El càncer colorectal (CCR) és una de les neoplàsies més freqüents. La seva freqüència ha augmentat en els últims anys i constitueix la segona causa de mort per càncer en ambdós sexes. Els fàrmacs més àmpliament utilitzats en el tractament quimioteràpic dels pacients amb càncer de recte són el 5-Fluorouracil (5-FU) i el Oxaliplatí (OXA). Els estudis farmacogenètics plantegen la utilització dels coneixements derivats dels estudis genòmics per tal que els pacients es puguin sotmetre a tractaments farmacològics més eficaços i menys tòxics. Aquests estudis tenen una especial rellevància en el camp de l’oncologia, ja que els tractaments quimioradioteràpics es caracteritzen per tenir una finestra terapèutica molt estreta que fa difícil establir l’equilibri entre l’increment de la dosi (per millorar l’eficàcia) i l’aparició d’efectes adversos. Pel que fa a l’estudi de la relació de la resposta clínica i l’aparició d’efectes adversos del tractament amb 5-FU en pacients amb CCR avançat i el patró de polimorfismes/mutacions dels gens relacionats amb la via metabòlica de la síntesis de folats, les conclusions d’aquesta tesi són: 1. El nombre de llocs d’unió de factors de transcripció de la regió 5’ no traduïda del gen de la Timidilat Sintasa és un marcador farmacogenètic de l’eficàcia del tractament amb 5-FU. 2. No s’ha evidenciat una associació entre els polimorfismes del gen de la Metilentetrahidrofolat reductasa (C677T i A1298C) i la toxicitat relacionada amb l’administració de 5-FU. 3. Existeix una associació estadísticament significativa entre el genotip A1298C del gen de la Metilentetrahidrofolat reductasa i la supervivència global en les dones tractades amb 5-FU. 4. Ni els reordenaments genòmics en el gen de la Dihidropirimidina deshidrogenasa, ni la presència de la mutació IVS14 +1 G>A tenen un paper rellevant en el desenvolupament d’efectes adversos associats amb el tractament amb 5-FU. Pel que fa a l’estudi de la relació de la resposta i de la toxicitat del tractament amb derivats del platí en pacients amb CCR avançat amb el patró de polimorfismes en gens relacionats amb els mecanismes de reparació de l’ADN de les vies de reparació NER i BER, les conclusions són: - Via NER: 1. El polimorfisme C118T del gen de reparació per escissió del grup de complementació creuada 1 és un bon marcador pronòstic que avalua la resposta i la supervivència en pacients amb CCR tractats amb règims OX/5-FU. 2. El polimorfisme Lys751Gln del gen xeroderma pigmentosa grup D és un marcador pronòstic que avalua la resposta i la supervivència global en pacients tractats amb derivats del platí. - Via BER: 1. No es demostra una associació entre els tres polimorfismes del gen de reparació per raigs X del grup de complementació creuada 1 i els paràmetres clínics que defineixen la remissió clínica i la supervivència. Pel que fa a l’estudi de la resposta a la quimioteràpia amb derivats de platí en pacients amb CCR avançat en relació amb el polimorfisme de la Glutatió-S-transferasa, la conclusió és: 1. No es demostra associació significativa entre el polimorfisme Ile105Val d’aquest gen i la neurotoxicitat induïda pel tractament amb oxaliplatí. / Colorectal cancer (CRC) is one of the most frequent neoplasms. Its frequency has increased in recent years and is the second leading cause of cancer death in both sexes. The drugs most widely used in chemotherapy for patients with colorectal cancer are 5-fluorouracil (5-FU) and oxaliplatin (OXA). Pharmacogenetics studies raise the use of knowledge gained from genomic studies so that patients can be subjected to more effective and less toxic drug treatments. These studies have special relevance in the field of oncology, as chemotherapy treatments are characterized by a very narrow therapeutic window that makes it difficult to establish a balance between increasing the dose (to improve efficiency) and the occurrence of adverse effects. Regarding the study of the relationship between clinical response and the emergence of adverse effects of treatment with 5-FU in patients with advanced CRC and the pattern of polymorphisms / mutations of genes related to metabolic pathway of folate synthesis, the conclusions of this thesis are: 1. The number of binding sites of transcription factors in the 5’ UTR region of thymidylate synthase gene is a pharmacogenetics marker of the efficacy of treatment with 5-FU. 2. It has shown an association between polymorphisms methylenetetrahydrofolate reductase gene (C677T and A1298C) and toxicity associated with administration of 5-FU. 3. There is a significant association between the A1298C genotype methylenetetrahydrofolate reductase gene and overall survival in women treated with 5-FU. 4. Neither the genomic rearrangements in the dihydropyrimidine dehydrogenase gene, the presence of the mutation IVS14 +1 G> A have a role in the development of adverse effects associated with treatment with 5-FU. Regarding the study of the relationship between the response and toxicity of treatment with platinum derivatives in patients with advanced CRC with the pattern of polymorphisms in genes related to the mechanisms of DNA repair pathways: NER and BER, the conclusions are: - Via NER: 1. The C118T polymorphism of the gene for excision repair cross complementing 1 is a good prognostic marker to evaluate response and survival in patients with CRC treated with regimens OX/5-FU. 2. Polymorphism Lys751G in the Xeroderma Pigmentosum group D gene is a prognostic marker to evaluate the response and overall survival in patients treated with platinum derivatives. - Via BER: 1. Not demonstrated an association between three polymorphisms of the X-ray repair complementing group 1 gene and clinical parameters that define clinical remission and survival. Regarding the study of response to chemotherapy with platinum derivatives in patients with advanced CRC in relation to the polymorphism of glutathione-S-transferase P1 gene, the conclusion is: 1. It demonstrates a significant association between the Ile105Val polymorphism of this gene and treatment with oxaliplatin-induced neurotoxicity.

