Introduction : La prévention de la mort de cellules cardiaques contractiles suite à un épisode d'infarctus du myocarde représente le plus grand défi dans la récupération de la fonction cardiaque. On a démontré à maintes reprises que l'ocytocine (OT), l'hormone bien connue pour ses rôles dans le comportement social et reproductif et couramment utilisée dans l’induction de l’accouchement, diminue la taille de l'infarctus et améliore la récupération fonctionnelle du myocarde blessé. Les mécanismes de cette protection ne sont pas totalement compris. Objectif : Étudier les effets d'un traitement avec de l'ocytocine sur des cardiomyocytes isolés en utilisant un modèle in vitro qui simule les conditions d'un infarctus du myocarde. Méthodes : La lignée cellulaire myoblastique H9c2 a été utilisée comme modèle de cardiomyocyte. Pour simuler le dommage d'ischémie-reperfusion (IR), les cellules ont été placées dans un tampon ischémique et incubées dans une chambre anoxique pendant 2 heures. La reperfusion a été accomplie par la restauration du milieu de culture régulier dans des conditions normales d'oxygène. L'OT a été administrée en présence ou en absence d'inhibiteurs de kinases connues pour être impliquées dans la cardioprotection. La mortalité cellulaire a été évaluée par TUNEL et l'activité mitochondriale par la production de formazan pendant 1 à 4 heures de reperfusion. La microscopie confocale a servie pour localiser les structures cellulaires. Résultats : Le modèle expérimental de l'IR dans les cellules H9c2 a été caractérisé par une diminution dans la production de formazan (aux alentours de 50 à 70 % du groupe témoin, p < 0.001) et par l'augmentation du nombre de noyaux TUNEL-positif (11.7 ± 4.5% contre 1.3 ± 0.7% pour le contrôle). L'addition de l'OT (10-7 a 10-9 M) au commencement de la reperfusion a inversé les effets de l'IR jusqu'aux niveaux du contrôle (p < 0.001). L'effet protecteur de l'OT a été abrogé par : i) un antagoniste de l'OT ; ii) le knockdown de l'expression du récepteur à l'OT induit par le siRNA ; iii) la wortmannin, l'inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinases ; iv) KT5823, l'inhibiteur de la protéine kinase dépendante du cGMP (PKG); v) l'ODQ, un inhibiteur du guanylate cyclase (GC) soluble, et A71915, un antagoniste du GC membranaire. L'analyse confocale des cellules traitées avec OT a révélé la translocation du récepteur à l'OT et la forme phosphorylée de l'Akt (Thr 308, p-Akt) dans le noyau et dans les mitochondries. Conclusions : L'OT protège directement la viabilité des cardiomyocytes, lorsqu'elle est administrée au début de la reperfusion, par le déclenchement de la signalisation du PI3K, la phosphorylation de l'Akt et son trafic cellulaire. La cytoprotection médiée par l'OT implique la production de cGMP par les deux formes de GC. / Introduction: The prevention of the death of contractile cardiac cells following an episode of myocardial infarction represents the largest challenge in the recovery of myocardial function. Oxytocin, the hormone best known for its roles in reproduction and social behaviour and used commonly for the induction of parturition, has been repeatedly demonstrated to decrease the infarct size and to ameliorate the functional recovery of the injured myocardium. The mechanisms for this protection are incompletely understood. Objective: To study the effects of oxytocin treatment on isolated cardiomyocytes using an in vitro model simulating the conditions of a myocardial infarction. Methods: The cardiomyoblastic cell line H9c2 was used as a model of cardiomyocyte. For IR injury, the cells were placed in ischemic buffer and incubated in an anoxic chamber for 2 hours. Reperfusion was achieved by restoring cell media under normoxic conditions. OT was administered in the presence or absence of enzyme inhibitors. Cell death was evaluated by TUNEL and mitochondrial activity by formazan production during 1-4 hours of reperfusion. Confocal microscopy served for localization of cell structures. Results. The experimental model of IR in H9c2 cells was characterized by decreased formazan production (at the range of 50-70% of normoxic control, p < 0.001) and by the increased number of TUNEL-positive nuclei (11.7±4.5 vs. 1.3±0.7% in normoxic control). The addition of OT (10-7 to 10-9 M) at the onset of reperfusion reversed the effects of IR to the control levels (p < 0.001). The protective effect of OT was abrogated by: i) an OT antagonist, OTA and siRNA-mediated OT receptor knockout; ii) the phosphatidylinositol 3-kinases inhibitor wortmannin; iii) the cGMP-dependent protein kinase (PKG) inhibitor, KT5823. Soluble guanylate cyclase (GC) inhibitor ODQ and particulate GC antagonist A71915 only partially blocked the protective effects of OT. Confocal analysis of OT-treated cells revealed translocation of OT receptor and the phosphorylated form of Akt (Thr 308, p-Akt) into the nucleus and mitochondria. Conclusions: OT directly protects cardiomyocyte viability if administered at the onset of reperfusion by triggering signaling of Pi3K, Akt phosphorylation and its cellular trafficking. OT-mediated cytoprotection involves cGMP production by both forms of GC.

