Entre as hospedeiras de invasão sistêmica do vírus do mosaico do mamoeiro - estirpe mamoeiro (Papaya ringspot virus type P; PRSV-P) encontram-se espécies de cucurbitáceas, cuja suscetibilidade à transmissão experimental, mecânica e com afídeos, é variável. A literatura nacional e internacional apresenta resultados distintos quanto à recuperação desse vírus a partir de cucurbitáceas presentes próximas ou no interior de plantios de mamoeiros infectados com esse vírus. O presente trabalho teve como objetivo avaliar em casa de vegetação a suscetibilidade de quatro espécies de cucurbitáceas a cinco isolados do PRSV-P obtidos de diferentes regiões do Brasil e inoculados de forma mecânica. Visou também estudar a infecção natural de cucurbitáceas cultivadas nas entrelinhas ou próximas de mamoeiros com mosaico. Para o desenvolvimento do trabalho em casa-de-vegetação os isolados do PRSV-P mantidos em mamoeiros, foram inoculados nos cotilédones de abobrinha de moita cv. Caserta, moranga cv. Exposição, pepino híbrido Primepack Plus e melancia cv. Crimson Sweet. As plantas foram avaliadas com base nos sintomas e indexadas por PTA-ELISA, e recuperação biológica do biótipo P do PRSV através de inoculações em mamoeiro. A confirmação da infecção dos mamoeiros foi realizada da mesma forma, por sintomatologia e indexação por PTA-ELISA. A abobrinha de moita foi a espécie mais suscetível aos cinco isolados do PRSV-P, seguida da melancia e do pepino. Não foi possível transmitir o vírus a moranga cv. Exposição. Para estudar a infecção natural realizou-se um ensaio com plantas de abobrinha de moita em Linhares-ES, três ensaios independentes em Rinópolis-SP e quatro em Piracicaba-SP, incluindo-se nessa última localidade a melancia e o pepino. Depois de aproximadamente 40 a 60 dias de exposição em campo coletaram-se amostras individuais ou compostas (de 3 a 5 plantas) das folhas dos ponteiros das plantas para realizar a recuperação biológica do PRSV-P para mamoeiros em casa de vegetação. A presença de afídeos foi monitorada em Piracicaba durante a execução dos experimentos no campo. No único teste de exposição em Linhares, nenhuma planta de abobrinha cultivada entre mamoeiros com mosaico mostrou-se infectada com esse vírus. O PRSV-P foi recuperado da abobrinha de moita em proporções variáveis em 2 dos 3 testes realizados em Rinópolis, e em 3 dos 4 testes realizados em Piracicaba. Nenhuma planta de melancia e pepino cultivada entre mamoeiros com mosaico foi infectada com o PRSV-P. Não foi possível recuperar o PRSV-P de nenhuma planta de abobrinha cultivada entre 5 e 80 metros de distância dos mamoeiros com mosaico em Piracicaba. Foram capturados afídeos vetores do PRSV-P e foi possível detectar plantas infectadas com os potyvirus PRSV-W e ZYMV, o que demonstra a presença e atividade dos vetores de vírus. Os resultados confirmaram a suscetibilidade variável das espécies de cucurbitáceas ao PRSV-P. Embora a abobrinha de moita fosse a única espécie encontrada naturalmente infectada pelo PRSV-P quando cultivada entre linhas de mamoeiro com mosaico, a presença de cucurbitáceas nos campos de produção de mamoeiro, especialmente quando o controle do mosaico do mamoeiro é feito através do roguing, não é recomendada. / Besides Carica papaya, Papaya ringspot virus type P (PRSV-P) infects systemically only species belonging to the family Cucurbitaceae. Their susceptibility varies according to the species/cultivar, virus isolate and the method of inoculation. Attempts to recovery PRSV-P from naturally infected cucurbit plants grown near to or among diseased papaya trees have shown distinct results worldwide. This study aimed to evaluate the susceptibility of Cucurbita pepo cv. Caserta, Cucurbita maxima cv. Exposiçao, Cucumis sativus hybrid Primepack Plus, and Citrullus lanatus cv. Crimson Sweet to five isolates of PRSV-P obtained from different regions of Brazil. It was also evaluated the natural infection of cucurbit plants grown between rows and in the vicinity of papaya trees infected with PRSV-P. The five PRSV-P isolates were maintained in papaya plants. Cucurbit plants grown in pots under greenhouse conditions were mechanically inoculated with each isolate at the cotiledonary stage. The plants were assessed based on symptoms and infection was confirmed by PTA-ELISA using extracts from the inoculated cotyledons and upper leaves. The same extracts were also mechanically inoculated on papaya plants in order to recover the virus isolate. Inoculated papaya plants were also tested by PTA-ELISA. Zucchini squash was the most susceptible species to PRSV-P, followed by watermelon and cucumber. Pumpkin cv. Exposição was not infected. To study the natural infection of zucchini squash cv. Caserta by PRSV-P, a trial was carried out in Linhares, State of Espírito Santo; three independent trials were carried out in Rinópolis; and four trials were carried out in Piracicaba, both regions located in the State of São Paulo. Watermelon and cucurbit were also included in some trials in Piracicaba. After approximately 40 to 70 days, leaf samples were collected and tested individually or in groups of three to five plants for the presence of PRSV-P by mechanical inoculation on papaya plants under greenhouse conditions. None of the zucchini squash plants grown between rows of infected papaya trees in Linhares was found infected by PRSV-P based on the virus recovery test to papaya plants. The virus was also not recovered from watermelon and cucurbit plants grown between rows of infected papaya trees in Piracicaba. On the other hand, PRSV-P was recovery from zucchini squash plants grown intercalated with diseased papayas in Rinópolis and Piracicaba. The number of infected plants varied among the trial. Several attempts to recover PRSV-P from innumerous zucchini squash plants grown approximately five to 80 meters from diseased papaya trees in Piracicaba failed. Alates of several species of aphids were captured in the field at Piracicaba. Also, innumerous cucurbit plants were found infected by the potyviruses Papaya ringspot virus type W and Zucchini yellow mosaic virus, suggesting aphids activity in the area. The results confirmed the variable susceptibility of cucurbit species to infection with PRSV-P. Although natural infection with PRSV-P was restricted to zucchini squash cv. Caserta grown among infected papaya trees, the presence of cucurbit plants in the vicinity of papaya orchards, especially where disease control is done by systematic rouging of diseased plants, should not be allowed.

