[EN] The general aim of this thesis was to reproductively characterize females from a rabbit line selected for growth rate and to evaluate the effect of different nutritional strategies (ad libitum and restricted), in order to improve the reproductive performance. In chapter 1, the influence of maternal and embryonic genotype on prenatal survival and fetal growth was evaluated and contrasted with a maternal line. Prenatal survival, fetal weight and fetal placenta weight were affected by both embryonic and maternal genotype. Nevertheless, no differences were detected either at transcriptomic level in fetal placenta or in progesterone and IGF-I plasma levels in these females. It may be concluded that in rabbit females from paternal lines both embryonic and maternal genotypes are key factors in the reproductive performance of these females. The aim of chapter 2 was to explore the causes of ovulation failures in these rabbit females. Results showed that non-ovulated females presented lower LH plasma concentration as well as higher body weight and leptin and BOHB plasma levels than ovulated females. Thus, ovulation failures in females from line R could be attributed to decreased LH plasma concentrations in these females which may be related with their higher body weight and leptin levels. The following three chapters were focused on improvement of the reproductive performance of these females through a different nutritional strategy: a feed-to-appetite diet of these females after the rearing period and prior to insemination. The initial hypothesis was that the females are submitted to a restricted nutritional regimen which is not enough to cope with their needs during reproduction, causing long-term disturbances of energy balance which leads to the subsequent reproductive problems. Chapter 3 aimed to determine if a feed-to-appetite nutritional strategy would affect the hypothalamus-hypophysis axis and the quality of the produced oocytes, by transcriptomic analysis. While no differences were found in the microarray analysis of the hypothalamus-hypophysis, small differences were detected in the transcript expression analysis in oocytes of a group of genes selected. MSY2 was found to be downregulated in oocytes from restricted females. As a key regulator of maternal RNA transcription and translation, changes in this essential gene could explain some of the reproductive problems of these females. Whether the differences found at oocyte level were inherent at embryonic level and so involved in the drop of fertility was studied in Chapter 4. Although no significant differences were revealed in ovulation, embryo recovery, and implantation rate, higher fetal and gestational losses were found in restricted females, as well as lower fetal growth. Thus, we concluded that the nutritional strategy employed may have an impact on the oocyte (Chapter 3), but we also demonstrated that these changes were inherited by the embryo, and result in disturbances in gestational losses and fetal growth. The final chapter of this thesis was conducted to determine whether these effects on reproductive and metabolic elements were also evident in females following the common semi-intensive farm production system. Although the results obtained showed small variances in NEFAs and BOHB plasma levels, and also in body weight, no differences were detected in global reproductive performance in terms of fertility, prolificacy and productivity. The results obtained established that although differences are found at oocyte level and inherited by embryo and fetus, no improvements are reached with the proposed nutritional strategy in terms of reproductive performance when females selected for growth rate lead a normal semi-intensive production system. / [ES] El objetivo general fue la caracterización reproductiva de las hembras de una línea de conejo seleccionada por velocidad de crecimiento y el efecto de distintas estrategias nutricionales (ad libitum y restringidas), con la finalidad de mejorar el rendimiento reproductivo. En el capítulo 1 se evaluó la influencia de los genotipos materno y embrionario en la supervivencia prenatal y crecimiento fetal, entre las hembras de esta línea y una línea maternal. La supervivencia prenatal, peso fetal y el peso de la placenta resultaron afectados por los genotipos tanto embrionario como materno, pero no se detectaron diferencias sobre la placenta fetal a nivel del transcriptoma ni en los niveles de progesterona e IGF-I. Por lo tanto, se puede concluir que en éstas tanto el genotipo embrionario como el materno son factores clave en su rendimiento reproductivo. El objetivo del capítulo 2 fue explorar las causas de los fallos reproductivos en estas hembras. Los resultados mostraron que las hembras que no ovularon presentaban menores niveles de LH, un mayor peso corporal y mayor concentración en sangre de leptinas y BOHB, que aquellas que había ovulado. Por ello, los fallos en ovulación detectados en estas hembras podrían estar relacionados con una reducción en los niveles de LH, consecuencia del mayor peso de estas hembras y de los incrementados niveles de leptinas. Los siguientes capítulos se enfocaron a la mejora del rendimiento reproductivo de estas hembras empleando una estrategia nutricional distinta: la ingesta ad libitum de alimento tras el periodo de crianza hasta el momento del comienzo de su vida reproductiva. La hipótesis de partida fue que estas hembras son sometidas a un régimen nutricional restringido que no es suficiente para satisfacer sus necesidades energéticas durante la reproducción, lo que causa alteraciones en su balance energético que se manifestarían en los problemas reproductivos observados. El capítulo 3 trató de determinar a través de un análisis trasncriptómico si la estrategia nutricional planteada afectaría el eje hipotalámico-hipofisario y la calidad de los ovocitos. Aunque no se encontraron diferencias en el análisis de un micrarray realizado sobre el hipotálamo-hipófisis, sí que se detectaron en la expresión génica de los ovocitos. El transcrito MSY2 mostró una menor expresión en los ovocitos de las hembras restringidas. Este gen es un regulador clave en la maduración ovocitaria, por lo tanto, cambios en la expresión de este gen podrían explicar algunos de los problemas reproductivos de estas hembras. En el capítulo 4 se estudió si las diferencias a nivel ovocitario eran heredadas por el embrión pudiendo causar la baja fertilidad de estas hembras. Aunque no se encontraron diferencias en las tasas de ovulación, recuperación embrionaria e implantación, sí que aparecieron diferencias en las pérdidas fetales y gestacionales, así como un menor crecimiento fetal en los embriones procedentes de hembras con restricción alimentaria. Por ello, concluimos que la estrategia nutricional empleada tiene unas consecuencias en el ovocito (Capítulo 3), y demostramos que estos cambios parecen continuar en el embrión, resultando en alteraciones en pérdidas gestacionales y crecimiento fetal. El capítulo final fue desarrollado para evidenciar si los efectos reproductivos y metabólicos observados en los capítulos previos se manifestaban en las hembras que se encuentran en un sistema de producción tradicional en granja. A pesar de que los resultados mostraron variaciones en los niveles circulantes de NEFAs y BOHB y de peso corporal, no se encontraron diferencias en el rendimiento reproductivo global a nivel de fertilidad, prolificidad y productividad. Los resultados obtenidos parecen indicar que a pesar de las diferencias encontradas a nivel ovocitario, embrionario y fetal, con el régimen nutricional propuesto no se logra alcanzar mejoras en la eficiencia reproductivo de las h / [CAT] L'objectiu general va ser la caracterització reproductiva de les femelles d'una línia de conill seleccionada per velocitat de creixement i l'efecte de diferents estratègies nutricionals (ad libitum i restringides), amb la finalitat de millorar el rendiment reproductiu. En el capítol 1 s'avaluà la influència dels genotipus matern i embrionari en la supervivència prenatal i el creixement fetal, entre les femelles d'aquesta línia i les de una altra línia maternal. La supervivència prenatal, el pes fetal i el pes de la placenta resultaren afectats pels genotipus embrionari i matern, però no es detectaren diferències en la placenta fetal a nivell de trascriptoma ni en els nivells de progesterona i IGF-I. Per tant, en les femelles de conill seleccionades per velocitat de creixement, tant el genotipus embrionari com el matern són factors clau en el seu rendiment reproductiu. L'objectiu del capítol 2 va ser explorar les causes de les fallades reproductives en aquestes femelles. Les femelles que no ovularen presentaren menor nivells de LH, major pes corporal i major concentració de leptines i BOHB que aquelles que sí que hi havia ovulat. Per això, les fallades d'ovulació detectades en aquestes femelles podrien estar relacionades amb la reducció en els nivells de LH, com a conseqüència del major pes d'aquestes femelles i dels incrementats nivells de leptines. Els capítols següents s'enfocaren a la millora del rendiment reproductiu d'aquestes femelles mitjançant una estratègia nutricional distinta: la ingesta ad libitum d'aliment després del període de criança i fins al moment de l'inici de la vida reproductiva. La hipòtesi de partida fiu que aquestes femelles són sotmeses a un règim nutricional restringit que no és suficient per a satisfer les seves necessitats energètiques durant la reproducció, la qual cosa provoca alteracions en el balanç energètic que podrien manifestar-se en els problemes reproductius observats. El capítol 3 tractà de determinar mitjançant un anàlisi trasncritòmic si la estratègia nutricional plantejada podria afectar l'eix hipotalàmic-hipofisiari i la qualitat dels ovòcits. Metre que no es detectaren diferències en el anàlisi del microarray realitzat en el hipotàlem-hipòfisi, sí que es detectaren en l'expressió gènica del ovòcits. El transcrit MSY2 mostrà una menor expressió en els ovòcits de les femelles restringides. Aquest gen es un regulador clau en la maduració ovocitària, per aquest motiu, canvis en la seva expressió gen podrien explicar alguns dels problemes reproductius de les femelles. En el capítol 4 s'estudià si aquestes diferències a nivell ovocitari eren heretades per l'embrió i podrien causar la baixa fertilitat d'aquestes femelles. Encara que no se trobaren diferències en les taxes d'ovulació, recuperació embrionària i implantació, sí que es trobaren diferències en les pèrdues fetals i gestacionals, així com un menor creixement fetal en els embrions de les femelles provinents d'un règim alimentari restringit. Per això concloíem que l'estratègia nutricional emprada té conseqüències en el ovòcit (Capítol 3), i demostrarem que aquest canvis pareixen continuar en l'embrió, resultant en alteracions en pèrdues gestacionals i creixement fetal. El capítol final fou desenvolupat per evidenciar si els efectes reproductius i metabòlics observats en els capítols previs eren manifestats en les femelles que es troben en un sistema productiu tradicional de granja. Tot i que el resultats mostraren variacions en els nivells circulants de NEFAs i BOHB i pes corporal, no es trobaren diferències en el rendiment reproductiu global, en termes de fertilitat, prolificitat i productivitat. Els resultats obtinguts pareixen indicar que tot i que les diferències trobades a nivell ovocitari i embrionari amb un efecte significatiu en el desenvolupament i creixement fetal, amb el règim nutricional proposat no s'aconsegueix assolir millores en / Naturil Alfonso, C. (2016). EFFECT OF FEED RESTRICTION IN A RABBIT LINE SELECTED FOR GROWTH RATE ON REPRODUCTIVE PERFORMANCE: OVULATION INDUCTION, OOCYTE QUALITY, EMBRYONARY AND FETAL LOSSES [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/73065 / TESIS

