Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2016-09-27T12:14:06Z No. of bitstreams: 1 TeseNB.pdf: 25264059 bytes, checksum: f823e6e565d3555a5d49056afd7c39fe (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T20:08:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseNB.pdf: 25264059 bytes, checksum: f823e6e565d3555a5d49056afd7c39fe (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T20:08:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseNB.pdf: 25264059 bytes, checksum: f823e6e565d3555a5d49056afd7c39fe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T20:08:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseNB.pdf: 25264059 bytes, checksum: f823e6e565d3555a5d49056afd7c39fe (MD5) Previous issue date: 2015-06-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / In this work are presented the in silico study of the formation of complexes between organochalcogens compounds with enzymes COX-1 and COX-2 that were carried out in order to study their potential to act as selective inhibitors of COX-2 and thus as anti-inflammatories, as well as the results of in vitro and in vivo experiments of this activity. There were modeled and studied 15 organochalcogens compounds and their enantiomers, with a structure similar to that of the selective drug celecoxib. Compounds 2-(phenylseleno)-2-(2-ethyl-X)acetophenones-4’Y-substituted , with Y = H, Br, CH3, OCH3, NO2 and X = SO2, SO, S, were modeled using as starting point the crystallographic structure of the compound with Y = Br and X = SO. The three dimensional structures of the COX-1 and COX-2 enzymes were obtained from the PDB. The results of the molecular docking calculations were evaluated considering the patterns of orientations/conformations, intermolecular interactions, π interactions and scores. The results of these experiments allowed to propose a mechanism of action as well as a preferred bonding mode that would explain the activity of these compounds as possible inhibitors of COX-2, which is a condition necessary to act as anti-inflammatory. In particular, the compound where Y = OCH3 and X = SO2 (5-OCH3) being selective to COX-2 is the one with the best chances to act as an anti-inflammatory. This is because the OCH3 substituent occupied the S1 subsite of the enzyme, maintaining the interaction with His90 and the SO2 moiety interacts with the Tyr355, an important amino acid for the metabolism of the COX-2 substrate, the arachidonic acid. The other interactions made by the compound, such as π interactions, are important for fixing the ligand in the active site, although they are not directly related to its selectivity. The experiments in vitro and in vivo confirm the in silico results, as the enzyme immunoassay showed that this compound exhibits greater inhibition of COX-2 relative to COX-1. Furthermore, the activity of the 5-OCH3 compound was evaluated with the classical models of edema formation, that is the carrageenan and zymosan induced inflammation in the rat paw, resulting in a significant reduction in paw thickness after two hours and decreasing of the temperature after one hour of the application of the anti-inflammatory agent. As the best results were obtained for the model of paw edema elicited by carrageenan this suggests that the compound acts better in the case of acute inflammation. / Neste trabalho são apresentados o estudo in silico da formação de complexos entre compostos organocalcogênios e as enzimas COX-1 e COX-2 realizado com o objetivo de estudar seu potencial para atuar como inibidores seletivos da COX-2, e portanto como anti-inflamatórios, bem como os resultados dos experimentos in vitro e in vivo desta atividade. Na presente pesquisa, foram modelados e estudados 15 compostos organocalcogênios e seus enantiômeros, com estrutura similar à do fármaco seletivo celecoxibe. Os compostos da família 2-(fenilseleno)-2-(etil-X)acetofenonas-4’Y-substituídas, com Y = H, Br, CH3, OCH3, NO2 e X = SO2, SO, S, foram modelados tendo como ponto de partida a estrutura cristalográfica do composto da mesma família com Y = Br e X= SO. As estruturas tridimensionais das enzimas COX-1 e COX-2 foram obtidas no PDB. Os resultados dos cálculos de docking molecular foram avaliados considerando-se o padrão de orientações/conformações, as interações intermoleculares, as interações π e os escores. OS resultados desses experimentos permitiram propor um mecanismo de ação, bem como um modo de ligação preferencial para explicar a atuação desses compostos como possíveis inibidores da COX-2, condição necessária para atuar como anti-inflamatório. Em