A cultura do maracujazeiro é afetada pela virose causada pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), provocando a redução da qualidade e produtividade dos frutos e, em alguns casos, pode inviabilizar o cultivo comercial desta espécie. Uma alternativa para o controle de doenças viróticas é o desenvolvimento de plantas resistentes pela transformação genética. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa), utilizando 2 construções gênicas contendo a região codificadora do gene da proteína capsidial do CABMV. A construção pCABMV-asCP, que contém um fragmento na orientação antisenso e a construção pCABMV-dsCP, que contém fragmentos senso e antisenso do gene da proteína capsidial, separados por um íntron, uma construção hairpin. Para os experimentos de transformação genética, via Agrobacterium tumefaciens, foram utilizados os explantes de segmentos de hipocótilo e discos de folhas jovens das variedades FB-100, IAC-275 e IAC-277. Após 2 - 3 dias de co-cultivo em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) contendo acetosseringona (100 mM), os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração constituído de sais minerais e vitaminas de MS, suplementado com canamicina (100 mg/L) + cefotaxima (500 mg/L) + nitrato de prata (4,0 mg/L), pH 5,8 e os reguladores BAP, TDZ e combinação de BAP e TDZ. Após 4 - 6 semanas, as gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para meio de cultura de alongamento MSM + GA3 (1,0 mg/L) + cefotaxima (500 mg/L) + nitrato de prata (4,0 mg/L). As plantas desenvolvidas foram aclimatizadas e analisadas por PCR, utilizando-se primers específicos para a detecção dos transgenes. Foram identificadas 30 plantas transgênicas PCR positivas para do gene nptII, sendo 11 positivas para o fragmento antisenso da proteína capsidial do CABMV e 2 positivas para o fragmento da construção gênica hairpin. Até o momento, a integração dos transgenes foi confirmada por Southern blot em 4 plantas. Paralelo aos experimentos de transformação genética, foram avaliadas plantas de maracujazeiro das variedades IAC-275 e IAC-277, obtidas em experimentos anteriores, com a construção gênica pCABMV-CP, que contém o gene da proteína capsidial do CABMV. A análise de Southern blot de 14 plantas destes experimentos, confirmou a integração do transgene em 13 plantas, as quais foram propagadas e inoculadas mecanicamente com 3 isolados do CABMV (SP, RJ, CE). A linhagem T16 foi resistente as 3 inoculações, com os 3 isolados testados. Clones desta linhagem foram analisados por RT-PCR, comprovando a transcrição do transgene / The yellow passionfruit is affected by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), which causes a decrease in fruit quality and productivity and in some cases making it unpractical for commercial cultivation of this species. Ann alternative for the control of virus diseases is the development of resistant plants through genetic transformation techniques. The objective of this work was to obtain passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) transgenic plants with two different gene constructs derived from the CABMV coat protein coding region. pCABMV-asCP contains the gene fragment in an antisense direction and pCABMV-dsCP contains a sense and antisense coat protein gene fragments, separated by intron, a hairpin construct. The genetic transformation experiments with Agrobacterium tumefaciens, were done in hypocotyl segments and young leaf disks explants from varieties FB-100, IAC-275 and IAC-277. After two to three days in co-culture in MS culture medium (MURASHIGE; SKOOG, 1962) supplemented with acetoseringone (100 mM) the explants were subcultured to medium for selection and regeneration, composed of MS minerals and vitamins, supplemented with kanamycin (100 mg/L), cefotaxime (500 mg/L) and silver nitrate (4.0 mg/L), at pH 5.8, and the growth regulators BAP, TDZ and combination of BAP and TDZ. After four to six weeks, the adventitious buds developed were transferred to an elongating medium composed of MSM salts supplemented with GA3 (1.0 mg/L), cefotaxime (500 mg/L) and silver nitrate (4.0 mg/L). Plants were acclimatized and analyzed by PCR, with specific primers for the transgenes detection. Thirty transgenic plants were identified as PCR positive for the nptII gene, with 11 being positive for the antisense fragment of the CABMV coat protein gene and two positive for the hairpin gene construct fragment. Currently, the transgene integration was confirmed by Southern blot analysis in four plants. Simultaneously to the genetic transformation experiments, passionfruit plants, varieties IAC-275 e IAC-277, obtained from previous experiments with pCABMV-CP, which contains CABMV coat protein gene, were analized. The Southern blot analysis of 14 plants from these experiments confirmed the transgene integration in 13 plants, which were propagated and mecanically inoculated with three CABMV isolates (SP, RJ, CE). Line T16 was resistant to three inoculations with all three isolates tested. Clones from this line were analyzed by RT-PCR which confirmed the transgene transcription

A cultura do maracujazeiro é afetada pela virose causada pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), provocando a redução da qualidade e produtividade dos frutos e, em alguns casos, pode inviabilizar o cultivo comercial desta espécie. Uma alternativa para o controle de doenças viróticas é o desenvolvimento de plantas resistentes pela transformação genética. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa), utilizando 2 construções gênicas contendo a região codificadora do gene da proteína capsidial do CABMV. A construção pCABMV-asCP, que contém um fragmento na orientação antisenso e a construção pCABMV-dsCP, que contém fragmentos senso e antisenso do gene da proteína capsidial, separados por um íntron, uma construção hairpin. Para os experimentos de transformação genética, via Agrobacterium tumefaciens, foram utilizados os explantes de segmentos de hipocótilo e discos de folhas jovens das variedades FB-100, IAC-275 e IAC-277. Após 2 - 3 dias de co-cultivo em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) contendo acetosseringona (100 mM), os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração constituído de sais minerais e vitaminas de MS, suplementado com canamicina (100 mg/L) + cefotaxima (500 mg/L) + nitrato de prata (4,0 mg/L), pH 5,8 e os reguladores BAP, TDZ e combinação de BAP e TDZ. Após 4 - 6 semanas, as gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para meio de cultura de alongamento MSM + GA3 (1,0 mg/L) + cefotaxima (500 mg/L) + nitrato de prata (4,0 mg/L). As plantas desenvolvidas foram aclimatizadas e analisadas por PCR, utilizando-se primers específicos para a detecção dos transgenes. Foram identificadas 30 plantas transgênicas PCR positivas para do gene nptII, sendo 11 positivas para o fragmento antisenso da proteína capsidial do CABMV e 2 positivas para o fragmento da construção gênica hairpin. Até o momento, a integração dos transgenes foi confirmada por Southern blot em 4 plantas. Paralelo aos experimentos de transformação genética, foram avaliadas plantas de maracujazeiro das variedades IAC-275 e IAC-277, obtidas em experimentos anteriores, com a construção gênica pCABMV-CP, que contém o gene da proteína capsidial do CABMV. A análise de Southern blot de 14 plantas destes experimentos, confirmou a integração do transgene em 13 plantas, as quais foram propagadas e inoculadas mecanicamente com 3 isolados do CABMV (SP, RJ, CE). A linhagem T16 foi resistente as 3 inoculações, com os 3 isolados testados. Clones desta linhagem foram analisados por RT-PCR, comprovando a transcrição do transgene / The yellow passionfruit is affected by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), which causes a decrease in fruit quality and productivity and in some cases making it unpractical for commercial cultivation of this species. Ann alternative for the control of virus diseases is the development of resistant plants through genetic transformation techniques. The objective of this work was to obtain passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) transgenic plants with two different gene constructs derived from the CABMV coat protein coding region. pCABMV-asCP contains the gene fragment in an antisense direction and pCABMV-dsCP contains a sense and antisense coat protein gene fragments, separated by intron, a hairpin construct. The genetic transformation experiments with Agrobacterium tumefaciens, were done in hypocotyl segments and young leaf disks explants from varieties FB-100, IAC-275 and IAC-277. After two to three days in co-culture in MS culture medium (MURASHIGE; SKOOG, 1962) supplemented with acetoseringone (100 mM) the explants were subcultured to medium for selection and regeneration, composed of MS minerals and vitamins, supplemented with kanamycin (100 mg/L), cefotaxime (500 mg/L) and silver nitrate (4.0 mg/L), at pH 5.8, and the growth regulators BAP, TDZ and combination of BAP and TDZ. After four to six weeks, the adventitious buds developed were transferred to an elongating medium composed of MSM salts supplemented with GA3 (1.0 mg/L), cefotaxime (500 mg/L) and silver nitrate (4.0 mg/L). Plants were acclimatized and analyzed by PCR, with specific primers for the transgenes detection. Thirty transgenic plants were identified as PCR positive for the nptII gene, with 11 being positive for the antisense fragment of the CABMV coat protein gene and two positive for the hairpin gene construct fragment. Currently, the transgene integration was confirmed by Southern blot analysis in four plants. Simultaneously to the genetic transformation experiments, passionfruit plants, varieties IAC-275 e IAC-277, obtained from previous experiments with pCABMV-CP, which contains CABMV coat protein gene, were analized. The Southern blot analysis of 14 plants from these experiments confirmed the transgene integration in 13 plants, which were propagated and mecanically inoculated with three CABMV isolates (SP, RJ, CE). Line T16 was resistant to three inoculations with all three isolates tested. Clones from this line were analyzed by RT-PCR which confirmed the transgene transcription

Uma das espécies que atualmente vem despertando interesse econômico por seu elevado valor de mercado é o maracuzajeiro doce (Passiflora alata Curtis). Entretanto, a cultura é afetada por diferentes doenças que prejudicam a produtividade e a qualidade dos frutos, sendo a doença causada pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) a que mais afeta a cultura do maracujazeiro no Brasil. O presente trabalho teve como objetivo a obtenção de plantas transgênicas de P. alata visando resistência ao CABMV. O processo de transformação genética utilizado foi via Agrobacterium tumefaciens, estirpe EHA105, contendo o cassete de expressão com um fragmento do gene da proteína capsidial do CABMV, numa construção tipo hairpin e o gene de seleção nptII que confere resistência ao antibiótico canamicina. Para os experimentos de transformação genética foram utilizados como explantes segmentos de hipocótilo e segmentos internodais. Após 2 a 3 dias de co-cultivo em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) contendo acetosseringona (100 mM), os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração constituído de sais minerais e vitaminas de MS, suplementado com benzilaminopurina (BAP - 1mg/L) + thidiazuron (TDZ - 0,5 mg/L) + canamicina (100 mg/L) + cefotaxima (500 mg/L) + nitrato de prata (4,0 mg/L), pH 5,8. Após 4 a 6 semanas de incubação, determinou-se o número de explantes responsivos e as gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para meio de cultura de alongamento MSM + GA3 (1,0 mg/L) + cefotaxima (500 mg/L) + nitrato de prata (4,0 mg/L). As plantas desenvolvidas foram aclimatizadas e analisadas por PCR, utilizando primers específicos para a detecção do fragmento do gene da proteína capsidial do CABMV e do gene de seleção (nptII). Foram identificadas 47 plantas transgênicas PCR positivas para do gene nptII. Até o momento, a integração do gene nptII foi confirmada por Southern blot em 9 plantas / One species that is currently attracting interest due to its high economic value is the sweet passionflower (Passiflora alata Curtis). However, the culture is affected by different diseases that harm the productivity and fruit quality. The disease caused by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) is the one that more affect the culture of passionflower in Brazil. This work aimed to obtain transgenic plants of P. alata resistant to the CABMV. The genetic transformation process was via Agrobacterium tumefaciens, strain EHA105, containing the expression cassette with a fragment of the coat protein gene