Partial hydrolysates of two types potato protein concentrates were produced by four selected food proteases. Commercialy produced (company Lyckeby) protein concentrate and laboratory prepared concentrate from tubers of Ornella cultivar were subjected of enzymatic hydrolysis by Fromase 220TL, Fromase 220XLG, Maxiren XDS (commercialy available forms of chymosin) and Neutral protases from bacterial Bacillus subtilis. Protein profile of hydrolysates was created using SDS-PAGE. All hydrolysates were determined by solubility and antioxidant activity using DPPH method. The main aim of this study was to evaluate the efficiency of digestion potato protein concentrate by these selected proteases. Based on the results, the most effective enzyme used for hydrolysis of PC was Neutral proteases form Bacillus subtilis.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-06T15:07:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3732467 bytes, checksum: 247973bf48da051a9a1fe62db84cfc55 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T15:07:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3732467 bytes, checksum: 247973bf48da051a9a1fe62db84cfc55 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), é considerada uma das principais pragas da sojicultura, causando enormes prejuízos devido ao seu ataque. As proteases digestivas desempenham papel importante na fisiologia das larvas e o estudo de inibidores de proteases como agentes de controle de pragas tem recebido atenção contínua. Para a utilização dessa estratégia de controle é necessário conhecer a estrutura dessas enzimas, além de entender as interações químicas com esses inibidores. O uso de programas computacionais são ferramentas úteis para contornarem os problemas relacionados às técnicas de elucidação estrutural e avaliam in silico as principais interações entre as enzimas e os ligantes. Após esse processo a caracterização cinética do complexo enzimático contribuem para a melhor compreensão dos centros ativos e dos mecanismos de ação da enzima. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo realizar a modelagem molecular por homologia das serino-proteases intestinais de A. gemmatalis, avaliar as possíveis interações com peptídeos sintéticos utilizando estudos de docking e propôr um modelo de inibição enzimática das serino-proteases utilizando os peptídeos. As sequências obtidas foram utilizadas na modelagem molecular com o programa I-TASSER. Os três melhores modelos estruturais foram validados através dos parâmetros de C-score e B-factor profile. A análise do C-scoreEC classificou as enzimas como serino-proteases. No estudo de docking, dos sete ligantes testados, somente Gor K, Gor R e Gor 5 apresentaram valores de energia livre de ligação para a formação de complexos estáveis. As principais interações observadas foram em regiões do centro ativo e sítio secundário das enzimas. Para a caracterização cinética utilizando diferentes substratos peptídicos as enzimas foram purificadas por cromotagrafia de afinidade utilizando coluna de p-aminobenzamidina agarose em sistema FPLC. Pelas análises dos parâmetros cinéticos foi possível constatar que as serino-proteases intestinais tripsina- like de Anticarsia gemmatalis têm preferência na hidrólise de substratos contendo arginina na posição P1. Nos estudos de cinética de inibição utilizando os peptídeos sintéticos Gor 3, Gor 4 e Gor 5 em presença do substrato cromogênico L-BApNA observou-se que a inibição é do tipo competitiva linear nas concentrações utilizadas. A melhor Ki foi observada para o peptídeo Gor 5 que apresentou uma inibição mais eficiente em comparação aos peptídeos Gor 3 e Gor 4. No geral, a eficiência na inibição da atividade enzimática está relacionada à capacidade de ligação ao centro ativo da enzima. / The velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), is considered the main pest of soybean culture, causing huge losses due to its attack. Digestive proteases play an important role in the physiology of the larvae and the study of protease inhibitors as pest control agents has received continuous attention. The use of this control strategy requires knowledge of the structure of these enzymes, besides understanding the chemical interactions with those inhibitors. Computer programs are useful tools to overcome problems related to structural elucidation techniques and also evaluate in silico the main interactions between enzymes and ligands. After this process the kinetic characterization of the enzyme complex contribute to a better understanding of the active centers of the enzyme and mechanisms of action. In this context, this study aimed to perform homology modeling of intestinal serine proteases A. gemmatalis, to evaluate possible interactions with synthetic peptides utilizing docking studies and to propose one enzyme inhibition model of serine proteases using peptides. The sequences obtained were used in molecular modeling with I-TASSER program. The top three structural models were validated through the C-score parameters and B-factor profile. Analysis of C-scoreEC ranked enzymes like serine proteases. In the docking study of the seven tested ligands, only Gor K, Gor R and Gor 5 showed binding free energy values for the formation of stable complexes. The main interactions were observed in regions of the active site and secondary site of the enzyme. For kinetic characterization using different peptides substrates the crude extract were purified by affinity cromotagraphy using p-aminobenzamidine agarose column FPLC system. From the analysis of the kinetic parameters was noted that the trypsin-like serine proteases from Anticarsia gemmatalis prefer hydrolyse substrates containing arginine at position P1. In inhibition kinetic studies using synthetic peptides Gor 3, Gor 4 and Gor 5 in the presence of chromogenic substrate L-BApNA was observed that the inhibition is linear competitive in the concentration range used. The best Ki was observed for Gor 5 peptide that showed more efficient inhibition compared to peptides Gor 3 and Gor 4. Overall, the efficient inhibition of enzyme activity is related to the binding capacity to the active center of the enzyme.