During the last 50 years, there has been an overall improvement of efficiency in all domestic species thanks to an improvement in productivity traits. However, during the last years, disorders associated to a loss of functionality of animals (such as poor fertility, health and longevity of reproductive females) with high productivity standards have been observed. In this scenario, interactions between genetics and nutrition are becoming relevant. The main hypothesis of the present thesis is that nutritional strategies adapted to the genetic type could help to modulate productivity and functionality of females in the long term. To evaluate this hypothesis, 203 rabbit females were used which gave birth a total of 758 litters. These females belonged to 3 genetic types that differed greatly on their breeding goals: H, maternal line characterised by hyper-prolificacy; LP, maternal line characterised by functional hyper-longevity; R, paternal line characterised by growth rate. Females were fed during 5 consecutive reproductive cycles with 2 iso-energetic and iso-protein diets differing in energy source: Animal fat enhancing milk yield (84 g of ether extract per kg of DM and 105 g of starch per kg of DM); Cereal starch promoting body reserves recovery (21 g of ether extract per kg of DM and 237 g of starch per kg of DM). This experiment generated a set of longitudinal data with particular structures of (co)variances among data which had to be taken into account. Several models differing in the way data structure is modelled were evaluated. We found that none of the tested models was the best in terms of goodness of fit to the data for all traits, but it seems that models in which (co)variance structure was modelled in blocks of (co)variances for each reproductive cycle could be the most recommendable because they presented an overall suitable statistic performance (in terms of parsimony and fitting) and biological interpretation. These models provided useful information to understand acquisition and allocation of individual animals. In this sense, it seems that we can modulate allocation between energy addressed to milk or to body reserves by changing energy source of diet, but altering normal homeostasis of animals. Respect to the strategies of genetic types, results of the present experiment seem to indicate that R females were characterized by greater adult weight and by a high dependence on the body reserves to cope with the reproductive requirements of the current reproductive cycle. They gave birth little but heavier kits, although it seems they could be more immature. When R females were fed with a diet promoting milk yield, they invested more on the current litter, whereas when fed with a diet promoting body reserves recovery, it seems that they invested more in recovering for future reproduction. On the contrary, females from the maternal lines were smaller and had numerous but lighter kits, but each genetic type used different strategies. H females were also high dependent on body reserves, but storing body reserves during lactation to cope with future reproduction. This strategy makes them more sensible to the energy source of the diet, triggering problems to ensure future reproduction when fed with a diet promoting body reserves recovery (low conception rate or higher mortality of females). LP females were characterised by an acquisition capacity better fitted to changing requirements, safeguarding body reserves. This strategy seems to be more generalist, allowing them to ensure high performance of the current litter without neglecting future reproduction and with less sensitivity to the diet. Therefore, to properly balance between productivity and functionality, results reported in the presented thesis suggest that apart from requirements, the way each genetic type acquire and allocate energy over its life trajectory should be considered when formulating diets for reproductive rabbit females. / En los últimos 50 años, ha habido mejora general de la productividad y en consecuencia de la eficiencia en todas las especies domésticas. Sin embargo, en los últimos an¿os se han observado trastornos asociados a una pérdida de funcionalidad en animales con altos estándares de productividad (como baja fertilidad, salud o longevidad de las hembras reproductivas). Las interacciones entre la genética y la nutricio'n son cada vez ma's relevantes. La principal hipótesis de la presente tesis es que estrategias nutricionales adaptadas al tipo genético podrían ayudar a modular entre productividad y funcionalidad de las hembras. Para evaluar esta hipótesis, se utilizaron 203 conejas que dieron lugar a un total de 758 lactaciones. Estas conejas pertenecían a 3 tipos genéticos que diferían ampliamente en sus objetivos de selección: H, línea materna caracterizada por hiper-prolificidad; LP, línea materna caracterizada por hiper-longevidad funcional; R, línea paterna caracterizada por la velocidad de crecimiento. Las conejas fueron alimentadas durante 5 ciclos reproductivos consecutivos con 2 dietas iso-energéticas e iso-proteicas que diferían en la fuente de energía: Grasa animal para fomentar la producción de la leche (84 g de extracto etéreo por kg MS y 105 g de almidón por kg MS); Almidón de cereal para promover la recuperación de las reservas del corporales (21 g de extracto etéreo por kg MS y 237 g de almidón por kg MS). El experimento genero' una base de datos con datos longitudinales con unas estructuras particulares de (co)varianzas entre los datos y que debían tenerse en cuenta. En este sentido, se evaluaron varios modelos que diferían en la forma en que se modelan la estructura de datos. Se encontró que ninguno de los modelos probados fue el mejor en términos de bondad de ajuste para todos los caracteres. Sin embargo, parece que los modelos en los que la estructura (co) varianza se modelo' en bloques de (co)varianzas para cada ciclo reproductivo podrían ser los ma's recomendables. Respecto al efecto de la fuente de energía de la dieta, parece que podemos modular la asignación entre la energía dirigida a la producción de leche o la ganancia de reservas corporales cambiando la fuente de energía de la dieta, pero alterando la homeostasis normal de los animales. Respecto a las estrategias de los tipos genéticos, los resultados del presente experimento parecen indicar que las hembras R se caracterizaron por un mayor peso adulto y por una alta dependencia de las reservas corporales para hacer frente a las necesidades reproductivas del ciclo reproductivo actual. Estas hembras parieron menos gazapos, pero ma's pesados. Cuando las hembras R fueron alimentadas con una dieta que promovía la producción de la leche, invirtieron ma's en la camada actual, mientras que cuando se les alimento' con una dieta que promovía la recuperación de las reservas corporales, invirtieron ma's en la recuperación para su futura reproducción. Por el contrario, las hembras de las líneas maternas fueron ma's pequen¿as y tuvieron ma's gazapos, pero ma's ligeros. No obstante, cada tipo genético utilizo' una estrategia diferente. Las hembras H también fueron muy dependientes de las reservas corporales, pero almacenando reservas corporales durante la lactación para hacer frente a la futura reproducción. Esta estrategia les hace sensibles a la fuente de energía de la dieta, desencadenando problemas para asegurar la reproducción futura cuando fueron alimentadas con una dieta que promueve la recuperación de las reservas corporales. Las hembras LP se caracterizaron por una capacidad de adquisición mejor adaptada a las necesidades cambiantes. Esta estrategia parece ser ma's generalista, lo que les permite asegurar un alto rendimiento de la camada actual sin descuidar la reproducción futura, salvaguardando las reservas corporales, y con menos sensibilidad a la dieta. / En els últims 50 anys, ha aportat una millora general de la productivitat i, en conseqüència, de l'eficiència en totes les espècies domèstiques. Al llarg dels últims anys s'han observat trastorns associats a una pèrdua de funcionalitat en animals amb estàndards elevats de productivitat (com baixa fertilitat, salut o longevitat de les femelles reproductives). Les interaccions entre la genètica i la nutrició són cada vegada més rellevants. La hipòtesi principal de la tesi proposa que les estratègies nutricionals adaptades al tipus genètic permeten modular la productivitat i funcionalitat de les femelles. Per avaluar esta hipòtesi es van utilitzar 203 conilles que proporcionaren un total de 758 lactacions. Estes conilles pertanyien a tres tipus genètics que diferien àmpliament en els seus objectius de selecció: H, línia materna caracteritzada per hiperprolificitat; LP, línia materna caracteritzada per hiperlongevitat funcional; R, línia paterna caracteritzada per velocitat de creixement. A les conilles se'ls va subministrar 2 dietes isoenergètiques i isoproteiques durant cinc cicles reproductius consecutius, els quals diferien en la font d'energia: Greix animal per fomentar la producció de llet (84 g d'extracte eteri per kg MS i 105 g de midó per kg MS); Midó de cereal per promoure la recuperació de les reserves del corporals (21 g d'extracte eteri per kg MS i 237 g de midó per kg MS). L'experiment va generar una base de dades amb dades longitudinals amb unes estructures particulars de covariàncies entre les dades que havien de tindre's en compte. Es van avaluar diversos models que diferien en la forma en què modelitzaven l'estructura de les dades. Es va trobar que cap dels models provats va ser millor en termes de bondat d'ajust per a tots els caràcters. No obstant això, pareix que els models en què l'estructura covariància es va modelar en blocs de covariàncies per a cada cicle reproductiu podrien ser els més recomanables. Estos models van proporcionar informació útil per a comprendre l'adquisició i assignació d'animals individuals. Respecte a la font d'energia de la dieta, pareix que podem modular l'assignació entre l'energia dirigida a la producció de llet o el guany de reserves corporals si canvia la font d'energia de la dieta, tanmateix l'homeòstasi normal dels animals es veu alterada. Des del punt de vista de les estratègies segons el tipus genètics, els resultats del present experiment pareixen indicar que les femelles R es van caracteritzar per tindre major pes adult i per una dependència elevada de les reserves corporals per a fer front a les necessitats reproductives del cicle reproductiu actual. Estes femelles van parir menys catxaps. Quan les femelles R van ser alimentades amb una dieta que promovia la producció de la llet, van invertir més en la ventrada actual, mentres que quan se'ls va alimentar amb una dieta que promovia la recuperació de les reserves corporals, van invertir més en la recuperació per al següent cicle reproductiu. Contràriament, les femelles de les línies maternes van ser més menudes i van tindre més catxaps, però més lleugers. No obstant això, cada tipus genètic va utilitzar una estratègia diferent. Les femelles H també van ser molt dependents de les reserves corporals, però emmagatzemaren reserves corporals durant la lactació per a fer front a pròxima reproducció. Esta estratègia les fa més sensibles a la font d'energia de la dieta, i conseqüentment, desencadena problemes per assegurar la reproducció propera quan es nodrixen amb una dieta que promou la recuperació de les reserves corporals (baixa taxa de concepció o major mortalitat de les femeelle). Les femelles LP es van caracteritzar per una capacitat d'adquisició de recursos millor adaptada a les necessitats canviants. Esta estratègia pareix més generalista, la qual cosa les permet assegurar un rendiment alt de la ventrada actual sense descuidar la reproducció fu / Arnau Bonachera, A. (2017). OPTIMIZATION OF RESOURCE ALLOCATION TO THE GENETIC TYPE IN REPRODUCTIVE RABBIT DOES [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/85980 / TESIS

[ES] En las últimas décadas, la anguila europea Anguilla anguila ha sufrido una disminución drástica de su población lo que ha llevado su inclusión como especie en peligro crítico en la lista roja UICN. Esta situación, junto con la gran importancia comercial de esta especie, evidencia la necesidad de tomar acciones como el desarrollo de la reproducción en cautividad y el control de la pesca. Una de las herramientas más interesantes para su uso en la biología de la conservación es la criopreservación de espermatozoides, que presenta varias ventajas para esta especie, incluyendo la sincronización de gametos, la selección de líneas genéticas o su uso para la creación de un criobanco. Sin embargo, el desarrollo de protocolos de criopreservación necesariamente requieren esperma de buena calidad. Además, se necesita un método preciso para evaluar la calidad del esperma tanto antes como después de la criopreservación. Sobre esta última cuestión, la motilidad de los espermatozoides de los peces se considera uno de los mejores biomarcadores para la evaluación de la calidad de los espermatozoides en los peces, y se puede estudiar de forma subjetiva u objetiva utilizando sistemas "computer assisted sperm analysis" (CASA-Mot). Primero, se realizó un experimento para evaluar la precisión y la exactitud de ambos métodos para estudiar la motilidad del esperma: el método subjetivo y la técnica objetiva que utiliza el sistema CASA-Mot. Además, se probó si el grado de experiencia de los técnicos en el caso del método subjetivo tiene un efecto en la precisión de la estimación de la motilidad y, por lo tanto, hay una influencia del personal del laboratorio en la evaluación de la motilidad del esperma. Aquí concluimos que tanto el método como la experiencia técnica eran factores clave para evaluar con precisión la motilidad del esperma en la anguila europea, por lo que se requiere el uso de CASA-Mot junto con material calificado para obtener resultados fehacientes. En segundo lugar, se evaluaron métodos alternativos para la maduración de los machos de anguila europeos probando dos tratamientos hormonales diferentes: OVI, una gonadotropina recombinante; y VET, una gonadotropina purificada a partir de orina femenina. Después de elegir el mejor tratamiento hormonal de los dos, se evaluó el efecto de tres dosis diferentes con el objetivo de obtener el mayor rendimiento al menor coste. Los resultados de este experimento apuntaron a OVI como el mejor tratamiento hormonal en una dosis semanal de 1.5 UI/g de pez, que proporciona la mayor rentabilidad, obteniendo esperma de alta calidad a menor precio. En un tercer experimento, y utilizando los conocimientos adquiridos en los dos primeros experimentos, se realizaron una serie de experimentos para estandarizar los protocolos de criopreservación de esperma de anguila europea disponibles en ese momento (utilizando DMSO o metanol como crioprotector). Los resultados apuntaron al protocolo que utiliza el metanol como el mejor de ellos dos en términos de motilidad, velocidad y viabilidad de los espermatozoides y la preservación de la integridad del ADN. Siguiendo este último método estandarizado, se realizó