Les récepteurs couplés aux protéines G forment une grande famille de récepteurs transmembranaires. De nombreuses études montrent que ces récepteurs présenteraient une tendance à interagir entre eux et à former des oligomères. Ces structures sont toutefois sujettes à controverse. En effet, très peu d'éléments permettent d'affirmer que ces oligomères existeraient dans les tissus natifs, la plupart des caractérisations se faisant en systèmes hétérologues. Nous avons donc développé une approche basée d'une part sur l'utilisation de ligands fluorescents pour marquer les récepteurs dans leur environnement natif et d'autre part sur le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) en temps résolu en utilisant des cryptates de lanthanides, en particulier le Lumi4-Tb. Nous avons ainsi pu montrer et publier l'existence d'oligomères du récepteur de l'ocytocine dans la glande mammaire. Le protocole de cette étude a aussi été publié et a été validé pour la mise en évidence d'hétéro-oligomères, plus précisément entre les récepteurs V1a et V2 de la vasopressine. La poursuite de l'étude de ce phénomène dans les tissus natifs nous a poussés à développer notre propre dispositif de microscopie FRET en temps résolu. Ce dispositif est basé sur un microscope en champ large auquel nous avons ajouté une source laser pour l'excitation pulsée et une caméra CCD Multigate pour la détection. Nous en présentons ici les premiers résultats ainsi que sa validation pour l'utilisation de multiples fluorophores accepteurs avec une contamination minimale par le Lumi4-Tb. Enfin, nous proposons un modèle pharmacologique montrant l'utilisation de ligands bivalents pour étudier le couplage des oligomères. / G-protein coupled receptors form a very large family of transmembrane receptors. Numerous studies have shown that these receptors showed a tendency to interact and form oligomers. These structures are however the matter of great debate. Indeed, very few elements allow us to maintain that these oligomers could exist in native tissues, most studies being carried out in heterologous systems. We have therefore developed an approach based for one part on the use of fluorescent ligands to label receptors in their native environment, and on the other part on time-resolved FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) by using lanthanide cryptates, more specifically Lumi4-Tb. We have thus been able to show and publish the existence of oxytocin receptor oligomers in the mammary gland. The protocol used for this study was also published and validated for the study of hetero-oligomers, more specifically between vasopressin V1a and V2 receptors. Following on our study of oligomers in native tissues, we have developed our own setup to perform time-resolved FRET microscopy. This setup is based on a wide field microscope to which we added a laser source for the pulsed excitation and a Multigate CCD camera for imaging. We are here presenting the first results as well as its validation for the use of multiple acceptor fluorophores with minimal bleed through from the Lumi4-Tb. Lastly, we propose a pharmacological model showing the use of bivalent ligands to study oligomer coupling.

Le Syndrome de Prader Willi (SPW) est une pathologie neurodéveloppementale d’origine génétique présentant un tableau clinique complexe et évoluant avec l’âge.Elle est caractérisée par des déficits sensori-moteurs présents dès la naissance se manifestant par une hypotonie, une absence du réflexe de succion et des troubles respiratoires incluant des apnées obstructives et centrales constituant la première cause de mortalité. Les patients présentent un certain degré d’altération cognitive et un déficit de comportement associé aux troubles du spectre autistique (TSA). Des déficits sensoriels, se manifestent dès la naissance et sont caractérisés par un seuil élevé à la douleur, une altération de la thermosensibilité et de la thermorégulation se manifestant par des épisodes d’hyper- ou d’hypothermie pouvant être fatals chez le nourrisson. Ces déficits sont une caractéristique fondamentale du diagnostic des TSA et sont retrouvées chez 90% des patients autistes. Mon travail de thèse a consisté à étudier la physiopathologie de la fonction respiratoire et la thermosensibilité néonatales et leur altération dans la pathologie neurodéveloppementale. Ces études ont été rendues possibles grâce à l’utilisation de deux modèles murins:les Ndn-/- et Ml2+/-p.Ndn est impliqué dans le SPW et l’étude des souris Ndn-/-,a permis de décrypter l’origine des déficits sérotoninergiques responsables des troubles respiratoires.Ml2,est impliqué dans le SPW et le syndrome de Schaaf Yang (SSY) et l’investigation des souris Ml2+/-p a mis en évidence l’existence d’un déficit de thermosensibilité néonatale et démontré l’implication du système ocytocinergique dans la modulation de cette fonction sensorielle. / Prader Willi Syndrome (PWS) is a neurodevelopemental genetic disease with a symptomatology which evolves with age. This pathology is mainly characterized by sensory motor defects at birth such as severe infantile hypotonia with poor suck and failure to thrive and respiratory disturbances including both obstructive and central sleep apnea which represent the most common cause of death. PWS patients also have some cognitive impairment and behavioral disturbances, overlapping with autism spectrum disorder (ASD). Sensory deficits, are already present at birth and are characterized by high pain threshold and a defect in thermosensibility and thermoregulation manifested by episode of hypo- or hyperthermia which can be fatal in newborns. Moreover, these deficits are a core aspect of ASD affecting 90 % of children. My thesis work consisted in studying the pathophysiology of respiratory function during the early postnatal stages as well as neonatal thermosensitivity and its alteration in neurodevelopmental pathology. These studies were made possible by the use of two mouse models: Ndn-/- and Magel2+/-p mice. Ndn is involved in PWS and summarizing the respiratory disorders found in patients. Ml2 is involved in both SPW and Schaaf Yang syndrome (SYS), a recently discovered pathology overlapping with ASD. Ndn-/-mice allowed me to decipher the underlying mechanism behind the serotonin deficits responsible for respiratory disorders, thus allowing me to develop an effective therapeutic strategy. The investigation of Ml2+/-p mice revealed neonatal cool sensitivity deficit and demonstrated the involvement of the oxytocinergic system in the modulation of this sensory function.

