação na biologia desses insetos, devem ser avaliados, em condições de campo, como sendo alternativas potenciais a serem utilizadas visando o controle de M. ochroloma.

Os solos ácidos recobrem, cerca de 40% da área terrestre, constituindo-se em um dos principais fatores limitantes à população à produção vegetal do planeta. No Brasil, os solos ácidos abrangem cerca de dois terços do território nacional. De um modo geral, a acidez do subsolo reduz a profundidade do sistema radicular, aumentando a susceptibilidade à seca e diminuindo o uso de nutrientes pelas plantas. Além da alta atividade de íon hidrogênio (H+), os solos ácidos geralmente apresentam níveis tóxicos de alumínio, sendo que a toxicidade por AI tem sido intensivamente investigada nos últimos anos. No entanto, a toxicidade por AI ocorre apenas a pH baixo e em condições onde a toxicidade por prótons geralmente também se manifesta. Apesar disto, trabalhos envolvendo a toxicidade por prótons são escassos. A sensibilidade de células a pH baixo depende da fase de crescimento e desenvolvimento em que estas se encontram. Em raízes, as células mais sensíveis são as da região de alongamento e em suspensões celulares as células na fase log de crescimento são mais sensíveis do que as células na fase estacionária. Este trabalho faz parte de uma linha de pesquisa que procura explorar as diferenças que existem entre células quanto à sensibilidade a pH baixo para melhor entender a toxicidade e tolerância a prótons. Foram utilizadas células da cultura de tabaco cv. BY-2, um sistema modelo que apresenta diversas vantagens sobre o uso de raízes para a realização deste trabalho. Os objetivos deste estudo foram de a) determinar condições apropriadas para a exposição destas células a acidez; b) caracterizar a resposta destas células a pH baixo, sob influência de diferentes fatores ambientais, quando se encontram em estados distintos de sensibilidade ao pH baixo; e c) verificar se mudanças na sensibilidade das células a pH baixo podem ser decorrentes de alterações na composição da membrana plasmática ou na atividade das ATPases. Vários testes iniciais foram realizados com o intuito de se definir algumas condições experimentais - o tempo de exposição, a composição do meio e o tampão a ser empregado. Optou-se por lavar as células e depois incubá-las por 1h em meio simples com pH desejado e contendo apenas Ca \'Cl IND. 2\' 2mM, KCl 10mM. E o tampão MES ou biftalato (10 mM). O biftalato foi testado porque o tampão MES, usado normalmente no meio de cultura completo, não é eficiente na faixa de pH abaixo de 5,0. O biftalato (pKa = 4,1) praticamente não afetou a viabilidade celular avaliada pela permeabilidade a trypan blue, mas inibiu o crescimento celular no meio de cultura completo. Mesmo assim, os dois tampões foram utilizados em paralelo em diversos experimentos e verificou-se que os resultados foram semelhantes. A viabilidade das células na fase log (2 dias) foi reduzida quando se abaixou o pH de 5,6 a 3,8, sendo que caiu mais acentuadamente até o pH de 4,8. As células da fase estacionaria (7d) foram insensíveis ao baixo pH. A um pH fixo de 4,2 aumentando-se a concentração de Ca \'Cl IND. 2\' para cerca de 8 a 16 mM praticamente aboliu o efeito deletério do pH baixo. Para se ter o mesmo efeito com a adição de KCl, foi necessário adicionar entre 80 e 160 mM. A adição de sacarose também amenizou os efeitos do pH\'sendo praticamente revertido a uma concentração de 100 Mm. Os resultados indicam a importância da força iônica e da osmolaridade da solução, mas o efeito de Ca não parece depender apenas destas duas propriedades. A inibição de ATPases, pelo uso de DCCD, não pareceu ter qualquer relação com a sensibilidade a pH baixo. Tanto células de tabaco na fase log quanto estacionárias foram sensíveis à aplicação de ortovanadato de sódio. Em células da fase estacionária, este efeito mais acentuado a pH 4,2, sugerindo que nestas células, as H+ ATPases do tipo P da membrana plasmática podem ter algum papel na tolerância destas células ao baixo pH. Encontrou-se diferenças no perfil protéico de frações enriquecidas em membrana plasmática entre células da fase log e estacionárias e entre células tratadas ou não a pH baixo. Estas diferenças precisam ser melhor estudadas. / Acid soils account for about 40 % of the surface area of the world and are one of the major factors limiting plant productivity. In Brazil, these soils comprise roughly two-thirds of its total territory. In general, soil acidity is detrimental because it limits the depth of the root system, increasing susceptibility to drought and decreasing the use of nutrients. In addition to the high levels of hydrogen ion activity, acid soils usually have Al toxicity hazards, a topic which has been intensely studied in the past years. However, Al toxicity only occurs at low pH, under conditions in which proton toxicity is also a problem. Despite this, studies of proton toxicity are lacking. The sensitivity of cells to low pH depends on their growth and developmental status. In roots, the most sensitive cells are those of the elongation zone and in cell cultures, cells in the log phase are more sensitive than those of the stationary phase. This study is part of a larger attempt to explore the differences that exist between cells with respect to their sensitivity to low pH to further understand toxicity and tolerance to protons. Cells of tobacco BY-2, a plant cell model system which has several advantages over the use of roots, was used in this study. The objectives were a) to determine the appropriate conditions to expose these cells to low pH; b) characterize the response of these cells to low pH, when different environmental factors are varied and at different stages of cellular sensitivity to acidity; and c) examine if changes in the sensitivity of cells to low pH are due to changes in the composition of plasma membranes or in the activity of ATPases. Several preliminary tests were performed to define the experimental conditions to be used ? the duration of exposure to low pH, the composition of the medium and the buffer to be used. A simple solution containing only CaCl2 2mM, KCl 10 mM and MES or phthalate buffer (10 mM) was chosen to wash and incubate the cells at the pH of interest. Phthalate was tested because MES, the buffer normally used in the culture medium, is not effective at pH values below 5.0. Phthalate (pKa = 4,1) had very little effects on cell viability as evaluated by membrane permeability to trypan blue, but it severely inhibited the growth of the cell culture in complete medium. Nevertheless, both buffers were used in several subsequent experiments, the results of which were found to be similar between both buffers. The viability of log-phase cells (2 day-old) was reduced when the pH was lowered from pH 5,6 to 3.8, but this was sharper down to pH 4,8. Cells in stationary phase (7 day-old) were insensitive to low pH. At a fixed pH of 4,2, increases in the concentration of CaCl2 up to 8 or 16 mM abolished most of the deleterious effects of low pH. To generate the same effect, KCl had to be added at concentrations between 80 and 160 mM. The addition of sucrose also alleviated the effects of low pH. The results suggest the importance of solution ionic strength and osmolarity on sensitivity to low pH, but the effects of Ca do not appear to depend only on these two properties. The inhibition of ATPases, by DCCD, did not appear to bear any relation to cellular sensitivity to low pH. Both log-phase and stationary-phase cells were affected by the addition of sodium orthophosphate. In stationary-phase cells, this effect was more pronounced at pH 4,2, suggesting that in these cells, P-type H+-ATPases of the plasma membrane may play a role in the tolerance of these cells to lo pH. Differences were found in the protein profile of enriched plasma membrane fractions both between log-phase and stationary-phase cells and between cells treated or not with low pH. These differences, however, need to be better examined.