Introducció: El càncer colorectal és un dels càncers més freqüentes del nostre país així com en la majoria de societats occidentals. Els factors mebiambientals juguen un paper determinant en el seu desenvolupament. Els nutrients i específicament els greixos, estarien entre els factors més destacats.Tot i que a Groenlàndia, Finlàndia i algunes zones mediterrànies, les dietes tenen un alt contingut en greix, la incidència de càncer colorrectal és relativament baixa en comparació amb la resta de països occidentals. Una important diferència dietètica és l'elevat consum de peix i oli de peix (ric en els àcids grassos n-3, eicosapentaeonic (EPA) i docosahexaenoic (DHA)) en el cas del països nòrdics i l'oli de oliva (ric en àcid oleic C18:1, n-9) a la conca mediterrània. La tesi es basa en la hipòtesi que "l'oli de peix i el d'oliva són capaços de modular el desenvolupament del càncer colorrectal.Objectius: L'objectiu de l'estudi va ser avaluar els mecanismes pels quals aquests olis realitzaven aquesta modulació i la implicació dels àcids grassos presents en aquests.Resultats: Per respondre els objectius plantejats es van utilitzar dues estratègies d'estudi. La primera es basa en estudis in vitro amb línies cel·lulars d'adenocarcinoma colorectal, Caco-2 i Ht-29. L'altra es basa en l'estudi de l'efecte dels diferents nutrients en un model animal d'inducció de la carcinogènesi colorectal. L'oli de peix i l'oli d'oliva indueixen la diferenciació en cèl·lules Caco-2. Com a resultat de la diferenciació aquestes cèl·lules comencen a expressar els enzims Sucrasa-Isomaltasa i la Dipeptidilpeptidasa IV.La regulació de l'homeòstasi del teixit colònic depèn d'una estreta relació entre la proliferació cel·lular i l'apoptosi o mort cel·lular programadaMitjançant estudis d'incorporació de timidina tritiada, hem demostrat que l'oli de peix té un important efecte inhibidor de la proliferació de les cèl·lules Caco-2 i HT-29. Sembla ser, que aquests efectes són deguts als àcids grassos n-3 EPA i DHA presents en l'oli de peix. L' efecte modulador del desenvolupament del càncer colorectal per part de l'oli de peix i del d'oliva té la seva major incidència en la inducció de l'apoptosi. L'índex d'apoptosi s'ha determinat analitzant els canvis morfològics de les cèl·lules (amb tinció DAPI). L'oli de peix, l'oli d'oliva, així com el DHA, l'EPA i l'àcid oleic són capaços d'incrementar l'apoptosi de forma molt significativa. Aquests efectes estan relacionats amb una molt ràpida inhibició de l'expressió de COX-2. L'expressió de la proteïna antipopotòtica Bcl-2 disminueix després de disminuir COX-2, fet que suggereix la implicació d'aquests dos gens en els efectes antineoplàstics produïts per aquests àcids grassos. Per altra banda es va demostrar una clara implicació de la proteïna pro-apoptòtica BAX, ja que a l'administrar un inhibidor d'aquesta, es produïa una disminució significativa de l'apoptosi.L'oli de peix i el d'oliva tenen un important efecte protector en la inducció de la carcinogènesi colorectal en animals tractats amb azoximetà. Els animals que van rebre una dieta amb oli de peix o d'oliva, com a font principal de greix, presentaven un major índex d'apoptosi. Per altra banda, l'oli de peix podria tenir un efecte preventiu al ser capaç d'incidir en la renovació de l'epiteli sa, incrementant l'apoptosi d'aquestes cèl·lules.Conclusions: L'oli de peix és capaç de modular de forma clara el desenvolupament del càncer colorectal incidint directament en els processos de diferenciació cel·lular, proliferació i apoptosi. L'oli de peix podria tenir un efecte preventiu del desenvolupament del càncer colorrectal al modificar la regeneració de l'epiteli colònic sa. L'oli d'oliva pot modular el desenvolupament del càncer colorrectal encara que no tingui el seu efecte en la totalitat dels mecanismes estudiats. / Introduction: Colorectal cancer is one of the most frequent cancers in our country as well as in most of the occidental societies. Environmental factors play a crucial role on its development. Nutrients and in concrete fat seems to be one of the most determinant components. Although relatively high fat diets are consumed in Greenland, Finland and some Mediterranean areas, colorectal cancer incidence remains relatively low there. An important difference between these regions and the rest of the western countries is the much higher consumption of fish and fish oil (rich in the n-3 fatty acids eicosapentaenoic, C20:5 and docosahexaenoic, C22:6) in the case of the Northern countries, and fish and olive oil (containing mostly oleic acid, C18:1, n-9) down in the Mediterranean basin.The hypothesis of our study was if "fish oil and olive oil are able to modulate the colorectal cancer development".Aims: The objectives of this study were to evaluate the mechanisms implicated in the modulation of cancer by these oils and determine the implications of its fatty acids.Results: In order to answer the objectives mentioned above we followed two study strategies. First, we performed: in vitro studies using adenocarcinoma cell lines, Caco-2 and Ht-29. The other one is the study of the effects of several nutrients in an animal model of carcinogenesis induction . Fish oil and olive oil induced the differentiation of Caco-2 cells. As a result of this differentiation, the cells began to express Sucrase-Isomaltase and Dipeptydilpeptidase IV enzymes.Homeostasis regulation of colonic tissue depends on a tightly relationship between cell proliferation and cell loss, through apoptosis.With [3H] thymidine incorporation studies, we demonstrated that fish oil has an important inhibitor effect on the proliferation of Caco-2 and HT-29 cells. It seems that this effect is caused by EPA i DHA (n-3 fatty acids present in fish oil). The most important effect on the development of colorectal cancer by fish oil and olive oil is the induction of apoptosis. To determine the Apoptotic index we evaluated cell morphologic changes by DAPI staining.Fish oil, olive oil, as well as DHA, EPA and oleic acid are able to increase apoptosis in a significant manner. These effects are related to a very fast inhibition of the expression of COX-2. Antipoptotic Bcl-2 protein expression decreases after Cox-2 expression inhibition, suggesting that these two genes are implicated in the antineoplastic effects. On the other hand, we demonstrated a clear implication of the proapoptotic protein BAX, because when an inhibitor of BAX was added, apoptosis significantly decreased.Fish oil and olive oil have an important protective effect in the induction of colorectal carcinogenesis in animals which received an azoximethane treatment. Animals fed with fish oil and olive oil as a principal source of fatty acids in its diet, showed a higher apoptotic index. On the other hand, fish oil may have a preventive effect due to an acceleration of the turnover of colonic epithelia through the induction of apoptosis of these cells. Conclusions: Fish oil can modulate the development of colorectal cancer in cellular differentiation, proliferation and apoptosis processes. Fish oil could have a preventive effect on the development of colorectal cancer modifying the regeneration of normal colonic epithelial. Olive oil could modulate the development of colorectal cancer although not having effects in all of the studied mechanisms.

