Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le papier bioactif est obtenu par la modification de substrat du papier avec des biomolécules et des réactifs. Ce type de papier est utilisé dans le développement de nouveaux biocapteurs qui sont portables, jetables et économiques visant à capturer, détecter et dans certains cas, désactiver les agents pathogènes. Généralement les papiers bioactifs sont fabriqués par l’incorporation de biomolécules telles que les enzymes et les anticorps sur la surface du papier. L’immobilisation de ces biomolécules sur les surfaces solides est largement utilisée pour différentes applications de diagnostic comme dans immunocapteurs et immunoessais mais en raison de la nature sensible des enzymes, leur intégration au papier à grande échelle a rencontré plusieurs difficultés surtout dans les conditions industrielles. Pendant ce temps, les microcapsules sont une plate-forme intéressante pour l’immobilisation des enzymes et aussi assez efficace pour permettre à la fonctionnalisation du papier à grande échelle car le papier peut être facilement recouvert avec une couche de telles microcapsules. Dans cette étude, nous avons développé une plate-forme générique utilisant des microcapsules à base d’alginate qui peuvent être appliquées aux procédés usuels de production de papier bioactif et antibactérien avec la capacité de capturer des pathogènes à sa surface et de les désactiver grâce à la production d’un réactif anti-pathogène. La conception de cette plate-forme antibactérienne est basée sur la production constante de peroxyde d’hydrogène en tant qu’agent antibactérien à l’intérieur des microcapsules d’alginate. Cette production de peroxyde d’hydrogène est obtenue par oxydation du glucose catalysée par la glucose oxydase encapsulée à l’intérieur des billes d’alginate. Les différentes étapes de cette étude comprennent le piégeage de la glucose oxydase à l’intérieur des microcapsules d’alginate, l’activation et le renforcement de la surface des microcapsules par ajout d’une couche supplémentaire de chitosan, la vérification de la possibilité d’immobilisation des anticorps (immunoglobulines G humaine comme une modèle d’anticorps) sur la surface des microcapsules et enfin, l’évaluation des propriétés antibactériennes de cette plate-forme vis-à-vis l’Escherichia coli K-12 (E. coli K-12) en tant qu’un représentant des agents pathogènes. Après avoir effectué chaque étape, certaines mesures et observations ont été faites en utilisant diverses méthodes et techniques analytiques telles que la méthode de Bradford pour dosage des protéines, l’électroanalyse d’oxygène, la microscopie optique et confocale à balayage laser (CLSM), la spectrométrie de masse avec désorption laser assistée par matrice- temps de vol (MALDI-TOF-MS), etc. Les essais appropriés ont été effectués pour valider la réussite de modification des microcapsules et pour confirmer à ce fait que la glucose oxydase est toujours active après chaque étape de modification. L’activité enzymatique spécifique de la glucose oxydase après l’encapsulation a été évaluée à 120±30 U/g. Aussi, des efforts ont été faits pour immobiliser la glucose oxydase sur des nanoparticules d’or avec deux tailles différentes de diamètre (10,9 nm et 50 nm) afin d’améliorer l’activité enzymatique et augmenter l’efficacité d’encapsulation. Les résultats obtenus lors de cette étude démontrent les modifications réussies sur les microcapsules d’alginate et aussi une réponse favorable de cette plate-forme antibactérienne concernant la désactivation de E. coli K-12. La concentration efficace de l’activité enzymatique afin de désactivation de cet agent pathogénique modèle a été déterminée à 1.3×10-2 U/ml pour une concentration de 6.7×108 cellules/ml de bactéries. D’autres études sont nécessaires pour évaluer l’efficacité de l’anticorps immobilisé dans la désactivation des agents pathogènes et également intégrer la plate-forme sur le papier et valider l’efficacité du système une fois qu’il est déposé sur papier. / Bioactive paper is obtained through the modification of paper substrate with biomolecules and reagents. It is used in the development of novel biosensors that are portable, disposable and inexpensive, aimed at capturing, detecting and in some cases deactivating pathogens. Generally bioactive papers are made by