un cuarto experimento con el objetivo de mejorar el protocolo en términos de volumen (volúmenes de esperma más grandes) y de calidad espermática. Además, se desarrolló un protocolo simple de almacenamiento a corto plazo para complementar las opciones de preservar el esperma durante diferentes períodos de tiempo. De todas las condiciones de almacenamiento probadas, las diluciones 1/50 a 4 ºC mostraron los mejores resultados, manteniendo la motilidad en comparación con el control durante 3 días, y manteniendo cierta motilidad espermática (12%) después de 7 días. A partir del experimento de criopreservación, fue posible aumentar los volúmenes a 2 y 5 mL sin perder la calidad del esperma en comparación con volúmenes más pequeños, y mejorando las mot / [CAT] En les últimes dècades, l'anguila europea Anguilla anguila ha sofert una disminució dràstica de la seva població el que ha portat la seva inclusió com a espècie en perill crític en la llista vermella UICN. Aquesta situació, juntament amb la gran importància comercial d'aquesta espècie, evidencia la necessitat de prendre accions com el desenvolupament de la reproducció en captivitat i el control de la pesca. Una de les eines més interessants per al seu ús en la biologia de la conservació és la criopreservació d'espermatozoides, que presenta diversos avantatges per a aquesta espècie, incloent la sincronització de gàmetes, la selecció de línies genètiques o el seu ús per a la creació d'un criobanc. No obstant això, el desenvolupament de protocols de criopreservació necessàriament requereixen esperma de bona qualitat. A més, es necessita un mètode precís per avaluar la qualitat de l'esperma tant abans com després de la criopreservació. Sobre aquesta última qüestió, la motilitat dels espermatozoides dels peixos es considera un dels millors biomarcadors per a l'avaluació de la qualitat dels espermatozoides en els peixos, i es pot estudiar de forma subjectiva o objectiva utilitzant sistemes "computer assisted sperm analysis" (CASA-Mot). Primer, es va realitzar un experiment per avaluar la precisió i l'exactitud de tots dos mètodes per estudiar la motilitat de l'esperma: el mètode subjectiu i la tècnica objectiva que utilitza el sistema CASA-Mot. A més, es va provar si el grau d'experiència dels tècnics en el cas del mètode subjectiu té un efecte en la precisió de l'estimació de la motilitat i, per tant, hi ha una influència del personal del laboratori en l'avaluació de la motilitat del esperma. Vam concloure que tant el mètode com l'experiència tècnica eren factors clau per avaluar amb precisió la motilitat de l'esperma en l'anguila europea, de manera que es requereix l'ús de CASA-Mot juntament amb material qualificat per obtenir resultats fefaents. En segon lloc, es van avaluar mètodes alternatius per a la maduració dels mascles d'anguila europeus provant dos tractaments hormonals diferents: OVI, un gonadotropina recombinant; i VET, un gonadotropina purificada a partir d'orina femenina. Després de triar el millor tractament hormonal dels dos, es va avaluar l'efecte de tres dosis diferents amb l'objectiu d'obtenir el major rendiment al menor cost. Els resultats d'aquest experiment van apuntar a OVI com el millor tractament hormonal en una dosi setmanal de 1.5 UI/g de peix, que proporciona la major rendibilitat, obtenint esperma d'alta qualitat a un preu millor. En un tercer experiment, i utilitzant els coneixements adquirits en els dos primers experiments, es van realitzar una sèrie d'experiments per estandarditzar els protocols de criopreservació d'esperma d'anguila europea disponibles en aquest moment (utilitzant DMSO o metanol com crioprotector). Els resultats van apuntar al protocol que utilitza el metanol com el millor d'ells dos en termes de motilitat, velocitat i viabilitat dels espermatozoides i la preservació de la integritat de l'ADN. Seguint aquest últim mètode estandarditzat, es va realitzar un quart experiment amb l'objectiu de millorar el protocol en termes de volum (volums d'esperma més grans) i de qualitat espermàtica. A més, es va desenvolupar un protocol simple d'emmagatzematge a curt termini per complementar les opcions de preservar l'esperma durant diferents períodes de temps. De totes les condicions d'emmagatzematge provades, les dilucions 1/50 a 4ºC van mostrar els millors resultats, mantenint la motilitat en comparació amb el control durant 3 dies, i mantenint certa motilitat espermàtica (12%) després de 7 dies. A partir de l'experiment de criopreservació, va ser possible augmentar els volums a 2 i 5 ml sense perdre la qualitat de l'esperma en comparació amb volums més petits. / [EN] In the last decades, the European eel Anguilla anguilla has suffered a drastic decrease in the recruitment in most areas of their distribution range, leading the species to be included as critically endangered in the IUCN list. This situation, together with the high commercial importance of the species, evidence the need of taking actions such as development of reproduction in captivity and control of fisheries based on the complexity of their life cycle. One of the most interesting tools for its use in conservation biology is the sperm cryopreservation, which presents several advantages for this species such as the synchronization of gametes, selection of genetic lines or cryobanking. However, the development of cryopreservation protocols necessarily requires good quality sperm, and it is also needed an accurate method to assess sperm quality both pre- and post-cryopreservation. On this last matter, fish sperm motility is considered one of the best quality biomarkers for sperm quality assessment in fish, and it can be evaluated subjectively or objectively using computer assisted sperm analysis (CASA-Mot) systems. First, an experiment was conducted to evaluate the precision and accuracy of both methods for assessing sperm motility: the subjective method and the objective technique using CASA-Mot system. Moreover, it was tested whether the degree of expertise of the technicians in the case of the subjective method, has an effect on the accuracy of the motility estimation, and therefore there is an influence of the laboratory staff on the sperm motility assessment. Here we concluded that both the method and the technician expertise were key factors in order to accurately assess sperm motility in European eel, so the use of CASA-Mot together with qualified stuff is required to obtain reliable results. Secondly, and alternative methods for European eel males maturation was evaluated by testing two different hormonal treatments: OVI, a recombinant ¿-choriogonadotropin; and VET, a human chorionic gonadotropin purified from female urine. After choosing the best hormonal treatment, the effect of three different doses was evaluated aiming for best performance and lowest cost on the treatment. The results of this experiment pointed at OVI as the best hormonal treatment in terms on sperm quantity and quality in most of the weeks of treatment, and at a weekly dose of 1.5 IU/g fish, which also provide the greatest profitability, obtaining high quality sperm at a lower price. In a third experiment, and using the knowledge acquired in the two first experiments (using the OVI hormonal treatment and CASA-Mot to assess sperm quality), a series of experiments were conducted to standardize the European eel sperm cryopreservation protocols available at the moment (using DMSO or methanol as cryoprotectant). The results indicated that the protocol using methanol was the best of them two in terms of sperm motility and velocity, sperm viability and preservation of DNA integrity. Following this last standardized method, a fourth experiment was conducted aiming for improvement of the protocol in terms of volume (larger volumes) and sperm quality outcome. Moreover, a simple protocol for short-term storage was developed to complement the options to preserve sperm for different time periods. Of all the tested storing conditions, 1/50 dilutions at 4 ºC showed the best results, maintaining the motility compared to control for 3 days, and some sperm motility (12%) was still observed after 7 days. From the cryopreservation experiment, it was possible to scale up the cryopreserved volumes to 2 and 5 mL without losing sperm quality compared to lower volumes. Moreover, the protocol was further improved by supplementing the protocol with egg yolk as an additive, obtaining the highest cryopreserved sperm motilities (over 50%) ever reported in European eel. / Herranz Jusdado, JG. (2019). Improvement of techniques for sperm evaluation and cryobanking in European eel [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/130846 / TESIS

[ES] Esta tesis aborda la caracterización y posible utilización de la goma de alholva (Trigonella foenum-graecum) (FSG, por sus siglas en inglés) en la nutrición de gazapos durante el período posterior al destete como una alternativa al uso de antimicrobianos, centrándose en el comportamiento de la goma extraída con diferentes niveles de fibra dietaria, tanto in vitro como in vivo. En el primer experimento, a partir de una dieta basal comercial de conejo, se formularon tres dietas experimentales con niveles graduales de inclusión de FSG (0, 0.25, 0.50%) administrados a tres grupos de conejos desde el destete a los 31 días hasta el sacrificio a los 94 días. Se estudió el efecto de las dietas experimentales sobre la digestibilidad fecal en dos edades (38-41 días y 56-59 días), además de los parámetros de fermentación cecal al final del experimento. Por otro lado, a partir de la misma dieta comercial de conejo, se formularon cinco dietas experimentales que contenían 0. 0.125, 0.25, 0.50 y 100% de FSG, que se sometieron a incubación in vitro con inóculo cecal de conejo durante 72 h. Se midieron la producción de gas y las variables de fermentación. La digestibilidad fecal aparente y los parámetros de fermentación cecal no se vieron afectados significativamente por la inclusión in vivo de FSG hasta 0.5%. Sin embargo, los animales alimentados con FSG mostraron valores de pH cecal más bajos. La inclusión gradual en la dieta de FSG aumentó la concentración in vitro de ácidos grasos volátiles (VFA, por sus siglas en inglés), mientras que el FSG puro aumentó la producción asintótica de gas y la tasa máxima de degradación del sustrato y disminuyó el tiempo de incubación en el que se forma la mitad de la cantidad asintótica de gas. La incubación in vitro de FSG puro disminuyó el valor del pH, la concentración de ácido láctico y la concentración de N-NH3, y aumentó la de VFA. En el segundo experimento, el FSG se caracterizó para determinar su composición química, su contenido de galactosa y manosa y su potencial como prebiótico. Se evaluaron tanto FSG puro como niveles graduales (0, 5, 10, 15 y 20 g/kg) incluidos en dietas ricas en fibra soluble (SF, por sus siglas en inglés) de pulpa de remolacha (incluida al 10%) y dietas ricas en fibra insoluble (IF, por sus siglas en ingles) de semilla de uva desengrasada (incluida al 10%). Se sometieron a digestión enzimática con pepsina y pancreatina y luego sus fracciones indigestibles se sometieron a fermentación usando inóculo cecal. Se midieron las fracciones no digestibles después de la digestión enzimática, así como las fracciones no fermentables y las variables de fermentación después del tiempo de incubación (48 h). La FSG se compone principalmente de galactosa y manosa (630 g/kg) en una proporción de 1: 1 y un nivel moderado de proteínas (223 g/kg). El FSG puro se vio poco afectado por la digestión enzimática, ya que solo se disolvieron 145 g/kg. Sin embargo, desapareció casi por completo (984 g/kg) durante el proceso de fermentación. En consecuencia, FSG aumentó la concentración de VFA, disminuyó el valor de pH y la concentración de N-NH3. La inclusión gradual de FSG en las dietas de conejos afectó la digestión de algunos nutrientes, como las fracciones fibrosas, el almidón y las proteínas, además de aumentar la fracción fermentada en la dieta SF, pero sin ningún efecto relevante en el perfil de fermentación. En el tercer experimento, se formularon cuatro dietas de acuerdo con un diseño factorial 2 x 2: una dieta convencional de conejo (C), la misma dieta C suplementada con 10 g / kg de FSG, una dieta de bajo riesgo (LR, por sus siglas en inglés) y la misma dieta LR suplementada con 10 g/kg de FSG. Las dietas C y LR se diferenciaban en el nivel de SF y proteína bruta (CP, por sus siglas en inglés) (104 vs 205 y 156 vs 121 g/kg de SF y CP respectivamente para dietas C y LR). Doscientos dieciséis conejos de la línea LP se alojaron en jaulas individuales, se dividieron aleatoriamente entre los cuatro tratamientos y se les permitió el libre acceso al alimento y al agua. La mortalidad, la morbilidad, el índice de riesgo sanitario (HRi, por sus siglas en inglés), la ingestión diaria de pienso (DFI, por sus siglas en inglés), la ganancia media diaria (ADG, por sus siglas en inglés) y el índice de conversión alimenticia (FCR, por sus siglas en inglés) se controlaron hasta los 63 días de edad. El coeficiente de digestibilidad aparente total del tracto digestivo (CTTAD, por sus siglas en inglés) de los nutrientes se determinó en doce conejos por tratamiento, entre los 49 y 53 días de edad y finalmente se midió el ambiente cecal a los 63 días de edad. La inclusión de FSG en la dieta a 10 g/kg de alimento no afectó al rendimiento durante el cebo ni al CTTAD de los nutrientes, pero aumentó ligeramente la