Les cèl·lules de càncer colorectal adquireixen el fenotip tumoral mitjançant l'acumulació de mutacions en gens específics. Les mutacions més prevalents en el càncer de còlon es produeixen en el gen APC i indueixen l'acumulació de beta-catenina nuclear. Però la transcripció depenent de beta-catenina no és l'únic requeriment per la progressió del càncer colorectal ja que la inhibició de l'activitat gamma-secretasa redueix la tumorigènesi en ratolins APCmin/+. En canvi, l'activació de Notch a l'intestí resulta en un bloqueig de la diferenciació de cèl·lules secretores i una expansió dels progenitors immadurs.A més dels factors de transcripció, existeixen complexes multiproteics, que inclouen corepressors nuclears (NCoRs), com N-CoR i SMRT, i deacetilases d'histones (HDAC) responsables dels silenciament específic de grups de gens, mitjançant el qual regulen processos cel·lulars molt important com són la diferenciació cel·lular, el desenvolupament embrionari i l'homeòstasi tissular.La via de transducció de la senyal d'NFkappaB està implicada en la resposta immune i inflamatòria així com en el desenvolupament de tumors de mama, fetge, i intestí. Aquesta via s'activa, en resposta a estímuls, a través del complex IKK, que fosforila el repressor d'NFkappaB, IkappaB, induint la seva degradació pel proteosoma, la translocació a nucli d'NFkappaB i l'activació del programa gènic corresponent.Recentment s'han identificat altres funcions per a les proteïnes IKKs, diferents a les anteriorment descrites. Algunes d'aquestes funcions tenen lloc a nivell de la cromatina i inclouen, entre d'altres, la fosforilació de la H3 y la fosforilació del repressor nuclear SMRT.Treballs previs del nostre laboratori demostren que tant la IKKalpha com la IKKbeta és recluten al promotor de hes1 i herp2 en resposta a l'activació per TNFalpha. Aquest reclutament coincideix amb l'alliberament de complexes repressors formats per IkappaBalpha y HDACs, així com amb l'activació transcripcionals d'aquests gens.L'objectiu principal de la meva tesi ha estat determinar si les IKK juguen algun paper en la regulació dels gens diana de Notch en les cèl·lules de càncer colorectal, i si aquest és el cas, determinar quins són els mecanismes d'activació de les IKK en aquestes cèl·lules i les seves implicacions en el desenvolupament del procés tumoral. Els nostres resultats demostren que les cèl·lules de càncer de còlon presenten una activació anòmala d'IKKalpha a nivell nuclear fosforila al repressor transcripcional SMRT. Hem descrit que en aquestes cèl·lules, la IKK es troba associada de forma específica als promotors de gens de la família de Notch tals com hes1, herp2 i hes5, coincidint amb l'alliberament del repressor SMRT d'aquest promotors i amb la seva activació transcripcional. La inhibició de l'activitat IKK restableix l'associació d'SMRT als promotors reprimint la seva activació. Això és concomitant amb una disminució de la proliferació i un increment de l'apoptosi en les cèl·lules de càncer de còlon. El tractament amb inhibidors de la IKK disminueix el creixement de tumors implantats en ratolins immunodeprimits. A més, també hem demostrat que l'activitat IKKalpha nuclear de les cèl·lules de càncer de còlon també fosforila el repressor N-CoR, un homòleg d'SMRT, induint el seu export al citoplasma cel·lular.Actualment, el projecte està focalitzat en determinar els mecanismes que indueixen l'activació de la IKKalpha en el càncer colorectal. Els resultats més recents indiquen que en les cèl·lules de càncer de còlon podria haver una forma truncada de la proteïna, que no té els dominis necessaris pel seu manteniment a citoplasma però que conserva el domini quinasa intacte. Els nostres esforços es centren en caracteritzar bioquímicament aquesta forma així com en determinar la seva funció pro-tumorogènica. Tenim alguns resultats preliminars que suggereixen que la forma truncada de la IKKalpha podria ser el resultat de la degradació parcial pel proteosoma, dependent d'ubiqüitinació, de la IKKalpha sencera (FL-IKKalpha). Les dades que tenim suggereixen que les característiques bioquímiques d'aquesta forma truncada d'IKKalpha difereixen de les de la FL-IKKalpha, i que això determina que les seves funcions siguin també diferents. En aquest sentit, creiem que mentre FL-IKKalpha és qui forma part del complex de quinases reguladores de la via NFkappaB, la IKKalpha truncada podria ser la responsable de la fosforilació de repressors nuclears. Més important encara, creiem que aquesta forma truncada coopera amb K-Ras més eficientment que la forma sencera en la generació de focus de transformació en cèl·lules NIH-3T3, suggerint que la forma truncada de la IKKalpha té potencial tumorigènic. / Colorectal cancer cells accumulate multiple mutations in specific sets of genes. Mutation of adenomatous polyposis coli (APC) that leads to the accumulation of nuclear beta-catenin, is the most prevalent event in these multistep process. However, not only beta-catenindependent transcription is required for colorectal cancer progression, because abrogation of the Notch pathway prevents tumorigenesis in APCmin/+ mice whereas activation of Notch results in the expansion of the progenitor compartment in the intestine.NFkappaB signalling pathway is involved in inflammatory and immune response as well as in tumour development in breast, liver and intestine. The NFkappaB signalling pathway is activated in response to different stimuli that induce the activation of the IKK complex, that phosphoylates the NFkappaB inhibitor, IkappaBalpha permitting the NFkappaB-dependent transcription.Recently, chromatin associated functions for IKK have been described, resulting in the transcriptional activation of NFkappaB dependent and independent genes.We have described that colorectal tumour cells have and aberrant nuclear IKKalpha activity that phosphorylates Nuclear Co-repressors (NCoRs), inducing its cytoplasmic export and the derepression of different genes, among them the Notch target genes: hes1, herp2 and hes5, that are related with the maintenance of the undifferentiated phenotype of intestinal cells.In addition, we have demonstrated that IKK activity restores the normal expression of these Notch target genes and decrease the proliferation of tumour cells "in vitro" and "in vivo". However, the IKK inhibitors can not be used as therapeutically agents due to their toxicity derived from the total inhibition of NFkappaB signalling. For this reason is crucial to define the tumorigenic properties of IKK proteins, in order to specifically inhibit them, without affecting the IKK physiological role.Nowadays, the project is focused in determining how the IKKalpha is activated in colorectal cancer. Our preliminary results suggest that colorectal cancer cells contain a truncated form of IKKalpha that when becomes activated preferentially localizes in the nucleus and differs from the full-length form in several biochemical and functional properties. This truncated IKKalpha does not participate in the activation of NFkappaB but displays specific activities that have been associated with cancer such as phosphorylation of the nuclear co-repressors. Moreover, expression of the truncated IKKalpha, but not the full-length IKKalpha, increases the transformation capacity of k-ras in NIH-3T3, suggesting a tumorigenic potential for this IKKalpha isoform.

