Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2015-06-02T16:56:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_BuscaClassificacaoSistematica.pdf: 3387140 bytes, checksum: f1b3bbc5ae2a1bc53b8ea2de4c8d5bb0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2015-06-18T13:45:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_BuscaClassificacaoSistematica.pdf: 3387140 bytes, checksum: f1b3bbc5ae2a1bc53b8ea2de4c8d5bb0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-18T13:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_BuscaClassificacaoSistematica.pdf: 3387140 bytes, checksum: f1b3bbc5ae2a1bc53b8ea2de4c8d5bb0 (MD5) Previous issue date: 2015 / UFPA - Universidade Federal do Pará / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As proteínas oxigenases com ferro não hêmico compartilham um domínio conservado composto por oito histidinas, podem ser encontradas em organismos eucariotos e procariotos, e participam de importantes vias de biossíntese lipídica. Para compreender a relação evolutiva existente entre essas proteínas, foram realizadas análises comparativa e filogenética em procariotos e eucariotos que permitiram uma classificação dessa família, até então inexistente. A busca de seqüências resultou, após a curadoria, em uma coleção de 448 proteínas, pertencentes a 58 organismos previamente selecionados dentro dos principais taxa. O alinhamento múltiplo de seqüências gerado com a ferramenta MAFFT (BLOSUM 62; L-INS-i) mostrou a presença do domínio de histidinas com espaçamento conservado entre os motivos. A classificação das proteínas feita com o software CLANS gerou 28 grupos a partir da similaridade entre pares de seqüências. Dentre esses, 2 contêm seqüências que não tiveram similaridade com proteínas já caracterizadas e 48 seqüências não foram atribuídas a quaisquer dos grupos formados. As seqüências de plantas, representadas por 119 seqüências da coleção, foram distribuídas em 7 grupos correspondentes às funções C4 metilesterol monoxigenase, C5 esterol desaturase, ácido graxo hidroxilase, esfingolipídeo C4 monooxigenase, aldeído decarbonilase, β-caroteno hidroxilase e Acil-ACP desaturase. A análise filogenética, utilizando o método de máxima verossimilhança com a ferramenta PhyML, mostrou a formação de grupos bem definidos e que foram similares aos gerados por CLANS. Esses resultados começam a preencher a lacuna existente até o momento acerca da relação evolutiva e da classificação das oxigenases com ferro não hêmico. Além disso, sugerem que dentro dessa família ainda há proteínas com funções desconhecidas, reforçando a necessidade de realizar mais estudos de caracterização funcional das mesmas. / Nonheme iron oxygenase proteins shares a conserved domain consisting of eight histidines, and they can be found in eukaryotes and prokaryotes organisms and participate in important pathways of lipid biosynthesis. To understand the evolutionary relationship among these proteins, we performed comparative and phylogenetic analyzes in prokaryotes and eukaryotes that allowed a classification of this family, nonexistent until now. The search of sequences resulted in a collection of 448 proteins, belonging to 58 organisms previously selected. The multiple alignment made with MAFFT (BLOSUM 62; L-INS-i) showed the presence of three histidine-rich motifs, with conserved spacing among them. The classification made with CLANS software has generated 28 clusters through of similarity among sequences. Two clusters contain sequences that had no similarity to proteins already characterized, and 48 sequences were not assigned to any of the 28 clusters. In the collection, 119 sequences are derived from plants, distributed in 7 clusters corresponding to C4 methysterol monooxygenase, C5 sterol desaturase, fatty acid hydroxylase, sphingolipid C4 monooxygenase, aldehyde decarbonylase, β-carotene hydroxylase and Acyl-ACP desaturase functions. Phylogenetic analysis using maximum likelihood method with PhyML tool showed the formation of well-defined groups that were similar to generated by CLANS. These results start to fill a gap existing so far about the evolutionary relationship and classification of nonheme iron oxygenases. Also, suggest that within this family there are still proteins with unknown functions, reinforcing the need for more studies of functional characterization.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2697.pdf: 5379086 bytes, checksum: 5f63f672d07f64a60a5a807ad123c4ca (MD5) Previous issue date: 2009-11-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / The endophytic microorganisms Penicillium griseoroseum, Penicillium brasilianum, Aspergillus flavus e Aspergillus aculeatus have shown to be very efficient in order to perform the most diferenciated biotransformation reactions. The fungi Penicillium griseoroseum has presented an elevated desmethylation selectivity of the caffeine substrate besides the desmethylation of the 2 ,4 ,6 - trimethoxyacetophenone. More complex chemical modifications as the formation of the C-C bond (in the flavanoid 5,7,3 ,4 ,5 -pentamethoxyflavanone) and chloration were also observed with this microorganisms. Yet when explored with flavonoids such as the naringenin and hesperetin, their respective chalcone and, with the glicosylated flavonoid the fungi has also shown