digestibilidad de la fibra neutrodetergente (NDF, por sus siglas en inglés) y la fibra ácido-detergente (ADF, por sus siglas en inglés) en las dietas C. Del mismo modo, los parámetros cecales no se vieron afectados por la inclusión de FSG, excepto la concentración de ácido caproico en las dietas C. Sin embargo, las dietas LR disminuyeron la mortalidad, HRi, DFI, ADG y CTTAD de materia orgánica y CP pero aumentaron FCR y CTTAD de NDF y ADF con respecto a las dietas C. Además, las dietas LR aumentaron la concentración de VFA, la proporción de ácido acético, isobutírico e isovalérico mientras que disminuyeron la materia seca del contenido cecal, NNH3 y la proporción de ácidos butírico, caproico y valérico. En resumen, la FSG responde perfectamente a las dos primeras condiciones para ser un prebiótico, ya que no es digestible por las enzimas gastrointestinales antes del ciego y es altamente fermentado una vez que alcanza el ciego. Parece afectar selectivamente a la microbiota cecal debido a su efecto sobre la concentración de VFA y N-NH3, además de su efecto sobre la proporción de caproico y valérico en dietas convencionales. FSG podría aumentar la viscosidad de la digesta limitando la solubilización de algunos nutrientes como el almidón y la proteína. FSG parece ser más efectivo en dietas comerciales convencionales que en dietas de bajo riesgo. Finalmente, se confirmó que las dietas con alto nivel de SF y bajo de CP podrían ser una buena herramienta contra la enteropatía epizoótica del conejo (ERE, por sus siglas en inglés) en un sistema de producción no medicado, a costa de peores parámetros de crecimiento. / [EN] This thesis tackles the possible characterisation and utilisation of fenugreek (Trigonella foenum-graecum) seed gum (FSG) in the nutrition of young rabbits during the post-weaning period as an alternative to antimicrobials uses. The study was focussed on the behaviour of the extracted gum with different dietary fibre levels, both in vitro and in vivo. In a first trial, starting from a basal commercial rabbit diet, three experimental diets were formulated with gradual levels of inclusion of FSG (0, 0.25, 0.50 %) given to three groups of rabbits starting from weaning at 31 days old to slaughter 94 days old. The effect of the experimental diets was studied on the faecal digestibility of the diet in two ages (38-41 days and 56-59days) and on the caecal fermentation parameters at the end of the experiment. On the other hand, starting from the same commercial rabbit diet five experimental diets were formulated containing 0, 0.125, 0.25, 0.50 and 100% of FSG that were submitted to in vitro incubation with rabbit caecal inoculum during 72h. Gas production and fermentation traits were measured. Apparent faecal digestibility and caecal fermentation parameters were not significantly affected by the in vivo inclusion of FSG up to 0.5%. However, animals fed with FSG showed lower caecal pH values. Gradual dietary inclusion of FSG increased in vitro concentration of volatile fatty acids (VFA), while pure FSG increased the asymptotic gas production and the maximum substrate degradation rate and decreased the time after incubation at which half of the asymptotic amount of gas is formed. In vitro incubation of pure FSG decreased pH value, lactic acid concentration and N-NH3 concentration and increased that of VFA. In a second trial, FSG was characterised determining its chemical composition, galactose and mannose content and prebiotic potential. Pure FSG and gradual levels of FSG (0, 5, 10, 15 and 20 g/kg), included both in diets rich in soluble fibre (SF) from beet pulp (included at 10%) or in diets rich in insoluble fibre (IF) from defatted grape seeds (included at 10 %), were evaluated. They were submitted to enzymatic digestion with pepsin and pancreatin and then their indigestible fractions were submitted to fermentation using caecal inoculum. The indigestible fractions after enzymatic digestion were measured, as well as the nonfermentable fractions and the fermentation traits after incubation time (48 h). FSG was mostly composed of galactose and mannose (630 g/kg) in 1:1 ratio and a moderate protein level (223 g/kg). Pure FSG was weakly affected by enzymatic digestion, only 145 g/kg was dissolved. However, it was almost entirely disappeared (984 g/kg) during the fermentation process. Consequently, FSG increased VFA concentration and decreased both pH value and N-NH3 concentration. Th gradual inclusion of FSG in rabbit’s diets affected some nutrients digestion such as the fibre fractions, starch and protein, besides to increase the fermentation fraction in SF diet but without any relevant effect on the fermentation profile. In a last third trial, four diets were formulated according to 2 x 2 factorial design: a conventional rabbit diet (C), the same C diet supplemented by 10 g/kg of FSG, a low-risk diet (LR), and the same LR diet supplemented by 10 g/kg of FSG. C and LR diets differed in SF and crude protein levels (CP) (104 vs 205 and 156 vs 121 g/kg of SF and CP respectively for C and LR diets). Two hundred and sixteen weaned rabbits (28 days of age) of the LP line were allocated in individual cages and divided randomly between the four treatments and allowed free access to feed and water. Mortality, morbidity, health risk index (HRi), daily feed intake (DFI), average daily gain (ADG) and feed conversion ratio (FCR) were controlled until 63 days of age. Coefficient of total tract apparent digestibility (CTTAD) of nutrients, on twelve rabbits per treatment, was determined from 49 to 53 days of age and finally, caecal environment was measured at 63 days of age. FSG dietary inclusion at 10 g/kg did not affect performance or CTTAD of nutrients but did slightly increased neutral-detergent fibre (NDF) and acid-detergent fibre (ADF) digestibility in C diets. Similarly, caecal parameters were not affected by FSG except caproic acid concentration in C diets. Nevertheless, LR diets decreased mortality, HRi, DFI, ADG and CTTAD of organic matter and CP but increased FCR and CTTAD of NDF and ADF respect to C diets. Moreover, LR diets increased VFA concentration, the proportion of acetic, isobutyric and isovaleric while decreased the dry matter of the caecal content, N-NH3 and the proportion of butyric, caproic and valeric acids. To summarise, FSG perfectly responds to the two first conditions to be prebiotic, being not digestible by gastrointestinal enzymes before the caecum and highly fermented once reached the caecum. It seems to affect selectively caecal microbiota due to its effect on VFA and N-NH3 concentration besides to its effect on caproic and valeric proportions in conventional diets. FSG could increase viscosity of digesta limiting the solubilisation of some nutrients such starch and protein. FSG seems to be more effective in conventional commercial diets than in low-risk diets. Finally, it was confirmed that diets with high SF level and low CP could be a good tool against epizootic rabbit enteropathy (ERE) in a nomedicated breeding system at the cost of impaired growth parameters. / [CA] Aquesta tesi aborda la caracterització i possible utilització de la goma de fenigrec (Trigonella foenum-graecum) (FSG, per les sigles en anglès) en la nutrició del conills durant el període posterior al deslletament com una alternativa a l'ús d'antimicrobians, centrant-se en el comportament de la goma extreta amb diferents nivells de fibra dietària, tant in vitro com in vivo. En el primer experiment, a partir d'una dieta basal comercial de conill, es van formular tres dietes experimentals amb nivells graduals d'inclusió de FSG (0, 0.25, 0.50%) administrats a tres grups de conills des del deslletament als 31 dies fins al sacrifici als 94 dies. Es va estudiar l'efecte de les dietes experimentals sobre la digestibilitat fecal en dues edats (38-41 dies i 56-59 dies), a més dels paràmetres de fermentació cecal a la fi de l'experiment. D'altra banda, a partir de la mateixa dieta comercial de conill, es van formular cinq dietes experimentals que contenien 0. 0.125, 0.25, 0,50 i 100% de FSG, que es van sotmetre a incubació in vitro amb inòcul cecal de conill durant 72 h. Es van mesurar la producció de gas i les variables de fermentació. La digestibilitat fecal aparent i els paràmetres de fermentació cecal no es van veure afectats significativament per la inclusió in vivo de FSG fins a 0.5%. No obstant això, els animals alimentats amb FSG van mostrar valors de pH cecal més baixos. La inclusió gradual en la dieta de FSG va augmentar la concentració in vitro d'àcids grassos volàtils (VFA, per les sigles en anglès), mentre que el FSG pur va augmentar la producció asimptòtica de gas i la taxa màxima de degradació del substrat i va disminuir el temps d'incubació en el qual es forma la meitat de la quantitat asimptòtica de gas. La incubació in vitro d'FSG pur va disminuir el valor del pH, la concentració d'àcid làctic i la concentració de N-NH3, i va augmentar la de VFA. En el segon experiment, el FSG es va caracteritzar per determinar la seva composició química, el seu contingut de galactosa i manosa i el seu potencial com prebiòtic. Es van avaluar tant FSG pur com nivells graduals (0, 5, 10, 15 i 20 g/kg) inclosos en dietes riques en fibra soluble (SF, per les sigles en anglès) de polpa de remolatxa (inclosa al 10%) i dietes riques en fibra insoluble (IF, per les sigles en anglès) de llavor de raïm desgreixada (inclosa al 10%). Es van sotmetre a digestió enzimàtica amb pepsina i pancreatina i després les fraccions indigeribles es van sotmetre a fermentació usant inòcul cecal. Es van mesurar les fraccions no digestibles després de la digestió enzimàtica, així com les fraccions no fermentables i les variables de fermentació després del temps d'incubació (48 h). La FSG es compon principalment de galactosa i manosa (630 g/kg) en una proporció de 1: 1 i un nivell moderat de proteïnes (223 g/kg). El FSG pur es va veure poc afectat per la digestió enzimàtica, ja que només es van dissoldre 145 g/kg. No obstant això, va desaparèixer gairebé del tot (984 g/kg) durant el procés de fermentació. En conseqüència, FSG va augmentar la concentració de VFA, va disminuir el valor de pH i la concentració de N-NH3. La inclusió gradual de FSG en les dietes de conills va afectar la digestió d'alguns nutrients, com les fraccions fibroses, el midó i les proteïnes, a més d'augmentar la fracció fermentada en la dieta SF, però sense cap efecte rellevant en el perfil de fermentació. En el tercer experiment, es van formular quatre dietes d'acord amb un disseny factorial 2 x 2: una dieta convencional de conill (C), la mateixa dieta C suplementada amb 10 g/kg de FSG, una dieta de baix risc (LR, per les sigles en anglès) i la mateixa dieta LR suplementada amb 10 g/kg de FSG. Les dietes C i LR es diferenciaven en el nivell de SF i proteïna bruta (CP, per les sigles en anglès) (104 vs 205 i 156 vs 121 g/kg de SF i CP respectivament per a dietes C i LR). Doscents setze conills de la línia LP es van allotjar en gàbies individuals, es van dividir aleatòriament entre els quatre tractaments i se'ls va permetre el lliure accés a l'aliment i a l'aigua. La mortalitat, la morbiditat, l'índex de risc sanitari (HRi, per les sigles en anglès), la ingestió diària de pinso (DFI, per les sigles en anglès), el guany mitjá diari (ADG, per les sigles en anglès) i l'índex de conversió alimentària (FCR, per les sigles en anglès) es van controlar fins als 63 dies d'edat. El coeficient de digestibilitat aparent total del tracte digestiu (CTTAD, per les sigles en anglès) dels nutrients es va determinar en dotze conills per tractament, entre els 49 i 53 dies d'edat i finalment es va mesurar l'ambient cecal als 63 dies d'edat. La inclusió de FSG en la dieta a 10 g/kg d'aliment no va afectar el rendiment durant l'engreix ni el CTTAD dels nutrients, però va augmentar lleugerament la digestibilitat de la fibra neutre-detergent (NDF, per les sigles en anglès) i la fibra àcid-detergent (ADF, per les sigles en anglès) en les dietes C. De la mateixa manera, els paràmetres cecals no es van veure afectats per la inclusió de FSG, excepte la concentració d'àcid caproic en les dietes C. No obstant això, les dietes LR van disminuir la mortalitat, HRi, DFI, ADG i CTTAD de matèria orgànica i CP però van augmentar FCR i CTTAD de NDF i ADF pel que fa a les dietes C. A més, les dietes LR van augmentar la concentració de VFA, la proporció d'àcid acètic, isobutíric i isovalèric mentre que van disminuir la matèria seca del contingut cecal, N-NH3 i la proporció d'àcids butíric, caproic i valéric. En resum, la FSG respon perfectament a les dues primeres condicions per ser un prebiòtic, ja que no és digestible pels enzims gastrointestinals abans del cec i és altament fermentat un cop que arriba al cec. Sembla afectar selectivament a la microbiota cecal pel seu efecte sobre la concentració de VFA i N-NH3, a més del seu efecte sobre la proporció de caproic i valéric en dietes convencionals. FSG podria augmentar la viscositat de la digesta limitant la solubilització d'alguns nutrients com el midó i la proteïna. FSG sembla ser més efectiu en dietes comercials convencionals que en dietes de baix risc. Finalment, es va confirmar que les dietes amb alt nivell de SF i baix de CP podrien ser una bona eina contra la enteropatia epizoòtica del conill (ERE, per les sigles en anglès) en un sistema de producció no medicat, a costa d'pitjors paràmetres de creixement. / Jihed, Z. (2020). In vitro and in vivo characterization of galactomannanes extracted from fenugreek seeds (Trigonella foenum-graecum) for young rabbit nutrition [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/153714 / TESIS

