Effects of a deoxynivalenol contaminated diet on feed intake and health status in horses.

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Die Expression von natriumabhängigen und natriumunabhängigen Transportern für Sulfat in Nieren und Leber ist für die Sulfathomöostase unabdingbar. Ein natriumunabhängiger Transporter für Sulfat ist der Sulfat-Anionen-Transporter 1, sat-1, der Sulfat im Austausch gegen Oxalat, Bicarbonat, Chlorid und Glyoxylat sowohl in die Zellen aufnehmen als auch in das Blut abgeben kann. In dieser Arbeit wurde die Transportfunktion des Sulfat-Anionen-Transporters 1 der Ratte, rsat-1, untersucht. Das Ziel war eine genauere Kenntnis über den Einfluss von Chlorid, des intrazellulären pH-Wertes und der extrazellulären Calciumkonzentration auf den Sulfattransport durch rsat-1 zu erlangen. Als Expressionssystem für rsat-1 wurden Oozyten des Krallenfrosches Xenopus-laevis verwendet. Elektrophysiologische Versuche, die im „Current-Clamp-Modus“ durchgeführt wurden, ermöglichten die Messung von substratinduzierten Potentialänderungen. Durch radiochemische Versuche konnte die Sulfataufnahme durch sat-1 unter variierenden Bedingungen bestimmt werden. Die Rolle des Chlorids in Hinblick auf den Sulfattransport durch sat-1 konnte nicht gänzlich geklärt werden. Da Thiosulfat und Nitrat in den durchgeführten Versuchen die Aufnahme von [35S]Sulfat über rsat-1 hemmten, könnte das Stickstoffatom den Transport von Sulfat beeinflussen. Intrazellulär an Chlorid verarmte rsat-1-exprimierende Oozyten nahmen in den durchgeführten Versuchen vermehrt [35S]Sulfat auf. Des Weiteren konnte eine Steigerung der [35S]Sulfataufnahme in chloridreduzierten, gluconat- beziehungsweise mannithaltigen Lösungen beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind mit einer allosterischen oder kompetitiven Hemmung der Aufnahme von Sulfat durch Chlorid vereinbar. Eine genauere Untersuchung des Chloridtransports über sat-1 wäre durch Versuche mit radioaktiv markiertem Iod¹²⁵ möglich, das wie Chlorid transportiert wird. Die intrazelluläre Ansäuerung der Oozyten durch Ammoniumchlorid führte zu einer erhöhten [35S]Sulfataufnahme in die rsat-1-exprimierenden Oozyten. Diese könnte durch eine verminderte Bicarbonatkonzentration an der äußeren Zellmembran mit einer reduzierten kompetitiven Hemmung begründet sein. Ebenso könnte Ammoniumchlorid durch eine protonierende Wirkung eine Konformationsänderung mit einer Affinitätssteigerung von sat-1 für Sulfat zur Folge haben. Mit steigender Calciumkonzentration wurde die Depolarisation rsat-1-exprimierender Oozyten in chloridreduzierten und gluconathaltigen Lösungen geringer. Dies ist mit bereits vorliegenden Daten vereinbar, in denen Xenopus laevis Oozyten in chloridreduzierten Medien depolarisieren.