itself active. Besides that, the oxidative capability of the Penicillium brasilianum e Aspergillus flavus fungi has been explored with the 1 indanone substrate. Both fungi have performed the Baeyer-Villiger oxidation reaction and the hidroxylation as well. Therefore, when testing glicosylated flavonoids with the fungi Aspergillus flavus their complete degradation was obtained, but with the respective methoxylated substrates no transformation has been obtained. The Aspergillus aculeatus fungi was explored concerning its capability of dimerizing substances. This way, the used substrates were the phenolics 2-naphthol, 1-naphthol e 1- naphthilamine compounds. As a biotransformation product a new reaction was obtained, a Fries rearrangement that has originated the adition of the ketil group to all tested substrates. / Os micro-organismos endofíticos Penicillium griseoroseum, Penicillium brasilianum, Aspergillus flavus e Aspergillus aculeatus se mostraram bastante eficientes para a realização das mais diferenciadas reações de biotransformação. O fungo Penicillium griseoroseum apresentou elevada seletividade de desmetilação do substrato cafeína além da desmetilação da 2 ,4 ,6 -trimetoxiacetofenona. Modificações químicas mais complexas como formação de ligação C-C ( no flavanóide 5,7,3 ,4 ,5 -pentametoxiflavanona) e cloração também foram observadas com este micro-organismo. Ainda quando explorado com flavonóides como naringenina e hesperetina, obteve-se suas respectivas chalconas e, com o flavonóide glicosilado o fungo também se mostrou ativo. Por outro lado explorou-se a capacidade oxidativa dos fungos Penicillium brasilianum e Aspergillus flavus com o substrato 1-indanona. Ambos os fungos realizaram tanto a reação de oxidação de Baeyer-Villiger quanto hidroxilação. No entanto ao se testar flavonóides glicosilados com o fungo Aspergillus flavus obteve-se a degradação completa dos mesmos, porém com os respectivos substratos metoxilados nenhuma transformação foi obtida. O fungo Aspergillus aculeatus por sua vez foi explorado quanto a sua capacidade de dimerizar substâncias. Dessa forma os substratos utilizados foram os compostos fenólicos 2-naftol, 1- naftol e 1-naftilamina. Como produto de biotransformação foi obtida uma nova reação, um rearranjo de Fries que originou a adição do grupo cetil em todos os substratos testados.

Neste trabalho foi avaliada a seletividade (quimio ou enantiosseletividade) de quatro enzimas Baeyer-Villiger mono-oxigenases (BVMOs: PAMO, PAMO M446G, HAPMO e CHMO) frente a substratos contendo boro ou selênio. Inicialmente uma série de boro-acetofenonas foram submetidas à bio-oxidação catalisada por estas BVMOs. A enzima CHMO mostrou quimiosseletividade para transformação da ligação C-B em detrimento da reação de Baeyer-Villiger. Enquanto PAMO e PAMO M446G catalisaram a oxidação de ambas as funções em substratos 4-substituídos e a seletiva transformação de C-B no caso de substratos 3-substituídos. A enzima HAPMO levou a reação de Baeyer-Villiger e a transformação da ligação C-B em todos os casos. Quando alquenos contendo boro foram utilizados como substratos, somente aqueles que continham uma porção fenila em sua estrutura foram oxidados por BVMOs. Em nenhum dos casos foi observada reação de epoxidação e todas as enzimas levaram a transformação da ligação C-B em C-O. Compostos quirais contendo boro foram submetidos a reações com as BVMOs na tentativa de transformação enantiosseletiva. PAMO e PAMO M446G foram as melhores enzimas levando, na maioria dos casos, a satisfatória oxidação dos substratos. Entretanto, somente um composto pôde ser oxidado com boa enantiosseletividade (e.e 82-91%). Compostos quirais contendo o átomo de selênio também foram alvos de estudo com BVMOs. Novamente a enzima PAMO se mostrou a melhor opção dentre as enzimas testadas e somente quando R2 e R1 = Ph houve boa enantiosseletividade na oxidação (e.e 97 %). / In this work we evaluated the selectivity (chemo or enantioselectivity) of four Baeyer-Villiger mono-oxigenases (BVMOS: PAMO, M446G PAMO, HAPMO and CHMO) in the presence of boron-containing or selenium-containing compounds. Initially, a series of boron-acetophenones were submitted to oxidation reactions mediated by BVMOs. The enzyme CHMO was chemoselective leading only to C-B bond transformation instead Baeyer-Villiger reaction. However, PAMO and PAMO M446G mediated both oxidations in 4-substituted substrates, and only the C-B transformation in 3-substituted substrates. The enzyme HAPMO leading to Baeyer- Villiger reaction and C-B transformation in all cases. When boron-containing alkenes were the substrates, only compounds with phenyl moiety in the structure were oxidized by BVMOs. It was observed only the C-B transformation and none of the epoxidation reaction. Chiral boron compounds were submitted to BVMOS mediated reactions in an attempt of enantioselective transformation. PAMO and M446G PAMO showed the best results leading, in most cases, to a satisfactory oxidation. However, only one compound was oxidized with great enantioselectivity (82-91% ee). Selenium-containing chiral compounds were also tested in reactions mediated by BVMOs. Again, PAMO showed the best results among BVMOs tested, but only when R2 e R1 = Ph the reaction occurred with great enantiosselectivity (97 % ee).