1 INTRODUCCIÓNEl cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa de diagnóstico de cáncer en todo el mundo. El 11-27% de pacientes se diagnostican en estadio avanzado o metastático. De los inicialmente diagnosticados de CCR localizado, un 25-50% acabarán presentando metástasis. En los últimos años hemos asistido a un leve decremento de la incidencia y de la mortalidad por CCR, probablemente debido a la mejora en los programas de ¨screening¨ y a las mejoras en las estrategias terapéuticas. El CCRM tiene un pronóstico pésimo. La supervivencia global se sitúa entre los 5-6 meses, en pacientes que no reciben tratamiento. En los últimos años, la implementación de las nuevas terapias ha elevado esta media hasta los 15-18 meses. En la actualidad, ¿existe alguna manera para reconocer con que tipo de CCRM estamos tratando? ¿Cómo podemos determinar de antemano como se comportará el CCRM, en términos de pronóstico y respuesta a los tratamientos? Hasta la fecha se han realizado multitud de estudios con la intención de determinar factores pronósticos y predictivos de respuesta en CCRM. En el texto se recogen detalladamente los más importantes. Sin embargo, existen diferentes factores que explican que estos factores no se hayan implementado en la práctica clínica habitual. Entre ellos está la falta de estudios clínicos prospectivos confirmativos y, por otra parte está la heterogeneidad que impera a la hora de realizar los estudios sobre marcadores. Para solventar este último punto, el Nacional Cancer Institute ha creado unas guías a seguir (REMARK). Actualmente hace falta diseñar convenientemente estudios prospectivos confirmativos. En el Hospital Clínic de Barcelona hemos desarrollado (2001) un algoritmo terapéutico basado en el patrón de metástasis al debut de la enfermedad y los algunos de los factores más utilizados como pronósticos. 2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS: En nuestra hipótesis, hemos seleccionado dos determinantes moleculares (MMP-7 y sFAS/sFASL) como potenciales marcadores pro'osticos y predictivos de respuesta a terapia en CCRM. Matrilisina o metaloproteasa-7 (MMP-7) es una enzima proteolítica perteneciente a la familia de las metaloproteasas. Es sintetizada y secretada al medio por células tumorales. Detalles sobre la regulación de su expresión y función pueden hallarse en el texto original. Entre sus actividades destacamos su capacidad de cortar la proteína de membrana FASL. El receptor FAS y su ligando FASL son receptores transmebrana. Su interacción induce la activación de la vía extrínseca de apoptosis. Existen fracciones solubles de estas proteínas: sFAS y sFASL. sFAS es resultante de fenómenos de "splicing" alternativo. Su función es predominantemente proapoptótica. sFASL resulta de cortar la proteína de membrana, a cargo de proteasas como MMP-7. La función de sFASL es básicamente antiapoptótica. Las fracciones solubles pueden anularse entre sí. Su función final depende de los balances entre ellas, por lo que el ratio pude ser un estimador de la función apoptótica final. FAS y FASL son proteínas que se han relacionado con la respuesta apoptótica al tratamiento quimioterápico. El CCRM muestra un patrón de resistencia a la inducción de apoptosis vía FAS-FASL. El papel de las formas solubles sFAS y sFASL en quimioresistencia nunca ha sido evaluado. MMP-7 se ha relacionado con un fenotipo agresivo de CCRM, aunque también con quimioresistencia, debido a su capacidad de corte de FASL. Los niveles séricos de sFAS han demostrado estar aumentados en pacientes con CCRM. La medición de los niveles séricos de sFASL y MMP-7 nunca se ha llevado a cabo en pacientes con CCRM.Nuestra hipótesis es que los niveles séricos de MMP-7, sFAS y sFASL en pacientes con CCRM puden ser marcadores biológicos que estimen la agresividad y la quimioresistencia. A modo de concepto nuevo y, teniendo en cuenta que el tumor varía en el tiempo, está el hecho que los marcadores biológicos deberían poderse obtener no solo en el momento del diagnóstico sino en cualquier momento durante la evolución de la enfermedad. Si esto fuera así, el método de obtención debería ser fácil y no invasivo. Los niveles séricos de MMP-7, sFAS y sFASL y sus variaciones durante el tiempo deberían ser predictores de quimioresistencia en CCRM en cualquier momento durante la enfermedad.Los objetivos se pueden resumir en:A) Determinar si los niveles séricos basales de MMP-7 en pacientes con CCRM y establecer su valor pronóstico. B) Determinar los niveles séricos de sFAS y sFASL en pacientes con CCRM, antes y durante el tratamiento quimioterápico, y establecer una correlación con la respuesta tumoral, de manera que podamos valorar su papel como marcador predictivo de respuesta. C) En función de los resultados obtenidos, diseñar estudios clínicos prospectivos para validar el valor de los niveles séricos de MMP-7 y sFAS/sFASL como nuevos marcadores solubles de pronóstico y respuesta al tratamiento en CCRM. 3. RESULTADOS: Los resultados han sido hechos públicos en dos artículos, uno de ellos aparecido en 2005 y otro de ellos en prensa. Ambos se recogen en la tesis. 4. CONCLUSIONES: En resumen, concluimos que:-MMP-7 puede medirse en el suero y sus niveles basales son un factor pronóstico independiente en pacientes con CCRM.-Las variaciones de los niveles séricos de sFAS/FASL en pacientes con CCRM en tratamiento quimioterápico correlacionan con la respuesta tumoral.-La detección de un descenso del los valores séricos del ratio sFAS/sFASL, habitualmente debido al incremento de sFASL, se relaciona con quimioresistencia.-Los valores séricos del ratio sFAS/sFASL podrían utilizarse como un predictor dinámico de respuesta al tratamiento quimioterápico en pacientes con CCRM y su valor debería validarse en estudios clínicos prospectivos. -Nuestras observaciones, en los campos básico y clínico, indican que MMP-7 estaría implicada en quimioresistencia primaria o intrínseca y adquirida, en CCRM.-Una hipótesis generada "de novo" es que un patrón sérico consistente en niveles altos de MMP-7 y de FASL, tanto si se detecta antes de iniciar el tratamiento como durante éste, implicaría qumioresistencia y, en consecuencia, mal pronóstico. -MMP-7 y sFAS/sFASL, los nuevos marcadores solubles que proponemos, se pueden detector fácilmente a través de una técnica no invasiva.-MMP-7 y sFAS/sFASL, los nuevos marcadores solubles propuestos, se pueden detectar en cualquier momento a lo largo de la enfermedad y refleja la biología tumoral cambiante, de una manera dinámica. -De acuerdo a los resultados presentados y las hipótesis generadas a partir de éstos, hemos diseñado estudios clínicos prospectivos para determinar la relevancia clínica de los niveles séricos de MMP-7 y sFAS/sFASL, como nuevos marcadores solubles de quimioresistencia en CCRM.

