La traduction des ARNm en protéine est un processus finement régulé grâce aux mécanismes développés par la cellule pour en contrôler l’efficacité et la fidélité. En effet, les ARNm sont sujets à diverses erreurs au cours de leur transcription et leur maturation. En particuliers, les erreurs entrainant l’apparition de codons stop précoces peuvent conduire à la synthèse de protéines tronquées à effet néfaste sur la cellule. C’est pour cela que de tels ARNm sont rapidement dégradés grâce à un mécanisme régulateur appelé la NMD (Nonsence mediated mRNA Decay). Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, cette voie est régie par l’action coordonnée des protéines Upf1, Upf2 et Upf3 formant le complexe de surveillance, mais elle fait également intervenir les facteurs de terminaison classique eRF1 et eRF3, ainsi que d’autres facteurs peu caractérisés tels que la protéine Ebs1. Par ailleurs, la dégradation de ces ARNm défectueux est accélérée par la dégradation rapide de la coiffe ou « decapping ». Au cours de ce travail, nous avons caractérisé des domaines fonctionnels de protéines impliquées dans la détection et la dégradation de ces ARNm. En particuliers, nous nous sommes intéressés à l’étude structurale de la protéine Upf2 qui constitue l’élément central du complexe de surveillance. Nous avons également caractérisé un domaine de la protéine Pat1, puissant activateur du « decapping ». Cette étude nous a permis de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans le contrôle qualité et la dégradation des ARNm. / MRNA translation process is finely tuned thanks to the regulatory mechanisms evolved by the cell controlling its rate, efficiency and fidelity. Indeed, mRNAs are often subjected to transcription and maturation errors. In particular, mRNA harboring premature stop codons (PTC) in their open reading frames could be translated into truncated proteins with a deleterious impact on the cell. Thus, such mRNAs are rarely detected in the cell as they are rapidly degraded thanks to the NMD (Nonsence mediated mRNA Decay) pathway. In yeast Saccharomyces cerevisiae, this process is governed by the Upf1, Upf2 and Upf3 proteins forming the “surveillance complex”, the termination factors (eRF1 and eRF3) as well as some other poorly characterized factors like Ebs1 protein. In addition, degradation of such mRNAs is enhanced by rapid degradation of the 5’ cap or decapping. In this work, we focused on the characterization of some proteins involved in this process. In particular, we addressed the structural characterization of Upf2 protein, the central component of the surveillance complex. In addition, we characterized a functional domain of Pat1 protein, a strong decapping enhancer. This study allowed us to give a new insight into the role of these proteins in mRNA quality control and decay.

Au cours de mon travail de thèse j’ai étudié la relation entre les facteurs participant à la terminaison de la traduction et ceux participant à la dégradation des ARNm chez S. cerevisiae.D’une part, je me suis intéressée au facteur Tpa1, caractérisé pour son rôle dans la terminaison de la traduction et la stabilité des ARNm chez S. cerevisiae et dont l’homologue chez S. pombe, Ofd1, participe au contrôle de la réponse hypoxique. Je me suis basée sur la structure de ce facteur, établie par nos collaborateurs pour comprendre plus précisément la fonction moléculaire de Tpa1 et rechercher des similitudes avec sa fonction chez S. pombe.Tpa1 est composée de deux domaines de type DSBH dont le premier, contenant le site catalytique, présente des homologies structurales avec la famille des prolyl-hydroxylases.Nous avons reproduit l’effet de la protéine Tpa1 sur la translecture in vivo et montré que son site catalytique prédit, ainsi que la présence des deux domaines étaient nécessaires pour cette activité. Nous avons aussi observé que Tpa1 inhibait par un mécanisme inconnu le facteur de transcription Hap1, qui régule des gènes en fonction de la quantité d’oxygène. Basé sur l’existence d’un inhibiteur d’Ofd1 chez S. pombe, nous avons ensuite montré qu’Ett1 (l’homologue de cet inhibiteur