Tesis por compendio / [ES] Las tecnologías de reproducción asistida suponen un cambio drástico en el entorno natural del embrión, al no conseguir imitar las condiciones maternales óptimas, por lo que su aplicación implica consecuencias para el desarrollo del organismo. El objetivo general de esta tesis fue estudiar los efectos a largo plazo y transgeneracionales del estrés provocado durante un procedimiento de transferencia de embriones vitrificados, utilizando el conejo como modelo animal. En el Capítulo I, demostramos que la transferencia de mórulas tempranas o compactas resulta en tasas de supervivencia al parto > 70% en fresco y > 55% tras la vitrificación. La facilidad con la que se pueden realizar estos procedimientos, el elevado número de descendientes que podemos obtener y el corto ciclo de vida del conejo, fomentaron y facilitaron los siguientes estudios. En el Capítulo II, se compararon las diferencias en el desarrollo a corto y largo plazo entre los animales nacidos de embriones transferidos en fresco (FT) o tras su vitrificación (VT), utilizando una población concebida de forma natural (NC) como referencia. Tanto las tasas de supervivencia prenatal, como el rendimiento del crecimiento postnatal, se redujeron significativamente a medida que aumentó la manipulación embrionaria (NC<FT<VT). Además, comparamos el efecto de dos dispositivos de vitrificación, observando que, aunque el cryotop ejerció un efecto positivo sobre la supervivencia fetal, implicó mayores desviaciones fenotípicas (rendimiento de crecimiento y lactancia) postnatalmente que el dispositivo de la ministraw. Sin embargo, todas las progenies fueron sanas y fértiles. Por lo tanto, estos resultados demostraron la gran plasticidad del embrión de mamífero. El objetivo del Capítulo III fue evaluar los efectos del procedimiento de transferencia de embriones vitrificados (VET) en el desarrollo, comparando animales VT y NC. Así, detectamos que los animales VT presentaron alteraciones del peso al nacer y del patrón de crecimiento, viéndose los machos más afectados que las hembras. En la edad adulta, los machos VT presentaron un menor peso corporal, del hígado y del corazón. Un análisis proteómico hepático mostró cambios en relación con la fosforilación oxidativa y el metabolismo de los lípidos y el zinc. Mediante un análisis de sangre, se comprobó que el estado de salud entre los animales VT y NC fue comparable. En el Capítulo IV, se constituyó un modelo de tres generaciones (F1, F2 y F3) para evaluar los efectos transgeneracionales del VET. Los resultados mostraron que los efectos directos (F1) del VET fueron intergeneracionales (F2) y transgeneracionales (F3), ya que las progenies VT mostraron alteraciones en el crecimiento, peso corporal adulto y peso hepático. Un estudio molecular (transcriptómico y metabolómico) del tejido hepático reveló alteraciones en el metabolismo del zinc y los ácidos grasos insaturados a través de las generaciones, correlacionado con el fenotipo VT. No obstante, la fertilidad fue similar entre los machos VT y NC en cada generación, denotando un buen estado de salud. Finalmente, en el Capítulo V, mediante un enfoque comparativo multi-ómico (metabolómico, proteómico y epigenómico) del tejido hepático entre animales F3-VT y F3-NC, se demostró una alteración global de la fisiología molecular en los animales VT, relacionada principalmente con el metabolismo de los lípidos (ácidos grasos poliinsaturados, esteroides, hormonas esteroides...). Además, se detectaron amplios cambios en el epigenoma hepático, demostrando la herencia transgeneracional de los cambios moleculares inducidos por el VET en los embriones de la F1. El estado de salud fue similar entre los animales VT y NC. A lo largo de esta tesis se ha demostrado, por primera vez, que el VET induce una reprogramación embrionaria del desarrollo que persiste hasta la edad adulta y en las generaciones posteriores. Se cree que los mecanismos epigenéticos median esta plasticidad del desarrollo y su herencia transgeneracional, un hecho también avalado por nuestros resultados. Por lo tanto, los diferentes campos que actualmente se nutren de la criopreservación y transferencia de embriones, como la medicina y la producción animal, deberían evaluar cómo estos procedimientos pueden afectar a la eficiencia o la consecución de sus objetivos. / [EN] Assisted reproductive technologies involve the furthest change from the natural environment by failing to mimic optimal maternal conditions, and thereby entail consequences for late development. The general aim of this thesis was to study the long-term and transgenerational effects of the in vitro stressors occurring during a vitrified embryo transfer procedure on the rabbit model. In Chapter I, we prove that transferring early or compact morula leads to rates of survival at birth >70% in fresh and >55% after vitrification. The ease of performing both embryo cryopreservation and embryo transfer procedures, the high numbers of descendants that we are able to obtain and the short life cycle of the rabbit encouraged and facilitated the following studies. Chapter II was designed to compare the short and long-term developmental differences between animals born from fresh-transferred (FT) and vitrified-transferred (VT) embryos, using a naturally conceived (NC) population as control reference. Both prenatal survival rates and growth performance were significantly reduced as embryo manipulation was increased (NC<FT<VT). In addition, we compare the effect of two vitrification devices, noting that although cryotop exerted a positive effect on foetal survival, incurred higher phenotypic (growth and lactation performances) deviations postnatally than the straw device. Then, the choice of vitrification device is not trivial. However, all progenies were healthy and fertile. Therefore, these results demonstrated the high developmental plasticity of the mammalian embryo under different in vitro stressors. The aim of Chapter III was to evaluate the effects of the entire vitrified embryo transfer procedure (VET) on development, detecting that VT animals have modifications of the birth weight and growth pattern, but males were more affected than females. At adulthood, VT males were smaller and showed a significantly lower liver and heart weight than NC males. A comparative proteomic analysis showed changes in relation to oxidative phosphorylation and dysregulations in the zinc and lipid metabolism. However, a blood analysis (haematological and biochemical) revealed that health status was comparable between VT and NC animals. In Chapter IV, a three generation (F1, F2 and F3) model was constituted in order to assess the transgenerational effects of the VET. The results showed that direct (F1) effects of the VET were also intergenerational (F2) and transgenerational (F3), as VT progenies exhibited alterations in the growth velocity, adult body weight and liver weight in each generation. A comparative molecular (transcriptomic and metabolomics) study in the liver tissue unveiled alterations in the zinc and unsaturated fatty acid metabolism across the generations, which can be correlated with the VT phenotype. Nonetheless, similarities in the fertility between VT males and their NC counterparts in each generation denote that VET did not seem to impair the health status in the VT animals. Finally, in Chapter V, a comparative multi-omic (metabolomic, proteomic and epigenomic) approach was performed in the liver tissue between F3-VT and F3-NC animals. Both metabolomic and proteomic analyses showed global alteration in the hepatic metabolism of VT animals, mainly related to lipid metabolism (e.g. polyunsaturated fatty acids, steroids, steroid hormones¿). In addition, broad methylation changes were detected in the hepatic epigenome, involving genes related with lipid metabolism and apoptosis. These data demonstrated the transgenerational inheritance of the changes induced by VET in ancestors' embryos. The healthy status was similar between VT and NC animals. Through this thesis, it has been demonstrated for the first time that VET induces a developmental reprogramming that persists until adulthood and in subsequent generations, incurring long-term consequences for the phenotype and the molecular physiology of the resultant offspring. / [CA] Les tecnologies de reproducció assistida suposen un canvi dràstic en l'entorn natural de l'embrió, al no aconseguir imitar les condicions maternals òptimes, per la qual cosa la seua aplicació implica conseqüències per al desenvolupament de l'organisme. L'objectiu general d'esta tesi va ser estudiar els efectes a llarg termini i transgeneracionals de l'estrés provocat durant un procediment de transferència d'embrions vitrificats, utilitzant el conill com a model animal. En el Capítol I, demostrem que la transferència de mórules primerenques o compactes resulta en taxes de supervivència al part > 70% en fresc i > 55% després de la vitrificació. La facilitat amb què es poden realitzar aquests procediments, l'elevat nombre de descendents que podem obtindre i el curt cicle de vida del conill, van fomentar i van facilitar els següents estudis. En el Capítol II, es van comparar les diferències en el desenvolupament a curt i llarg termini entre els animals nascuts d'embrions transferits en fresc (FT) o després de la seua vitrificació (VT), utilitzant una població concebuda de forma natural (NC) com a referència. Tant les taxes de supervivència prenatal, com el rendiment del creixement postnatal, es van reduir significativament a mesura que va augmentar la manipulació embrionària (NC<FT<VT). A més, es va comparar l'efecte de dos dispositius de vitrificació, observant que, encara que el cryotop va exercir un efecte positiu sobre la supervivència fetal, va implicar majors desviacions fenotípiques (rendiment de creixement i lactància) postnatalment que el dispositiu de la ministraw. No obstant això, totes les progènies van ser sanes i fèrtils. Per tant, estos resultats van demostrar la gran plasticitat de l'embrió de mamífer. L'objectiu del Capítol III va ser avaluar els efectes del procediment de transferència d'embrions vitrificats (VET) en el desenvolupament, comparant animals VT i NC. Així, vam detectar que els animals VT van presentar alteracions del pes al nàixer i del patró de creixement, veient-se els mascles més afectats que les femelles. En l'edat adulta, els mascles VT van presentar un menor pes corporal, del fetge i del cor. Un anàlisi proteòmic hepàtic va mostrar canvis en relació amb la fosforilació oxidativa i el metabolisme dels lípids i el zinc. Per mitjà d'un anàlisi de sang, es va comprovar que l'estat de salut entre els animals VT i NC era comparable. En el Capítol IV, es va constituir un model de tres generacions (F1, F2 i F3) per a avaluar els efectes transgeneracionals del VET. Els resultats van mostrar que els efectes directes (F1) del VET van ser intergeneracionals (F2) i transgeneracionals (F3), ja que les progènies VT van mostrar alteracions en el creixement, pes corporal adult i pes hepàtic. Un estudi molecular (transcriptòmic i metabolòmic) del teixit hepàtic va revelar alteracions en el metabolisme del zinc i els àcids grassos insaturats a través de les generacions, correlacionat amb el fenotip VT. No obstant això, la fertilitat va ser semblant entre els mascles VT i NC en cada generació, denotant un bon estat de salut. Finalment, en el Capítol V, per mitjà d'un enfocament comparatiu multi-òmic (metabolòmic, proteòmic i epigenòmic) del teixit hepàtic entre animals F3-VT i F3-NC, es va demostrar una alteració global de la fisiologia molecular en els animals VT, relacionada principalment amb el metabolisme dels lípids (àcids grassos poliinsaturats, esteroides, hormones esteroides...) . A més, es van detectar amplis canvis en l'epigenoma, demostrant l'herència transgeneracional dels canvis moleculars induïts pel VET en els embrions de la F1. L'estat de salut va ser semblant entre els animals VT i NC. Al llarg d'esta tesi s'ha demostrat, per primera vegada, que el VET indueix una reprogramació embrionària del desenvolupament que persisteix fins a l'edat adulta i en les generacions posteriors. [CA] Les tecnologies de reproducció assistida suposen un canvi dràstic en l'entorn natural de l'embrió, al no aconseguir imitar les condicions maternals òptimes, per la qual cosa la seua aplicació implica conseqüències per al desenvolupament de l'organisme. L'objectiu general d'esta tesi va ser estudiar els efectes a llarg termini i transgeneracionals de l'estrés provocat durant un procediment de transferència d'embrions vitrificats, utilitzant el conill com a model animal. En el Capítol I, demostrem que la transferència de mórules primerenques o compactes resulta en taxes de supervivència al part > 70% en fresc i > 55% després de la vitrificació. La facilitat amb què es poden realitzar aquests procediments, l'elevat nombre de descendents que podem obtindre i el curt cicle de vida del conill, van fomentar i van facilitar els següents estudis. En el Capítol II, es van comparar les diferències en el desenvolupament a curt i llarg termini entre els animals nascuts d'embrions transferits en fresc (FT) o després de la seua vitrificació (VT), utilitzant una població concebuda de forma natural (NC) com