Neste trabalho foi avaliada a seletividade (quimio ou enantiosseletividade) de quatro enzimas Baeyer-Villiger mono-oxigenases (BVMOs: PAMO, PAMO M446G, HAPMO e CHMO) frente a substratos contendo boro ou selênio. Inicialmente uma série de boro-acetofenonas foram submetidas à bio-oxidação catalisada por estas BVMOs. A enzima CHMO mostrou quimiosseletividade para transformação da ligação C-B em detrimento da reação de Baeyer-Villiger. Enquanto PAMO e PAMO M446G catalisaram a oxidação de ambas as funções em substratos 4-substituídos e a seletiva transformação de C-B no caso de substratos 3-substituídos. A enzima HAPMO levou a reação de Baeyer-Villiger e a transformação da ligação C-B em todos os casos. Quando alquenos contendo boro foram utilizados como substratos, somente aqueles que continham uma porção fenila em sua estrutura foram oxidados por BVMOs. Em nenhum dos casos foi observada reação de epoxidação e todas as enzimas levaram a transformação da ligação C-B em C-O. Compostos quirais contendo boro foram submetidos a reações com as BVMOs na tentativa de transformação enantiosseletiva. PAMO e PAMO M446G foram as melhores enzimas levando, na maioria dos casos, a satisfatória oxidação dos substratos. Entretanto, somente um composto pôde ser oxidado com boa enantiosseletividade (e.e 82-91%). Compostos quirais contendo o átomo de selênio também foram alvos de estudo com BVMOs. Novamente a enzima PAMO se mostrou a melhor opção dentre as enzimas testadas e somente quando R2 e R1 = Ph houve boa enantiosseletividade na oxidação (e.e 97 %). / In this work we evaluated the selectivity (chemo or enantioselectivity) of four Baeyer-Villiger mono-oxigenases (BVMOS: PAMO, M446G PAMO, HAPMO and CHMO) in the presence of boron-containing or selenium-containing compounds. Initially, a series of boron-acetophenones were submitted to oxidation reactions mediated by BVMOs. The enzyme CHMO was chemoselective leading only to C-B bond transformation instead Baeyer-Villiger reaction. However, PAMO and PAMO M446G mediated both oxidations in 4-substituted substrates, and only the C-B transformation in 3-substituted substrates. The enzyme HAPMO leading to Baeyer- Villiger reaction and C-B transformation in all cases. When boron-containing alkenes were the substrates, only compounds with phenyl moiety in the structure were oxidized by BVMOs. It was observed only the C-B transformation and none of the epoxidation reaction. Chiral boron compounds were submitted to BVMOS mediated reactions in an attempt of enantioselective transformation. PAMO and M446G PAMO showed the best results leading, in most cases, to a satisfactory oxidation. However, only one compound was oxidized with great enantioselectivity (82-91% ee). Selenium-containing chiral compounds were also tested in reactions mediated by BVMOs. Again, PAMO showed the best results among BVMOs tested, but only when R2 e R1 = Ph the reaction occurred with great enantiosselectivity (97 % ee).

Protein nitration is considered as a marker of reactive nitrogen species formation. Heme oxygenases (HOs) are important for the defence against oxidative stress. We evaluated the involvement of the neuronal (nNOS), the endothelial (eNOS), and the inducible (iNOS) in nitrotyrosine formation and localitzation, and both the expression and funcional significance (HO inhibition and contractility studies) of HOs in sepsis-induced muscle contractile dysfunction. Sepsis was elicited by injecting rats and transgenic mice deficient in either nNOS, eNOS, or iNOS isoforms with E.Coli lipolysaccharide (LPS). Nitrotyrosine formation and HO expressions were assessed by immunoblotting. Oxidative stress was assessed measuring protein oxidation, lipid peroxidation, and muscle glutathione. We conclude that protein tyrosine nitration occurs in normal muscles, and sepsis-mediated increase in nitrotyrosine formation is limited to the mitochondria and membrane muscle fractions. The iNOS isoform is mostly involved in nitrotyrosine formation. HOs protect normal and septic muscles from the deleterious effects of oxidants. / En un model de sepsi de disfunció diafragmàtica, s´ha avaluat el paper de les sintetases de l'òxid nítric (NOS) en la formació i localitzacio de 3-nitrotirosina, i l´expressió i significat biològic de les hemo oxigenases (HOs) (inhibidor de les HOs i estudis de contractilitat) davant l' estrès oxidatiu. La sepsi s'induí mitjançant injecció de 20 mg/kg del lipolisacàrid (LPS) d´Escherichia Coli a rates, i a ratolins deficients en les NOS induïble (iNOS), neuronal (nNOS) i endotelial (eNOS). Les proteïnes nitrificades i les HOs es van detectar amb anticossos específics. L' estrès oxidatiu s' avaluà mitjançant l' oxidació proteica, la peroxidació lipídica i el glutation muscular. Concloem que hi han proteïnes nitrificades en el múscul normal i aquestes s'incrementen durant la sepsi en les fraccions mitocondrial i membranar. L'isoforma iNOS és majorment responsable de la formació de nitrotirosina. Les HOs protegirien el múscul normal i sèptic dels efectes deleteris dels oxidants.