Introduction : La prévention de la mort de cellules cardiaques contractiles suite à un épisode d'infarctus du myocarde représente le plus grand défi dans la récupération de la fonction cardiaque. On a démontré à maintes reprises que l'ocytocine (OT), l'hormone bien connue pour ses rôles dans le comportement social et reproductif et couramment utilisée dans l’induction de l’accouchement, diminue la taille de l'infarctus et améliore la récupération fonctionnelle du myocarde blessé. Les mécanismes de cette protection ne sont pas totalement compris. Objectif : Étudier les effets d'un traitement avec de l'ocytocine sur des cardiomyocytes isolés en utilisant un modèle in vitro qui simule les conditions d'un infarctus du myocarde. Méthodes : La lignée cellulaire myoblastique H9c2 a été utilisée comme modèle de cardiomyocyte. Pour simuler le dommage d'ischémie-reperfusion (IR), les cellules ont été placées dans un tampon ischémique et incubées dans une chambre anoxique pendant 2 heures. La reperfusion a été accomplie par la restauration du milieu de culture régulier dans des conditions normales d'oxygène. L'OT a été administrée en présence ou en absence d'inhibiteurs de kinases connues pour être impliquées dans la cardioprotection. La mortalité cellulaire a été évaluée par TUNEL et l'activité mitochondriale par la production de formazan pendant 1 à 4 heures de reperfusion. La microscopie confocale a servie pour localiser les structures cellulaires. Résultats : Le modèle expérimental de l'IR dans les cellules H9c2 a été caractérisé par une diminution dans la production de formazan (aux alentours de 50 à 70 % du groupe témoin, p < 0.001) et par l'augmentation du nombre de noyaux TUNEL-positif (11.7 ± 4.5% contre 1.3 ± 0.7% pour le contrôle). L'addition de l'OT (10-7 a 10-9 M) au commencement de la reperfusion a inversé les effets de l'IR jusqu'aux niveaux du contrôle (p < 0.001). L'effet protecteur de l'OT a été abrogé par : i) un antagoniste de l'OT ; ii) le knockdown de l'expression du récepteur à l'OT induit par le siRNA ; iii) la wortmannin, l'inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinases ; iv) KT5823, l'inhibiteur de la protéine kinase dépendante du cGMP (PKG); v) l'ODQ, un inhibiteur du guanylate cyclase (GC) soluble, et A71915, un antagoniste du GC membranaire. L'analyse confocale des cellules traitées avec OT a révélé la translocation du récepteur à l'OT et la forme phosphorylée de l'Akt (Thr 308, p-Akt) dans le noyau et dans les mitochondries. Conclusions : L'OT protège directement la viabilité des cardiomyocytes, lorsqu'elle est administrée au début de la reperfusion, par le déclenchement de la signalisation du PI3K, la phosphorylation de l'Akt et son trafic cellulaire. La cytoprotection médiée par l'OT implique la production de cGMP par les deux formes de GC. / Introduction: The prevention of the death of contractile cardiac cells following an episode of myocardial infarction represents the largest challenge in the recovery of myocardial function. Oxytocin, the hormone best known for its roles in reproduction and social behaviour and used commonly for the induction of parturition, has been repeatedly demonstrated to decrease the infarct size and to ameliorate the functional recovery of the injured myocardium. The mechanisms for this protection are incompletely understood. Objective: To study the effects of oxytocin treatment on isolated cardiomyocytes using an in vitro model simulating the conditions of a myocardial infarction. Methods: The cardiomyoblastic cell line H9c2 was used as a model of cardiomyocyte. For IR injury, the cells were placed in ischemic buffer and incubated in an anoxic chamber for 2 hours. Reperfusion was achieved by restoring cell media under normoxic conditions. OT was administered in the presence or absence of enzyme inhibitors. Cell death was evaluated by TUNEL and mitochondrial activity by formazan production during 1-4 hours of reperfusion. Confocal microscopy served for localization of cell structures. Results. The experimental model of IR in H9c2 cells was characterized by decreased formazan production (at the range of 50-70% of normoxic control, p < 0.001) and by the increased number of TUNEL-positive nuclei (11.7±4.5 vs. 1.3±0.7% in normoxic control). The addition of OT (10-7 to 10-9 M) at the onset of reperfusion reversed the effects of IR to the control levels (p < 0.001). The protective effect of OT was abrogated by: i) an OT antagonist, OTA and siRNA-mediated OT receptor knockout; ii) the phosphatidylinositol 3-kinases inhibitor wortmannin; iii) the cGMP-dependent protein kinase (PKG) inhibitor, KT5823. Soluble guanylate cyclase (GC) inhibitor ODQ and particulate GC antagonist A71915 only partially blocked the protective effects of OT. Confocal analysis of OT-treated cells revealed translocation of OT receptor and the phosphorylated form of Akt (Thr 308, p-Akt) into the nucleus and mitochondria. Conclusions: OT directly protects cardiomyocyte viability if administered at the onset of reperfusion by triggering signaling of Pi3K, Akt phosphorylation and its cellular trafficking. OT-mediated cytoprotection involves cGMP production by both forms of GC.