DE LA TESI:El diagrama complet de les pertorbacions genètiques i epigenètiques que afecten el càncer colorectal (CCR) està lluny de ser totalment conegut. L'LOH és una de les alteracions més recurrents en CCR així com en d'altres neoplàsies. Acostuma a ser un bon indicador de la presència de gens rellevants per a la carcinogènesi. L'estudi de les alteracions somàtiques en gens situats en aquestes regions recurrents de desequilibri al·lèlic ha estat fonamental en el passat per la identificació d'alguns dels gens supressors tumorals més coneguts, com és el cas de p53, Smad4, p16, APC o Rb. Els desequilibris al·lèlics a 4p s'han associat amb una major agressivitat i un pitjor pronòstic en pacients de CCR, malgrat que els gens diana d'aquests alteracions resten encara per ser identificats. En aquesta tesi s'ha dut a terme un treball d'anàlisi genètica integral per a una regió crítica situada a 4p15 am la intenció de localitzar-hi els gens que més probablement estiguin contribuint a la progressió tumoral. Hem realitzat un exhaustiu treball d'al·lotipat mitjançant la utilització de marcadors microsatèl·lit, sobre un model de tumors xenoempeltats en ratolins atímics. Hem identificat una regió crítica en al que els gens candidats han estat analitzats d'acord a les seves possibles alteracions somàtiques genètiques i/o epigenètiques. També hem analitzat els patrons d'expressió dels gens candidats per tal d'identificar possibles alteracions transcripcionals. Mitjançant prediccions de regulació transcripcional bioinformàtiques hem trobat que PI4K2B i STIM2 són dos gens regulats per TCF4/B-catenina. Això ha estat confirmat mitjançant immunoprecipitació de cromatines. Hem avaluat el valor pronòstic de les alteracions en aquests dos gens i el seu valor com predictors de la resposta al tractament basat en el 5-FU de pacients de CCR. A més, hem realitzat experiments de depleció mitjançada per siRNA sobre línies cel·lulars de CCR, alhora que hem transfectat de forma estable aquests dos gens. Finalment hem realitzat assajos de formació de tumors en ratolins immunodeprimits per comprovar si la sobreexpressió dels nostres gens candidats té o no un efecte en la formació dels tumors generats a partir de línies cel·lulars. Els patrons de LOH identificats a 4p descarten que, com s'havia proposat, es doni en l'estadi metastàtic una acumulació d'aquestes alteracions. L'LOH detectat no correlaciona amb la dosi gènica, és a dir que les pèrdues d'heterozigositat no comporten una pèrdua de material genètic i probablement són la conseqüència de processos de recombinació mitòtica i/o pèrdua i duplicació associats a un escenari d'inestabilitat cromosòmica. Els gens d'aquesta regió crítica no són portadors de mutacions, microdelecions ni delecions en homozigosi, ni tampoc presenten alteracions en els patrons de metilació de les seves regions promotores. Per contra, vam trobar que PI4K2B i STIM2 estaven significativament sobreexpressats en pacients afectes de CCR i metàstasi hepàtiques (MH) independentment de la presència o no d'LOH, i que, a més, la seva transcripció estava sot control del complex TCF4/B-catenina. Els nivells elevats de PI4K2B, tant de proteïna com d'mRNA estan assocats a un millor pronòstic i una millor resposta al tractament quimioteràpic dels pacients de CCR. Finalment, els estudis de depleció amb siRNA han demostrat que el silenciament d'aquests dos gens comporta un increment significatiu de la proliferació cel·lular i que la sobreexpressió en línies cel·lulars de STIM2 resulta en una disminució del volum tumoral i per tant té un efecte de supressió de la proliferació. Conclusions: Hem identificat PI4K2B i STIM2 com a gens diana de les alteracions recurrents a 4p15 i hem demostrat que són dianes transcripcional de la via de B-catenina. La sobreexpressió d'aquests dos gens té un efecte supressor de la proliferació cel·lular, que alhora, té un impacte en el pronòstic i el tractament dels pacients de càncer colorectal.