Tfap2a gehört zur Familie der AP-2-Transkriptionsfaktoren. Heterozygote Mutationen von TFAP2A im Menschen führen zum Branchio-Okulo-Fazialen-Syndrom (BOFS) und sind mit Nierenanomalien assoziiert. Molekulare Mechanismen, die zu diesen BOFS-assoziierten Nierenanomalien führen, sind noch unbekannt. In diesem Projekt wurde die Expression von Mitgliedern der AP-2-Familie in neugeborenen und erwachsenen Wildtyp-Mäusen analysiert. Tfap2a wurde in der Ureterknospe und der distalen Region des S-förmigen Körpers in den Nieren neugeborener Mäuse exprimiert. Die Expression blieb in ausgereiften distalen Tubuli und Sammelrohren erhalten. Tfap2b, ein zweites Mitglied der AP-2-Familie, das in der Niere exprimiert wird und mit Zystenbildung assoziiert ist, wurde im aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife sowie in den distalen Tubuli und dem in der Nierenrinde liegenden Sammelrohr exprimiert. Um die Rolle von Tfap2a in der Niere zu untersuchen, wurden Mäuse mit einer sammelrohrspezifischen Deletion von Tfap2a (Tfap2a-KO) erzeugt. Phänotypische und morphologische Analysen ergaben, dass Tfap2a-KO-Mäuse mäßig reduzierte Nierengewichte und eine fortschreitende Dilatation der äußeren medullären Sammelrohre aufwiesen. Einzelkern- und RNA-Sequenzierung der Nieren adulter Mäuse zeigte eine deregulierte Expression von Genen, die mit der Organisation von Aktinfilamenten, Zelladhäsion, Wnt-Signalen und anderen Signalwegen der Nierenentwicklung in Verbindung stehen. In einem isolierten Modell von kultivierten Sammelrohrzellen mit einer Deletion von Tfap2a waren ähnliche Signalwege dereguliert. Insgesamt deutet diese Studie darauf hin, dass Tfap2a für die Differenzierung des Sammelrohrepithels und die Regulierung des Durchmessers des Tubuluslumens erforderlich ist. Dies ermöglicht Einblicke in die molekularen Grundlagen der beim BOFS beobachteten Nierenfehlbildungen. / The transcriptional regulator Tfap2a is part of the AP-2 transcription factor family. Heterozygous mutations of TFAP2A in humans lead to branchio-oculo-facial syndrome (BOFS) and are associated with renal anomalies. Molecular mechanisms leading to BOFS-associated renal anomalies are still unknown. In this project, expression patterns of AP-2 family members were analyzed in newborn and adult wildtype mice. Tfap2a was expressed in the ureteric bud and distal region of the S-shaped body in kidneys of newborn mice. Expression was maintained in mature distal tubules and collecting ducts. Tfap2b, a second AP-2 family member expressed in the kidney and associated with cyst formation, was found in the ascending limb and showed overlapping expression with Tfap2a in distal tubules and the cortical collecting duct. To investigate the role of Tfap2a in the kidney, mice with a collecting duct-specific deletion of Tfap2a (Tfap2a-KO) were generated by crossing mice carrying a Cre-recombinase under the Hoxb7 promotor and mice with floxed Tfap2a alleles. Phenotypic and morphological analyses revealed that Tfap2a-KO mice displayed moderately reduced kidney weights and a progressive dilation of outer medullary collecting ducts. Single-nucleus and bulk RNA sequencing of kidneys of three months old Tfap2a-KO mice and littermate controls indicated deregulated expression of genes associated with actin filament organization, cell adhesion, Wnt signaling, and other kidney developmental pathways. Genes deregulated in Tfap2a-deficient mice included several genes previously implicated in the development of congenital anomalies of the kidney and urinary tract. In an isolated model of cultured collecting duct cells carrying a Tfap2a knockout similar pathways were deregulated. Taking together, this study indicates that Tfap2a is required for collecting duct epithelium differentiation and tubular lumen diameter regulation, providing insights into the molecular basis of renal defects observed in BOFS.

Diese Arbeit befasst sich tierexperimentell und klinisch mit Aspekten der Nierenfunktion bei der Behandlung angeborener Herzfehler. Von Patientenseite sind das Neonatal- und Säuglingsalter und ab der Adoleszenz eine chronische Zyanose, von Behandlungsseite Röntgenkontrastmittelgaben, Dauer, Blutviskositätsänderungen und Kreislaufstillstand am kardiopulmonalen Bypass Risikofaktoren. Cortikosteroidgaben, Optimierung von Blutviskosität und Hydratation sowie eine prophylaktische Peritonealdialyse sind Ansätze zur Behandlung eines Nierenschadens. Die Ergebnisse zeigen, dass Verbesserungen der Plasmaviskosität Nierenschäden am hypothermen kardiopulmonalen Bypass vermindern während eine Cortikosteroidgabe vor Kreislaufstillstand bei Ferkeln nicht nephroprotektiv wirkt. Bei Risikopatienten erweist sich der prophylaktische Einsatz einer Peritonealdialyse als günstig. Bei chronisch zyanotischen Patienten mit einer Glomerulopathie und einem erhöhtem Risiko für Röntgenkontrastmittelexposition und kardiopulmonale Byppassoperationen muss der Nierenstatus die Operationsplanung und postoperative Therapie beeinflussen. Nephroprotektion und Verbesserungsmöglichkeiten der Blutviskosität am kardiopulmonalen Bypass müssen weiter untersucht werden. / This work focusses on clinical aspects of kidney function in the treatment of congenital heart disease. Neonates and infants as well as adolescents with cyanosis may be especially at risk. Contrast agents, duration, blood viscosity changes, and circulatory arrest in cardiopulmonary bypass may be risk factors. Corticosteroids, optimized blood viscosity and hydration, and early onset of peritoneal dialysis are considerations of treatment. Our results demonstrate a reduction of renal damage with optimized plasma viscosity during hypothermia in cardiopulmonary bypass, while corticosteroids have no advantage in young pigs after circulatory arrest. Prophylactic treatment with peritoneal dialysis has advantages in patients at risk. In chronicly cyanotic patients with glomerulopathy the risk of contrast agents and cardiopulmonary bypass is elevated. Thus, renal status should influence operative procedures and postoperative treatment. The possibilities of nephroprotection and improvement of blood viscosity should be further evaluated.

