Cette thèse concerne le développement d’approches spectroscopiques infrarouge et Raman exaltées de surface: la spectroscopie infrarouge exaltée de surface (SEIRAS) combinée avec une cellule de perfusion et la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) couplée avec l’électrochimie. Dans le cadre du premier projet, différentes protéines ont été étudiées : lactose perméase (LacY), complexe I et IM30. Nous avons déterminé le pKa de Glu325 dans LacY sauvage et dans différents mutants portant des mutations dans le centre actif de translocation des protons. Sauvage complexe I a été oxydé avec différents agents oxydants et réduit avec NADH. Spectres différentiels correspondants ont été analysés. Des changements conformationnels dans la protéine IM30, induits par la présence des ions Mg2+, ont été observés.Dans le cadre du deuxième projet, une cellule spectroélectrochimique contenant une grille d’or a été adaptée pour étudier des protéines redox actives. Cette grille d’or sert à la fois de substrat SERS et d’électrode de travail. Cyt c, Hb et Mb ont d'abord été utilisés pour valider la configuration, puis l'approche a été étendue pour étudier une protéine membranaire. / This thesis concerns the development of surface-enhanced infrared and Raman spectroscopic approaches: surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) combined with perfusion cell and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) combined with electrochemistry. Within the first project different proteins were studied: Lactose Permease (LacY), complex I and IM30.The pKa of Glu325 in LacY WT and in different mutants carrying mutations in the proton translocation active center was determined. WT complex I was oxidized with different oxidizing agents and reduced with NADH. Corresponding redox-induced conformational changes were studied. The evidence was given that Mg2+ ions induce conformational changes in the protein IM30.Within the second project the spectroelectrochemical cell containing gold grid electrode was adopted for the studies of redox active proteins. This gold grid serves both as working electrode and as SERS active substrate. First Cyt c, Hb and Mb were used to validate the setup and then the approach was extended to study a membrane protein.

Ce travail montre qu’une protéine non encore décrite dans les phagocytes, la PAT1 « Protein interacting with APP Tail 1 », interagit avec la partie cytosolique de la p22phox (composant du cytochrome b558 membranaire de la NADPH oxydase). Nous avons utilisé différentes approches pour montrer cette interaction : le système double hybride, la technique de GST-pull down, la microscopie confocale et la technique de co-immunoprécipitation. De plus, nous avons montré que la PAT1a recombinante augmente l’activité de la NADPH oxydase, in vitro dans un système acellulaire reconstitué, et dans les cellules intactes (monocytes et cellules COS-phox). Cette nouvelle interaction régule donc l’activation de la NADPH oxydase et la production des FRO. Par ailleurs, la liaison de PAT1 aux microtubules pourrait favoriser l’assemblage du complexe NADPH oxydase pendant son activation. Ceci pourrait conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques qui préviennent la survenue des lésions tissulaires dans les maladies inflammatoires. / Reactive oxygen species (ROS) production by the phagocyte NADPH oxidase plays a crucial role in host defenses. NADPH oxidase is composed of the membrane flavocytochrome b558 components (p22phox and gp91phox/NOX2), and cytosolic components (p40phox, p47phox, p67phox and a small GTPase Rac1 or Rac2). In this work we identified PAT1 by double hybrid system as a potential partner of p22phox. The interaction between p22phox and PAT1a was further confirmed by in vitro GST pull-down assay, confocal microscopy and co-immunoprecipitation. Addition of recombinant PAT1a to the cell free-system enhanced NADPH oxidase activation and it’s over-expression in human monocytes and in COSphox cells increased ROS production in resting and fMLP-stimulated cells.These data clearly identify PAT1 as a novel regulator of NADPH oxidase activation in phagocytes.Inhibition of p22phox/PAT1 interaction could be used as new approach to limit ROS production by phagocytes at inflammatory sites.