La via Ras-Raf-MAPK regula funcions cel·lulars com la proliferació, la transformació o l'apoptosi. En càncer sol presentar mutacions activants en algun dels tres gens que codifiquen per a Ras (KRAS, HRAS y NRAS) i en un dels gens que codifiquen per a Raf (BRAF). A més, les mutacions de Ras i Raf són events alternatius ja que mai es donen a la vegada en un mateix tumor, suggerint que aquestes mutacions activen a la mateixa via. En càncer colorectal (CCR) la mutació puntual de BRAF V600E s'associa significativament als casos que presenten inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) que solen presentar mutacions per inserció o deleció a seqüències repetitives.En aquesta tesi hem volgut determinar possibles associacions moleculars o clínico-patològiques de la mutació V600E que permetin explicar l'alta capacitat tumorogènica d'aquesta mutació en aquest tipus específic de tumor. Així, en càncer gàstric, que en MSI presenta un patró mutacional molt semblant al colorectal, no hem detectat mutacions de BRAF, ni en casos estables (MSS) ni en MSI, mentre que si que hem confirmat l'associació d'aquesta mutació a MSI en CCR. Sorprenentment, les mutacions de KRAS en càncer gàstric també s'associen significativament a MSI, mentre que en CCR es troben a ambdós fenotips (MSS i MSI). Per un altre costat, en CCR MSI esporàdic, que sol estar provocat per l'hipermetilació del gen MLH1, no hem trobat cap associació de BRAF-V600E amb mutacions als gens KRAS, APC ni p53. En canvi, si que hem detectat una clara associació de V600E amb l'hipermetilació de MLH1. A més, analitzant els mateixos tumors per la metilació dels gens p16, p14, RASSF1A, APC, MGMT i THBS1 hem associat BRAF-V600E i l'hipermetilació de MLH1 a un estat d'hipermetilació genòmica. D'una altra banda, no hem trobat cap associació de BRAF amb cap característica clínico-patològica a excepció de la localització ja que BRAF-V600E es detecta significativament en els casos proximals. També hem analitzat casos de CCR de pacients HNPCC, que tenen MSI per mutacions germinals enlloc de per metilació. No hem detectat cap mutació V600E de BRAF en aquests tumors, tant si tenen mutacions germinals a MLH1, MSH2 o MSH6 o no tenen mutació coneguda però compleixen criteris clínics com els d'Amsterdam o els de Bethesda més estrictes. Això confirma que V600E no es dóna específicament als casos MSI sinó en els casos amb hipermetilació de MLH1, i que aquests solen tenir més metilació genòmica que la resta de tumors.Apart, també hem analitzat KRAS en casos de CCR MSS, MSI esporàdics amb i sense hipermetilació de MLH1 i HNPCC. Així, la freqüència de mutacions a KRAS és més alta si no hi ha hipermetilació de MLH1, independentment del seu origen esporàdic o hereditari. No obstant, en els casos esporàdics aquestes mutacions afecten sobretot al codó 12 mentre que en els casos hereditaris afecten al codó 12 i al 13 equitativament. A més, els casos HNPCC amb mutació a MLH1 tenen una freqüència de mutacions a KRAS menor que si la mutació germinal té lloc a MSH2 o MSH6. Finalment, les diferències mutacionals de KRAS i BRAF en CCR esporàdic i hereditari suggereixen una modulació diferent de la via Ras-Raf-MAPK així com una possible activació d'altres vies moleculars alternatives depenent de l'estat en que es trobi el fons genètic i epigenètic del tumor. A més, l'absència total de la mutació V600E de BRAF a HNPCC la converteix en una eina fiable, ràpida i de baix cost per al diagnòstic molecular com a criteri d'exclusió de càncer familiar. / The Ras-Raf-MAPK pathway regulates functions such as cell proliferation, transformation and apoptosis. In cancer activating mutations are present in the three Ras genes (KRAS, HRAS and NRAS) and in one Raf gene (BRAF). Moreover, Ras and Raf mutations hardly ever are found together in the same tumor suggesting that they activate the same pathway. In colorectal cancer (CRC) the BRAF hotspot mutation V600E is associated to microsatellite instability (MSI), which is characterised by insertion/deletion mutations in repetitive sequences. Here we have determined possible molecular or clinico-pathological associations of V600E to understand its higher tumorogenic capabilities in this subset of tumors.We found that BRAF was not mutated in gastric cancer with MSI or without (MSS), although gastric and colorectal MSI tumors presented the same mutational patterns. Interestingly, gastric cancer only presented KRAS mutations in MSI tumors. Furthermore, in sporadic MSI CRC (which is usually caused by MLH1 hypermethylation) BRAF-V600E was not associated to KRAS, APC or p53 mutations but it was to MLH1 hypermethylation and to genomic hypermethylation after analysing p16, p14, RASSF1A, APC, MGMT and THBS1. In addition, V600E was associated significantly to tumors located in the proximal colon. Moreover, tumors from HNPCC (a hereditary form of MSI cancer caused by germline mutations in mismatch repair genes) never had V600E mutations.We have also analysed KRAS in CRC showing MSS, sporadic MSI with or without MLH1 hypermethylation and HNPCC. We found that KRAS mutation frequency is higher if MLH1 is not hypermethylated, independently of its sporadic or hereditary origin. And although in sporadic tumors these mutations are located in codon 12, in the hereditary ones they are located in codons 12 or 13 equally. Furthermore, HNPCC tumors carrying germline MLH1 mutations have less KRAS mutations than tumors with germline mutations in MSH2 or MSH6. Finally, we concluded that KRAS and BRAF differences in sporadic and hereditary CRC suggest a different Ras-Raf-MAPK modulation and possible alternative activation pathways depending on the genetic and epigenetic background of the tumor. Moreover, V600E is a reliable, fast and cheap tool for HNPCC diagnosis to exclude a hereditary origin.

Les mutacions germinals en el gen APC són les responsables de la majoria de casos de poliposi adenomatosa familiar. APC participa en diferents processos cel·lulars que inclouen la regulació del cicle cel·lular, l'apoptosi, l'adhesió cel·lular, la migració cel·lular, la transducció de senyals, l'acoblament de microtúbuls i la segregació dels cromosomes. Encara que tots aquests processos estan potencialment lligats amb el càncer, sembla que la funció supressora tumoral del gen resideix en la seva capacitat per regular de manera acurada els nivells intracel·lulars de la β-catenina, component central de la via de Wnt. Aquesta via és important en el desenvolupament embrionari per determinar llinatges cel·lulars específics i en l'homeòstasi cel·lular de determinats teixits com la mucosa intestinal. A part del seu paper clau en la via de Wnt, APC participa en la inestabilitat cromosòmica del càncer colorectal, encara que els mecanismes concrets a través dels quals actua són encara desconeguts en bona part. Els resultats descrits en els tres capítols d'aquesta tesi donen lloc al concepte global que és en les lesions benignes del còlon, els adenomes, ja siguin de pacients de FAP com de càncer colorectal esporàdic, on s'acumulen gran nombre d'alteracions genètiques que afecten a mecanismes molt diversos del funcionament cel·lular, essent especialment importants aquelles alteracions que afecten a la via de Wnt. Totes les alteracions detectades permeten la progressió tumoral ja que afecten a la proliferació, mitosi i moltes altres funcions importants per la cèl·lula. El coneixement de les alteracions moleculars que afecten als adenomes és important per proporcionar més evidències dels mecanismes moleculars i cel·lulars implicats en els primers estadis de la progressió tumoral i donar lloc a noves estratègies de diagnòstic precoç i teràpies preventives, tan importants en la lluita contra el càncer. / Classical Familial Adenomatous Polyposis (FAP) syndrome is caused by APC germline mutations. APC plays important roles in different cellular processes such as cell cycle regulation, apoptosis, cellular adhesion, cellular migration, signal transduction, microtubule binding and chromosome segregation. Although all these processes are potentially related to cancer, it seems that the main tumoral suppressor activity is mediated by its capacity to accurately regulate the β-catenin intracellular levels, which is a central member of the Wnt signalling pathway. This pathway is important in the embryonic development and in cellular homeostasis in certain tissues such as intestinal mucosa. In colorectal cancer, APC is not only believed to be playing a key role in Wnt signalling, but also it is important in chromosomal instability (CIN), although the mechanisms in which APC is participating are still largely unknown.The results presented in this thesis and divided in 3 chapters give us the general idea that in the benign lesions of the colon, called adenomas, in FAP and in sporadic colorectal cancer patients, is where a great number of genetic alterations are accumulated affecting different functional mechanisms in the cell. Those aberrations that alter the Wnt signalling pathway are especially important in the process of tumorigenesis. All the reported alterations enable the tumoral progression because they target proliferation, mitosis and other important functions of the cell. A better understanding of the molecular defects in adenomas is crucial to discover all the molecular and cellular mechanisms operating in the early stages of colorectal cancer and give clues for early diagnosis and prevention.