incorporating biomolecules such as enzymes and/or antibodies on to paper. The immobilization of such biomolecules on solid surfaces is widely used for different diagnostic applications such as in immunosensors and immunoassays but due to the sensitive nature of enzymes, their large scale incorporation into paper has faced several difficulties especially under industrial papermaking conditions. The functionalization of paper at large scale is possible because paper can be easily coated with a layer of microcapsules, which have proven to be an efficient immobilization platform for enzymes and to allow. In this study, we developed a generic alginate-based platform incorporating microcapsules that can be applied to current paper production processes to prepare antibacterial bioactive paper with the ability to capture pathogens on its surface and to deactivate them by producing an anti-pathogenic agent. The design of the antibacterial platform is based on constant production of hydrogen peroxide as the antibacterial agent inside the alginate microcapsules. Hydrogen peroxide production is achieved through oxidation of glucose, catalyzed by the enzyme glucose oxidase encapsulated inside the alginate beads. The different steps of development included the entrapment of glucose oxidase inside alginate microcapsules, the reinforcement and surface activation of microcapsules by adding an additional layer of chitosan, investigating the possibility of immobilization of antibodies (human immunoglobulin G as a model antibody) on the surface of microcapsules and, finally, verifying the antibacterial properties of the system against Escherichia coli K-12 (E. coli K-12) as a representative pathogen. During development, certain measurements and observations were made using various analytical methods and techniques such as Bradford protein assay, oxygen electroanalysis, optical and confocal laser canning microscopy (CLSM), matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), etc. Appropriate tests were performed to validate the successful modification of microcapsules and to ensure that glucose oxidase is still active after each modification. It was found that the encapsulated glucose oxidase maintained the specific enzymatic activity of 120±30 U/g. Subsequent efforts were made to immobilize glucose oxidase on gold NPs of two different diameters (10.9 nm and 50 nm) to enhance the enzymatic activity and increase the encapsulation efficiency. The results obtained during this study demonstrate successful modifications on alginate microcapsules and also a successful response of such antibacterial platform regarding deactivation of the pathogen representative, E. coli K-12. The threshold for the enzymatic activity was found to be 1.3×10-2 U/ml for E. coli K-12 growth inhibition of 6.7×108 cells/ml. Further studies are needed to assess the efficiency of immobilized antibody in the capture of pathogens and also to incorporate the platform onto paper and to validate the efficiency of the system once it is coated on paper.

La lysyl oxydase (LOX) est une enzyme extracellulaire dont le rôle canonique est de catalyser la réticulation des fibres de collagènes et de l’élastine, assurant ainsi l’intégrité des tissus conjonctifs. La LOX agit également dans plusieurs types cellulaires comme régulateur de différents processus biologiques, soulignant des fonctions à la fois extra et intracellulaires. Ces travaux de thèse ont contribué à améliorer la compréhension du rôle de LOX dans l’épiderme, et plus précisément au cours de la différenciation des kératinocytes. Le développement d’un modèle de culture en monocouche à confluence, et d’un modèle tridimensionnel d’épiderme reconstruit ont permis d’aborder l’étude de LOX au cours de l’induction du programme de différenciation des kératinocytes et du processus de différenciation terminale conduisant à la formation d’un épiderme pluristratifié, cornifié et fonctionnel. L’expression de LOX est induite au cours des premières étapes de la différenciation de kératinocytes primaires ainsi que d’une lignée de kératinocytes immortalisés. Grâce à l’établissement de lignées de kératinocytes éteignant l’expression de LOX de façon stable, nous avons mis en évidence l’implication de la protéine LOX, indépendamment de son activité enzymatique, dans la régulation des premières