Parmi les technologies basées sur H2 comme vecteur d’énergie, les biopiles à combustibles utilisant des enzymes comme biocatalyseurs spécifiques et efficaces au lieu des catalyseurs au platine apparaissent comme des alternatives émergentes. L’objectif de cette thèse est de comprendre les paramètres gouvernant l’immobilisation fonctionnelle sur des interfaces nanostructurées d'enzymes spécifiques de l’oxydation de H2 et de la réduction d’O2 en vue de désigner une biopile H2/O2 performante.Divers nanomatériaux sont caractérisés, nanoparticules d’or (AuNP) et nanotubes de carbone (CNT), présentant différentes tailles et chimie de surface, aptes à développer des ratios importants surface/volume, autorisant une augmentation du nombre de molécules enzymatiques incorporées et donc une augmentation des courants catalytiques. L’immobilisation des enzymes sur AuNP a permis de discriminer entre l’augmentation de surface ou un effet nano sur l’efficacité catalytique. L’étude intégrée sur CNT, avec les charges de l’interface électrochimique, les charges et moments dipolaires des enzymes considérées, a permis de démontrer que les interactions électrostatiques contrôlent le processus de transfert d’électrons. Cette étude montre que les bases moléculaires pour une immobilisation efficace des enzymes, obtenues sur monocouches est applicables aux réseaux 3D.La détermination des nanostructures optimales pour les réactions enzymatiques est étudiée pour un changement d’échelle. Ainsi des feutres de carbone sont fonctionnalisés avec les nanostructures adaptées, pour au final développer la première biopile H2/O2 capable d’alimenter un multicapteur et un système de communication sans fil. / Among the technologies based on H2 as an energy carrier, biofuel cells that use specific and effective enzymes as biocatalysts instead of platinum catalysts appear as emerging alternative. The objective of this thesis is to understand the parameters governing the functional immobilization of specific enzymes for H2 oxidation and O2 reduction reactions on nanostructured interfaces, aimed to design a performant H2 / O2 biofuel cell.Gold nanoparticles (AuNP) and carbon nanotubes (CNT) having different sizes and surface chemistry are characterized. These nanomaterials develop important ratios surface / volume ratio, allow an increment in the number of enzyme molecules immobilized and therefore an increase catalytic currents. The immobilization of enzymes on AuNP allowed the discrimination between the increase in surface area and a nanomaterial effect on catalytic efficiency. The study on CNT integrates the charge of the electrochemical interface, dipole moments and the surface charge of enzymes. It demonstrated that electrostatic interactions control the electron transfer process. This study shows that the molecular basis for effective immobilization of enzymes, obtained on monolayers is applicable to 3D networks.The determination of the best parameters for enzymatic reactions, allows the development of an optimized 3-D volumetric interface based on carbon felt. We finally design for the first time a H2/O2 biofuel cell able to generate enough electric power to feed a complete wireless communication device.

Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) sont considérés comme des messagers intracellulaires et sont produits principalement par les NADPH oxydases (Nox) dont Nox4 est l'un des représentants. Le dysfonctionnement de Nox4 est relié à de nombreuses pathologies (cancer, athérosclérose, hypertension pulmonaire ou arthrose). La régulation de l'activité NADPH oxydase de Nox4 est encore peu connue. L'objectif de ce travail est d'étudier l'activité NADPH oxydase et diaphorase (initiation du transfert d'électron) de Nox4.<br />Le clonage du gène de Nox4 a mis en évidence deux isoformes protéiques (Nox4A, forme entière et Nox4B, forme délétée d'un domaine de fixation du NADPH). La mise en place de deux modèles d'étude cellulaire (cellules HEK293E) et acellulaire (protéines recombinantes Nox4 tronquées) a permis d'obtenir les résultats suivants:<br />1) L'activité NADPH oxydase de Nox4A surexprimée dans les cellules HEK293E est constitutive et la partie C terminale cytosolique en milieu acellulaire possède une activité diaphorase. Par contre, Nox4B est inactive. <br />2) L'activité NADPH oxydase de Nox4 est inhibée par une série de composés quinones faiblement substitués (benzoquinone, hydroquinone, tMetBQ) et stimulée par d'autres quinones (tBuBQ, tBuBHQ, duroquinone, AA-861). L'implication du calcium et de la 5-lipoxygénase dans le mécanisme d'action des composés AA-861 et tBuBHQ a été écartée. Nos données convergent vers l'hypothèse d'une action directe des quinones sur la partie N terminale membranaire de Nox4.<br />Nous avons donc démontré que l'activité NADPH oxydase de Nox4 n'est pas seulement constitutive mais modulable par différentes quinones. Le mécanisme moléculaire précis reste à définir.