Les mutacions germinals d'elevada penetrància del gen APC que originen una proteïna truncada són les responsables de la majoria de casos de poliposi, mentre que les variants missense, que canvien un aminoàcid de la proteïna, es detecten en una minoria dels casos. S'han identificat diverses variants missense en el gen APC, però el seu potencial patogènic és encara motiu de controvèrsia, el què limita la utilitat de la seva detecció en el consell genètic. L'estudi de la presència de les variants en la població control i en les diferents poblacions de càncer colorectal (CCR) esporàdic i hereditari, juntament amb la realització d'anàlisis funcionals, podrien ajudar a conèixer l'impacte de les variants del gen APC en el desenvolupament del CCR. El nostre objectiu és determinar el significat funcional de les variants identificades en el gen APC en pacients afectes de poliposi adenomatosa familiar en relació al risc de desenvolupar CCR tant esporàdic com hereditari.L'anàlisi molecular de la regió codificant del gen APC realitzat en 138 famílies amb poliposi adenomatosa familiar clàssica (n= 98) i poliposi adenomatosa familiar atenuada (n= 40) ha permès la identificació de deu variants missense del gen APC: G101E, K957N, N1026S, L1129S, I1307K, E1317Q, D1822V, A2274V, G2502S i P2681L. En el nostre estudi s'han caracteritzat amb diferent profunditat set d'aquestes deu variants: G101E, N1026S, L1129S, D1822V, A2274V, G2502S i P2681L. La variant APC G101E, identificada en una família de poliposi clàssica, no s'associa a la malaltia ni sembla tenir cap funció modificadora del fenotip de poliposi. L'efecte biològic de les variants APC A2274V i APC P2681L, identificades en dues famílies de poliposi, és encara desconegut. La variant APC G2502S és un polimorfisme que no sembla tenir rellevància clínica. La variant APC L1129S, identificada en dues famílies de poliposi, no altera la interacció de la proteïna APC 4x15 amb la beta-catenina. La variant APC D1822V és un polimorfisme que incrementa el risc de desenvolupar CCR en pacients amb història prèvia d'adenomes i no s'associa amb la història familiar de CCR. La variant APC N1026S, que està present de forma exclusiva en una família de poliposi adenomatosa familiar atenuada, disminueix la unió d'APC amb beta-catenina i activa moderadament la transcripció mitjançada pel complex beta-catenina/Tcf-4. Aquests resultats indiquen que la variant APC N1026S és patogènica i és la mutació responsable del desenvolupament de la poliposi atenuada a la família on es va identificar.La caracterització funcional de les variants del gen APC és de gran importància per conèixer la seva contribució en el desenvolupament de la poliposi i facilitar l'assessorament genètic. / Truncating germline mutations in the APC gene are responsible for the majority of Familial Adenomatous Polyposis (FAP) cases, while in a minority of cases missense mutations, leading to single amino acid changes, are detected. Germline missense variants in the APC gene have been reported although their contribution to FAP is controversial, limiting their use in genetic counseling. The aim of this thesis is to determine the functional relevance of the variants identified in the APC gene in FAP patients in order to establish its pathogenicity.The molecular analysis of the APC gene was performed in 138 classical (n= 98) and attenuated (n= 40) FAP families and allowed the identification of ten missense variants. In this thesis, seven out of these ten APC variants have been characterised: G101E, N1026S, L1129S, D1822V, A2274V, G2502S and P2681L. The APC G101E variant, identified in a classical FAP family, is not associated with the disease. The biological effect of APC A2274V and APC P2681L variants, identified in two FAP families, remains unknown. The APC G2502S variant is a polymorphism without clinical relevance. The APC L1129S variant, identified in two FAP families, does not modify the interaction of the APC 4x15 protein with beta-catenin. The APC D1822V variant is a polymorphism associated with an increased risk of adenoma transformation and does not associate with family history of colorectal cancer. The APC N1026S variant, identified for the first time in an attenuated FAP family, diminishes beta-catenin binding to APC and moderately activates beta-catenin/Tcf-4-mediated transcription. These findings strongly support a pathogenic role of the APC N1026S variant in the AFAP phenotype.In summary, functional characterization of APC variants is crucial to elucidate their contribution to FAP and improve genetic counseling.