chez S. cerevisiae) avait un rôle similaire à Tpa1 dans la translecture. Une étude structurale collaborative d’Ett1 a mis en évidence une région conservée, se liant à une molécule de sulfate et à un ligand inconnu. Cette région est importante pour la translecture. Cependant, le substrat de Tpa1 reste pour l’instant inconnu comme les rôles précis de Tpa1 et Ett1 dans la terminaison de la traduction et dans la réponse à l’hypoxie.D’autre part, j’ai étudié le processus de NMD, particulièrement en me focalisant sur le mécanisme de discrimination entre un codon stop précoce (PTC) et un codon stop normal, et en analysant également la modification post-traductionnelle d’un facteur central du NMD, Upf1. Nous avons mis en évidence, qu’en plus de la région aval, la région en amont du PTCparticipait à sa reconnaissance. Nous avons testé plusieurs hypothèses sur le rôle de cette région, qui ont confirmé son rôle sans permettre de démontrer un mécanisme définitif. En parallèle, l’étude de la protéine Upf1 s’est concentrée sur ses modifications posttraductionnelles, particulièrement par phosphorylation. En effet, une telle modification est importante chez son homologue humain. Nous avons pu confirmer l’existence d’une forme modifiée et démontrer que celle-ci était localisée entre les acides aminés 153 et 971. Cette modification s’est avérée être très labile ce qui n’a pas permis de confirmer qu’il s’agissait d’une phosphorylation, ni de la cartographier plus précisément. / During my PhD thesis, I analyzed the relation between factors that participate intranslation termination and those participating in mRNA decay in yeast S. cerevisiae.First, I focused on Tpa1, that had been proposed to participate in translationtermination and mRNA decay in S. cerevisiae, and whose homologue in S. pombe, Ofd1,participates to the control of hypoxic response. Based on the structure of Tpa1, established byour collaborators, I performed functional analysis to understand more precisely the molecularfunction of Tpa1 and similarities with its role in S. pombe. Tpa1 is composed of two DSBHdomains; the first, which contains the catalytic site, has structural homologies with the familyof prolyl-hydroxylase. We could reproduce the effect of Tpa1 on stop codon readthrough invivo and we showed that the predicted catalytic site and the presence of the two domains ofTpa1 were necessary for its activity. We also showed that Tpa1 inhibited one factor, Hap1,implicated in regulation of gene expression by oxygen. The existence of an inhibitor of Ofd1in S. pombe, allowed the identification of Ett1 (its homologue in S. cerevisiae). We showedthat Ett1 has a role similar to the one of Tpa1 in translational readthrough. A collaborativestructural and functional study of Ett1 revealed a conserved region, which binds a sulfate ion,and an unknown ligand. This region is important for the readthrough. However, thesubstrate(s) of Tpa1 remain(s) for the moment unknown, and the precise roles of Tpa1 andEtt1 in translation termination and in response to hypoxia remain to be deciphered.I also analyzed the NMD process by focusing more particularly on the mechanism thatallows the discrimination between a normal stop and a PTC (premature termination codon)and on the analysis of the post-translational modification of an important factor for the NMD,Upf1. This study revealed that, not only the region downstream of the PTC but also theupstream region participates to its recognition. We have tested several hypotheses on the roleof this upstream region, which confirmed its implication but did not reveal a definitivemechanism. In parallel, we started the study of the post-translational modifications of Upf1,and more particularly by phosphorylation. Indeed, the phosphorylation of Upf1 in human isvery important for the NMD process. We could confirm the presence of a modified form ofyeast Upf1 and we have demonstrated that it was localized between amino acids 153 and 971.This modification appeared to be highly labile. This prevented us to confirm definitively thatit was really a phosphorylation and to cartography precisely its location.