La quiescine/sulfhydryl oxydase QSOX1 catalyse la formation de ponts disulfures. In vivo, ses substrats et ses rôles cellulaires restent à déterminer. Les stress oxydants sont notamment impliqués dans les maladies neurodégénératives. L'hormone estradiol-17b (E2) possède des effets neuroprotecteurs. Nos objectifs ont été d'étudier la régulation de l'expression de QSOX1 par E2 et son implication dans les stress oxydants et la neuroprotection par E2.<br />Nous avons tenté d'établir un modèle de protection par E2 des cellules PC12/ERa soumises à un stress oxydant induit par H2O2 ou le complexe Fe(III)-HQ. Malgré différentes conditions testées, aucune protection par E2 n'a pu être obtenue.<br />Nous avons ensuite étudié la régulation de l'expression de QSOX1 dans le cerveau de Rates ovariectomisées traitées ou non par E2. Dans trois aires cérébrales exprimant fortement ERa et ERb, le niveau de messagers QSOX1 diminue en présence de E2.<br />Enfin, nous avons étudié l'implication de QSOX1 dans les stress oxydants. Dans les cellules PC12 soumises au stress oxydant, l'expression des messagers et de la protéine QSOX1 augmente. Suite au stress oxydant, la viabilité des cellules MCF-7 surexprimant QSOX1 diminue moins fortement que celle des cellules contrôles. La diminution de l'apoptose est associée à une moindre dépolarisation des mitochondries dans ces cellules.<br />Nos travaux ont ainsi permis de confirmer l'estrogéno-dépendance de QSOX1 in vivo et de montrer pour la première fois le rôle de QSOX1 dans la protection des cellules contre l'apoptose induite par les stress oxydants. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives et renforcent l'intérêt de l'étude de QSOX1 dans la neuroprotection par E2.

L'objectif de cette étude consiste à développer des bio-architectures à base de nanotubes de carbone mono-feuillet à visées électroanalytiques. Pour ce faire, différentes méthodes de fonctionnalisation de nanotubes de carbone ont été proposées à savoir la fonctionnalisation en solution, par trempage et par électropolymérisation en se servant des interactions π entre les nanotubes de carbone et des molécules π-conjugués (le pyrrole-biotine, le pyrène-biotine et le pyrèneadamantane). Les matrices utilisées pour la conception des biocapteurs sont basées sur les systèmes d'affinité entre l'avidine et la biotine, et entre l'adamantane et la β- cyclodextrine. La comparaison des performances des différents biocapteurs a permis de déterminer la méthode la plus adéquate pour la fonctionnalisation des nanotubes de carbone. Cette dernière consiste à former une monocouche de monomères par simple trempage puis de la renforcer par électropolymérisation oxydative dans une solution exempte de monomère. Cette stabilisation de la couche adsorbée préserve une excellente accessibilité à la surface de l'électrode sous-jacente. Les surfaces fonctionnelles qui en résultent ont été caractérisées par des méthodes physico-chimiques d'analyse.

Les cellules dendritiques jouent un rôle prépondérant dans le développement des réponses immunitaires ; les nombreuses activités fonctionnelles de ces cellules dont leur importante capacité de phagocytose leur confèrent le pouvoir d'activer les différents mécanismes de défense de l'organisme qu'ils fassent parties de l'immunité innée ou adaptative. Or de nombreux travaux ont montré que lors du développement des réponses immunitaires, les mécanismes oxydatifs ont un rôle essentiel et sont donc étroitement contrôlés. Dans le cas des cellules dendritiques, la production de radicaux oxygénés est en très grande partie relié au fonctionnement d'une NADPH Oxydase (NOX2) que notre laboratoire a été le premier à identifier dans ces cellules, il y a quelques années. Ce complexe enzymatique à une position centrale dans la production en premier des radicaux superoxydes puis des différentes formes réactives de l'oxygène (FRO) qui en découlent. Au cours de ma thèse, j'ai tout d'abord mis en place un protocole permettant l'étude de la production des FRO dans les cellules dendritiques. Les différentes méthodes employées m'ont permis de démontrer que d'autres protéines du système oxydant tels NOX1 et SOD3, étaient également produites par les cellules dendritiques. Nos résultats montrent que ces protéines, à l'instar de ce qui avait été montré pour NOX2, jouent un rôle dans la formation et le contrôle des FRO. J'ai également étudié la localisation intracellulaire de ces protéines, ce qui m'a permis de mieux comprendre les rôles respectifs de ces dernières dans le contrôle de la production et de l'activité des FRO dans les cellules dendritiques. Il avait été préalablement montré que la dégradation des pathogènes dans les cellules dendritiques, après qu'ils aient été phagocytés, était en partie liée à l'activité NOX2. Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse nous permet d'envisager un impact des FRO résultant de l'activité de NOX1 sur le contrôle de l'apoptose des cellules dendritiques ou sur certaines voies de signalisation au niveau de noyau. De plus, la dismutation du superoxyde en peroxyde (H2O2) pourrait ne pas être une réaction spontanée comme plusieurs auteurs l'ont proposé, mais pourrait être lié à la présence de SOD3 qui interviendrait dans les compartiments d'endocytose.