étapes de différenciation des kératinocytes. En absence de LOX, l’initiation du programme de différenciation est perturbée, affectant la différenciation terminale et fonctionnelle des épidermes reconstruits. Ainsi, une régulation fine de l’expression de LOX est nécessaire au déroulement normal du processus de différenciation des kératinocytes, et donc au maintien de l’homéostasie épidermique / Lysyl oxidase (LOX) is an extracellular enzyme that catalyzes the cross-linking of fibrillar collagens or elastin, thereby regulating the structural integrity of connective tissues. Moreover, LOX displays multiple roles in different cell types, acting as a regulator of various biological processes at both extra and intracellular levels. The aim of the present work was to shed light on LOX functions in the epidermis, especially during keratinocyte differentiation. The development of culture models, consisting of confluent monolayers or reconstructed-epidermis allowed us to study LOX functions during the induction of the differentiation program, and furthermore during the terminal differentiation process leading to the formation of a pluristratified, cornified and functional epidermis. LOX expression is induced at the onset of the commitment to differentiation, both in primary and immortalized keratinocytes. Stable silencing of LOX expression affects the induction of the differentiation program and strongly impairs terminal and functional epidermal differentiation in reconstructed-epidermis. Therefore, LOX protein acts during the first steps of keratinocyte differentiation, independently of its enzymatic activity, and is implied for subsequent commitment into terminal differentiation. Taken together, these results suggest that a finely regulated expression of LOX is required for normal keratinocyte differentiation, and thus for maintenance of epidermal

Au sein d’une tumeur des régions hypoxiques se forment ce qui conduit à l’activation du facteur de transcription HIF1. HIF1, composé des deux protéines HIF1a et HIF1b, permet l’adaptation des cellules à des faibles concentrations d’oxygène en activant la transcription de gène cible. Un de ces gènes est celui codant pour la lysyl oxydase (LOX). Cette enzyme structure la matrice extracellulaire et est impliquée dans la tumorigénèse. Pour comprendre les liens entre LOX et HIF1a, nous avons modulé leurs expressions dans des lignées humaines de carcinome du côlon. En condition hypoxique, HIF1a contrôle l’expression de LOX et réciproquement, LOX régule la synthèse protéique d’HIF1a via l’activation de la voie de signalisation PI3K/AKT. Nous avons donc mis en évidence l’existence d’une boucle de régulation positive entre LOX et HIF1 en conditions hypoxique. Sachant que ces deux protéines sont des acteurs majeurs de la progression tumorale, nous avons cherché à comprendre le rôle de cette régulation mutuelle dans ce processus. Nos résultats démontrent que l’activité enzymatique de LOX promeut la croissance tumorale in vitro et in vivo et que son action est potentialisée par la présence de son partenaire HIF1a. De plus, LOX et HIF1a agissent en synergie afin d’augmenter la potentiel métastatiques des cellules tumorale de côlon in vitro. Ainsi, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence l’existence d’une boucle de régulation entre HIF1a et LOX qui est critique dans la progression tumorale et semble également être impliquée dans le processus métastatiques / The microenvironment of solid tumors is exposed to hypoxic conditions which lead to the activation of Hypoxia‐Inducible Factor 1 (HIF1). HIF1, composed by a heterodimer of HIF1a and HIF1b protein, is a key transcription factor involved in cellular adaptation to changes in oxygen level, inducing the expression of several transcriptional targets such as Lysyl Oxidase (LOX). LOX is an amine oxidase that catalyzes crosslinking of fibrillar collagens and elastin in the extracellular matrix. Furthermore, LOX is implied in tumor progression. To clarify, the link between LOX and HIF1a, their expression were modulated in human colorectal carcinoma cell lines. We pointed out that besides HIF1‐dependant regulation of LOX, LOX can also act on the HIF1 pathway under hypoxic conditions. Indeed, LOX enzymatic activity upregulates HIF1a protein synthesis, and this action is mediated by