El càncer colorectal és una de les neoplàsies més prevalents als països occidentals. Des d'un punt de vista epidemiològic es pot classificar el CCR en 5 grups: esporàdic, familiar, hereditari no associat a poliposi (CCHNP), associat a poliposi adenomatosa familiar (PAF) i associat a la malaltia inflamatòria intestinal. Actualment no es coneix la incidència d´aquests 5 grups de CCR a Espanya ja que la majoria d'estudis han estat realitzats als Estats Units o en països del nord d'Europa. El CCHNP és el tipus més freqüent de CCR hereditari, oscil·lant entre l'1 i el 5% dels total de casos de CCR i les mutacions germinals en els gens reparadors dels errors de replicació de l'ADN, principalment MSH2 i MLH1, constitueixen la seva base genètica. La instauració dels criteris d'Amsterdam va ser cabdals per a definir el CCHNP i identificar la seva base molecular. Posteriorment aquests criteris varen ser modificats per considerar-se massa restrictius (criteris d´Amsterdam II). Després, l'any 1996, el National Cancer Institute va proposar els criteris de Bethesda, els quals tenien com objectiu identificar aquells pacients amb una major probabilitat de CCHNP i que haurien de ser avaluats mitjançant estudi d'inestabilitat de microsatèl·lits i/o anàlisi genètic. Aquests criteris han estat recentment revisats, però fins a l'actualitat no s'ha avaluat el seu rendiment. En relació a la base molecular de la síndrome de Lynch o CCHNP se sap que més del 90% de casos presenta inestabilitat de microsatèl·lits, pel que determinar si un tumor presenta aquesta alteració pot ser una estratègia adequada per a seleccionar els individus tributaris d'ulterior estudi genètic. Per altra banda, la majoria de mutacions en els gens MSH2 i MLH1 comporten l'anul·lació de l'expressió de les proteïnes codificades per aquests. D´aquesta manera, l´absència d'expressió de les proteïnes reparadores de l'ADN determinada mitjançant tècniques immunohistoquímiques podria traduir la presència d'inestabilitat de microsatèl·lits. Fins el moment actual no hi ha una estratègia definida per a identificar aquests individus ni indicar quins serien tributaris d´anàlisi genètic.Un altre aspecte a tenir present és que els pacients amb antecedent de neoplàsia colorectal tenen un major risc de presentar una neoplàsia sincrònica o metacrònica, situació coneguda com a multicentricitat tumoral. En el primer estudi es demostra que un 2,5% dels casos de CCR diagnosticats de novo a Espanya acompleixen els criteris clínics de CCHNP (criteris d'Àmsterdam II), una xifra semblant a la d'estudis realitzats a altres països occidentals. Per altra banda, , prop d'un 20% del total de CCR acompleixen els criteris de Bethesda i, conseqüentment, haurien de ser sotmesos a un estudi molecular.En el segon estudi remarca la importància d'identificar pacients amb CCR i tendència a desenvolupar una segona neoplàsia colorectal. Els resultats mostren que l'antecedent personal d'adenoma colorectal i les característiques del tumor primari (la localització proximal, l´estadi TNM II i la presència de component mucós) es correlacionen amb la mutlicentricitat tumoral, en quant a l'existència d'adenomes o carcinomes colorectals sincrònics en els pacients amb CCR.El tercer estudi posa de manifest que la freqüència de CCHNP associat a MSH2 / MLH1 a Espanya és del 0,9%. A més els resultats de l´estudi suggereixen que l´estudi de la IMS i la IHQ de proteïnes reparadores són estratègies equivalents en termes d'eficàcia i cost-eficàcia, i que quan qualsevol d'aquests mètodes es realitza en pacients prèviament seleccionats d'acord als criteris revisats de Bethesda el seu rendiment encara és més alt. per a la identificació dels pacients amb CCHNP associat a MSH2/MLH1. Considerant aquesta equivalència, i donada la major facilitat per a realitzar IHQ que estudis d´IMS en la pràctica clínica diaria, l'aplicació dels criteris de Bethesda seguit de la IHQ per a MSH2 / MLH1 pot ésser una alternativa vàlida per al cribratge del CCHNP..

In the intestinal epithelium, Wnt signaling drives the expression of the genes encoding tyrosine kinase receptors EphB2 and EphB3 and represses the expression of their membrane-tethered ligands, ephrin-Bs. Eph-ephrin interactions result in cellular repulsion and are involved in boundary formation. The project of this thesis is to understand the mechanism by which EphB−ephrin-B signals restrict cell positioning of cell types (cell sorting) in the normal intestinal epithelium and suppress colorectal cancer (CRC) progression beyond the earliest stages. We have demonstrated that at the onset of CRC EphB receptors impair the expansion of tumor cells through a mechanism dependent on E-cadherin–mediated adhesion. We show that EphB-mediated compartmentalization restricts the spreading of EphB+ tumor cells into ephrin-B1+ territories in vitro and in vivo. Our results indicate that CRC cells must silence EphB expression to avoid repulsive interactions imposed by normal ephrin-B1+ intestinal cells at the onset of tumorigenesis. We have discovered that cell sorting is the outcome of two integrated mechanisms: cell contraction/repulsion and differential cell adhesion. The latter is the driving force to induce EphB/ephrin-B−mediated cell compartmentalization. We have developed in vitro models to analyze the mechanisms that induce E-cadherin remodeling upon EphB activation. We found RhoA, p120-catenin and the metalloproteinase ADAM10 as downstream effectors of EphB signaling involved in the control of cell sorting in CRC cells. / A l'epiteli intestinal, la ruta de senyalització Wnt indueix l'expressió dels gens que codifiquen per als receptors tirosina kinasa EphB2 i EphB3 i reprimeixen la dels seus lligands transmembrana, efrines de tipus B. Les interaccions Eph-efrina causen repulsió cel·lular i estan implicades en la formació de fronteres entre compartiments. La finalitat d'aquesta tesi és entendre el mecanisme pel qual la senyalització per EphB−efrina-B restringeix el posicionament dels diferents tipus cel·lulars a l'epiteli intestinal normal i suprimeix la progressió del càncer colorectal (CRC) en els primer estadis. Hem demostrat que, a l’inici del CRC, els receptors EphB restringeixen l'expansió de les cèl·lules tumorals a través d'un mecanisme depenent d'adhesió intercel·lular a través d’E-cadherina. En aquest treball es mostra in vitro i in vivo que la compartimentalització mitjançada per la senyalització dels receptors EphB restringeix l’invasió de les cèl·lules tumorals EphB+ als territoris efrina-B+. Aquests resultats indiquen que les cèl·lules de CRC han de silenciar l’expressió d'EphB per evitar les interaccions repulsives imposades per les cèl·lules intestinals normals efrina-B+ circumdants al començament del procés de tumorigènesi. Hem pogut discernir que el reordenament cel·lular per senyals EphB−efrina-B és el resultat de dos mecanismes integrats: la contracció/repulsió intercel·lular i l’adhesió diferencial entre diferents poblacions cel·lulars. Aquesta última és la força principal que condueix a la compartimentalització cel·lular mitjançada per EphB−efrina-B. Hem desenvolupat models in vitro per analitzar els mecanismes que provoquen el remodelament de la E-cadherina sota la senyalització per EphB. Presentem RhoA, p120-catenina i ADAM10 com a efectors de la senyalització de la ruta EphB implicats en el control de la compartimentalització cel·lular en el CRC.