Depuis plusieurs années, des agents exogènes environnementaux appelés perturbateurs endocriniens (PE), sont soupçonnés d’interférer avec les fonctions essentielles de reproduction et de développement chez de nombreux organismes vivants. Pour la protection de l’Environnement et de l’Homme, la Directive Cadre sur l’Eau établit des normes de qualité environnementale (NQE) et limite la concentration de trente-trois substances et de huit autres polluants dans les eaux de surface. En revanche, elle ne prend pas encore en compte l’effet de ces substances prioritaires sur les écosystèmes et les humains notamment la perturbation endocrinienne. De plus les spécificités des perturbateurs endocriniens (courbe dose réponse, effets de mélanges etc..) rendent le processus d'identification de ces molécules complexe. Cette thèse est axée sur l’étude d’un des effets hormonaux, les plus couramment rencontrés, la perturbation estrogénique en utilisant comme outils de diagnostic le yeast estrogen screen (YES). Cette étude porte plus particulièrement sur le nord de la Tunisie où l’impact de certains PE sur le développement de poissons Aphanius fasciatus a été mis en évidence. Certains xénoestrogènes comme le cadmium et les HAP, produits générés par l’industrie locale, sont en partie mis en cause dans les malformations observées. En parallèle, certains xénoestrogènes (parabènes notamment) sont retrouvés dans les eaux de stations d’épuration. D’autres produits chimiques comme les colorants textiles et alimentaires ont également des activités endocriniennes. Dans le cadre de la surveillance de la qualité des eaux, il est nécessaire de développer des tests rapides de détection de ces perturbateurs venant complémenter les analyses chimiques. Certaines substances actives sur le système endocrinien étant peu immunogènes, l’axe de recherche développé, dans ce cadre de cette thèse, porte sur un peptide affine pour détecter une myoestrogène, l’ochratoxine A. / For several years, environmental exogenous agents called endocrine disruptors (ED) , are thought to interfere with reproduction and development fonctions in many organisms . For the Protection of the Environment and human health, the Water Framework Directive establishes environmental quality standards (EQS) and limits the ranges of thirty-three substances and eight other pollutants in surface waters. Nevertheless, it does not yet take into account the effect of these priority substances on ecosystems and humans including endocrine disruption. More than endocrine disruptors specificity (dose response curve , mixtures effect etc. .. ) make the identification process more complex. This thesis focuses on the study of hormonal effects, the most commonly encountered, estrogen disruption using the yeast estrogen screen (YES) as diagnostic tool. This study focuses particularly on the north of Tunisia, where the impact of ED on development of Aphanius fasciatus . Some xenoestrogens such as cadmium and PAH products generated by local industry are partly implicated on observed skeletal deformities. In parallel, some xenoestrogens (including parabens) are detected in the waters of sewage treatment plants. Other chemicals such as textile and food dyes also have endocrine activities. Under the supervision of water quality, it is necessary to develop rapid tests to detect endocrine disrupter and supplement chemical analyzes. Some active substances on the endocrine system is poorly immunogenic, the research axis developed in this thesis focuses on a peptide affinity for detecting a fungi toxin, ochratoxin A.