the PI3K/AKT pathway. Thus, these results emphasize the existence of a regulation loop between HIF‐1a and LOX, which represent two main actors of tumoral progression. Thus, we wanted to determine the implication of this amplification loop in tumor progression. Our results show that LOX enzymatic activity increase tumor growth in vitro and in vivo, and this role is partially dependant of its partner HIF1a. Furthermore, we established that that LOX and HIF1a act in synergy to foster metastatic potential in colorectal carcinoma cell lines. Taken together, our results demonstrate a regulation loop between LOX and HIF1a with is critical for tumor progression and metastasis formation

Cette étude a pour objectif la mise en évidence, chez les basidiomycetes du genre Pycnoporus, de nouvelles oxydo-réductases impliquées dasn la dégradation de la biomasse végétale: de l'expression des gènes aux applications biotechnologiques. Les champs d'application visés concernent essentiellement le domaine de la chimie verte, dans le cadre du projet européen BIORENEW. Le travail s'est articulé autour de trois axes principaux. Le premier a concerné l'exploration de la biodiversité naturelle en particulier tropicale, pour la sélection de souches productrices de nouvelles laccases de haut potentiel d'oxydo-réduction. Le gène codant pour la laccase Lac1 chez Pycnoporus a été utilisé comme marqueur moléculaire d'identification et de relation phylogénie-fonction, mettant en évidence une distribution des souches fortement corrélée avec leur écozone. Le deuxième axe a porté sur l'isolement de trois nouvelles laccases issues de P.sanguineus et P. coccineus qui exhibent des caractéristiques biochimiques complémentaires: haute thermostabilité, résistance aux solvants, au pH, constantes catalytiques et potentiels rédox élevés. Ces enzymes constituent de bons modèles pour des applications en biotechnologies blanches:décoloration de colorants polyphénoliques, oxydation de composés modèles de type lignine non-phénolique, oligomérisation de flavonoides naturels adaptés aux applications cosmétiques et pharmaceutiques. Enfin, dans le cadre de l'annotation du génome des souches monocaryotiques P. cinnabarinus BRFM 137 et P; sanguineus BRFM 1264, dont le séquençage a été réalisé par notre Unité, un regard tout à fait nouveau est porté sur le système lignolytique du genre Pycnoporus, longtemps décrit comme produisant que de la laccase comme enzyme du système lignolytique. Pour la première fois, nous avons montré la présence de gènes codant pour tout l'arsenal enzymatique de dégradation des lignines, c'est à dire plusieurs laccases mais surtout de nombreuses peroxydases et des enzymes auxilliaires génératrices d'H2O2 comme les glyoxal oxydases. Ces nouvelles enzymes ont été caractérisées in silico. Pour la première fois également, la sécrétion effective de peroxydases, de glyoxal oxydases et d'autres FOLymes dans nos conditions de culture a également pu être démontrée par analyse protéomique. / The purpose of this work was to prospect, in the genus Pycnoporus, for new oxido-reductases involved in the degradation of lignocellulosic biomass: from gene expression to biotechnological applications. This research was conducted in the framework of green chemistry applications according to BIORENEW European Project. The study was divided in three main research axes. Firstly, the exploration of natural biodiversity, especially tropical biodiversity, for the selection of new high redox potential-laccase producing strains. These strains were repositionned in a context of phylogenomic/function through the lac1 gene. Molecular clustering based on lac1 sequences enabled the distribution of P. sanguineus and P. coccineus through four distinct, well supported clades and subclades. This distribution was highly correlated with ecozones. The second part of the work deals with the biochemical and molecular characterization of three novel laccases from P. coccineus and P. sanguineus, and their applicability on natural or model phenolic substrates. The three laccases showed complementary biochemical features: high thermo- and pH stability, high catalytic efficiency and resistance to organic solvents. The three novel laccases proved to be suitable models for white biotechnology processes: polyphenolic dye decolourization, non-phenolic lignin model compound oxidation, and synthesis of new oligomers from natural flavonoids suitable for cosmetic or pharmaceutical applications. Finally, annotation of genomic data from the monocaryotic strains P. cinnabarinus BRFM 137 and P. sanguineus BRFM 1264 (genomes sequenced by the UMR1163 BCF ) was performed for lignolytic enzymes. For the first time, new oxidases (peroxidases, glyoxal oxidases and other FOLymes) were evidenced in Pycnoporus and in silico characterized. Moreover, the active secretion of several of these enzymes has been demonstrated in our culture conditions by 1D-proteomic analysis