La NADPH-oxydase phagocytaire, responsable de la production d'anions superoxydes microbicides, résulte de l'assemblage des protéines cytosoliques avec le cytochrome b558 membranaire redox formé de Nox2 et p22phox. Nous avons mis en évidence précédemment que le remplacement de la boucle D de Nox2 par celle de Nox4 (mutant D-loopNox4-Nox2) était à l'origine d'une " super-activité " oxydase. Le présent travail a consisté à élucider les mécanismes moléculaires à l'origine de la super-activité oxydase de ce mutant. Le mutant présente une activité oxydase ex vivo 2 à 8 fois supérieure à celle de cellules PLB-985 WT-Nox2, en réponse aux stimuli solubles et particulaires. Cette suractivité est plus importante en réponse à l'ionomycine et au facteur chimiotactique fMLF, dont les voies d'activation impliquent une augmentation du taux de Ca2+i. Cette suractivité a également été mise en évidence dans un système simplifié in vitro contenant uniquement les protéines purifiées du complexe oxydase et activé par l'acide phosphatidique. L'activité oxydase du mutant ex vivo présente une sensibilité accrue à un influx de calcium. Le cytochrome b558 muté est moins sensible aux événements de phosphorylation dépendant d'ERK1/2 durant l'activation par le fMLF. Ainsi, la suractivité du mutant D-loopNox4-Nox2 pourrait provenir d'une modification de la conformation de Nox2 mutée, favorisant l'état activé du complexe oxydase. De plus, la super-activité du mutant améliore son pouvoir bactéricide vis-à-vis de la souche atténuée P. aeruginosa PAO1. Enfin, nous avons pu mettre en évidence l'existence de deux phases distinctes et interdépendantes dans le processus de bactéricidie de ce microorganisme.

Des études épidémiologiques ont démontré que l’exposition aux pesticides tels que le chlordécone augmente le risque du cancer, en particulier de la prostate. Il avait été précédemment montré au laboratoire que le chlordécone possède des propriétés pro-angiogéniques impliquant la libération de NO et la production de VEGF suite à l’activation du récepteur aux oestrogènes de type alpha (ERα). Les processus angiogéniques pouvant impliquer les espèces réactives de l’oxygène (EROs), produites notamment par la mitochondrie, l’objectif de ce travail a été d’évaluer la contribution de la biogenèse mitochondriale et du stress oxydatif dans l’angiogenèse induite par le chlordécone.Les résultats obtenus montrent que la biogenèse mitochondriale n’est pas essentielle pour la réponse angiogénique du chlordécone puisqu’elle n’est retrouvée que pour de forte concentration de chlordécone. Les mécanismes mis en jeu ont été identifiés au niveau des cellules endothéliales humaines. Ils impliquent une régulation spatio temporellede la production des EROs impliquant dans un premier temps la NADPH oxydase, elle même capable de stimuler la production mitochondriale d’EROs via la voie impliquant la NO synthase. Le chlordécone serait par ailleurs capable de favoriser la localisation périnucléaire des EROs afin de favoriser la production de VEGF. L’ensemble de ces effets implique le récepteur aux oestrogènes. Ce travail a donc permis d’identifier les mécanismes cellulaires impliqués dans la modulation de l’angiogenèse par le chlordécone. Ces mécanismes moléculaires pourraient contribuer à identifier de nouvelles cibles permettant de réguler les processus angiogéniques et la tumorigenèse induites par ce toxique. / Epidemiological studies report that exposure to pesticides like chlordecone increases risk of prostate cancer and tumorigenesis. We have reported recently that the pro-angiogenic effect of chlordecone involving NO release and VEGF production is mediated through activation of α isoform of the estrogen receptor (ERα). Since mitochondria and ROS have been implicated inthe process of angiogenesis, this study aims to determine the contribution of mitochondrial biogenesisand oxidative stress in chlordecone-induce dangiogenesis. Firstly, our results indicate that mitochondrial biogenesis is not essential for chlordecone angiogenic response. We also identified the molecular mechanism involved; chlordecone induces endothelial cells angiogenesis by a spatiotemporal regulation of ROS production involving NADPH oxidase then mitochondrial O2 -via a NO sensitive pathways through activation of ERα.These findings propose that a molecular mechanism may partly explain the epidemiological evidence implicating chlordecone as risk factor of prostatic cancer.