Der Typ I Transmembran-Rezeptor SORLA gehört zur VPS10p-Rezeptor Familie in Säugern. Der Rezeptor mit starker Homologie zu Endozytose- und Sorting-Rezeptoren ist am stärksten im zentralen Nervensystem (CNS) exprimiert. Außerhalb des CNS ist SORLA in einer Vielzahl von Geweben zu finden, unter anderem in der Niere. Das klare Expressionsmuster des Rezeptors im distalen Nephron lässt eine Rolle des Rezeptors in transepithelialen Transportprozessen vermuten. Um genau festzustellen, welche Prozesse von SORLA beeinflusst werden, wurde die Nierenfunktion von Mäusen mit einer vollständigen Defizienz des Sorla-Gens (Sorla-/-) untersucht. Diese Tiere zeigen Defekte in der renalen Ionenhomöostase: sie verlieren Na+, Cl-, K+, und Ca2+ (im Normalzustand und/oder nach Trinkwasserentzug). Eine Erniedrigung von Blutdruck und Herzfrequenz sowie eine fehlregulierte Sekretion von Aldosteron gehen mit dem Salzverlust-Phänotyp einher. Passend zu dieser Beobachtung konnte eine Expression von SORLA in der Nebenniere – speziell in der Zona glomerulosa, dem Ort der Aldosteron-Synthese – gezeigt werden. Des weiteren wurde eine signifikant verminderte Expression mehrerer Gene des Adrenalin-Synthesewegs in Sorla-/--Mäusen festgestellt, welcher in einer verringerten Menge des Hormons in den Nebennieren der Tiere resultiert. In der Niere bewirkt das Fehlen von SORLA insbesondere eine veränderte Phosphorylierung der beiden Kation-Chlorid-Cotransporter NCC und NKCC2 hervor, deren Aktivität durch Phosphorylierung reguliert wird. Es ist bekannt, dass die Signalkinase SPAK die Aktivität von NKCC2 und NCC reguliert. Die anormale Phosphorylierung fällt mit einer untypischen Verteilung der Kinase im TAL der SORLA-defizienten Mäuse zusammen. Dies deutet auf eine Funktion des Rezeptors beim Trafficking von SPAK hin. Durch die Identifizierung von Transportproteinen als putative Interaktionspartner SORLAs konnte diese Hypothese bekräftigt werden. / The type I transmembrane receptor SORLA is a member of the mammalian VPS10p-receptor family. The receptor, which is mainly expressed in the central nervous system (CNS), is characterized by high structural homology to endocytosis- and sorting-receptors. Outside the CNS, expression of SORLA can be found in a variety of tissues, including kidney. This distinct expression pattern in the distal nephron suggests a role for SORLA in transepithelial transport processes. To determine which processes the receptor might be involved in, the kidney function of mice, wich carry a complete deficiency of the Sorla gene, was analyzed. These animals show defects in ion handling: they are wasting Na+, Cl-, K+, and Ca2+ (under normal conditions and/or after water deprivation). The salt loss phenotype is accompanied by decreased mean arterial pressure and heart rate as well as mis-regulated secretion of aldosterone. In line with this observation, SORLA is also expressed in the adrenal gland, particularly in the zona glomerulosa, the place of aldosterone synthesis. Additionally, a significant down-regulation of several genes of the epinephrine synthesis pathway in mice lacking SORLA was found. This defect results in lower adrenal levels of the hormone. In the kidney, the lack of SORLA results especially in altered phosphorylation of the two cation-chloride cotransporters NCC and NKCC2, as their activity is regulated by phosphorylation. The signaling kinase SPAK has been reported to regulate the activity of NKCC2 and NCC. The transporters’ abnormal phosphorylation coincides with the atypical distribution of the kinase in TAL of Sorla-/- mice, suggesting a role of the receptor in establishing the localization of SPAK. This hypothesis was further substantiated by the identification of putative SORLA-interacting proteins involved in trafficking.