of CABMV, in a hairpin construct and the selection gene nptII, which confers resistance to the antibiotic kanamycin. In the experiments of genetic transformation hypocotyl segments and internodal segments were used as explants. After 2-3 days of co-cultivation in MS medium (MURASHIGE; SKOOG, 1962) containing acetosyringone (100 mM), the explants were transferred to the selection and regeneration culture medium consisting of mineral salts and vitamins of MS medium supplemented with benzylaminopurine (BAP - 1 mg/L) + thidiazuron (TDZ - 0.5 mg/L) + kanamycin (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L) + silver nitrate (4.0 mg /L), pH 5.8. After 4-6 weeks of incubation, it was determined the number of responsive explants. Shoots developed were transferred to elongating culture medium MSM + GA3 (1.0 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L) + nitrate silver (4.0 mg/L). The developed plants were acclimatized and analyzed by PCR using specific primers to detect the fragment of CABMV and the selection gene (nptII). It was identified 47 transgenic plants PCR positive for the gene nptII. Until this moment, the integration of the nptII gene was confirmed by Southern blot in 9 plants

Entre as hospedeiras de invasão sistêmica do vírus do mosaico do mamoeiro - estirpe mamoeiro (Papaya ringspot virus type P; PRSV-P) encontram-se espécies de cucurbitáceas, cuja suscetibilidade à transmissão experimental, mecânica e com afídeos, é variável. A literatura nacional e internacional apresenta resultados distintos quanto à recuperação desse vírus a partir de cucurbitáceas presentes próximas ou no interior de plantios de mamoeiros infectados com esse vírus. O presente trabalho teve como objetivo avaliar em casa de vegetação a suscetibilidade de quatro espécies de cucurbitáceas a cinco isolados do PRSV-P obtidos de diferentes regiões do Brasil e inoculados de forma mecânica. Visou também estudar a infecção natural de cucurbitáceas cultivadas nas entrelinhas ou próximas de mamoeiros com mosaico. Para o desenvolvimento do trabalho em casa-de-vegetação os isolados do PRSV-P mantidos em mamoeiros, foram inoculados nos cotilédones de abobrinha de moita cv. Caserta, moranga cv. Exposição, pepino híbrido Primepack Plus e melancia cv. Crimson Sweet. As plantas foram avaliadas com base nos sintomas e indexadas por PTA-ELISA, e recuperação biológica do biótipo P do PRSV através de inoculações em mamoeiro. A confirmação da infecção dos mamoeiros foi realizada da mesma forma, por sintomatologia e indexação por PTA-ELISA. A abobrinha de moita foi a espécie mais suscetível aos cinco isolados do PRSV-P, seguida da melancia e do pepino. Não foi possível transmitir o vírus a moranga cv. Exposição. Para estudar a infecção natural realizou-se um ensaio com plantas de abobrinha de moita em Linhares-ES, três ensaios independentes em Rinópolis-SP e quatro em Piracicaba-SP, incluindo-se nessa última localidade a melancia e o pepino. Depois de aproximadamente 40 a 60 dias de exposição em campo coletaram-se amostras individuais ou compostas (de 3 a 5 plantas) das folhas dos ponteiros das plantas para realizar a recuperação biológica do PRSV-P para mamoeiros em casa de vegetação. A presença de afídeos foi monitorada em Piracicaba durante a execução dos experimentos no campo. No único teste de exposição em Linhares, nenhuma planta de abobrinha cultivada entre mamoeiros com mosaico mostrou-se infectada com esse vírus. O PRSV-P foi recuperado da abobrinha de moita em proporções variáveis em 2 dos 3 testes realizados em Rinópolis, e em 3 dos 4 testes realizados em Piracicaba. Nenhuma planta de melancia e pepino cultivada entre mamoeiros com mosaico foi infectada com o PRSV-P. Não foi possível recuperar o PRSV-P de nenhuma planta de abobrinha cultivada entre 5 e 80 metros de distância dos mamoeiros com mosaico em Piracicaba. Foram capturados afídeos vetores do PRSV-P e foi possível detectar plantas infectadas com os potyvirus PRSV-W e ZYMV, o que demonstra a presença e atividade dos vetores de vírus. Os resultados confirmaram a suscetibilidade variável das espécies de cucurbitáceas ao PRSV-P. Embora a abobrinha de moita fosse a única espécie encontrada naturalmente infectada pelo PRSV-P quando cultivada entre linhas de mamoeiro com mosaico, a presença de cucurbitáceas nos campos de produção de mamoeiro, especialmente quando o controle do mosaico do mamoeiro é feito através do roguing, não é recomendada. / Besides Carica papaya, Papaya ringspot virus type P (PRSV-P) infects systemically only species belonging to the family Cucurbitaceae. Their susceptibility varies according to the species/cultivar, virus isolate and the method of inoculation. Attempts to recovery PRSV-P from naturally infected cucurbit plants grown near to or among diseased papaya trees have shown distinct results worldwide. This study aimed to evaluate the susceptibility of Cucurbita pepo cv. Caserta, Cucurbita maxima cv. Exposiçao, Cucumis sativus hybrid Primepack Plus, and Citrullus lanatus cv. Crimson Sweet to five isolates of PRSV-P obtained from different regions of Brazil. It was also evaluated the natural infection of cucurbit plants grown between rows and in the vicinity of papaya trees infected with PRSV-P. The five PRSV-P isolates were maintained in papaya plants. Cucurbit plants grown in pots under greenhouse conditions were mechanically inoculated with each isolate at the cotiledonary stage. The plants were assessed based on symptoms and infection was confirmed by PTA-ELISA using extracts from the inoculated cotyledons and upper leaves. The same extracts were also mechanically inoculated on papaya plants in order to recover the virus isolate. Inoculated papaya plants were also tested by PTA-ELISA. Zucchini squash was the most susceptible species to PRSV-P, followed by watermelon and cucumber. Pumpkin cv. Exposição was not infected. To study the natural infection of zucchini squash cv. Caserta by PRSV-P, a trial was carried out in Linhares, State of Espírito Santo; three independent trials were carried out in Rinópolis; and four trials were carried out in Piracicaba, both regions located in the State of São Paulo. Watermelon and cucurbit were also included in some trials in Piracicaba. After approximately 40 to 70 days, leaf samples were collected and tested individually or in groups of three to five plants for the presence of PRSV-P by mechanical