UPF1 (Up-Frameshift 1) est une hélicase multifonctionnelle conservée chez tous les eucaryotes. Elle est essentielle à la voie de surveillance du NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay), qui dégrade des ARNm portant un codon stop prématuré. UPF1 est l’archétype d’une famille d’hélicases qui partagent des corps similaires mais sont impliquées dans des voies cellulaires variées. Cependant, les relations structure-fonction et les caractéristiques biophysiques intrinsèques de ces moteurs moléculaires restent à ce jour peu connues. In vitro, le coeur hélicase d’UPF1 est hautement processif, il traverse des milliers de bases sur l’ARN ou l’ADN et déroule des doubles brins. Dans ce travail, nous avons cherché les facteurs clés régissant cette remarquable processivité en combinant des techniques de biochimie et de biophysique. En particulier, nous avons utilisé des pinces magnétiques pour étudier en temps réel des hélicases à l’échelle de la molécule unique. Contrairement à UPF1, l’hélicase IGHMBP2 de la famille UPF1-like n’est pas processive ; la processivité n’est donc pas un trait conservé au sein de la famille. Grâce à une étude fine de la structure 3D des deux hélicases, nous avons conçu divers mutants que nous avons utilisés pour identifier les éléments structuraux qui modulent la processivité. Notre approche révèle qu’UPF1 a une prise très ferme sur les acides nucléiques, garantissant de longs temps de résidence et d’action qui dictent sa haute processivité. Grâce à la variété de comportements des mutants, nous avons construit un modèle mécanistique expliquant le lien entre énergie d’interaction et processivité. Nous démontrons aussi que la processivité d’UPF1 est requise pour un processus de NMD efficace in vivo. Nous avons utilisé les mêmes outils biochimiques et biophysiques pour étudier une isoforme naturelle d’UPF1 humaine se déplaçant plus vite que l’isoforme majeure, et pour comparer la régulation d’UPF1 humaine et de levure par leurs domaines flanquants. Nous avons également caractérisé l'interaction d’UPF1 de levure avec de nouveaux partenaires. Nos travaux montrent comment la combinaison d'outils biochimiques, biophysiques, structuraux etin vivo offre des aperçus inattendus quant au mode de fonctionnement des moteurs moléculaires. / UPF1 (Up-Frameshift 1) is a multifunctional helicase that unwinds nucleic acids and is conserved throughout the eukaryote kingdom. UPF1 is required for the Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) surveillance pathway, which degrades mRNAs carrying premature termination codons, among other substrates. UPF1 is the archetype of a family of 11 helicases sharing similar cores but involved in various cellular pathways. However, the structure-function relationship and intrinsic biophysical properties of these molecular engines remain poorly described. In vitro, the UPF1 helicase core is highly processive, it travels along thousands of RNA or DNA bases and unwinds double-strands. In this work, we looked for key factors governing this remarkable processivity. We combined biochemical and biophysical techniques. In particular, we used magnetic tweezers to study helicases in real time at a single molecule scale. In contrast to UPF1, the related IGHMBP2 is not processive, thus processivity is not a shared family trait. Based on the 3D structures of both proteins, we designed various mutants and used them to identify structural elements that modulate processivity. Our approach reveals that UPF1 has a very firm grip on nucleic acids, guaranteeing long binding lifetimes and action times that dictate its high processivity. Thanks to the variety in mutant behaviors, we built a novel mechanistic model linking binding energy to processivity. Furthermore, we show that UPF1 processivity is required for an efficient NMD in vivo. In addition, we used the same biochemical and biophysical tools to investigate a natural human UPF1 isoform moving faster than the major isoform, and to compare the regulation of human andyeast UPF1 by their flanking domains. We also characterized the interaction of yeast UPF1 with new NMD partners. Our work shows how a combination of biochemical, biophysical, structural and in vivo tools can offer unexpected insights into the operating mode of molecular motors.