La puissance de la biopile enzymatique à glucose/oxygène est limitée par sa partiecathodique. Afin de contourner cette limitation, nous avons étudié les enzymescathodiques : les Bilirubine oxydases (BODs). Dans le but de mieux appréhender ces BODs, lemécanisme réactionnel, la nature de l’étape limitante et l’effet des sels ont alors été étudiés.Deux mécanismes différents sont retrouvés en fonction du mode de transfert des protons etdes électrons (4 fois 1H+/1e- ou 2 fois 2H+/2e-). De plus, nous avons démontré que l’étapelimitante est l’oxydation du substrat pour les trois substrats testés et que les sels agissent auniveau du cuivre T1. Les principales limitations des BODs sont leur stabilité à 37 °C ainsi queleur inhibition par le NaCl. Deux techniques ont alors été utilisées pour identifier des BODsplus résistantes. La première méthode est l’extraction de nouvelles enzymes à partird’organismes extremophiles. Elle a permis d’isoler la BOD d’Anaerophaga thermohalophilaqui possède une bonne résistance au NaCl mais une densité de courant faible. Dans unsecond temps, afin de reconstruire des séquences ancestrales, la phylogénie de la familledes Bacillus Bacterium a été effectuée. Cette technique a permis l’identification de troisBODs possédant des caractéristiques très intéressantes : la BOD de Bacillus nakamurai etdeux BODs ancestrales (Noeud 10 et Noeud 13). Par exemple, après une heure à 37°C et 140mM de NaCl, le Noeud 10 possède une meilleure densité de courant que la BOD de Bacilluspumilus, qui est l’enzyme utilisée comme base de la phylogénie. La seconde technique estdonc une méthode de choix permettant la découverte de nouvelles enzymes à la fois plusstables et plus résistantes que les enzymes actuelles. Elle ouvre de grandes perspectivespour l’utilisation des BODs comme enzymes cathodiques ou pour d’autres applicationsbiotechnologiques. Enfin, nous avons montré que l’immobilisation de la BOD de B. pumilusdans le matériau Si-(HIPE) permet la décoloration cyclique de colorants chimiques surplusieurs mois. / Power of glucose/oxygen enzymatic biofuel cell is limited by the cathodic part. In order to prevent this limitation, we studied cathodic enzymes: Bilirubin oxidases (BODs). For this purpose, the kinetic mechanism, rate-limiting step and salts effect were determined. Two different mechanisms are observed depending on the electron/proton transfer (4 times1H+/1e- or 2 times 2H+/2e-). We also demonstrated that the rate-limiting step is the substrate oxidation for the three substrates tested and salts act around the T1 copper. Main BODs limitations are their stability at 37°C and their inhibition by NaCl. Two methods were used toidentify the most resistant BODs. The first one was the identification of new enzymes from extremophile organisms. It allows to isolate BOD from Anaerophaga thermohalophila whichhas good NaCl resistance but low current density. In addition, in order to reconstructancestral sequences, phylogeny of Bacillus Bacterium family was performed. This methodidentified three BODs with interesting features: BOD from Bacillus nakamurai and twoancestral BODs (Noeud 10 and Noeud 13). For example, after one hour at 37°C and 140 mMNaCl, Noeud 10 has a better current density than the BOD from Bacillus pumilus, which is theenzyme used as basis for the phylogeny. This second method allowed the discovery of newenzymes that were both more stable and more resistant than actual enzymes. Thistechnique opens up valuable prospects for the use of BODs as cathodic enzymes or for otherbiotechnological applications. In the end, we demonstrated that BOD from B. pumilusimmobilization in Si-(HIPE) materials allows cyclic discoloration of chemical dyes duringseveral months.