Chez les mammifères, l'attachement pour la mère, est caractérisé par un effet sécurisant de la présence de cette figure qui permet au jeune d'explorer son environnement. Plusieurs études ont suggéré qu’un attachement pouvait se développer pour des substituts maternels tels qu’un congénère ou un objet. Cette thèse sur l'agneau montre, au travers de l'évaluation des caractéristiques de l'attachement, l'absence d'un tel lien en absence de figure maternelle pour un congénère de même âge ou un objet. L'altération de l'attachement chez ces individus est associée à une modification de l'axe corticotrope (HPA) et du système ocytocinergique : les agneaux élevés en absence de figure maternelle montrent un stress accru à 24 heures de vie, traduit au niveau central par une réduction du nombre de neurones contenant de la corticolibérine et une augmentation de ceux contenant l'ocytocine à 21 jours. Cette étude suggère un rôle apaisant de la figure maternelle pouvant faciliter la mise en place de l'attachement et influençant le développement de l'axe HPA. Ce travail suggère par ailleurs l'implication de l'ocytocine dans l'adaptation du jeune à un contexte social stressant. / In mammals, attachment to the mother is characterized by a secure effect of the presence of such figure which allows the young to explore its environment. Several studies have suggested that attachment bond could develop for mother surrogates such as peers or objects. This thesis shows through the evaluation of attachment key features in lambs, the absence of attachment in motherless lambs for a same-aged peer or an object. The alteration of attachment in these individuals is associated with a modification of the hypothalamic-pituitaryadrenal (HPA) axis and the oxytocinergic system: peer- and object-reared lambs show physiological sign of stress 24h after birth, reflected at the central level by a decrease of the number of neurons containing corticoliberin and increase of those containing oxytocin at 21 days of age. This study suggests a soothing effect of the mother figure that could facilitate the establishment of attachment and influence the development of the HPA axis. This work also suggests the involvement of oxytocin in the young to cope with stressful early social context.

Le lait est produit par les cellules épithéliales mammaires (CEM). La quantité de lait produit est déterminée par le nombre de CEM et leur activité métabolique. Le nombre de CEM dépend de l’équilibre entre la prolifération cellulaire et l’apoptose. Le processus d’exfoliation, défini comme le décrochage des CEM de l’épithélium mammaire et leur évacuation dans le lait, a été proposé comme participant aussi à la régulation du nombre de CEM. Les objectifs de cette thèse étaient d’identifier les mécanismes biologiques impliqués dans la régulation de ce processus et d’étudier son rôle dans la régulation du nombre de CEM et son influence sur la production laitière. Nos résultats montrent qu’une partie des CEM est exfoliée entre deux traites consécutives.Cependant, la majorité des CEM sont exfoliées au moment de la traite suite à la contraction des cellules myoépithéliales et à la perte d’intégrité de l’épithélium induites par la décharge d’ocytocine. Le cortisol, au contraire, participerait à la restauration de l’intégrité de l’épithélium mammaire après la fin de la traite et limiterait l’exfoliation. Nous avons montré que les variations du taux d’exfoliation étaient opposées aux variations de production laitière dans le cas d’une restriction alimentaire et après la fin d’un traitement à l’hormone de croissance mais pas dans le cas d’un changement de fourrage, de l’inhibition de la prolactine et pendant un traitement à l’hormone de croissance. Le processus d’exfoliation des CEM participe donc à la régulation de la production laitière mais pas de façon systématique. / Milk is synthesized by mammary epithelial cells (MEC). Milk yield is determined by the number of MEC in the mammary gland and the metabolic activity of these cells. It is well known that MEC number depends on the balance between cell proliferation and apoptosis. The MEC exfoliation process, defined as the shedding of MEC from the mammary epithelium into milk, is another process that might participate in the regulation of MEC number in the udder and thus in milk yield variations. The aims of this thesis were to identify the mechanisms that regulate the exfoliation process and to study the potential role of this process in regulating the number of MEC and milk yield.Our results showed that some MEC are exfoliated between milkings. Most of the MEC are, however, exfoliated during milking as a consequence of the myoepithelial cell contraction and the disruption of mammary epithelium integrity, both of which are caused by milking-induced oxytocin release. Cortisol may play a role in limiting MEC exfoliation by restoring mammary epithelium integrity after milking. We showed that the exfoliation process participates in regulating milk yield during feed restriction and after a treatment with bovine growth hormone but did not participate in regulating milk yield when forage in the ration was changed, when prolactin secretion was inhibited, or during a treatment with bovine growth hormone. These results suggest that the MEC exfoliation process likely participates in regulating milk yield but not systematically.