L'aflatoxine B1 (AFB1) et l'ochratoxine A (OTA) sont des mycotoxines pouvant contaminer une large variété de denrées alimentaires. L'ingestion d'aliments contaminés par des animaux d'élevage peut entraîner l'altération de leur santé et de leurs performances zootechniques ainsi qu'un problème de sécurité alimentaire lié à la présence de résidus de mycotoxines dans les produits animaux, notamment le lait. Des traitements de détoxication basés sur l'addition d'adsorbants organiques ont été développés pour fixer les mycotoxines dans le tube digestif et ainsi réduire l'exposition des animaux. L'objectif de ce travail de thèse était d'évaluer l'efficacité d'un adsorbant à base d'extraits de parois modifiées de levures (Mycosorb®) sur deux modèles animaux, le rat et la brebis. L'efficacité a été déterminée en réalisant un suivi des mycotoxines et/ou de leurs métabolites dans 3 matrices : l'excrétion urinaire et fécale et la cinétique sanguine. Sur les 2 modèles animaux, nous avons ainsi étudié les effets de l'apport en Mycosorb sur l'excrétion urinaire et fécale et la cinétique sanguine des 2 mycotoxines (AFB1 et OTA). Chez le rat, le suivi de la radioactivité a montré que les fèces d'animaux supplémentés en parois de levures contiennent significativement plus de mycotoxines. Cette augmentation de la radioactivité dans les fèces s'est accompagnée d'une diminution marquée de la radioactivité dans le sang et dans les urines. Chez la brebis laitière, en plus de ces paramètres, nous avons évalué l'effet de l'adsorbant sur les paramètres de production de l'animal et l'excrétion des mycotoxines dans le lait. L'addition de la paroi de levure a entraîné une augmentation significative de l'excrétion de l'AFB1 et de son métabolite, l'aflatoxine M1(AFM1) dans les fèces du ruminant. Cette augmentation de l'excrétion fécale s'accompagne de la réduction du taux d'AFM1 excrété dans l'urine mais pas dans le lait. Les effets observés chez les deux modèles expérimentaux semblent être liés à la séquestration des mycotoxines dans le tractus digestif des animaux et permettent de conclure à la capacité de l'adsorbant organique à réduire la biodisponibilité des mycotoxines testées. L'ajout de la paroi de levure pourrait, par conséquent, réduire les risques sanitaires chez les animaux d'élevage exposés à une alimentation contaminée par les mycotoxines. Cependant, nous n'avons pas observé d'effet sur la santé et les paramètres zootechniques des animaux dans les conditions expérimentales utilisées.

L'objectif du travail de recherche mené concerne l'élaboration des nouveaux matériaux d'électrodes modifiés pour des applications dans le domaine des biocapteurs. Le travail a été subdivisé en trois parties portant sur le greffage du sel de diazonium pour application immunocapteur, l'électroadressage des d'anticorps et l'électrodépôt d'un espaceur pour application aptacapteur. Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes consacrés d'abord à l'électrogreffage du nitrobenzène diazonium sur la surface d'or pour le développement de capteurs immunologiques destinés à la détection de la bactérie Staphylococcus aureus. Une limite de détection de 10 UFC/mL a été atteinte. Dans la deuxième partie, la détection de l'ochratoxine A est présentée, basée sur l'électroadressage covalent de l'anticorps modifié par la fonction diazonium sur des électrodes de Diamant Dopé Bore (BDD). Une limite de détection de 0.007ng/mL a été obtenue et l'immunocapteur a été testé sur des échantillons réels. Enfin, on a développé un aptacapteur basé sur le greffage d'un espaceur (PEG) sur la surface des microcellules BDD pour la quantification de la biotoxine OTA. Une limite de détection de 0,01ng/L a été obtenue et application à un échantillon réel (le riz) a été démontrée. Les résultats obtenus, basés sur des méthodes électrochimiques de détection (variation de l'impédance ou du courant d'une sonde redox) sont encourageantes en termes de sensibilité, limite de détection, reproductibilité et spécificité / The objective of the research work was to the development of modified electrode materials for biosensor application. The work was devided into three parts: electrografting of diazonium salt for immunosensor application, electroadressing of antibodies and electrodeposition of PEG spacer for aptasensor application. In the first part of this work, the modification of gold surfaces with nitrobenzene diazonium cation was investigated in order to develop an immunosensors for the detection of Staphylococcus aureus. A detection limit of 10 CFU/mL has been obtained. The second part was focused on the electrically addressable deposition of diazonium functionalized antibodies on boron-doped diamond (BDD) microcells for the detection of OTA. A detection limit of 0.007ng/mL has been obtained and the immunosensor was tested on real samples. Finally, we developed an amperometric aptasensor based on electrochemical grafting of a PEG-COOH spacer on a BDD microcell for the detection of OTA biotoxin. A detection limit of 0.01 ng/L has been obtained and application to a real sample (rice) has been demonstrated. The amperometric and impedimetric techniques used in this work lead to promising results in terms of sensitivity, specificity and reproductibility