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus nombreux et les premières cellules à arriver au site de l’infection où elles internalisent les pathogènes par phagocytose. Dès le début du processus, la NADPH oxydase s’assemble au phagosome où elle permet la production de formes réactives de l’oxygène contribuant ainsi à la destruction du pathogène. La sous-unité catalytique membranaire de la NADPH oxydase, Nox2, est donc présente à la coupe phagocytaire puis au phagosome. Le dessein de cette étude était de déterminer quelles sont les sources subcellulaires de la protéine Nox2, de savoir si la protéine s’accumule au phagosome et le cas échéant selon quelle cinétique. Dans le but de comprendre la dynamique de la protéine Nox2, la protéine d’échafaudage IQGAP1 qui est associée au cytosquelette a également été étudiée. Enfin l’étude de l’organisation spatiale de la protéine Nox2 à la synapse phagocytaire a également été abordé.En utilisant des cellules neutrophil-like (PLB-985) ainsi que des neutrophiles humains, notre étude a montré par immunofluorescence la présence de la protéine Nox2 dans des endosomes de recyclage ou dans des endosomes précoces. Lors de la phagocytose ils avoisinent le phagosome suggérant leur implication dans l’apport de la protéine Nox2 à la membrane de ce dernier. L’utilisation de cellules PLB-985 pour lesquelles l’expression de Nox2 a été supprimée puis réintroduite avec un transgène codant pour la protéine GFP-Nox2 montre que la sous-unité Nox2 s’accumule au phagosome pendant les vingt minutes suivant sa fermeture. Dans notre étude, la protéine IQGAP1 ne semble pas avoir d’effet sur la phagocytose ou sur la production de FRO par la NADPH oxydase. Enfin, grâce à une technique de microscopie super-résolution (le dSTORM) l’évolution du pattern de Nox2 dans la membrane a été évalué au cours du temps en phagocytose frustrée. En dix minutes, le nombre de clusters de protéine Nox2 augmente mais leur taille reste inchangée. / Neutrophils are the most numerous leukocytes and the first cells to arrive at the site of infection where they internalize pathogens by phagocytosis. From the beginning of the process, the NADPH oxidase is assembled at the phagosome, where it allows the production of reactive oxygen species (ROS), thus contributing to the destruction of the pathogen. The membrane bound catalytic subunit of the NADPH oxidase, Nox2, is therefore recruited at the phagocytic cup and then at the phagosome. The purpose of this study was to determine, which are the subcellular sources of the Nox2 protein, whether the protein accumulates at the phagosome and if so, according to which kinetics. In order to modify the dynamics of the Nox2 protein, the scaffold protein IQGAP1 that is associated with the cytoskeleton was also studied. Finally, the spatial organization of the Nox2 protein in the phagocytic synapse was also investigated.Using neutrophil-like cells (PLB-985) as well as human neutrophils, our study showed by immunofluorescence the presence of the Nox2 protein in recycled or early endosomes. During phagocytosis, they are close to the phagosome, suggesting their involvement in the contribution of the Nox2 protein to the phagosome membrane. The use of PLB-985 for which Nox2 expression has been suppressed and then reintroduced with a transgene encoding the GFP-Nox2 protein shows that the Nox2 subunit accumulates at the phagosome during the first twenty minutes after its closure. In our study, the protein IQGAP1 does not appear to have any effect on phagocytosis or on the production of ROS by NADPH oxidase. Finally, using super resolution microscopy (dSTORM) the evolution of the Nox2 pattern in the membrane has been evaluated over time in frustrated phagocytosis. Within ten minutes, the number of Nox2 protein clusters increases but their size remains unchanged.