Claudin Tight Junction Proteine sind wichtige Komponenten für den parazellulären Ionentransport in Epithelien. In der Niere sind Claudine an der Ionenresorption im Rahmen der Urinbildung beteiligt. In meiner Arbeit wurde die renale Funktion von zwei Vertretern dieser Familie, Claudin-16 und Claudin-10, untersucht. Durch gerichtetes Gentargeting wurden murine Defizienzlinien für Cldn16 und Cldn10 generiert und hinsichtlich ihres Phänotyps charakterisiert, der Fokus der Untersuchungen wurde auf die Nierenfunktion gelegt. Claudin-16-Fehlfunktion wurde mit der herediären Nierenerkrankung FHHNC assoziiert. FHHNC ist charakterisiert durch renalem Salzverlust und die Ausbildung einer Nephrokalzinose, welche schließlich zu terminalem Nierenversagen führt. Claudin-16-defiziente Mäuse weisen ähnliche Elektrolytimbalanzen wie humane FHHNC-Patienten auf, zeigen jedoch kompensatorische Mechanismen auf physiologischer, endokrinologischer und Transkriptions-Ebene, welche eine Progression der Krankheit verhindern. Das Mausmodell eignet sich somit für Studien zum renalen Salzverlust und zur Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Zusätzlich konnten zwei putative Transporter gefunden werden, welche als interessante Kandidaten im renalen Magnesiumtransport weiteren Analysen unterzogen werden. Claudin-10 ist ubiquitär in Epithelien exprimiert, seine physiologische Rolle jedoch bis dato nur unzureichend geklärt. Claudin-10-defiziente Mäuse versterben wenige Stunden nach der Geburt. Untersuchungen an pulmonalem und renalem Gewebe konnten bislang keine Ursache für die Mortalität aufzeigen. Urinanalysen deuten jedoch auf eine Imbalanz der Magnesiumhomöostase hin. Durch konditionelle Knockout-Strategien soll im Folgenden die Claudin-10-Defizienz in einzelnen Geweben, etwa der Niere, untersucht werden. Auf diese Weise soll die Aufarbeitung des Phänotyps komplettiert und die Ursache der Letalität gefunden werden. / Claudin tight junction proteins are essential components in the regulation of paracellular fluxes through epithelial layers. In the kidney, claudins contribute to the resorption of ions in urine formation. This thesis highlights the physiological role of two renally expressed family members, claudin-16 and claudin-10. Via conditional gene targeting, murine Cldn16 and Cldn10 deficiency strains have been generated and evaluated with respect to their phenotype, with a focus on the renal function. Claudin-16 has been attributed to the resorption of bivalent ions in the thick ascending limb of Henle’s loop. Protein malfunction in humans goes in hand with FHHNC, a genetic disorder characterized by renal loss of bivalent ions, finally leading to nephrocalcinosis and end stage renal disease. Claudin-16 deficient mice display similar electrolyte disorders as human patients, but also resemble compensatory mechanisms on physiological, endocrinological and transcriptional levels to prevent the progression of the disease state. Hence, Cldn16 knockout mice serve as an adequate model to study renal salt wasting as well as counterregulatory mechanisms which highlights molecular pathways underlying renal salt wasting. Additionally, we could identify putative transport proteins which are attractive candidates for transcellular magnesium transport in the kidney. Claudin-10 shows a wide distribution in various tissues, its physiological role, however, is still under evaluation. Mice lacking claudin-10 display a lethal phenotype shortly after birth. Investigations of renal and pulmonary histology has not yet revealed the cause for the mortality under claudin-10-deficiency. However, urine analysis suggests an imbalance in the magnesium homeostasis in these animals. By subsequent conditional gene knockout approaches, this model will serve as a basis for tissue specific claudin-10 ablation and thereby enables investigation into the contribution of claudin-10 to distinct organ functions.

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Bone-Morphogenetic-Proteine besitzen eine umfangreiche Funktion in der Embryo- und Organogenese sowie bei der Gewebsregeneration im adulten Organismus. BMP-7 ist an der Nephrogenese beteiligt und besitzt protektive und regenerative Fähigkeiten in der adulten Niere. Das eng verwandte BMP-5 ist ebenfalls an der Nephrogenese beteiligt, wurde aber bisher in der adulten humanen Niere nicht untersucht. BMP-2 ist in der Embryogenese unabdingbar. Es induziert die Differenzierung, Migration und Proliferation embryonaler Stammzellen und ist essentiell in der Knochenentwicklung. Die Rolle von BMP-2 in der adulten Niere ist unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression, Funktion und Regulation von BMP-2 und BMP-5 in der adulten humanen Niere, bei der hypertensiven Nephrosklerose und in verschiedenen renalen Zelllinien zu untersuchen.

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