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au développement d’un nouveau biocapteur enzymatique ultrasensible pour la détection conductimétrique d’une mycotoxine, l’ochratoxine A (OTA). Une peptidase, la thermolysine (TLN), a été choisie comme élément de reconnaissance. Le biocapteur proposé est basé sur l’immobilisation de la TLN dans une matrice d’alcool polyvinylique (PVA)/polyéthylènimine (PEI) contenant des nanoparticules d’or et réticulée à la surface de microélectrodes interdigitées à l’aide de vapeurs de glutaraldéhyde. Dans les conditions optimales (35 min de réticulation, mesure à pH 7 et 25°C), la réponse du biocapteur est linéaire jusqu’à 60 nM et la limite de détection est de 1 nM. Cette valeur est 700 fois plus basse que celle obtenue en utilisant une méthode d’immobilisation basée sur la co-réticulation de la TLN en présence d’albumine de sérum bovin (BSA). La matrice PVA/PEI crée un environnement aqueux favorable à l’enzyme. Par ailleurs, les interactions entre les groupements amines protonés du PEI et les charges négatives des nanoparticules citratées et de la TLN améliore leur dispersion dans la matrice et favorise la stabilisation de l’enzyme et son accessibilité au substrat (OTA). Le biocapteur conductimétrique développé est très reproductible et stable pendant 30 jours lorsqu’il est stocké à 4°C dans du tampon phosphate 20 mM pH7 entre 2 mesures. Le biocapteur a ensuite été évalué sur des échantillons d’huile d’olive commerciale dopée. Aucun prétraitement de l’échantillon n’a été nécessaire et des taux de recouvrement proches de 100% ont été obtenus, démontrant l’absence d’effet de matrice / A new ultrasensitive enzymatic biosensor for the direct conductometric detection of ochratoxin A (OTA) has been developed in this work. Thermolysin (TLN), a peptidase, was chosen as recognition element. The proposed biosensor is based on TLN immobilization into a polyvinyl alcohol (PVA)/polyethylenimine (PEI) matrix containing gold nanoparticles (AuNPs) and cross-linked at the surface of gold interdigitated microelectrodes using glutaraldehyde vapor. Under optimal conditions (35 min cross-linking time, working pH of 7 and temperature of 25◦C), the biosensor response was linear up to 60 nM OTA and the limit of detection was 1 nM. This value was 700 times lower than the detection limit obtained using the more classical method based on enzyme cross-linking in the presence of bovine serum albumin (BSA). PVA/PEI hydrogel creates a very favorable aqueous environment for the enzyme. In addition, interactions between protonated amino groups of PEI and negative charges of both citrated AuNPs and thermolysin improve their dispersion in the polymer blend, favoring enzyme stabilization and accessibility to the substrate (OTA). The developed OTA biosensor was very reproducible and stable over a 30 days period when stored at 4◦C in 20 mM phosphate buffer between two measurements. The method was further evaluated using commercial doped olive oil samples. No pretreatment of the sample was needed for testing and no matrix effect was observed. Recovery values were close to 100%, demonstrating the suitability of the proposed method for OTA screening in olive oil

Ce travail de thèse a permis de décrire la contamination importante des grains du café de (Coffea canephora variété robusta) par des moisissures au cours des traitements post récolte des cerises de café par la voie sèche, dans une zone tropicale humide. La stratégie d’échantillonnage mise en place à consister à faire des prélèvements durant deux années successives (2008 et 2009) sur des sites localisés dans les principales zones de production du café en Côte d’Ivoire. A partir de 31 échantillons de cerises, grains et coques de café, 218 souches sauvages de moisissures ont été isolées sur milieu Potato Dextrose Agar (PDA) et identifiées. Ces champignons filamenteux sont répartis comme suit : Aspergillus section Nigri (52%) ; Aspergillus verts (13%), Penicillium (10%), Mucor (16%), Fusarium (4%), autre (5%). Les Aspergillus section Nigri qui comptent le complexe Aspergillus niger agreggate et Aspergillus carbonarius représentent un peu plus de la moitié de la population fongique soit 52%, soit 30% en 2008 et 70% en 2009, de la flore fongique totale. Ce groupe a fait l’objet d’une caractérisation morphologique. L’étude du potentiel mycotoxinogène des Aspergillus section Nigri isolées du café robusta a démontré qu’en plus de l’OTA, certaines souches d’Aspergillus Nigri produiraient de l’aflatoxine. Cependant l’espèce Aspergillus carbonarius reste la plus ochratoxinogène (0,6 µg et 15µg d’OTA/g de milieu gélosé). En plus des moisissures 44 souches de bactéries lactiques (LAB) ont été isolées à partir de la pulpe fraîche de café. Les caractères morphologiques, biochimiques et culturaux ont été étudiés. L’identification moléculaire des bactéries a permis de les classer dans le groupe de Lactobacillus plantarum sp. Après un criblage orienté, deux souches de LAB avec un effet important d’inhibition de croissance des moisissures mycotoxinogènes ont été sélectionnées. Les deux souches de Lactobacillus plantarum ont démontré une activité antifongique contre les souches d’Aspergillus carbonarius hautement ochratoxinogènes. Par conséquent la prévention de la mycotoxinogenèse sur café robusta, pourrait passer par l’inhibition de la croissance de certaines moisissures ochratoxinogènes. Les résultats acquis au cours de ce travail de thèse serviront de base afin de poursuivre cette étude d’une part avec des essais in situ pour tester l’efficacité des LAB sélectionnées et d’autre part, rechercher les biomolécules actives contre la germination des spores contaminants naturels post récolte en particulier des cerises de café en Côte d’Ivoire et des fruits et légumes en général. / One of the objectives of this thesis was to describe the significant contamination of robusta coffee beans (Coffea canephora) by moulds during the post-harvest processing of coffee cherries in the dry process. The sampling strategy was to take samples for two consecutive years (2008 and 2009) from different areas of coffee production in Ivory Coast and on the other hand, from the same area but from coffee producers using different methods of drying of coffee beans. From 31 samples, 218 wild strains of fungi were isolated on Potato Dextrose Agar (PDA) media and identified. These filamentous fungi were as follows: black Aspergilli (52%); green Aspergilli (13%), Penicillium (10%), Mucor (16%), Fusarium (4%) and others (5%). The black Aspergilli were found to include Aspergillus niger and Aspergillus carbonarius representing 52% of the fungal population, with a proportion of 30% in 2008 and 70% in 2009 of the total fungal flora. This group was selected to study more about their mycotoxin production. Most strains grown on media and at specific incubation conditions, were capable of producing one or more kinds of mycotoxins. Analysis of mycotoxins from fungi isolated from less than a hundred robusta coffee showed that ochratoxin A (OTA) was not the only mycotoxin that may contaminate the robusta coffee in Ivory Coast. Indeed, several strains belonging to the species Aspergillus Nigri group had shown their ability to produce not only ochratoxin A but also aflatoxin. However, the species A. carbonarius remains as the most ochratoxigenic strain but it does not produce aflatoxin.In parallel to the isolation of fungi, 44 strains of lactic acid bacteria (LAB) were also isolated from fresh coffee cherries, harvested in Ivory Coast in 2009. The morphological, biochemical and growth characteristics were studied. Molecular identification of strains ranked them to be in the group of Lactobacillus plantarum sp. After a screening experiment, it was possible to select two strains of LAB with a significant effect of inhibiting fungal growth by producing mycotoxins. The two strains of Lactobacillus plantarum showed antifungal activity against strains of Aspergillus carbonarius which is highly ochratoxigenic. Therefore the prevention of mycotoxigenicity of robusta coffee, could be rised by inhibiting the growth of certain ochratoxigenic fungi. The results achieved in this thesis serve as a basis to continue the study on one hand with field trials to test the effectiveness of selected LAB on the other hand, look for active biomolecules against spore germination of contaminants especially the natural post-harvest coffee beans in Ivory Coast and fruits and vegetables in general.