a referència. Tant les taxes de supervivència prenatal, com el rendiment del creixement postnatal, es van reduir significativament a mesura que va augmentar la manipulació embrionària (NC<FT<VT). A més, es va comparar l'efecte de dos dispositius de vitrificació, observant que, encara que el cryotop va exercir un efecte positiu sobre la supervivència fetal, va implicar majors desviacions fenotípiques (rendiment de creixement i lactància) postnatalment que el dispositiu de la ministraw. No obstant això, totes les progènies van ser sanes i fèrtils. Per tant, estos resultats van demostrar la gran plasticitat de l'embrió de mamífer. L'objectiu del Capítol III va ser avaluar els efectes del procediment de transferència d'embrions vitrificats (VET) en el desenvolupament, comparant animals VT i NC. Així, vam detectar que els animals VT van presentar alteracions del pes al nàixer i del patró de creixement, veient-se els mascles més afectats que les femelles. En l'edat adulta, els mascles VT van presentar un menor pes corporal, del fetge i del cor. Un anàlisi proteòmic hepàtic va mostrar canvis en relació amb la fosforilació oxidativa i el metabolisme dels lípids i el zinc. Per mitjà d'un anàlisi de sang, es va comprovar que l'estat de salut entre els animals VT i NC era comparable. En el Capítol IV, es va constituir un model de tres generacions (F1, F2 i F3) per a avaluar els efectes transgeneracionals del VET. Els resultats van mostrar que els efectes directes (F1) del VET van ser intergeneracionals (F2) i transgeneracionals (F3), ja que les progènies VT van mostrar alteracions en el creixement, pes corporal adult i pes hepàtic. Un estudi molecular (transcriptòmic i metabolòmic) del teixit hepàtic va revelar alteracions en el metabolisme del zinc i els àcids grassos insaturats a través de les generacions, correlacionat amb el fenotip VT. No obstant això, la fertilitat va ser semblant entre els mascles VT i NC en cada generació, denotant un bon estat de salut. Finalment, en el Capítol V, per mitjà d'un enfocament comparatiu multi-òmic (metabolòmic, proteòmic i epigenòmic) del teixit hepàtic entre animals F3-VT i F3-NC, es va demostrar una alteració global de la fisiologia molecular en els animals VT, relacionada principalment amb el metabolisme dels lípids (àcids grassos poliinsaturats, esteroides, hormones esteroides...) . A més, es van detectar amplis canvis en l'epigenoma, demostrant l'herència transgeneracional dels canvis moleculars induïts pel VET en els embrions de la F1. L'estat de salut va ser semblant entre els animals VT i NC. Al llarg d'esta tesi s'ha demostrat, per primera vegada, que el VET indueix una reprogramació embrionària del desenvolupament que persisteix fins a l'edat adulta i en les generacions posteriors. Es creu que els mecanismes epigenètics medien aquesta plasticitat del desenvolupament i la seua herència transgeneracional, un fet també avalat pels nostres resultats. Per tant, els diferents camps que actualment es nodreixen de la criopreservació i transferència d'embrions, com la medicina i la producció animal, haurien d'avaluar com aquests procediments poden afectar l'eficiència o la consecució dels seus objectius. / García Domínguez, X. (2020). Developmental plasticity and transgenerational reprogramming following vitrified embryo transfer in Oryctolagus cuniculus [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149562 / TESIS / Compendio

[ES] Los estudios sobre nutrición proteica en conejos son escasos en comparación con otras especies, el cálculo de las necesidades es relativamente antiguo, no están ofrecidos a nivel ileal y sus peculiares hábitos alimenticios complican su conocimiento. Además, en los últimos años, se ha establecido relación directa entre este nutriente con una de las principales enfermedades que afectan esta especie (la Enteropatía Epizoótica del Conejo), y como consecuencia, el contenido proteico de las dietas se ha reducido. Por otro lado, se ha comprobado una pérdida en la efectividad de la selección por velocidad de crecimiento en las líneas paternales la cual podría estar relacionada con una mala estimación de los requerimientos proteicos (especialmente en los animales con elevadas velocidades de crecimiento). Finalmente, el nitrógeno ureico plasmático (PUN) podría ser una buena herramienta para estimar el grado de aprovechamiento proteico del pienso, pero su uso no ha sido comprobado aún en esta especie. Con todo ello, la principal hipótesis de esta tesis es que existe una mala estimación de las necesidades de aminoácidos en conejos con elevadas velocidades de crecimiento y que otra combinación de aminoácidos podría maximizar su rendimiento. Para evaluar esta hipótesis se utilizaron un total de 1464 conejos de engorde (provenientes principalmente de la línea R, línea paternal seleccionada por velocidad de crecimiento, y, en mucha menor medida, de líneas maternales con menores velocidades de crecimiento), se formularon un total de 32 dietas (donde principalmente diferían el contenido de los tres aminoácidos típicamente limitantes; lisina, aminoácidos azufrados y treonina), se realizaron 69 y 71 ensayos de digestibilidad fecal e ileal, respectivamente, se valoró la retención de nutrientes de 126 animales durante su crecimiento y por último se analizaron los niveles de PUN de más de 2700 muestras. Con el primero de los trabajos obtuvimos la confirmación del primer indicio: las dietas actuales parecían presentar deficiencias en aminoácidos para los conejos con altas velocidades de crecimiento, comprobando que aquellos animales que crecían más depositaban proporcionalmente más energía y menos proteína (esto sugería una desviación de cierta proporción de proteína como fuente de energía, siendo poco eficiente). Antes de plantearnos qué combinación de aminoácidos mejoraría este problema, tendríamos que poner a punto la técnica para detectar dichas deficiencias. En el segundo trabajo no solo comprobamos que el PUN podría ser utilizado, en esta especie, sino que se estableció la mejor metodología: A las 08:00h (bajo una alimentación ad libitum) o a las 21:00h (bajo un ayuno de 10h y un restablecimiento del alimento a las 18:00h). Ahora ya, sabiendo que podría existir dicha deficiencia y que además podemos utilizar el PUN, seleccionamos de una matriz de 27 piensos (donde habían tres niveles de lisina, azufrados y treonina), aquel que optimizaba los valores de PUN y que previsiblemente mejoraría la asimilación proteica. De este experimento surge la Dieta MAB (8.1, 6.6 y 5.7 g/kg materia seca de lisina, aminoácidos azufrados y treonina, respectivamente) como candidato a sustituir a las actuales recomendaciones, Dieta MMM (8.1, 5.8 y 6.9 g/kg materia seca de lisina, aminoácidos azufrados y treonina, respectivamente). Pero hasta ahora solo podíamos decir que el MAB reduce los nivele de urea: ¿Está esto relacionado con unos mejores parámetros productivos? Finalmente en el último trabajo se comprobó la superioridad productiva de esta combinación, ya que mejoró significativamente tanto la velocidad de crecimiento como el índice de conversión. Tras la valoración digestiva, podemos aconsejar unos niveles de 5.3, 4.3 y 2.9 g/kg de materia seca para la lisina, aminoácidos azufrados y treonina a nivel ileal aparente, arrojando más información sobre la nutrición proteica de precisi� / [CAT] Els estudis sobre nutrició proteica en conills són escassos en comparació amb altres espècies, el càlcul de les necessitats és relativament antic, no estan oferts a nivell ileal i els seus peculiars hàbits alimentaris compliquen el seu coneixement. A més, en els últims anys, s'ha establert relació directa entre aquest nutrient amb una de les principals malalties que afecten aquesta espècie (la enteropatia epizoótica del Conill), i com a conseqüència, el contingut proteic de les dietes s'ha reduït. D'altra banda, s'ha comprovat una pèrdua en l'efectivitat de la selecció per velocitat de creixement en les línies paternals la qual podria estar relacionada amb una mala estimació dels requeriments proteics (especialment en els animals amb elevades velocitats de creixement). Finalment, el nitrogen ureic plasmàtic (PUN) podria ser una bona eina per estimar el grau d'aprofitament proteic del pinso, però el seu ús no ha estat comprovat encara en aquesta espècie. Amb tot això, la principal hipòtesi d'aquesta tesi és que hi ha una mala estimació de les necessitats d'aminoàcids en conills amb elevades velocitats de creixement i que una altra combinació d'aminoàcids podria maximitzar el seu rendiment. Per avaluar aquesta hipòtesi es van utilitzar un total de 1464 conills d'engreix (provinents principalment de la línia R, línia paternal seleccionada per velocitat de creixement, i, en molta menor mesura, de línies maternals amb menors velocitats de creixement), es van formular un total de 32 dietes (on principalment diferien el contingut dels tres aminoàcids típicament limitants; lisina, aminoàcids ensofrats i treonina), es van realitzar 69 i 71 assajos de digestibilitat fecal i ileal, respectivament, es va valorar la retenció denutrients de 126 animals durant el seu creixement i finalment es van analitzar els nivells de PUN de més de 2700 mostres. Amb el primer dels treballs vam obtenir la confirmació del primer indici: les dietes actuals semblaven presentar deficiències en aminoàcids per als conills amb altes velocitats de creixement, comprovant que aquells animals que creixien més dipositaven proporcionalment més energia i menys proteïna (això suggeria una desviació de certa proporció de proteïna com a font d'energia, sent poc eficient). Abans de plantejar- nos què combinació d'aminoàcids milloraria aquest problema, hauríem de posar a punt la tècnica per detectar aquestes deficiències. En el segon treball no només vam comprovar que el PUN podria ser utilitzat, en aquesta espècie, sinó que es va establir la millor metodologia: A les 08: 00h (sota una alimentació ad libitum) oa les 21: 00h (sota un dejuni de 10h i a un restabliment de l'aliment a les 18: 00h). Ara ja, sabent que podria existir aquesta deficiència i que a més podem utilitzar el PUN, seleccionem d'una matriu de 27 pinsos (on havien tres nivells de lisina, ensofrats i treonina), aquell que optimitzava els valors de PUN i que previsiblement milloraria l'assimilació proteica. D'aquest experiment sorgeix la Dieta MAB (8.1, 6.6 i 5.7 g / kg matèria seca de lisina, aminoàcids ensofrats i treonina, respectivament) com a candidat a substituir les actuals recomanacions, Dieta MMM (8.1, 5.8 i 6.9 g / kg matèria seca de lisina, aminoàcids ensofrats i treonina, respectivament). Però fins ara només podíem dir que el MAB redueix els anivelli d'urea: Està això relacionat amb uns millors paràmetres productius? Finalment en l'últim treball es va comprovar la superioritat productiva d'aquesta combinació, ja que va millorar significativament tant la velocitat de creixement com l'índex de conversió. Després de la valoració digestiva, podem aconsellar uns nivells de 5.3, 4.3 i 2.9 g / kg de matèria seca per la lisina, aminoàcids ensofrats i treonina a nivell ileal aparent, llançant més informació sobre la nutrició proteica de precisió i pretenent tallar la problemàtica que ens plantejàvem a l'inici de la tesi. / [EN] Studies on protein nutrition in rabbits are scarce compared with other species, the estimation of their requirements is relatively old and no data are reported at ileal level. Moreover, their peculiar feeding behaviour, including caecotrophy, complicates more this study. In addition, in recent years, a relationship has been established between dietary crude protein and Epizootic Rabbit Enteropathy (one of the most important disease that affects this species). As a consequence, the protein content of diets has been reduced. On the other hand, there has been a loss of effectiveness of the selection for growth rate in the paternal lines, which could be related with a possible nutritional deficit in high growth rate rabbits when using the current commercial diets. Plasma urea nitrogen (PUN) could be a good indicator of an amino acid imbalance, but its use has not yet been tested in rabbits. Thus, the main hypothesis of this thesis concerns that growing rabbits selected by growth rate could have amino acid requirements different from current recommendations, and that another amino acid combination would maximize productive traits. To evaluate this hypothesis, a total of 1464 growing rabbits were used (mainly from the R line, a paternal line selected by growth rate, and, to a much lesser extent, from some other maternal lines with lower growth rates), 32 diets were formulated differing in the content of the three typically limiting amino acids (lysine, sulfur amino acids and threonine). Faecal and ileal digestibility trials were performed with 69 and 71 animals, respectively. Nutrient retention during their growing period was evaluated in 126 animals. Finally, PUN was analyzed in more than 2700 samples. From the first trial,we obtained indication about the possible existence of some limiting amino acid when current moderate protein diets are used in growing rabbits with high growth rates, as retained protein to retained energy ratio was clearly lower for animals of the paternal lines (this suggested a deviation of a certain proportion of protein as a source of energy, which is inefficient). Before considering what combination of amino acids would improve their utilization, it was necessary to evaluate the possible interest of PUN to detect deficiencies in amino acids and establish the appropriate methodology to optimize its use for this purpose in growing rabbits. In the second study we verified the applicability of PUN in rabbits and checked the highest differences between diets: from 04:00h to12:00h in animals fed ad libitum and at three hours after refeeding (21:00h) when a fasting period of 10 h was applied. At this point, knowing that amino acid deficiency could exist and that PUN could be an indicator of it, we formulated a matrix of 27 diets (in a 3x3x3 factorial design, with three levels of the three amino acids mentioned above, using the current recommendations and increasing or decreasing them by 15%), searching for the combination minimizing PUN values and, hypothetically, improving the protein assimilation. From this trial, the diet MHL (8.1, 6.6 and 5.7 g/kg dry matter of lysine, sulphur amino acids and threonine, respectively) emerged as a candidate to replace the current recommendations (diet MMM; 8.1, 5.8 and 6.9 g/kg dry mater of lysine, sulphur amino acids and threonine, respectively). However a question arises: could this new combination improve productive traits? Finally, in the last study we verified the usefulness of this combination since it significantly improved both the growth rate and the feed conversion ratio. After digestibility assessment, we propose levels of 5.3, 4.3 and 2.9 g/kg dry matter of apparent ileal digestible lysine, sulphur amino acids and threonine, respectively. These data are intended to improve current knowledge on protein nutrition and move towards precision protein nutrition. / Marín García, PJ. (2019). Lysine, sulfur amino acids and threonine requirements of growing rabbits from a line selected by growth rate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/132186 / TESIS