inoculation on papaya plants under greenhouse conditions. None of the zucchini squash plants grown between rows of infected papaya trees in Linhares was found infected by PRSV-P based on the virus recovery test to papaya plants. The virus was also not recovered from watermelon and cucurbit plants grown between rows of infected papaya trees in Piracicaba. On the other hand, PRSV-P was recovery from zucchini squash plants grown intercalated with diseased papayas in Rinópolis and Piracicaba. The number of infected plants varied among the trial. Several attempts to recover PRSV-P from innumerous zucchini squash plants grown approximately five to 80 meters from diseased papaya trees in Piracicaba failed. Alates of several species of aphids were captured in the field at Piracicaba. Also, innumerous cucurbit plants were found infected by the potyviruses Papaya ringspot virus type W and Zucchini yellow mosaic virus, suggesting aphids activity in the area. The results confirmed the variable susceptibility of cucurbit species to infection with PRSV-P. Although natural infection with PRSV-P was restricted to zucchini squash cv. Caserta grown among infected papaya trees, the presence of cucurbit plants in the vicinity of papaya orchards, especially where disease control is done by systematic rouging of diseased plants, should not be allowed.

As cucurbitáceas no Brasil podem ser infectadas por diferentes vírus, tais como o Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W); o Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) e o Cucumber mosaic virus (CMV). Os dois primeiros pertencem ao gênero Potyvirus e no geral ocorrem com maior freqüência do que o CMV, que é uma espécie do gênero Cucumovirus. Os dois potyvirus e o cucumovirus são transmitidos por afídeos de maneira não persistente. O principal objetivo desse trabalho foi o de obter subsídios que possam explicar a menor incidência do CMV em espécies de cucurbitáceas, estudando: (a) a interferência dos potyvirus PRSV-W e ZYMV na transmissão do CMV por Aphis gossypii e Myzus persicae para plantas de abobrinha de moita (Cucurbita pepo ‘Caserta’) e (b) o efeito de isolados do CMV provenientes de maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa), de pimentão (Capsicum annuum), de pepineiro (Cucumis sativus), de meloeiro (Cucumis melo) e de trapoeraba (Commelina virginica) na infectividade de plantas de abobrinha de moita por meio da transmissão por afídeos. Para avaliar a possível interferência dos potyvirus na transmissão do CMV, as plantas de abobrinha de moita foram inoculadas com afídeos que adquiriram cada um dos vírus isoladamente; o CMV simultaneamente com cada um dos potyvirus; um dos potyvirus seguido pelo CMV e vice-versa. Os resultados mostraram, na maioria das vezes, que a transmissão dos vírus isoladamente foi mais eficiente do que em mistura, tanto através de aquisição simultânea como seqüencial. Os potyvirus no geral foram mais eficientemente transmitidos por ambas espécies de afídeos. Quando em mistura (aquisição simultânea ou sequencial), de uma maneira geral, houve uma redução na taxa de transmissão do CMV e do potyvirus presente na mistura. As avaliações sobre o efeito da origem dos isolados do CMV na infectividade de abobrinha de moita mostraram que apenas o isolado de pimentão não infectou plantas de abobrinha de moita quando transmitido por meio dos afídeos A. gossypii e M. persicae. Também não houve infecção quando inoculado mecanicamente. Os demais isolados infectaram abobrinha de moita através da transmissão por ambas espécies de afídeos. Análise da proteína capsidial dos diferentes isolados do CMV indicaram que todas apresentaram a mesma mobilidade em gel de SDS-PAGE. A origem do isolado o CMV, a eficiência da espécie de afídeo na sua transmissão e a interferência dos potyvirus PRSV-W e ZYMV podem explicar em parte a menor incidência desse cucumovirus em cucurbitáceas no país. / The cucurbits in Brazil can be infected by different viruses, such as Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W); Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) and Cucumber mosaic virus (CMV). The first two belong to the genus Potyvirus and in general they occur more frequently than CMV, which is a species of the genus Cucumovirus. The two potyviruses and the cucumovirus are transmitted by means of aphids in a non persistent way. The main objective of this work was to obtain subsidies that can explain the lower incidence of CMV in cucurbit species, studying: (a) the interference of the potyviruses PRSV-W and ZYMV in the transmission of CMV by means of Aphis gossypii and Myzus persicae to zucchini squash plants (Cucurbita pepo 'Caserta') and (b) the effect of isolates of CMV from passion flower (Passiflora edulis f. flavicarpa), bell pepper (Capsicum annuum), cucumber (Cucumis sativus), melon (Cucumis melo) and Commelina virginica in the infectividade of zucchini squash plants through the transmission by aphids. To evaluate the possible interference of the potyvirus in the transmission of CMV, zucchini squash plants were inoculated with aphids that acquired each one of the viruses separately; CMV simultaneously with each one of the potyvirus; one of the potyvirus follow by CMV and vice-versa. The results showed that the transmission of PRSV-W, ZYMV and CMV separately was more efficient than in mixture. The potyviruses in general were more efficiently transmitted by both species of aphids than CMV. When in mixture (simultaneous or sequential acquisition), there was a reduction in the rate of transmission of CMV as well as that of the potyvirus present in the mixture. The evaluation on the effect of the origin of the isolate of CMV in the infectivity of zucchini squash showed that only the isolate from bell pepper did not infected the plants when inoculated by means of A. gossypii and M. persicae. This isolate also did not infecte zucchini squash when inoculated mechanically. The others isolate infected zucchini squash when transmitted by both species of aphids. Analysis of the capsidial protein of the different isolates of CMV indicated that all presented the same mobility in SDS-PAGE. The origin of the isolate of CMV, the efficiency of the species of aphid and the interference of the potyviruses PRSV-W and ZYMV on its transmission can partly explain the lower incidence of this cucumovirus in cucurbits species in Brazil.