L’aflatoxine B1 (AFB1) et l’ochratoxine A (OTA) sont des mycotoxines pouvant contaminer une large variété de denrées alimentaires. L’ingestion d’aliments contaminés par des animaux d’élevage peut entraîner l’altération de leur santé et de leurs performances zootechniques ainsi qu’un problème de sécurité alimentaire lié à la présence de résidus de mycotoxines dans les produits animaux, notamment le lait. Des traitements de détoxication basés sur l’addition d’adsorbants organiques ont été développés pour fixer les mycotoxines dans le tube digestif et ainsi réduire l’exposition des animaux. L’objectif de ce travail de thèse était d’évaluer l’efficacité d’un adsorbant à base d’extraits de parois modifiées de levures (Mycosorb®) sur deux modèles animaux, le rat et la brebis. L’efficacité a été déterminée en réalisant un suivi des mycotoxines et/ou de leurs métabolites dans 3 matrices : l’excrétion urinaire et fécale et la cinétique sanguine. Sur les 2 modèles animaux, nous avons ainsi étudié les effets de l’apport en Mycosorb sur l’excrétion urinaire et fécale et la cinétique sanguine des 2 mycotoxines (AFB1 et OTA). Chez le rat, le suivi de la radioactivité a montré que les fèces d’animaux supplémentés en parois de levures contiennent significativement plus de mycotoxines. Cette augmentation de la radioactivité dans les fèces s’est accompagnée d’une diminution marquée de la radioactivité dans le sang et dans les urines. Chez la brebis laitière, en plus de ces paramètres, nous avons évalué l’effet de l’adsorbant sur les paramètres de production de l’animal et l’excrétion des mycotoxines dans le lait. L’addition de la paroi de levure a entraîné une augmentation significative de l’excrétion de l’AFB1 et de son métabolite, l’aflatoxine M1(AFM1) dans les fèces du ruminant. Cette augmentation de l’excrétion fécale s’accompagne de la réduction du taux d’AFM1 excrété dans l’urine mais pas dans le lait. Les effets observés chez les deux modèles expérimentaux semblent être liés à la séquestration des mycotoxines dans le tractus digestif des animaux et permettent de conclure à la capacité de l’adsorbant organique à réduire la biodisponibilité des mycotoxines testées. L’ajout de la paroi de levure pourrait, par conséquent, réduire les risques sanitaires chez les animaux d’élevage exposés à une alimentation contaminée par les mycotoxines. Cependant, nous n’avons pas observé d’effet sur la santé et les paramètres zootechniques des animaux dans les conditions expérimentales utilisées. / Aflatoxin B1 (AFB1) and Ochratoxin A (OTA) are mycotoxins that can be found in a large variety of feedstuffs. Consumption of contaminated feeds can affect the health and performances of farm animals and if transferred into animal products can be a problem for the safety of food. Different treatments of detoxication based on organic adsorbants addition have been developed to bind these mycotoxins in the digestive tract and thus to reduce exposure of animals. The objective of this work was to evaluate the efficacy of an adsorbent containing yeast cell wall extracts (Mycosorb®) in two animal models, the rat and the dairy ewe. The efficacy was determined by performing a monitoring of mycotoxins and/or theirs metabolites in 3 matrices : urinary and faecal excretion and blood kinetic. In both animal models, thus we have studied the effects of yeast cell walls on urinary and faecal excretion and blood kinetic of the 2 mycotoxins (AFB1 and OTA). Radioactivity analysis showed that faeces of animals supplemented with the adsorbent contained significantly more mycotoxins in rats. This increase of radioactivity in feces was associated with a marked decrease of radioactivity in blood and urine. In dairy ewes, in addition to these parameters, we have evaluated the effects of the adsorbent on the production parameters of animals and the excretion of mycotoxins in milk. The addition of yeast cell walls significantly increased the excretion of AFB1 and its metabolite, aflatoxin M1 (AFM1) in the faeces. This increase in fecal excretion was associated with a reduction of the excretion of AFM1 in urine but not in milk. The reduced absorption of AFB1 and OTA in both animal models could be associated with the capacity of the adsorbent to bind mycotoxins in the digestive tract. Addition of yeast cell wall extract could be a strategy to reduce sanitary risks in ruminants exposed to mycotoxins-contaminated feeds. However, we have not observed an effect on the health and the performances of animals in the experimental conditions used.