La neurohormone ocytocine (OT) est de plus en plus étudiée pour son potentiel thérapeutique dans les troubles du comportement social, comme l'autisme, qui sont associés à une dérégulation de plusieurs systèmes de neurotransmission, notamment l'OT et la sérotonine (5-HT). Dans ce cadre, une étape importante afin de développer des médicaments basés sur des mécanismes biologiques est de caractériser les interactions entre l'OT et les autres neurotransmetteurs. La littérature sur les rongeurs montre que la relation entre OT et 5-HT est fortement impliquée dans plusieurs aspects du comportement social. Par ailleurs, nous avons récemment montré chez le sujet sain que le fonctionnement du récepteur 5-HT 1A (5-HT1AR) est modifié suite à l'administration d'OT.neuroJ'ai donc réalisé une première expérience chez des patients autistes en utilisant le scanner TEP avec le radiotraceur [18F]MPPF (spécifique du 5-HT1AR). Aucune différence n'est apparue, à l'état basal, entre 18 patients autistes et 24 sujets contrôles. Par ailleurs, l'OT n'a pas modifié le système 5-HT1AR. Enfin, alors qu'une corrélation entre la densité de 5-HT1AR et le volume de matière grise du striatum a été observé dans le groupe contrôle, cette relation était absente dans le groupe de patients. Ces résultats suggèrent une altération subtile du 5-HT1AR, ne pouvant être détectée qu'au niveau fonctionnel.Parce que le scanner TEP ne permet pas de dire si les changements observés sont dus à une libération de sérotonine ou à une modification directe du récepteur, j'ai réalisé une deuxième expérience chez 3 macaques rhésus, avec le [18F]MPPF et le [11C]DASB (marquant le transporteur de la 5-HT). Par rapport au placebo, l'OT injectée dans le ventricule latéral a significativement augmenté la liaison du [18F]MPPF dans l'amygdale et l'insula tandis que la liaison du [11C]DASB diminuait dans ces mêmes régions. Ainsi, nous pouvons dire que l'OT a provoqué la libération de 5-HT ainsi qu'une modification du 5-HT1AR dans ces régions importantes pour les comportements socio-émotionnels. Une étude par autoradiographie a confirmé cette interprétation.Ces expériences montrent qu'il existe une action régulatrice de l'OT sur la 5-HT chez le primate, mais que ce mécanisme est dérégulé chez les patients avec autisme. Cela ouvre donc la voie à l'investigation de traitements combinés exerçant un effet sur ces deux neurotransmetteurs / The neurohormone oxytocin (OT) is increasingly studied for its therapeutic potential in social disorders, like autism, which are associated with the deregulation of several neurotransmission systems, including OT and serotonin (5-HT). Hence investigating OT’s interactions with other neurotransmitters is a relevant step towards mechanism-based treatments. Studies in rodents demonstrated that the interaction between OT and 5-HT, is critical for several aspects of social behaviour. Moreover, using PET-scan in humans we have recently found that 5-HT 1A receptor (5-HT1AR) function is modified after intra-nasal oxytocin intake. Thus I performed a first experiment in which intra-nasal OT was administered to patients with autism undergoing a [18F]MPPF (a 5-HT1AR radiotracer) PET scanner, in order to study their basal serotonergic system and to look if the oxytocin modulates the 5-HT1AR system. I found no differences of baseline 5-HT1AR concentration between 18 autistic subjects and 24 controls. Critically, in patients, OT did not induce changes on the 5-HT1AR system. Moreover, in controls, there was a correlation between 5-HT1AR and grey matter volume in the striatum, that was not observed in patients. These results suggest a subtle disruption of patients’ serotonergic system, that can only be seen at the functional level. Because PET scan does not tell us if the observed modification is due to a change in 5-HT1AR or 5-HT concentration, I performed a second PET scan experiment on 3 macaque monkeys, using [18F]MPPF and [11C]DASB, that marks the serotonin transporter. Compared to placebo, OT injections in the lateral ventricle significantly reduced [11C]DASB binding potential in right amygdala, insula and hippocampus whereas [18F]MPPF binding potential increased in right amygdala and insula. Thus we reproduced results obtained in healthy humans and extended it by suggesting that OT provokes the release of 5-HT in key limbic regions involved in socio-emotional processing. These results were confirmed with autoradiography.Taken together, these experiments indicate that OT modulates 5-HT release in primates, but this mechanism is disrupted in patients with autism. This opens ways to investigate combined OT/5-HT treatments, especially since FDA approved drugs targeting the two systems are already available for use in patients with autism