Depuis peu, des travaux ont montré que chez l’Homme, la transcétolase (TK, EC 2.2.1.1.) dont le cofacteur est la thiamine diphosphate (forme active de la vitamine B1), est une enzyme impliquée dans de nombreuses maladies telles que, le diabète, certains cancers, ou encore des maladies neurologiques, comme le syndrome de Wernicke-Korsakoff et la maladie d’Alzheimer. Pour des applications thérapeutiques, des inhibiteurs spécifiques de cette enzyme sont actuellement conçus et synthétisés dans les milieux académiques et industriels. Afin de déterminer l’activité de la TK (dans un but de diagnostic) d’une part, et de détecter des inhibiteurs potentiels de cette enzyme (dans un but thérapeutique) d’autre part, il est nécessaire de disposer de tests alliant rapidité, sensibilité et faible coût. Nous avons envisagé d’utiliser des biocapteurs ampérométriques qui combinent l’ensemble de ces avantages, et qui, de plus, n’ont jamais été mis en oeuvre avec la TK. Pour la détermination de l’activité des TK d’E. coli et humaine libres en solution, nous avons tout d’abord élaboré un premier biocapteur à galactose oxydase (GAOx, EC 1.1.3.9), dans lequel cette enzyme est immobilisée sur la laponite. Puis, dans le but de detecter des inhibiteurs de la TK, avec un système réutilisable, nous avons developpé un biocapteur à GAOx-TK d’E. coli, les deux enzymes étant co-immobilisées à la surface de l’électrode. Pour cela la TK a été immobilisée dans des Hydroxydes Doubles Lamellaires (HDL). Ce biocapteur bicouche et bi-enzymatique GAOx-TK, nous a permis d’évaluer l’effet d’inhibiteurs, tels que différents analogues du cofacteur et de substrats pris comme modèles. / Some recent studies have shown that human transketolase (TK, EC 2.2.1.1.), which thiamine diphosphate (active form of vitamin B1) is the cofactor, is involved in numerous disease such as diabete, some cancers and neurodegenerative diseases as Alzheimer’s disease and Wernicke-Korsakoff syndrome. For therapeutic purposes, TK inhibitors have been designed and synthesized in both academic and industrial fields. To determine TK activity (diagnostic) on the one hand, and to detect potential inhibitors of this enzyme (therapeutic) on the other hand, it is necessary to develop fast, sensitive and low cost assays. In this context, we designed some original amperometric biosensors that combine these advantages and were never studied with TK from now. We performed a first galactose oxidase (GAOx, EC 1.1.3.9) biosensor for E. coli and human TK activities detection. For that purpose, GAOx was immobilized on laponite matrix. Then, we designed a GAOx-TK biosensor by co-immobilization of GAOX and TK on the electrode surface that enabled the detection TK inhibitors with a reusable system. Thence, TK was immobilized in Layered Double Hydroxides (HDL). This bilayer and bi-enzymic biosensors, allowed us to determine the inhibitor potencies of several cofactors and substrates analogues as model compounds.

Le mutant immutans d'Arabidopsis présente un phénotype panaché et accumule du phytoène, précurseur des caroténoïdes.<br />Le gène IMMUTANS code une protéine plastidiale, homologue à l'oxydase alterne mitochondriale, et loacalisée dans les lamelles stromatiques du thylacoïde et dans les membranes achlorophylliques des chromoplastes. Son expression chez E. coli permet l'établissement d'un transport d'électrons résisatn au KCN et inhibé par le n-PG.<br />Cette protéine apparait être une oxydase terminale plastidiale (PTOX), dont l'activité dépend de la présence de PQ et de fer.<br />PTOX semblerait églaement être l'oxydase terminale de la chlororespiration; exprimée chez le tabac, elle accélère la ré-oxydation non photochimique des PQ, et entraine un flux d'électrons vers l'O2, évitant ainsi la sur-réduction des PQ. La forte expression de PTOX chez le plante d'altitude Ranunculus glacialis pourrait indiquer un role particulièrement actif de PTOX dans les mécanismes de résistance à la photoinhibition.

Le complexe de la NADPH oydase des neutrophiles catalyse la formation des ions<br />superoxydes nécessaires à la destruction des pathogènes. Il est constitué de deux protéines<br />membranaires (gp91phox, p22phox), de trois facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox, p40phox) et<br />d'une petite protéine G, Rac. Afin de comprendre les interactions et les réarrangements<br />structuraux mis en jeu lors de l'activation du complexe, des études structurales des facteurs<br />cytosoliques entiers seuls et en complexe ont été menées. Deux approches ont été choisies : la<br />microscopie électronique et la diffusion des rayons X aux petits angles. Cette dernière<br />approche a permis de calculer une enveloppe pour p47phox et p67phox.