Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2008.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2008.

La protéine p120, marqueur de prolifération, a été initialement identifiée dans les cellules humaines tumorales. Son homologue chez la levure, la protéine Nop2, est essentielle à la croissance et à la viabilité des cellules. La délétion du gène NOP2 bloque la maturation du pré-ARNr 27S en ARNr matures. Les protéines p120 et Nop2 possèdent des motifs de la famille des ARN : m5C-méthyltransférase. Dans un premier temps, j'ai démontré l'activité ARN : m5C-méthyltransférase de Nop2p par des expériences de méthylation in vitro en présence de S-adénosylméthionine tritiée. En parallèle, des expériences menées en collaboration avec une équipe allemande nous ont permis de localiser la méthylation catalysée par Nop2p à la position 2870 de l'ARNr 25S. Par la suite, j'ai étudié l'implication de Nop2p et de p120 dans la biogenèse de la sous-unité 60S du ribosome par plusieurs approches. Des expériences de complémentation dans une souche de levure [delta]NOP2 par la protéine humaine p120 et des protéines hybrides Nop2p-p120 ont permis de montrer que le domaine catalytique de p120, en présence du domaine N-terminal de Nop2p, permet une biogenèse normale des ribosomes chez S.cerevisiae. Parallèlement, des expériences d'ARN interférence dirigées contre p120 ont permis de montrer que, lorsque le taux de protéine p120 est diminué de 90% dans des cellules HEK293, la synthèse de l'ARNr mature 28S est ralentie. L'ensemble de ces données montrent que les protéines p120 et Nop2 appartiennent à la famille des protéines pré-ribosomiques essentielles au processus de maturation du pré-ARNr et semblent nécessaires à la structuration des pré-ARNr indispensable à leur maturation / The protein p120 is a proliferation marker that was originally identified in human tumor cells. The yeast homologue of p120, nucleolar protein Nop2p, was shown to be essential for viability of yeast. Alignment of Nop2p with human p120 points out the evolutionary conservation of a large domain that contains a SAM-binding motif and a protein domain having potential RNA: m5C-méthyltransférase activity. By in vitro methylation experiments and a sodium bisulfite approach, we show that Nop2p is a RNA: m5C-methyltransferase specific for 25S rRNA nucleotide 2870. In parallel, we succeeded to complement Nop2-deficient yeasts by human p120 and studied the importance of different sequence and structural domains of Nop2 and p120 for rRNA processing in vivo. In complementation assays, the C-terminal domain of Nop2 was essential for cell viability, whereas the absence of the N-terminal domain led to slow growth phenotype. Chimeric proteins formed by Nop2 and p120 fragments efficiently support growth if the N-terminal domain of Nop2 was present. In the absence of Nop2 or p120, the C1/C2 cleavages required to generate 5.8S and 25S rRNA were strongly reduced. The reduction of p120 content in human cells by specific siRNA leads to decreased 28S rRNA accumulation, supporting the idea on the implication of p120 in human pre-rRNA processing

Les jonctions adhérentes sont des jonctions intercellulaires essentielles à la morphogenèse et à la maintenance des tissus. Elles reposent sur l'assemblage de grands complexes multiprotéiques aux contacts intercellulaires, centrés sur des protéines transmembranaires appelées cadhérines. Nous avons découvert deux nouveaux partenaires des cadhérines N, E, M, P, R et 11, les flotillines. Nous avons caractérisé leur interaction avec la N-cadhérine et découvert qu'elle était constitutive à la membrane plasmique et vraisemblablement indirecte. Nous avons démontré que les flotillines sont essentielles à la stabilisation des jonctions adhérentes dans des cellules musculaires et épithéliales, ainsi qu'à des processus cellulaires dépendants des jonctions. Nous montrons qu'en effet, les flotillines sont nécessaires à l'interaction des cadhérines avec la p120-caténine, qui inhibe leur internalisation et leur dégradation. Nos expériences suggèrent que les flotillines seraient impliquées dans la formation d'un microdomaine membranaire particulier au niveau de la jonction en cours de maturation, permettant le recrutement de la p120-caténine. / Cadherins are essential in many fundamental processes such as tissue patterning during development and in the maintenance of adult tissue architecture. At regions of cell-cell contact, cadherins assemble into large macromolecular complexes named adherens junctions. Here we identify flotillin 1 and 2 as new partners of several classical cadherins. The interaction between flotillines and N-cadherin is constitutive at the plasma membrane and seems to require an intermediate partner. Knockdown of flotillins had a dramatic effect on N- and E-cadherin recruitment at the adherens junctions in both mesenchymal and epithelial cell types. At the molecular level, we show that flotillins stabilize cadherins at the PM hence allowing the coupling of 120 catenin, one of their main stabilizing partners. Our results suggest that flotillins might scaffold a membrane microdomaine at maturing junctions, allowing the recruitment of p120-catenin.