La crioconservación de los embriones por congelación o vitrificación reduce la supervivencia de los embriones de conejo (Oryctolagus cuniculus) entre un 20 y 50% dependiendo de la estirpe genética y el procedimiento utilizado. En embriones vitrificados de conejo se ha observado un elevada mortalidad tras la implantación que sugeriría que el proceso tiene efectos tardíos y negativos sobre el desarrollo fetal. El objetivo de la tesis fue estudiar el transcriptoma embrionario previo a la implantación (6 días) y el desarrollo embrionario y fetal de embriones de conejo crioconservados mediante dos procedimientos habituales en esta especie. Específicamente, el objetivo del capítulo I fue la evaluación de los efectos del procedimiento de congelación sobre el desarrollo y expresión génica de embriones de conejo. Para ello, evaluamos primero la distribución de pérdidas durante la gestación analizando las tasas de desarrollo a blastocisto tardío, implantación y nacimiento. Después comparamos el perfil transcriptómico de embriones de 6 días, previamente congelados y transferidos en el estadio de mórula, con embriones desarrollados in vivo (6 días post-inseminación). Para ello, llevamos a cabo un análisis microarray de dos colores y usamos una plataforma genérica específica de conejo. Las tasas de desarrollo a blastocisto tardío, implantación y nacimiento fueron más bajas para los embriones congelados. Así mismo, también se observaron diferencias a nivel de expresión, y los embriones viables de 6 días del grupo congelado presentaron 70 genes diferencialmente expresados. Esta fue la primera aproximación que nos proporcionó una lista de genes candidatos que podrían provocar fallos en el diálogo materno-embrionario, implantación y formación de la placenta. El capítulo II evaluó la distribución de pérdidas durante la gestación debidas al proceso de vitrificación. Sin embargo, en este caso, para evaluar los efectos de la vitrificación sobre la expresión génica de blastocistos tardíos usamos la técnica de PCR cuantitativa (qPCR) con 10 genes candidatos, elegidos por estar diferencialmente expresado en los embriones congelados del anterior trabajo (SCGB1A1, EMP1, C1QTNF1, ANXA3, EGFLAM y TNFAIP6 ), o por su rol en el desarrollo embrionario e implantación (OCT4, VEGF, HBA and LAMA 4 ). Además, introdujimos también datos ecográficos sobre el tamaño del saco embrionario, feto, la placenta fetal y materna desde el día 10 hasta el 14 de gestación. Los resultados mostraron dos picos principales de pérdidas durante la gestación: Uno situado antes de la implantación y el otro después. Asimismo, también detectamos una reducción en el tamaño del feto y de la placenta materna entre los días 10 y 14. Finalmente, pudimos observar que, comparado con los embriones de 6 días desarrollados en condiciones in vivo, la expresión relativa de los transcritos SCGB1A1, EMP1, C1QTNF1, ANXA3, EGFLAM y TNFAIP6 estaba significativamente alterada en los embriones vitrificados, siguiendo además el patrón previamente observado en los embriones congelados. En el capítulo III se compararon directamente los transcriptomas de los embriones de 6 días obtenidos de embriones congelados y vitrificados de 3 días. Siguiendo los mismos procedimientos que en los trabajos anteriores, evaluamos la distribución de pérdidas a lo largo de la gestación analizando las tasas de desarrollo a blastocisto tardío, implantación y nacimiento. Asimismo, empleando la misma plataforma genérica microarray del primer experimento realizamos un análisis dos colores microarray en el que comparamos directamente el perfil transcriptómico a día 6 de desarrollo de embriones congelados y vitrificados. Los resultados reportaron que la congelación y la vitrificación tienen los mismos efectos dañinos sobre el desarrollo a día 6, pero la distribución de pérdidas difiere durante la implantación y el desarrollo, siendo las tasas de implantación y nacimiento mayores para el grupo vitrificado. Las similitudes a día 6 de desarrollo también se reflejaron en el patrón de expresión génica, porque no se detectaron diferencias a nivel transcriptómico entre los dos tipos de embriones. En el capítulo IV se analizó el transcriptoma de los embriones vitrificados de 6 días y placentas fetales de 14 días frente al transcriptoma de embriones y placentas control no vitrificados pero que fueron recuperados y transferidos, aislando así el efecto del proceso de vitrificación. Al igual que observamos en el capítulo II, los embriones vitrificados que eran capaces de llegar al estadio de blastocisto tardío eran también capaces de implantar, pero no todos los embriones implantados tenían la capacidad de finalizar la gestación. Teniendo en cuenta los resultados de las ecografías del trabajo anterior, tomamos datos del peso del feto, la placenta fetal y materna a día 14 de desarrollo y del peso al nacimiento. En los resultados detectamos un descenso en los pesos del feto y la placenta materna, así como un incremento en el peso al nacimiento de los embriones vitrificados. En este experimento, para la evaluación de la expresión génica introdujimos unas cuantas modificaciones en el diseño experimental. Así, empleamos una plataforma microarray específica para embrión de conejo y realizamos un análisis microarray de un color. En el caso de los embriones de 6 días no encontramos diferencias significativas en la expresión génica, pero en el caso de las placentas identificamos 60 genes sobreexpresados. Llegados a este punto, realizamos un análisis 2D-DIGE en as placentas fetales para encontrar diferencias a nivel proteómico. Así, detectamos 89 proteínas diferencialmente expresadas en las placentas de 14 días de desarrollo derivadas de embriones vitrificados. Debido a los anteriores resultados de alteraciones a nivel transcriptómico y proteómico en las placentas pocos días después de la implantación, el capítulo V lo centramos en el estudio de las alteraciones proteómicas en placentas fetales de 24 días de desarrollo. En este trabajo pretendimos comparar los perfiles proteicos de placentas fetales de embriones vitrificados y controles en la última parte de la gestación, pocos días antes del nacimiento. Tras realizar un análisis 2D-DIGE encontramos que había 32 proteínas diferencialmente expresadas entre los grupos experimentales. Estos resultados demostraron que la vitrificación induce cambios sustanciales en la expresión de proteínas placentarias al final de la gestación, y que aparte de las consecuencias a corto plazo, la crioconservación embrionaria puede provocar consecuencias a largo plazo en esos fetos que al final nacen. Los resultados de esta tesis nos permiten suponer que la crioconservación embrionaria, bien sea por congelación o vitrificación, no debe ser neutral. Además, por primera vez se han observado modificaciones en los embriones vitrificados ya implantados. Basándonos en estos resultados, nuestro trabajo deja abierta la cuestión de si los efectos causados por la vitrificación durante el desarrollo fetal pueden conllevar algún tipo de alteraciones metabólicas o fisiológicas en la vida adulta. / Saenz De Juano Ribes, MDLD. (2014). Estudio del efecto de la crioconservación sobre la expresión génica de embriones de conejo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36957 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

[ES] Los sistemas de recirculación en acuicultura (definidos como circuitos cerrados con mínimo o nulo intercambio del agua de cría) son unos sistemas de producción acuícola con mucho potencial, pero requieren conocimientos específicos de los equipos de purificación de agua. La optimización de uno de estos equipos, el biofiltro nitrificante eliminador de nitrógeno amoniacal, es el objetivo de la presente tesis. Para ello se realizó una serie de experimentos donde se evaluó el rendimiento de biofiltros nitrificantes de percolación (expresado como tasa de eliminación amoniacal pero también prestando atención a la concentración de amonio máxima y mínima en el tanque) en función de diferentes características como son la carga de amonio en el influente del biofiltro, el tipo de material filtrante, la temperatura y la carga hidráulica. La combinación de parámetros (material filtrante, carga hidráulica y temperatura) que originó el mejor rendimiento del biofiltro fue seleccionada para diseñar los biofiltros usados en un experimento de cría de doradas (Sparus aurata) (especie seleccionada puesto que su rango de temperatura óptimo es equivalente a las temperaturas que originaron una mayor tasa de eliminación de amonio) en las mismas instalaciones. Durante este experimento, se reevaluó el rendimiento del biofiltro, sujeto a la influencia de la materia orgánica. Los peces fueron alimentados con tres piensos diferentes (un control, uno formulado a base de harina de pescado y uno formulado sin harina de pescado) y el pienso fue suministrado mediante tres estrategias diferentes de alimentación (a saciedad, utilizando comederos automáticos y utilizando comederos de auto-demanda). De la primera serie de experimentos se concluyó que, de los materiales filtrantes probados, uno de ellos (MECHpro® rings) fue responsable de rendimientos muy inferiores mientras que el uso de los materiales filtrantes restantes provocó un rendimiento muy similar. También se concluyó que la temperatura tuvo un efecto muy importante, pues bajas temperaturas (entre 15 y 18 ºC) originaron rendimientos bajos para cualquier combinación restante de parámetros por inactivación de las bacterias nitrificantes, mientras que a temperaturas altas el efecto de los diferentes parámetros, como la carga hidráulica, fue más significativo. Respecto a esta última, se observó un rendimiento claramente inferior a una carga hidráulica baja (4 m3/m2 h), así como rendimientos similares para las cargas hidráulicas restantes (8 m3/m2 h y 11 m3/m2 h). Una mayor carga de amonio produjo en todos los resultados de la primera serie de experimentos un rendimiento mayor, pero también picos de concentración de amonio elevados en el agua de cría, lo cual cuestiona su conveniencia en el correcto funcionamiento de los sistemas. Las tasas de eliminación de amonio de los biofiltros nitrificantes durante su utilización para la cría de doradas fue generalmente menor que en las pruebas de determinación del efecto de diferentes configuraciones en el rendimiento de biofiltros. Esto fue atribuido a la presencia de materia orgánica, pero también a la menor carga de amonio ligada a unas excreciones de amonio total bajas. Se observó asimismo que el pienso vegetal implicó una pérdida de rendimiento y también se concluyó que una determinada estrategia de alimentación (utilización de comederos de auto-demanda) produjo rendimientos superiores respecto a las restantes estrategias, tanto en tasa de eliminación amoniacal como en concentración de amonio en agua. El valor máximo de concentración de amonio fue el más bajo de todos los experimentos realizados, incluyendo los resultados de las pruebas de evaluación del efecto los parámetros operacionales en la tasa de eliminación de amonio. / [EN] Recirculating aquaculture systems (defined as closed circuits where rearing water exchange is reduced to a minimum) show a great potential for fish production but require expertise of water purification equipment. The optimization of one of those units, the nitrifying biofilter, which removes ammonia nitrogen, is the subject of the present thesis. The performance (determined as ammonia removal rate but also taking into account the maximum and minimum concentration of N-TAN in the tank water) of a determinate type of these biofilters, the trickling