Johnsongrass mosaic virus (JGMV) é uma espécie do gênero Potyvirus. A sua distribuição geográfica, até o início da década de 1990, estava limitada à Austrália e aos Estados Unidos, onde causa doença em sorgo, milho e várias gramíneas. Em 2001, o JGMV foi detectado pela primeira vez no Brasil em amostras de híbridos e variedades de milho provenientes da região de Ribeirão Preto, SP mediante análise sorológica (DAS-ELISA), e em 2013 foi detectado mediante RT-PCR em amostras de Pennisetum purpureum provenientes do Estado da Bahia. Em Fevereiro de 2012 a Clínica Fitopatológica da ESALQ/USP recebeu amostras de Panicum maximum cv. Mombaça, com sintomas de mosaico, de São Luiz do Paraitinga, SP. Exames preliminares de contrastação negativa em microscópio eletrônico de transmissão indicaram a presença de partículas virais características de potyvirus. Diante disso, o principal objetivo deste trabalho foi caracterizar o agente etiológico associado às plantas doentes de capim Mombaça mediante testes biológicos, sorológicos e moleculares. Extratos foliares de plantas sintomáticas de capim Mombaça foram inoculados mecanicamente em 69 genótipos da família Poaceae. As avaliações foram feitas com base nos sintomas e por PTA-ELISA usando antissoro policlonal contra a proteína capsidial do potyvirus produzido nesse trabalho, após purificação do isolado viral. As espécies susceptíveis foram Brachiaria brizantha, B. decumbens, B. plantaginea, Cenchrus echinatus, Echinochloa colona, E. crus-galli, E. cruspavonis, Melinis minutiflora, Panicum maximum cv. Colonião, Pennisetum setosum, Rhynchelytrum repens, Rottboellia exaltata, Sorghum bicolor BRS 332, S. bicolor BRS 509, S. bicolor x S. sudanense BRS 802 e S. verticilliflorum. Espécies cultivadas como arroz, aveia, cana-de-açúcar, centeio, milho e trigo não foram infectadas com esse isolado. O peso molecular da proteína capsidial deste potyvirus foi estimado em cerca de 33 kDa por meio de Western blot. Sequência de nucleotídeos do genoma completo (9.885 nt) obtida neste estudo revelou identidade de 82,03% com a única sequência completa do genoma de um isolado do JGMV da Austrália, depositada no GenBank. A partir dessa sequência foram obtidos oligonucleotídeos iniciadores específicos para a detecção do isolado de SP do JGMV mediante RT-PCR. / Johnsongrass mosaic virus (JGMV) is a species of the genus Potyvirus. The geographical distribution, until the early 1990s, was limited to Australia and the United States, where it causes disease in sorghum, corn and various grasses. In 2001, JGMV was first detected in Brazil in samples of hybrids and varieties of corn from the region of Ribeirão Preto, São Paulo State by serological analysis (DASELISA), and in 2013 it was detected by RT-PCR in samples of Pennisetum purpureum from the State of Bahia. In February 2012, the Disease Diagnostic Clinic ESALQ/USP received samples of Panicum maximum cv. Mombaça, exhibiting mosaic symptoms, from the region of São Luiz do Paraitinga, SP. Preliminary examination of negatively stained sap in a transmission electron microscope indicated the presence of potyvirus-like particles. Therefore, the main objective of this study was to characterize the etiologic agent associated with P. maximum cv. Mombaça diseased plants by biological, serological and molecular tests. Leaf extract from Mombaça infected plants was mechanically inoculated in 69 genotypes of the Poaceae family. Evaluations were done based on symptoms expression and PTAELISA using polyclonal antiserum against the capsid protein of the potyvirus produced in the preset work virus purification. Susceptible species were Brachiaria brizantha, B. decumbens, B. plantaginea, Cenchrus echinatus, Echinochloa colona, E. crus-galli, E. crus-pavonis, Melinis minutiflora, Panicum maximum cv. Colonião, Pennisetum setosum, Rhynchelytrum repens, Rottboellia exaltata, Sorghum bicolor BRS 332, S. bicolor BRS 509, S. bicolor x S. sudanense BRS 802 and S. verticilliflorum. Cultivated species such as rice, oats, sugarcane, rye, corn and wheat were not infected with this isolate. The molecular weight of the coat protein of this potyvirus was estimated at about 33 kDa by Western blot. The nucleotide sequence of the complete genome (9885 nt) obtained in this study showed 82.03% identity with an unique sequence for the complete genome of an isolate of JGMV from Australia, deposited in GenBank. From this nucleotide sequence, specific pair of primers was designed for the detection of the São Paulo isolate of JGMV by RT-PCR.