particular, o composto com Y = OCH3 e X = SO2 (5-OCH3) é o que apresentou o melhor potencial para atuar como anti-inflamatório, sendo seletivo à COX-2. Isto porque o substituinte OCH3 ocupou o subsítio S1 dessa enzima, mantendo a interação com a His90 e o grupo SO2, apresentou interação com a Tyr355, aminoácido importante para o metabolismo do substrato da COX-2, o ácido araquidônico. As outras interações feitas pelo composto, como as interações π, são importantes para fixação do ligante ao sítio ativo, embora não estejam diretamente ligadas com a sua seletividade. Os experimentos in vitro e in vivo permitiram confirmar os resultados dos experimentos in silico, uma vez que o ensaio imunoenzimático mostrou que este composto apresenta maior inibição da COX-2 em relação à COX-1. Ainda, a atividade do composto 5-OCH3 foi avaliada em modelo de edema de pata induzido por carragenina e zymosan, como agentes irritantes, resultando em uma diminuição significativa da espessura das patas após duas horas e diminuição da temperatura após uma hora da aplicação do agente anti-inflamatório. Uma vez que os melhores resultados foram obtidos para o modelo do edema de pata com a carragenina isto sugere o composto atua melhor no caso da inflamação aguda.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Ebselen is a seleno compound whose antioxidant properties have been attributed to its thiol-peroxidase and thioredoxin-like activity: it decomposes peroxides at the expense of reduced thiols. However, the excessive oxidation of thiols can be potentially toxic when it is not associated with peroxides degradation. Thus, this work investigated if LDH can be a possible in vitro target to toxicity of ebselen in comparison with diphenyl diselenide and diphenyl ditelluride, two antioxidant organochalcogens that can easily interact with thiol in exchange reaction. LDH inhibition was tested in homogenates from rat liver and heart, and in purified LDH from rabbit muscle. Ebselen was the most potent inhibitor of LDH. A maximal inhibitory effect was obtained at 2 μM to LDH purified and at 20 μM to LDH from heart and liver homogenates. Moreover, diphenyl diselenide followed by diphenyl ditelluride also presented a significant inhibitory effect on LDH activity. In addition, we observe that DTT was able to revert the inhibition of LDH induced by all compounds tested, confirming the involvement of essential thiol groups on LDH inhibition by organocalchogens. In conclusion, our results show that liver and heart LDH may be a possible target for toxicity of organochalcogens at relative low concentrations. However, the protection afforded by substrates may hide this potential molecular target of organochalcogenides. Our results also indicate that the use of LDH as a marker of cell viability may be biased by a direct inhibitory effect of ebselen or other chalcogenides on LDH, resulting in false protection in in vitro system. / O Ebselen é um composto de selênio o qual tem suas propriedades antioxidantes atribuídas à sua atividade mimética da tiorredoxina e tiolperoxidase: ele decompõe peróxidos à custa de tióis reduzidos. Contudo, a oxidação excessiva de tióis pode ser potencialmente tóxica quando não esta associada com a degradação de peróxidos. Assim, este trabalho investiga se a LDH pode ser um possível alvo à toxicidade do ebselen, em comparação com o disseleneto de difenila e o ditelureto de difenila, dois organocalcogênios antioxidantes que podem facilmente interagir com grupos tiol. A inibição da LDH foi testada em homogeneizados de fígado e coração de ratos, e em LDH purificada de músculo de coelhos. O Ebselen foi o mais potente inibidor da LDH. O seu efeito inibitório máximo foi obtido com 2 μM para a LDH purificada e 20 μM para a LDH de homogeneizados de fígado e coração de ratos. Além disso, o disseleneto de difenila, seguido do ditelureto de difenila, também apresentaram efeito inibitório significativo sobre a atividade da LDH. Em adição, observou-se que o DTT foi capaz de reverter a inibição da LDH induzida pelos compostos testados, confirmando o envolvimento de grupos tiol essenciais da LDH no processo de inibição pelos organocalcogênios. Em conclusão, estes resultados mostram que a LDH de fígado e coração pode ser um possível alvo para a toxicologia de organocalcogênios a doses relativamente baixas. Nossos resultados também indicam que o uso da LDH como um marcador de viabilidade celular pode ser mascarada por um efeito inibitório direto do ebselen, ou outros calcogênios, sobre a LDH, resultando em uma falsa proteção em um sistema in vitro.