filter, was evaluated according to different characteristics known as process parameters, such as the biofilter influent ammonia load, filter medium type, water temperature or hydraulic loading. The combination of those process parameters that led to the best results in biofilter performance was used to design biofilters for use in a pilot-scale rearing trial of gilthead sea bream (Sparus aurata), whose optimal growth temperature range is equivalent to the temperatures which led to the highest mean ammonia removal rate. During that experiment, carried out on the same facilities as the performance trials, the performance of the biofilter was re-evaluated, now subject to the influence of organic matter. Fish were fed three different diets (a control, a formulated diet with fishmeal and a formulated diet without fishmeal) y the feed was supplied by three different feeding strategies (to satiation, using automatic feeders and using auto-demand feeders). The first batch of experiments showed that, from the filter media assessed, one of them (MECHpro® rings) was responsible of low performance in general, while the ammonia removal rates were comparable with the use of the remaining filter media. It was also concluded that the temperature had a very important effect as low temperatures (between 15 and 18ºC) led to low ammonia removal independent of every combination of the remaining process parameters due to the inactivation of nitrifying bacteria, while the effect of other process parameters, such as the hydraulic loading, was more significant at high temperatures. In regard to this parameter, an inferior efficiency was observed at a low hydraulic loading (4 m3/m2 h) compared to the remaining hydraulic loadings (8 m3/m2 h y 11 m3/m2 h), although both values led to similar efficiencies. A higher ammonia load led to greater ammonia removal rates but also to high ammonia concentration peaks in the rearing water, which questions its convenience in the system correct operation. The mean ammonia removal rate of the nitrifying biofilters during operation in the gilthead sea bream rearing trial was generally lower than in the trials regarding the effect of the combination of process parameters on biofilter performance. This was attributed to the presence of organic matter, but also to the lower ammonia load consequence of low total ammonia excretion. In addition, it was observed that the plant meal based diet led to a loss of performance and that a determinate feeding strategy (use of auto-demand feeders) led to higher biofilter performances compared to the remaining feeding strategies, both in ammonia removal rate and in N-TAN concentration in the tank water. The maximum N-TAN concentration was the lowest across every experiment, including the results of the trials regarding the effect of the combination of process parameters on biofilter performance. / [CA] Els sistemes de recirculació en aqüicultura (definits com circuits tancats amb un intercanvi mínim o nul) són uns sistemes de producció aqüícola amb molt de potencial, però requerixen coneixements específics dels equips de filtració de l'aigua. La optimització d'un d'aquests equips, els biofiltres nitrificants, encarregat de la eliminació de nitrogen amoniacal, es l'objectiu de la present tesi. Per a tal funció es va elaborar una sèrie d'experiments on es va avaluar el rendiment de biofiltres nitrificants de percolació (expressat com tassa d'eliminació amoniacal però tenint en compte la concentració d'amoni màxima i mínima) en funció de diferents característiques como són la carga d'amoni en l'influent del biofiltre, el tipus de material filtrant, la temperatura i la càrrega hidràulica. La combinació de paràmetres (material filtrant, temperatura i càrrega hidràulica) que va originar el major rendiment del biofiltre fou seleccionada per a dissenyar els biofiltres a utilitzar per a l'experiment de cria de dorades (Sparus aurata) en les mateixes instal·lacions, ja què el seu rang of temperatura òptim és coincident amb les temperatures que varen original la major taxa d'eliminació d'amoni. Durant aquest experiment, es va re-avaluar el rendiment del biofiltre, subjecte a la influència de la matèria orgànica. Els peixos varen ser alimentats amb tres pinsos diferents (un control, un formulat amb farina de peix i un formulat sense farina de peix) i el pinso va ser subministrat mitjançant tres estratègies d'alimentació (a sacietat, usant comeders automàtics i usant comeders d'auto-demanda. De la primera sèrie d'experiments es va concloure que, dels materials filtrants provats, un d'ells (MECHpro® rings) fou responsable de rendiments molt inferiors, mentre que l'ús dels restants materials filtrants va produir rendiments molt similars entre ells. També es va concloure que la temperatura va tindre un efecte molt important perquè baixes temperatures (entre 15 i 18 ºC) conduïren a baixos rendiments amb independència de la combinació dels altres paràmetres, degut a la inactivació de les bactèries nitrificants. Per una altra banda, amb altes temperatures, l'efecte de paràmetres com la càrrega hidràulica sobre les tasses d'eliminació d'amoni fou més significatiu. Respecte a aquesta última, es va observar un rendiment clarament inferior a una càrrega hidràulica baixa (4 m3/m2 h) respecte a les restants càrregues hidràuliques (8 m3/m2 h y 11 m3/m2 h) que varen originar similar rendiments entre elles. Una major càrrega d'amoni va produir en tots els resultats de la primera sèrie d'experiments un rendiment major, però també pics de concentració d'amoni elevats en l'aigua de cria, la qual cosa cuestiona la seua conveniència en el correcte funcionament dels sistemes. El rendiment dels biofiltres nitrificant durant la seua utilització per a la cria de dorades fou generalment menor que en les proves de determinació dels efectes de diferents configuracions en la taxa d'eliminació d'amoni. Això fou atribuït a la presència de matèria orgànica, però també a la menor càrrega d'amoni lligada a unes excrecions d'amoni total baixes. Es va observar tanmateix que el pinso vegetal va implicar una pèrdua de rendiment i també es va concloure que una determinada estratègia d'alimentació (utilització de comeders d'auto-demanda) va produir rendiments superiors respecte a les restants estratègies, tant en taxa d'eliminació amoniacal como en concentració d'amoni en l'aigua. El valor màxim de concentració d'amoni fou el mes baix de tots els experiments realitzats, incloent els resultats de les proves d'avaluació del efecte dels paràmetres operacionals en la taxa d'eliminació d'amoni. / Godoy Olmos, S. (2020). Optimization of nitrifying biofilters for aquaculture [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/148718 / TESIS

La presencia de residuos de sustancias antimicrobianas en la leche supone un riesgo toxicológico para la salud pública así como un problema tecnológico para la industria láctea. La información disponible sobre la termoestabilidad de los antimicrobianos en la leche a las diferentes temperaturas empleadas a lo largo de la cadena de producción, es hasta el momento muy limitada. Por ello se planteó la realización de este trabajo donde se ha evaluado la influencia de las condiciones de almacenamiento de la leche sobre algunos antimicrobianos pertenecientes a los antibióticos betalactámicos, tetraciclinas y sulfonamidas así como el efecto del calentamiento de la leche a distintas temperaturas sobre la estabilidad de estas sustancias. El estudio de la influencia de la refrigeración (4 ± 2 ºC) y congelación (-20 ± 2 ºC) se realizó sobre muestras de leche enriquecidas con 20 sustancias antimicrobianas a unas concentraciones equivalentes a los Límites Máximos de Residuos (LMR), así como de sus correspondientes extractos obtenidos previo al análisis cromatográfico y las determinaciones se realizaron a diferentes tiempos de almacenamiento mediante un equipo HPLC-MS/MS. Los resultados obtenidos indican que la refrigeración y la congelación de la leche afectan en mayor medida a los antibióticos betalactámicos que a las tetraciclinas, tanto en los extractos como en las propias muestras, y no presentan ningún efecto sobre la estabilidad de las sulfonamidas. También se observa como en los extractos las pérdidas son, en general, menores que en las muestras de leche y que la congelación mejora también, en la mayoría de los casos, la estabilidad de las sustancias antimicrobianas en comparación con la refrigeración. Se recomienda por lo tanto conservar tanto las muestras de leche como los extractos en refrigeración y congelación el mínimo tiempo posible para intentar reducir la variabilidad entre resultados analíticos realizados en una misma muestra de leche en diferentes etapas de cont / Roca Marugán, MI. (2008). Termoestabilidad de sustancias antimicrobianas en la leche [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3022 / Palancia

In Mediterranean countries, sheep and goat’s milk production has traditionally been destined for the manufacture of cheese, often as raw milk. Cheese quality is closely related to milk composition but also to hygienic aspects such as somatic cell count, bacteriology or presence of antibiotic residues, currently regulated by European legislation. The implications of the presence of antibiotic residues in milk as a result of veterinary treatments include negative effects on consumer’s health such as allergies or antibiotic resistance and problems on the manufacturing processes of fermented products. For the screening of milk samples for antimicrobial residues, there are various methods available, microbial inhibitor tests and assays based on specific receptors, both widely used, especially in farms, the dairy industry and control laboratories. Screening methods have been validated for the use in raw milk from cows, but information on the performance of these tests in sheep and goat’s milk is rather limited. The aim of this study was to evaluate the performance of some microbial and receptor-binding screening tests to detect antibiotics in sheep and goat’s milk according to Commission Decision 2002/657/EC to determine their suitability to monitor the presence of antibiotic residues in milk and establish the most convenient analytical strategy in Spain. The Detection capability (CCβ) of microbial screening tests, the BRT MRL, the Delvotest MCS SP-NT, the Delvotest MCS Accelerator and the Eclipse 100, was at or below the maximum residue limits (MRLs) for most beta-lactam antibiotics assessed and other non-beta-lactam drugs such as neomycin, tylosin, sulfadiazine and sulfadimethoxine. However, they were less sensitive in the detection of quinolones and tetracyclines at safety levels. When individual milk samples were analysed, microbiological tests showed a higher occurrence of non-compliant results in sheep milk than in goat’s milk, being related in all cases to an elevated somatic cell count (SCC). The microbiological system consisting of two complemetary microtiter plates containing Geobacillus stereathermophilus var. calidolactis and Bacillus subtilis, respectively, allows improving the detection level in sheep milk with respect to the use of a single commercial test using G. stearothermophilus, detecting some quinolone and macrolide substances more closely related to their respective MRLs. The rapid receptor-binding assays (the Betastar Combo, the Charm MRL BLTET, the SNAP Betalactam, the SNAP Tetracycline and the TwinsensorBT) were able to detect most beta-lactams and tetracyclines at or below MRLs (CCβ ≤ MRL). A higher specificity of the rapid receptor tests was obtained in all cases even when individual milk samples were analysed. Only the TwinsensorBT test presented non-compliant results when antibiotic-free milk samples from individual animals were analysed, especially in the last weeks of lactation. No cross-reactions were found when drugs belonging to antimicrobial groups other than beta-lactams or tetracyclines were present in milk. Azidiol, used as a preservative, had no effect on the performance of the rapid receptor tests. Moreover, differences between the visual and instrumental classification of the test results were not found. Taking into account the frequency of use of antibiotics commonly employed in Spain and the screening test sensitivity at MRLs equivalent to antibiotic concentrations, total detection rates have been calculated. In general, the use of a single test allows detecting 62.8-82.4 % of the antibiotics employed. For sheep milk, the total detection range achieved with microbial tests was significantly higher than that reached with rapid receptor tests. However, no significant differences between the two types of tests were found when goat's milk was analysed. In both types of milk, the simultaneous use of two screening tests with a different analytical basis increases the total detection range significantly, reaching values ≥ 90 % in some cases. However, antibiotics such as enrofloxacin, marbofloxacin, spiramycin, and streptomycin also used to treat mastitis and other infectious diseases could not be detected by the screening tests assessed. Therefore, the improvement of the analytical strategy through the periodical implementation of screening tests able to detect these substances at safety levels would be recommended. / Beltrán Martínez, MC. (2014). Analytical strategy for the detection of antibiotic residues in milk from small ruminants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48164 / TESIS