Orientadores: Felipe Rodrigues da Silva, Francisco Pereira Lobo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:42:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_GiovanniMarquesde_M.pdf: 8706589 bytes, checksum: bd5b5d6428a549bafa82854367f811b9 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A planta Fevillea cordifolia L. possui um grande potencial para produção de biodiesel. Buscando entender o metabolismo foi realizado um experimento exploratório de RNA-seq com sementes inteiras. No entanto, as análises da qualidade na biblioteca indicaram grande quantidade de sequências virais. Após a reconstrução do transcriptoma usando o programa TRINITY, também foi reconstruído o genoma completo do vírus. O vírus reconstruído possui identidade de 96% com o Papaya ringspot virus (PRSV) em um alinhamento global de nucleotídeos dos genomas completos. Avaliando a abundância dos contigs, o PRSV encontrado representa quase 60% das 24,6 milhões de leituras da biblioteca. Para identificar qual a origem do vírus encontrado, este foi comparado com 29 PRSVs existentes no Genbank através de análise filogenética usando do Algerian watermelon mosaic virus (AWMV) para enraizar a árvore. O vírus encontrado agrupa-se com os dois PRSVs do Brasil, dentro do grupo das Américas estando mais próximo do PRSV-W-C (DQ374152). A existência de recombinações entre os PRSVs foi analisada, porém não foi detectada recombinação recente. Devido à profundidade de sequenciamento maior que 10.000x, foi possível analisar as variações existentes do genoma viral reconstruído. Uma análise das variações dos códons virais foi realizada, mostrando uma tendência para ocorrência de indels para a região do genoma no fim do cístron NIb e início do cístron CP. Essas variações ocorrem devido à existência de haplótipos virais na amostra sequenciada. Para se estimar a diversidade de haplótipos virais da amostra, foi realizada uma reconstrução local da região de 500 nt com mais alta entropia. Foram reconstruídos 58 haplótipos, dos quais dois eram predominantes com frequências de 64,84% e 24,34%. Os haplótipos reconstruídos podem ser usados para o desenvolvimento de resistência mediada por RNAi, evitando que uma variante conhecida e preexistente na população possa quebrar a resistência / Abstract: The plant Fevillea cordifolia L. has a great potential for producing biodiesel. In order to understand its metabolic pathways an exploratory RNA-seq experiment was conducted with its whole-seeds. However the quality analysis of the library revealed a substantial amount of virus sequences. After the reconstruction of the transcriptome using the software TRINITY, the complete viral genome was obtained as well. The reconstructed viral genome had an identity of 96% with Papaya ringspot virus (PRSV) in a global nucleotide alignment using whole genomes. When estimating the abundance of the reconstructed sequences, this PRSV had almost 60% of the 24,6 million reads mapping to it. Aiming to elucidate the origin of this virus, its sequence was compared to 29 PRSVs from Genbank using phylogenetic analysis and the Algerian Watermelon Mosaic Virus (AWMV) as an outgroup. This PRSV clustered with the Brazilian isolates, being closer to PRSV-W-C (DQ374152). A recombination analysis was performed within the PRSVs but no recent recombination was detected. Due to the depth of the coverage sequencing being higher than 10.000x, it was possible to analyze the variations existing in the reconstructed genome. An analysis of the codons variations was performed, revealing a tendency for the occurrence of indels in a region at the end of NIb cistron and at the start of the CP cistron. These variations occur due to the existence of viral haplotypes sequenced in this sample. A local reconstruction of the 500nt region with the highest entropy was performed to estimate the diversity of viral haplotypes in this sample. 58 haplotypes were reconstructed, of which 2 were dominant with frequencies of 64,84% and 24,34%. The reconstructed haplotypes may be used for the development of RNAi-mediated resistance, avoiding the breaking of the resistance by variants that are known to exist in the population / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-17T11:43:51Z No. of bitstreams: 1 Francisco de Assis Camara Rabelo Filho.pdf: 1431986 bytes, checksum: a5c762b1d10133b3e27a6ed470fcfa1b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T11:43:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francisco de Assis Camara Rabelo Filho.pdf: 1431986 bytes, checksum: a5c762b1d10133b3e27a6ed470fcfa1b (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The yam (Dioscorea spp.) has an important economic and social role in the Northeast of Brazil, providing food with high value to the human diet. It is also a source of income to poor family, employing large number of manpower. Among the phytosanitary problems of this crop, the fungal and nematode diseases are the most important ones. The virus diseases also have high importance, especially for causing cultivar degeneracy, with reduction of plant vigor and consequent qualitative and quantitative production losses. Three viruses stand out in Brazil with occurrence on main cultivars used in Northeast, Yam mosaic virus (YMV) and Yam mild mosaic virus (YMMV), belonging to the genus Potyvirus, family Potyviridae and one virus of the genus Badnavirus, family Caulimoviridae. Recently, two more viruses from the genus Begomovirus and Curtovirus genus, family Geminiviridae were detected. In the present work, initially, the detection and characterization of an YMMV isolate obtained from D. trifida were undertaken by electronic microscope analysis including visualization of cytoplasmatic inclusions typical of the genus Potyvirus. In addition, molecular studies with specific primers for YMMV in RT–PCR, followed by RT–PCR with degenerate primers to viruses of the Potyvirus genus, cloning the product corresponding to the coat protein and phylogenetic analysis including sequences available at the GenBank were done. Sequencing of the complete genome of a YMMV isolate and a detailed study on the nucleotide sequence of this virus by cDNA amplification and cloning in plasmids pGEM-T Easy and the pCR 4 Topo were also realized, and the data deposited in GenBank. The diagnosis of plant virus diseases can be realized by serological and molecular techniques. In yam crop, molecular tools normally are used due to difficulties in acquiring specific antisera, making more expense the identification of viral agents. Polyclonal antiserum was produced in rabbit for YMMV, using the coat protein of an isolate of YMMV expressed in vitro using Escherichia coli system. / O inhame (Dioscorea spp.) apresenta importante papel socioeconômico na região Nordeste do Brasil. Além de fornecer alimento de alto valor nutritivo para a dieta humana, é fonte de renda