Aspergillus westerdijkiaem qui est récemment démembré d'A. ochraceus est un producteur principal de plusieurs composés de type polycétone d'importance économique. Ces composés incluent l’ochratoxin A, mellein, l'acide penicillique, asperlactone et l’isoasperlactone et quelques intermédiaires comme l'acide 6- methylsalicylique et l’acide orsellinique. La biosynthèse de ces métabolites est catalysée par un groupe d'enzymes connues comme la polycétone synthases (PKSs). Ce travail a été visé pour cloner et a caractérisé fonctionnellement les différentes genes des PKS i.e. aoks1, aolc35-12 et aomsas, et de genes de polyketide synthases-non ribosomal peptide synthase (PKS-NRPS) i.e. aolc35-6, chez A. westerdijkiae. Ces gènes ont été inactivés par l'insertion du gène d’hygromycine B phosphotransferase d’Escherichia coli dans le génome d'A. westerdijkiae, pour obtenir les mutantes ao?ks1, ao?lc35-12, ao?msas et ao?lc35-6. Les mutants ao?ks1 et ao?lc35-12 ont été trouvés déficients dans la biosynthèse d’ochratoxin A, mais produisaient encore mellein. À notre connaissance, c’est la première fois que nous avons caractérisé les gènes impliquées dans la biosynthèse d’OTA, sachant que mellein, qui était proposé dans la littérature comme un intermédiaire, joue a cune role dans la biosynthesis de l'OTA. Ensuite le mutant ao?msas n'a pas seulement perdu la capacité de produire isoasperlactone et asperlactone, mais aussi il ne produit pas l’intermédiaire acide 6-methylsalicylique. Basé sur les expériences de la caractérisation génétique et de complémentation chimiques, nous avons proposé un shéma hypothétique de la biosynthèse d’asperlactone et isoasperlactone dans lequel l'acide 6-methylsalicylique, diepoxide et aspyrone jouent le rôle d’intermédiaires. La techniques de gène knock-out et de la reverse transcription PCR (RT-PCR) ont montré que seulle gène de type PKS-NRPS « aolc35-6 » identifié chez A. westerdijkiae codant pour un intermédiaire inconnu(s) qui pourrait inciter l'expression de gène aomsas et un gène impliqué dans la biosynthèse d'acide orsellinique et d'acide penicillique. / Aspergillus westerdijkiaem which is recently dismembered from A. ochraceusm is the principal producer of several economically important polyketide metabolites. These metabolites include ochratoxin A, mellein, penicillic acid, asperlactone and isoasperlactone and some intermediates like orsellinic acid and 6-methylsalicylic acid. The biosynthesis of these metabolites is catalyzed by a group of enzymes known as polyketide synthases (PKSs). This work was aimed to clone and functionally characterized various PKS i.e. aoks1, aolc35-12 and aomsas, and polyketide synthasesnon ribosomal peptide synthase (PKS-NRPS) genes i.e. aolc35-6, in A. westerdijkiae. These genes were inactivated by the insertion of Escherichia coli hygromycin B phosphotransferase gene in the genome of A. westerdijkiae to obtain ao?ks1, ao?lc35-12, ao?msas and ao?lc35-6 mutants. ao?ks1, ao?lc35-12 mutants were found deficient in ochratoxin A biosynthesis but are still producing mellein. To our knowledge, we for the first time characterized a gene involved in OTA biosynthesis, with the information about mellein which was proposed in the literature to be an intermediate OTA. Further ao?msas mutant not only lost the capacity to produce isoasperlactone and asperlactone but also the intermediate nature product 6-methylsalicylic acid. Based on the genetic characterization and chemical complementation experiments, we have proposed a hypothetical pathway mentioning that 6-methylsalicylic acid, diepoxid and aspyrone are intermediates of isoasperlactone and asperlactone. Gene knockout technique and reverse transcription PCR (RT-PCR) shown that the only PKS-NRPS gene aolc35-6 so far identified in A. westerdijkiae encoding certain unknown intermediate(s) which induces the expression of aomsas gene and a gene involved in the biosynthesis of orsellinic acid and penicillic acid.