réalisé avec la codirection de Marek Jankowski / Introduction: L’ocytocine (OT) était connue pour ses effets lors de la parturition et de la lactation. Depuis quelques années, d’autres rôles de l’OT ont été proposés. Ainsi, la découverte de l’OT et de son récepteur (OTR) dans le cœur a suggéré le rôle fonctionnel de cette hormone dans cet organe. Aujourd’hui, il existe une controverse concernant l’implication de l’OT dans la régulation de la pression artérielle (PA). Des études additionnelles sont donc requises pour préciser le rôle de l’OT dans le contrôle de la PA. C’est dans ce cadre que se situe la présente étude. Méthodes: Deux types d’expériences ont été faites: Une pour l’étude des paramètres métaboliques et l’autre pour les paramètres cardiovasculaires. Pour la première, l’OT (0.04 mg/kg) a été testée pour son effet métabolique. Les rats SD sont injectés avec l’OT et immédiatement placés dans des cages métaboliques individuelles et adaptées pour recueillir les urines. Les urines recueillies sur 3 heures nous ont permis de mesurer la diurèse, la natriurèse et la kaliurèse chez les rats. Pour le 2ème type, des rats spontanément hypertendus (SHR) et des Sprague-Dawley (SD) ont subi une chirurgie pour l’implantation de la sonde de télémétrie. Après 10 jours de récupération, nous avons commencé l’expérience qui s’est déroulée en 2 séries: la série des injections intraveineuses (i.v.) (0.04, 0.08, 0.1, 0.2 et 0.4 mg/kg en une seule injection) et la série des injections sous-cutanées (s.c.) (0.5 et 1 mg/kg/jour pendant 5 jours d’injection). La pression artérielle (PA), la fréquence cardiaque (FC) et de l’activité des rats ont été mesurées continuellement pendant toute l’expérience. Résultats: En i.v. la plus petite dose d’OT (0.04 mg/kg/0.3 ml) utilisée pour les effets rénaux a amené une diurèse significative, montre une tendance de natriurèse et de diminution de kaliurèse. Cette dose et celle d’OT (0.08 mg⁄kg⁄0.3 ml) sont sans effets sur la PA mais diminuent la FC des SHR et des SD (seulement les nuits). Pour les doses élevées en i.v. (0.1, 0.2 et 0.4 mg/kg d’OT), à l’exception de l’effet vasopresseur transitoire observé avec OT 0.4 mg/kg chez SD, l’OT 0.1 et 0.2 mg/kg ont diminué la PA. Les doses (0.2 et 0.4 mg/kg) d’OT ont diminué la PA chez les SHR. Elles ont augmenté la FC en journée aussi bien chez les SD que chez les SHR pendant que 0.1 mg/kg l’a diminuée. Pendant les nuits, c’est seulement la dose de 0.4 mg/kg qui a un effet sur la FC qu’elle diminue aussi bien chez les SD que les SHR. Les doses de 0.5 et 1 mg/kg injectées en s.c. ont diminué significativement la PA chez les SHR. Mais, chez les SD c’est l’OT à la dose de 1 mg/kg qui a amené une baisse de PA. À l’exception de OT 0.5 mg/kg/jour qui a augmenté la FC et l’activité chez les SHR en journée et ce au cours des injections, l’OT en s.c. a également entraîné une diminution de la FC et de l’activité. Conclusion: Ces résultats démontrent que l’OT intervient dans la régulation de la PA et la FC et les effets de l’OT dépendent de la souche de rats, de la dose, de la voie d’administration et du moment d’enregistrement des paramètres cardiovasculaires (jour ou nuit). Parlant de dépendance des résultats en fonction des voies d’administration, force est de signaler qu’avec les injections s.c. l’effet hypotenseur de l’OT est puissant et sans équivoque. Cela serait dû au fait que la duré de vie de l’OT est très courte (5 à 10 minutes) quand elle entre dans le sang. Ainsi, contrairement à la voie i.v., l’efficacité de l’OT en s.c. résulterait de sa libération lente dans le sang et donc toute la quantité administrée en s.c. ne se dégrade pas d’un seul coup. / Introduction: Oxytocin (OT) is known for its effects during parturition and lactation. In recent years, new roles of OT have been brought to light. Thus, the discovery of OT and its receptors (OTR) in the heart suggest a functional role in the body. Nowadays, the involvement of OT in blood pressure (BP) regulation is still controversial. Additional studies are therefore required to accurately determine the role of OT in the control of BP. Methods: Two types of experiments were carried out: Diuretic effect: conscious male, Sprague-Dawley rats were administered OT intravenously (0.04 mg/kg) and immediately placed in metabolic and individual cage; urine was collected and measured every hour for 3 hours. Urine measurement allowed diuresis, natriuresis and kaliuresis to be determined Telemetry: telemetry implants and catheters were inserted into the abdominal aorta of spontaneously hypertensive (SHR) and Sprague-Dawley (SD) rats. After 10 days (of necessary recovery), heart rate (HR), BP and animal locomotor activities were measured continuously. The same experiment was done on two batches of rats. Different doses of OT: 0.04; 0.08; 0.1, 0.2 or 0.4 mg/kg were injected once by intravenous (i.v) route. After each injection, we waited for the normalization of BP and HR before the next dose. Further more, 5 consecutive injections of OT were made (0.5 and 1 mg/kg) subcutaneously (s.c.). Results: The dose of 0.04 mg/kg of OT administrated for renal effects led to significant diuresis, a tendancy in natriuresis and kaliuresis decreased with no effect on BP. That dose as well as 0.08 mg/kg decreased HR in SHR and SD rats (only in the night). Whereas the highest doses in i.v. (0.1, 0.2 et 0.4 mg/kg d’OT), except a transient vasopressor effect observed with the OT 0.4 mg/kg in SD rats, OT 0.1 and 0.2 mg/kg decreased BP. OT 0.2 and 0.4 mg/kg decreased BP in SHR but increased HR during the days in both strains. The dose of 0.4 mg/kg led to a decrease of HR in SHR and in SD rats. The s.c. injections (0.5 and 1 mg/kg) of OT led to a significant decrease in BP in SHR, whereas in SD rats the lowering was only significant with a dose OT 1 mg/kg. HR significantly decreased in both strain with 1 mg/kg, whereas with 0.5 mg/kg, HR increased in SHR only and during the day. Conclusion: These results demonstrate that oxytocin acts on blood pressure and heart rate depending on strain, dose and route of administration. It’s important to point out that with s.c. injections the hypotensive effect of OT is powerful and unequivocal. This is probably because OT administered s.c. is slowly released into the bloodstream. Therefore the entire amount administered s.c. does not degrade at once and leads to the effectiveness of s.c. results.

L’ocytocine (OT) est un neuropeptide synthétisé au sein de l’hypothalamus. On sait aujourd’hui que l’OT est fortement impliquée dans la modulation de nombreux comportements et émotions. Pourtant, il reste encore difficile d’expliquer comment s’organise le système ocytocinergique, par exemple en sous-ensembles spécifiques. De même, les circuits neuronaux impliqués dans leur recrutement restent obscures, tout comme leur potentielle plasticité. C’est pourquoi, au cours de ma thèse, je me suis attachée à mieux comprendre ces différents points. Les résultats obtenus ont montré que i) un sous-ensemble spécifique de neurones OT est recruté par la peur ; ii) le système OT fait preuve d’une grande plasticité après une exposition à un contexte effrayant ; iii) le neuropeptide S est capable de recruter une sous-population de neurones OT afin d’exercer une action anxiolytique ; iv) les neurotransmetteurs monoaminergiques sont eux-mêmes capables de recruter différents sous-ensembles de neurones OT. En conclusion, mon travail a mis en évidence la plasticité de ce système peptidergique et différentes manières de recruter de manière spécifiques certains sous-ensembles existants de neurones OT. / Oxytocin (OT) is a peptide synthesized within the hypothalamus. We now know that OT is strongly involved in the modulation of many behaviors and emotions. However, it is still difficult to explain how the oxytocinergic system is organized, for example in specific sub-populations. Similarly, the neuronal circuits involved in their recruitment remain obscure, like their potential plasticity. That is why, during my thesis, I tried to better understand these different points. The results obtained showed that i) a specific sub-population of OT neurons is recruited by fear; ii) the OT system exhibits great plasticity after exposure to a scary context; iii) the neuropeptide S is able to recruit an OT neuron sub-population in order to exert an anxiolytic effect; iv) monoaminergic neurotransmitters are themselves able to recruit different sub-populations of OT neurons. In conclusion, my work has highlighted the plasticity of this peptidergic system and different ways to recruit in a specific manner some existing sub-populations of OT neurons.

Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP. Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western. Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels. Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire. / Traditionally associated with female reproduction, oxytocin (OT), a peptidic hormone synthesized in the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothalamus and secreted by the posterior pituitary (neurohypophysis), was revisited recently and was revealed to have several new roles in the cardiovascular system. Indeed, our laboratory has shown that OT can induce the differentiation of embryonic stem cells (ESC) into functional cardiomyocytes (CM). On the model of embryonal carcinoma cell line P19, it has been shown that this process occurs following the release of cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent nitric oxide. Similarly, it is known that atrial natriuretic peptide (ANP), a peptide produced, stored and secreted by cardiac myocytes, can also induce the release of cGMP. However, the cellular mechanisms involved in cardiac differentiation are still poorly understood. Numerous studies have shown that the injured heart can be regenerated from an isolated population of transplanted stem and progenitor cells. One of these cell populations, frequently isolated from embryonic and adult animal organs, called "Side Population" (SP), is characterized by active efflux of the fluorescent dye Hoechst 33342 (Ho). SP cells express specific ATP-binding cassette transporter proteins which actively transport Ho out of their cytoplasm. The SP cell subpopulation isolated from the heart display enhanced differentiation potential into cardiac phenotype in response to OT treatment. Recently, the phenotypic and functional heterogeneity of embryonic stem cells has been demonstrated, and this was correlated with the presence of cell subpopulations much like the SP cells from the heart and these cells can be identified by flow cytometry (FACS) as a population of unmarked cells by the Ho and which exhibit sensitivity to the inhibitor of the family of ATP-binding cassette ABC, verapamil. Thus, the SP from ESC could be a good candidate to induce cell differentiation more effectively to the cardiac phenotype. Since ANP can induce the release of cGMP and it has been shown that cardiac differentiation was mediated by the release of cGMP through the nitric oxide (NO), then we therefore formulate the hypothesis that ANP could also induce cardiac differentiation. Since ESC are composed of a mixture of different cell types so as we emit the hypothesis that the use of a subpopulation of more homogeneous ESC strengthen the differentiation potential of ANP. Methods: SP were isolated from P19 cells by FACS using the method of exclusion of fluorescent dye Hoechst and their phenotype was characterized by immunofluorescence (IF) for markers of the undifferentiated state, self-renewal and pluripotency OCT4 and SSEA1. Then, the optimal pharmacological dose of ANP was determined via cytotoxicity tests in P19 cells (MTT assay). For cardiac differentiation, cells in the form of spheroids were formed using the technique of "Hanging Drop" under the stimulation of ANP for 5 days. Then cuts were made in the spheroids via cryosection to highlight the presence of cardiac progenitor cell markers such as GATA4, Nkx2.5 and a specific mitochondrial marker Tom22. Next, the P19-SP cells were stimulated in cell spheroids by the treatment with ANP (10-7 M) or OT (10-7 M), the specific antagonist of particulate guanylate cyclase A71915 (10-6 M), and the combination of the inducers OT + ANP, OT + A71915, A71915 + ANP. After cell plating, the differentiation into cardiomyocytes has been identified by the appearance of beating cell colonies characteristics of contractile cardiac cells, by determining the cellular phenotype by IF, and finally by the extraction of RNA and proteins that were used for the determination of cGMP by RIA, the mRNA expression by RT-PCR and protein expression by western blotting. Results: The spheroids induced by ANP showed a significant increase in the presence of cardiac transcription factors GATA4 and Nkx2.5 as well as a greater number of mitochondria characterized by a greater presence of Tom22 compared with no induced cells suggesting a cardiomyogenic effect of ANP. In addition, ANP induced the appearance of beating cell colonies from day 7 (early stage) to day 14 (mature stage) similarly to OT. However, the combination of ANP with OT did not induce beating cell colonies suggesting a negative additive effect on cardiomyogenesis. The spheroids, obtained using the technique of "Hanging Drop", have shown a modest increase in mRNA expression as follows: OTR, ANP and GATA4 compared to cells grown in monolayers. By IF, we quantified (number of positive cells) and characterized, from day 6 to day 14 of differentiation, the cardiac phenotype of our cells using the following markers: Cardiac Troponin T, ANP, Connexines 40 and 43, Myosin Light Chain-2V, OTR. The SP differentiated under the stimulation of ANP showed a significant increase in intracellular cGMP compared with undifferentiated cells. Surprisingly, the antagonist A71915 induced a greater appearance of beating cell colonies compared to OT and ANP in early day of cardiac differentiation and the addition of OT or ANP potentiated its effects, further increasing the proportion of beating cells colonies. In addition, the size of beating cell colonies was even greater than under the simple stimulation of OT or ANP. Radioimmunoassay analysis in SP P19 cells stimulated with ANP, A71915 and the combination of both during 15min, 30min and 60min showed that ANP significantly stimulates the release of cGMP, however, A71915 does not abolish the effects of ANP and it rather stimulates the release of cGMP through partial agonist effects. Conclusion: Our results demonstrate firstly that ANP induces the differentiation of P19-SP cells into functional CM. Moreover, it appears that the signaling pathway NPRA-B/pGC/cGMP seems to be involved in the mechanism of cardiac differentiation since the abolition of cGMP mediated by the pGC potentiates cardiac differentiation and it appears that this signaling pathway is additive to the signaling pathway induced by OT, NO/sGC/cGMP, since the addition of OT to the antagonist A71915 stimulates cardiac differentiation more strongly than OT or A71915 alone. This suggests that the therapeutic effect of natriuretic peptides observed in heart failure and vasodilatory properties of certain natriuretic peptide receptor antagonists included the stimulation of stem cell differentiation into cardiomyocytes. This would therefore suggest that the natriuretic peptides or natriuretic peptide receptor antagonists could be an attractive alternative to cell therapy to induce heart regeneration.