para famílias de baixo poder aquisitivo, empregando grande contingente de mão de obra. Dentre os problemas fitossanitários desta cultura, destacam-se as doenças fúngicas e aquelas causadas por nematoides. As viroses apresentam também elevada importância, principalmente por ocasionarem degenerescência de cultivares, com diminuição do vigor das plantas e, consequentemente perdas qualitativas e quantitativas da produção. Três vírus se destacam, em nível de Brasil, com registros nas principais cultivares empregadas no Nordeste, Yam mosaic virus (YMV) e Yam mild mosaic virus (YMMV), pertencentes ao gênero Potyvirus, família Potyviridae e um vírus do gênero Badnavirus, família Caulimoviridae. Recentemente, foram detectados mais dois vírus, pertencentes aos gêneros Begomovirus e Curtovirus, família Geminiviridae. No presente trabalho, inicialmente foram efetuadas a detecção e caracterização de um isolado de YMMV, obtido de D. trifida, por meio de análise eletromicroscópica, incluindo a visualização de inclusões citoplasmáticas típicas do gênero Potyvirus. Em seguida, foram realizados estudos moleculares com primers específicos para o YMMV em RT–PCR, seguido de RT–PCR com primers degenerados para vírus do gênero Potyvirus, clonagem do produto correspondente à capa proteica e análise filogenética, com os dados de sequências disponíveis no GenBank. Também foi realizado o sequenciamento do genoma completo de um isolado de YMMV e estudo detalhado da sequência de nucleotídeo, mediante amplificação do cDNA e clonagem em plasmídeos pGEM-T Easy e do pCR 4 Topo, cujos dados foram depositados no GenBank. A diagnose das fitoviroses pode ser efetuada por técnicas sorológicas e moleculares. Na cultura do inhame, usa-se, em geral, ferramentas moleculares, pela dificuldade na aquisição de antissoros específicos, o que encarece a identificação dos agentes virais. Antissoro policlonal para YMMV foi desenvolvido em coelho usando a proteína capsidial de um isolado do vírus expressa in vitro no sistema Escherichia coli.

The potyvirus Papaya ringspot virus (PRSV) is widespread throughout the world in cucurbits (such as zucchini, watermelon, pumpkin etc) and papaya (papaw). There are two serologically indistinguishable strains of PRSV, which can only be differentiated on the basis of host range. PRSV-P is able to infect both papaya and cucurbits whereas PRSV-W only infects cucurbits. Both infections drastically reduce the yield and market quality of the fruit. Australian isolates of PRSV-P and -W are very closely related and there is evidence that PRSV-P arose by mutation from PRSV-W. The aim of this project was to investigate the molecular basis of the host range difference between Australian isolates of PRSV-P and -W. The close relationship between Australian PRSV-P and -W isolates at the molecular level made this an ideal system to investigate molecular host range determinants through the development of full-length infectious cDNA clones. Initially, the complete genomes of PRSV-P and -W were each incorporated into two overlapping clones; one included the CaMV 35S promoter fused to the 5' one third of the PRSV genome and the second included the 3' two thirds of the genome (including a 33 nucleotide poly(A) tail) fused to a CaMV35S terminator. Full-length clones could not be obtained from subcloning of these fragments due to apparent toxicity in E.coli. Several approaches were subsequently undertaken to overcome this problem. In an attempt to prevent transcription of potentially toxic sequences, a plant intron (St-Ls1 IV2 intron) was engineered into the first coding region (P1) of the PRSV-W genome. Although clones were obtained using this strategy these could not be effectively maintained in E.coli. An alternative strategy involved subcloning of the genome into a low copy number vector, pACYC177, to minimise expression of toxic sequences. Again this resulted in clones that produced very small colonies, which were hard to culture and which gave very low plasmid yields. These plasmids were also difficult to maintain in E. coli. A final, successful strategy was developed using overlapping long distance PCR (OE-LD PCR) to generate full-length infectious PCR products of both PRSV-P (rPRSV-P) and -W (rPRSV-W) incorporating a CaMV 35S promoter and terminator. Infectious PCR products of both strains were inoculated onto squash cotyledons in vitro by microprojectile bombardment and subsequently mechanically inoculated to squash with greater than 86% efficiency. RPRSV-P subsequently infected papaya with 96% efficiency while, as expected, rPRSV-W was unable to infect papaya. Once a system for generating infectious clones was developed, both sequence analysis and recombination of infectious clones was utilised to investigate the underlying host range mechanism. The complete genomes of PRSV-P and -W were sequenced and compared to each other and to five full- length sequences of overseas PRSV isolates that were available. Sequence analysis confirmed the close relationship between the Australian PRSV isolates (97.8% nucleotide and 98.4% amino acid identity over the whole genome), supporting the mutation theory between both Australian and Asian P and W pairs. However, there was no consistent amino acid difference over the whole genome that correlated with host range or a single site that could be implicated, suggesting that the mutation and possibly the position of the mutation is different at least between Asian and Australian isolates and potentially differs at each mutation event. To better localise the P/W mutation within the PRSV genome, five different recombinant hybrid PRSVs (rhPRSV1-5) were generated in which 5', middle or 3' regions of the PRSV-P and -W genomes were exchanged. Infectivity of all hybrids was confirmed in squash, however, only hybrids including the 3' third of the PRSV-P genome were able to infect papaya, suggesting that this region encodes the papaya host range determinant. The region implicated encodes the genome-linked protein (VPg), NIa protease, replicase (NIb), coat protein (CP) and 3' UTR. While further identification of the host range determinants was not possible due to time constraints, based on studies with other potyviruses, there is a strong basis for implication of the VPg. Sequence analysis identified only 2 amino acid differences between the VPg of Australian PRSV-P and -W isolates in regions previously implicated in pathogenicity. These will be targeted for mutagenesis in ongoing studies. Identification of the genes/sequences involved in the determination of host range in PRSV will provide valuable information as to the sequence of events that lead to infection and will lead to a better understanding of the significance of changing hosts in the molecular evolution of PRSV, an essential requirement for the development of long-term sustainable control strategies against PRSV.