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d’empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n’existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu’un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d’une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu’une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n’est pas exprimé du fait de l’intervention du NMD sur l’ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d’inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l’efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d’un luminomètre. A partir d’un premier criblage d’environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d’inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d’induire la synthèse de protéines entières à partir d’un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l’inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l’apparition d’une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d’inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosquelette. / MRNAs harboring a premature termination codon are rapidly degraded by a mechanism called nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD is a surveillance pathway that prevents the synthesis of truncated proteins that could be harmful for the cell or simply be non-functional. However in some cases, depending on the position of the premature stop codon, the truncated protein that would be synthesized if there were no NMD would be partially or fully as functional as the wild-type protein. It is noteworthy that premature termination codons are found in approximately one-third of inherited genetic disorders and several forms of cancer. In most of cases the disease arises not because a non-functional or unstable truncated protein is synthesized, but instead because the degradation of the transcript by NMD leads to complete loss of protein production. Therefore, NMD inhibition could be an interesting therapeutic approach in some cases of nonsense-related genetic diseases in which functional truncated proteins can restore the clinical phenotype. We decided to search for NMD inhibitors among thousands of small molecules. We developed a cell-based screening method which couples NMD efficiency into the cell to a luciferase activity that can be measured directly into cells by a luminometer. From a screening of approximately 1500 compounds, we have identified one molecule capable of efficiently inhibit NMD. Interestingly, this compound is also able to induce the synthesis of full-length proteins from an mRNA bearing a premature termination codon. We evaluated the therapeutic potential of this compound in different cellular models of genetic disorders such as Duchenne’s muscular dystrophy, cystic fibrosis and cancer. Our results demonstrate that NMD inhibition in general can be considered as an useful therapeutic approach to rescue PTC consequences in genetic diseases provoked by the apparition of a nonsense mutation. We have also identified another compound that inhibits NMD and uncovers a relationship between the NMD efficiency and the integrity of the cytoskeleton.

Différentes observations montrent que la protéine INT6 humaine possède une activité suppresseur de tumeurs. Il a été démontré que chez l'homme le gène int6 était sous-exprimé dans environ 30% des cancers du poumon non à petits cellules et que cette sous-expression était un facteur de mauvais pronostic. Des expériences de criblage double hybride avec INT6 comme appât ont identifié une protéine nommée SLIP1 (SLBP Interacting Protein 1). Un effet de SLIP1 sur la traduction des ARN messager des histones a été montré. Les travaux que j'ai menés indiquent qu'INT6 en interagissant avec SLIP intervient dans le contrôle de la stabilité et de la traduction des ARNs codant pour les histones. Un knockdown d'INT6 provoque une baise des niveaux des histones endogènes sans avoir un effet au niveau d'ARN. Mes études, en révélant un nouveau mécanisme de dans lequel INT6 joue un rôle direct, permettent ainsi de faire le lien entre - d'une part - les fonctions connues de cette protéine dans la traduction et son contrôle et - d'autre part - les effets oncogéniques connus de son altération. Par ailleurs, l'étude de la fonction d'INT6 dans les cellules humaines réalisée par ARN interférence montre une inhibition de la dégradation des ARNm possédant un codon stop prématuré par la voie du Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD). Nous avons étudié son action par rapport aux ARNs HTLV-1. Nous avons observé une stabilisation significative des cibles de NMD. Ceci démontre que la protéine Tax interfère avec cette voie de dégradation des ARN d'une part en empêchant l'interaction entre UPF1 et INT6 et d'autre part en interagissant lui-même avec la protéine UPF1 phosphorylée. En agissant sur le NMD, Tax intervient à un niveau post transcriptionel qui pourrait avantager la réplication virale et aussi permettre la tolérance cellulaire aux mutations liées à l'effet mutagénique établi de Tax.