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:21Z : No. of bitstreams: 1 Publico-204.pdf: 1677799 bytes, checksum: 7f10174cddd62a0a9683b2af760805d8 (MD5) / O mosquito Ae. aegypti é o vetor clássico da febre amarela e do dengue. Em insetos hematófagos, a digestão do sangue é realizada por enzimas proteolíticas, que também podem estar envolvidas na relação parasita-vetor. O processo de alimentação com sangue requer que os artrópodes hematófagos sejam capazes de inibir as defesas hemostáticas do hospedeiro, como por exemplo, com a presença de inibidores das enzimas da cascata da coagulação. Com a finalidade de conhecer melhor sobre a biologia do vetor do dengue, o objetivo deste trabalho foi a expressão e a caracterização de um inibidor de serinoproteases do tipo Kazal presente em mosquito Ae. aegypti. Para isso, o inibidor recombinante (rAaTI) e sua forma truncada rAaTIΔ (sem a região C-terminal) foram expressos em sistema Pichia pastoris e purificados por cromatografia de afinidade. O rAaTI purificado foi capaz de inibir a atividade amidolítica da tripsina, plasmina e fracamente a trombina. O rAaTI foi também capaz de prolongar o tempo de coagulação, e há indícios que o inibidor se ligue em alguma região ocupada pela heparina ou pela anitrombina III. O análise do transcrito mostrou que o AaTI está presente na glândula salivar e em intestino de fêmeas 3 e 24 h após a alimentação com sague, e também em todos os estádios larvais, em pupa e em machos, o que sugere que este inibidor possa ter outras funções no desenvolvimento do mosquito. O rAaTI ainda foi capaz de inibir fortemente as tripsinas de larva de 4° instar, e tripsina de fêmeas 24 h após a alimentação, sugerindo que também possa estar envolvido com a modulação destas enzimas na fase larval e no final da digestão com sangue. / The Aedes aegypti mosquito is the classic vector of yellow fever and dengue fever. In haematophagous insects, blood digestion is carried out by proteolitic enzymes, which can also be envolved in parasite-vector relationship. Blood feeding requires that haematophagous insects are able to inhibit host hemostatic defenses, containing inhibitors of coagulation cascade enzymes, for example. In order to understand the vector bilogy, the aim of this work was expression and characterization of a Kazal-type serine protease inhibitor present in Aedes aegypti mosquito. Recombinant inhibitor (rAaTI) and its truncated form rAaTIΔ (without Cterminal region) were expressed in Pichia pastoris system and purified by affinity chromatography. Purified rAaTI was able to inhibit amidolytic activity of trypsin, plasmin and weakly inhibited thrombin. rAaTI was also able to prolong coagulation time, and there are evidences that inhibitor bind in some region occupied by heparin or antithrombin III. Transcription analyzes showed that AaTI is present in salivary gland and midgut of females 3 and 24 h after blood feeding, and in all larval instars, pupae and males, which suggest that inhibitor may have other functions in mosquito development. rAaTI was also able to strongly inhibit trypsin from 4th instar lavae , and female trypsin 3 and 34 h after blood feeding, suggesting that rAaTI may be involved in trypsin modulation in larval phase and in the end of blood difgestion. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-06-23T12:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 vanessa_costa_ioc_mest_2016.pdf: 1636709 bytes, checksum: f1482445c5dbfcfc935910c2f44a235f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 3 vanessa_costa_ioc_mest_2016.pdf.txt: 178420 bytes, checksum: 70440b235431b251767ee3d5db881d5a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) vanessa_costa_ioc_mest_2016.pdf: 1636709 bytes, checksum: f1482445c5dbfcfc935910c2f44a235f (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Comunicação e Informação Científica e Tecnológica em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Um dos fatores limitantes da eficácia da terapia antiviral no tratamento da infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) com o uso de inibidores de protease (IP) é o surgimento de resistência causada por mutações pontuais. Objetivo: Analisar a prevalência de mutações na região da serino-protease da NS3 associadas à resistência aos IP em pacientes infectados pelos subtipos 1a e 1b do HCV. Métodos: Extração de RNA viral, reação de PCR com primers específicos para cada subtipo e purificação seguida pela reação de sequenciamento nucleotídico foram realizadas. As sequências obtidas abrangendo os nucleotídeos 3466-3961 do genoma do HCV foram editadas no programa MEGA 6.0. As substituições observadas nas posições de aminoácidos associadas à resistência aos IP foram relacionadas após submissão ao site geno2pheno. Resultados: Um total de 65 amostras (Subtipo 1a: n=47; Subtipo 1b: n=18) de pacientes não-respondedores ao tratamento prévio por terapia dupla IFN/RBV (n=8) ou terapia tripla com IP boceprevir ou telaprevir (n=15) e virgens