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L'intégrité de l'endothelium vasculaire est maintenue par des structures d'adhérence jonctionelle, notamment les jonctions adhérentes, dont la VE-cadhérine est le constituant majeur. Cette cadhérine est exclusivement exprimée dans les cellules endothéliales et joue un rôle clé au cours de la formation du plexus vasculaire. Les cellules endothéliales expriment également une autre cadhérine : la N-cadhérine. Bien que possédant une forte homologie structurale avec la VE-cadhérine, celle-ci possède une localisation subcellulaire originale pour une cadhérine classique puisqu'elle est localisée de manière diffuse au niveau de la membrane. Dans le développement vasculaire, elle pourrait ainsi permettre le recrutement des cellules murales par l'endothelium conduisant à la stabilisation du vaisseau. Mon travail de thèse a été d'analyser les propriétés différentielles de ces deux cadhérines dans la cellule endothéliale ainsi que le mécanisme d'exclusion jonctionelle de la N-cadhérine. Nous avons montré que la VE- et la N-cadhérine interagissent similairement à l'- et à la -caténine mais à l'inverse, p120 caténine lie préférentiellement la VE-cadhérine. Cette propriété confère à la VE-cadhérine la capacité d'exclure la N-cadhérine de la jonction interendothéliale. D'autre part, nous avons montré qu'une petite proportion de la VE-cadhérine est enchâssée dans des microdomaines riches en cholestérol : les radeaux lipidiques, à laquelle p120 est très fortement associée. Cette fraction pourrait représenter un pool de VE-cadhérine assurant la stabilité de la jonction et le maintien de la force cohésive entre cellules endothéliales. Nous avons également montré dans un modèle de différenciation cellulaire dérivé des cellules ES murines (embryonic stem cell), que l'expression de la VE-cadhérine était nécessaire à l'expression d'autres gènes endothéliaux : PECAM, Flk-1 et Tie-1. La VE-cadhérine exercerait un contrôle transcriptionel de l'expression de ces gènes mais le mécanisme exact de régulation n'a pas pu être décrypté. L'ensemble de ce travail permet donc de montrer un autre visage de la VE-cadhérine dans la biologie de l'endothelium qui serait de réguler des protéines-clé de l'endothelium.

Les gliomes sont les tumeurs cérébrales primitives les plus fréquentes. Dérivant des cellules gliales et majoritairement des astrocytes, les gliomes malins évoluent rapidement et sont associés à un très mauvais pronostic, en partie causé par leur nature invasive. Les cellules de gliomes infiltrent activement le parenchyme cérébral, ce qui leur permet d'échapper aux thérapies focales (chirurgie et radiothérapie), et de donner naissance à de nouveaux foyers tumoraux au voisinage direct ou à distance de la tumeur initiale. En analysant le transcriptome de plus de 130 gliomes de différents grades et en me focalisant uniquement sur les variations d'expression de gènes connus pour être impliqués dans la migration, l'invasion, l'adhérence et la polarité astrocytaire, j'ai mis en évidence une altération des jonctions adhérentes dans les gliomes et suggéré une corrélation inverse entre le niveau de la p120ctn et l'invasivité des gliomes in vitro et in vivo.. En contrôlant une boucle de recyclage inédite de la N-cadhérine dans les cellules en migration, la p120ctn régule spatialement les forces d'adhérence intercellulaire, et assure une migration collective dirigée. L'altération de sa fonction dans les astrocytes sains entraîne une augmentation de la dispersion des cellules, la perturbation de leur directionnalité et in fine une augmentation de leur vitesse de migration ; des caractéristiques identiques aux cellules de gliomes en migration. L'ensemble de ces résultats définit la p120ctn comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour le traitement des gliomes diffus et comme un potentiel marqueur de l'invasivité des gliomes.