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Messenger RNAs are transcribed and co-transcriptionally processed in the nucleus, and transported to the cytoplasm. In the cytoplasm, mRNAs serve as the template for protein synthesis and are eventually degraded. The removal of intron sequences from a precursor mRNA is termed splicing and is carried out by the dynamic spliceosome. In this thesis, I describe the regulated splicing of two transcripts in Saccharomyces cerevisiae. I also describe a study where the mechanisms that control the expression of magnesium transporters are elucidated. The pre-mRNA retention and splicing (RES) complex is a spliceosome-associated protein complex that promotes the splicing and nuclear retention of a subset of pre-mRNAs. The RES complex consists of three subunits, Bud13p, Snu17p and Pml1p. We show that the lack of RES factors causes a decrease in the formation of N4-acetylcytidine (ac4C) in tRNAs. This phenotype is caused by inefficient splicing of the pre-mRNA of the TAN1 gene, which is required for the formation of ac4C in tRNAs. The RES mutants also show growth defects that are exacerbated at elevated temperatures. We show that the temperature sensitive phenotype of the bud13Δ and snu17Δ cells is caused by the inefficient splicing of the MED20 pre-mRNA. The MED20 gene encodes a subunit of the Mediator complex. Unspliced pre-mRNAs that enter the cytoplasm are usually degraded by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway, which targets transcripts that contain premature translation termination codons. Consistent with the nuclear retention function of the RES complex, we find that NMD inactivation in the RES mutants leads to the accumulation of both TAN1 and MED20 pre-mRNAs. We also show that the cis-acting elements that promote RES-dependent splicing are different between the TAN1 and MED20 pre-mRNAs. The NMD pathway also targets transcripts with upstream ORFs (uORFs) for degradation. The ALR1 gene encodes the major magnesium importer in yeast, and its expression is controlled by the NMD pathway via a uORF in the 5’ untranslated region. We show that the ribosome reaches the downstream main ORF by a translation reinitiation mechanism. The NMD pathway was shown to control cellular Mg2+ levels by regulating the expression of the ALR1 gene. We further show that the NMD pathway targets the transcripts of the vacuolar Mg2+ exporter Mnr2p and the mitochondrial Mg2+ exporter Mme1p for degradation. In summary, we conclude that the RES complex has a role in the splicing regulation of a subset of transcripts. We also suggest a regulatory role for the NMD pathway in maintaining the cellular Mg2+ concentration by controlling the expression of Mg2+ transporters.

mRNA decay is an important step in gene regulation, environmental responsiveness, and mRNA quality control. One such quality control pathway, Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD), targets transcripts whose translation terminates prematurely. However, the scope and the defining features of NMD-targeted transcripts remain elusive. To address these issues, we re-evaluated the genome-wide expression of annotated transcripts in yeast cells harboring deletions of the UPF1, UPF2, or UPF3 genes. The vast majority of NMD-regulated transcripts are normal-looking protein-coding mRNAs. Our bioinformatics analyses reveal that this set of NMD-regulated transcripts generally have lower translational efficiency, lower average codon optimality scores, and higher ratios of out-of-frame translation. General mRNA decay is predominantly mediated by decapping by the Dcp1-Dcp2 complex and 5' to 3' decay by Xrn1, but the exact mechanism of decapping regulation has remained largely unknown. Several in vitro and in vivo studies have revealed the importance of the C-terminal extension of Dcp2 and the identities of many decapping regulators that interact with the decapping complex. To better understand how decapping regulation is achieved by the C-terminal extension of Dcp2 we generated RNA-Seq libraries from a Dcp2 allele that lacks this portion of Dcp2 along with libraries from strains that contain single deletions of several decapping activators. Our transcriptome-wide results indicate that the C-terminal extension of Dcp2 is crucial for efficient regulation of decapping, and different decapping activators are responsible for targeting different sets of mRNAs. Considering the limited pool of Dcp1-Dcp2 in the cell decapping activators might be in competition for decapping complex binding. Collectively, our results yield valuable insights into the mechanism of substrate selection for mRNA quality control and decay in yeast.

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