In the intestinal epithelium, Wnt signaling drives the expression of the genes encoding tyrosine kinase receptors EphB2 and EphB3 and represses the expression of their membrane-tethered ligands, ephrin-Bs. Eph-ephrin interactions result in cellular repulsion and are involved in boundary formation. The project of this thesis is to understand the mechanism by which EphB−ephrin-B signals restrict cell positioning of cell types (cell sorting) in the normal intestinal epithelium and suppress colorectal cancer (CRC) progression beyond the earliest stages. We have demonstrated that at the onset of CRC EphB receptors impair the expansion of tumor cells through a mechanism dependent on E-cadherin–mediated adhesion. We show that EphB-mediated compartmentalization restricts the spreading of EphB+ tumor cells into ephrin-B1+ territories in vitro and in vivo. Our results indicate that CRC cells must silence EphB expression to avoid repulsive interactions imposed by normal ephrin-B1+ intestinal cells at the onset of tumorigenesis. We have discovered that cell sorting is the outcome of two integrated mechanisms: cell contraction/repulsion and differential cell adhesion. The latter is the driving force to induce EphB/ephrin-B−mediated cell compartmentalization. We have developed in vitro models to analyze the mechanisms that induce E-cadherin remodeling upon EphB activation. We found RhoA, p120-catenin and the metalloproteinase ADAM10 as downstream effectors of EphB signaling involved in the control of cell sorting in CRC cells. / A l'epiteli intestinal, la ruta de senyalització Wnt indueix l'expressió dels gens que codifiquen per als receptors tirosina kinasa EphB2 i EphB3 i reprimeixen la dels seus lligands transmembrana, efrines de tipus B. Les interaccions Eph-efrina causen repulsió cel·lular i estan implicades en la formació de fronteres entre compartiments. La finalitat d'aquesta tesi és entendre el mecanisme pel qual la senyalització per EphB−efrina-B restringeix el posicionament dels diferents tipus cel·lulars a l'epiteli intestinal normal i suprimeix la progressió del càncer colorectal (CRC) en els primer estadis. Hem demostrat que, a l’inici del CRC, els receptors EphB restringeixen l'expansió de les cèl·lules tumorals a través d'un mecanisme depenent d'adhesió intercel·lular a través d’E-cadherina. En aquest treball es mostra in vitro i in vivo que la compartimentalització mitjançada per la senyalització dels receptors EphB restringeix l’invasió de les cèl·lules tumorals EphB+ als territoris efrina-B+. Aquests resultats indiquen que les cèl·lules de CRC han de silenciar l’expressió d'EphB per evitar les interaccions repulsives imposades per les cèl·lules intestinals normals efrina-B+ circumdants al començament del procés de tumorigènesi. Hem pogut discernir que el reordenament cel·lular per senyals EphB−efrina-B és el resultat de dos mecanismes integrats: la contracció/repulsió intercel·lular i l’adhesió diferencial entre diferents poblacions cel·lulars. Aquesta última és la força principal que condueix a la compartimentalització cel·lular mitjançada per EphB−efrina-B. Hem desenvolupat models in vitro per analitzar els mecanismes que provoquen el remodelament de la E-cadherina sota la senyalització per EphB. Presentem RhoA, p120-catenina i ADAM10 com a efectors de la senyalització de la ruta EphB implicats en el control de la compartimentalització cel·lular en el CRC.