de tratamento (n=42) foram sequenciadas As mutações V36M/L e R155K foram observadas apenas no subtipo 1a, em 33,3% e 4,7% respectivamente, dos pacientes não-respondedores à terapia dupla/tripla. Em pacientes virgens de tratamento, a mutação V36M foi observada em uma (3,8%) sequência do subtipo 1a e a T54S em uma (6,25%) do subtipo 1b. A mutação Q80K associada à resistência ao Simeprevir não foi observada em nenhuma sequência do subtipo 1a neste estudo, porém foi detectada pela primeira vez no Brasil em uma sequência do subtipo 1b de paciente virgem de tratamento. Conclusão: Os dados desse trabalho destacam que os isolados brasileiros do HCV apresentam um padrão distinto de polimorfismos associados à resistência ao simeprevir em comparação a outros países, evidenciando que não há necessidade de incorporação de testes de resistência pré-tratamento para pacientes infectados por subtipos 1a e 1b do HCV / One of the limiting factors of the effectiveness of the antiviral therapy of hepatitis C virus (HCV) infection with the use of protease inhibitors (PI) is the emergence of resistance due to point mutations. Aim: To analyze the prevalence of mutations in the HCV NS3 serine protease associated with PI resistance in patients infected with subtypes 1a and 1b of HCV. Methods: Viral RNA extraction, PCR reactions with specific primers for each subtype and purification followed by nucleotide sequencing reaction were performed. The obtained sequences covering nucleotides 3466-3961 of the HCV genome were analyzed by MEGA 6.0 program. The substitutions observed in the amino acid positions associated with PI resistance were related after submission to the site geno2pheno. Results: A total of 65 samples (subtype 1a: n=47; subtype 1b: n=18) of non-responding patients to previous treatment by dual therapy IFN/RBV (n=8) or triple therapy with PI boceprevir or telaprevir (n=15) and treatment-naïve patients (n=42) were sequenced. V36M/L and R155K mutations were observed only in the subtype 1a, in 33.3% and 4.7%, respectively, of non-responders to double/triple therapy In treatment-naive patients, V36M mutation was observed in one (3.8%) sequence of subtype 1a and T54S in one (6.25%) of subtype 1b. The Q80K mutation associated with resistance to simeprevir was not observed in any sequence subtype 1a in this study, but was for the first time detected in Brazil in a subtype 1b sequence of a treatment-naive patient. Conclusion: Data from this study point out that the Brazilian isolates of HCV have a distinct pattern of polymorphisms associated with resistance to simeprevir in comparison to other countries, showing that there is no need to incorporate pretreatment resistance tests for infected patients with subtypes 1a and 1b of HCV

BEZERRA, Lady Clarissa Brito da Rocha. Prospecção de moléculas com potencial nutracêutico em sementes de enterolobium contortisiliquum (VELL.) morong.: purificação e caracterização parcial de três inibidores de quimotripsina. 2010. 97 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-01T12:44:59Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_lcbrbezerra.pdf: 1826588 bytes, checksum: df35a29a0078f414afc02a541cfda647 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-12T23:30:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_lcbrbezerra.pdf: 1826588 bytes, checksum: df35a29a0078f414afc02a541cfda647 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-12T23:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_lcbrbezerra.pdf: 1826588 bytes, checksum: df35a29a0078f414afc02a541cfda647 (MD5) Previous issue date: 2010 / Leguminous seeds are main sources of food proteins for humans and animals. Other interests in these plant proteins concerning their nutraceutical properties have been raised, since many bioactive proteins, previously referred only as anti-nutritional factors, have exerted beneficial effects on health, acting as chemopreventive agents against several diseases. Among these are protease inhibitors, which play important roles in plant defense and have biological properties of interest for biotechnological applications in pharmaceutical and medical areas. This study aimed to evaluate the nutritional and nutraceutical potential of Enterolobium contortisiliquum seeds, focusing on the purification and partial characterization of chymotrypsin inhibitors and assess their antiproliferative effect against human tumor cells. E. contortisiliquum seeds are an excellent protein source, with about 50% of this macronutrient on a dry basis. The presence of protease inhibitors in high quantities suggests that these molecules may exert a nutraceutical application. Three chymotrypsin inhibitors, denominated EcCI1, EcCI2 and EcCTI were purified and partially characterized. EcCI1, EcCI2 and EcCTI show molecular weights of 17, 17 and 19 kDa, respectively. EcCI1 and EcCI2 are non-competitive inhibitors with ki of 4 x 10-8 and 2.5 x 10-8 M, respectively, while EcCTI inhibits chymotrypsin competitively with ki of 5 x 10-8 M. Only EcCTI was able to inhibit trypsin (98%). EcCI1 and EcCI2 successfully inhibited leukocyte elastase (about 70%), but EcCTI (20%). The three inhibitors slightly inhibited pancreatic elastase (about 20%) and none was able to inhibit papain. The three inhibitors have a high thermal stability (37 to 90 °C for EcCI2 and 37 to 100 °C for EcCI1 and EcCTI), pH (2 to 12) and DTT concentrations ranging from 1 to 100 mM for EcCI1 and EcCTI and from 1 to 10 mM for EcCI2. Further studies are needed to better characterize these inhibitors. None of the inhibitors promoted antiproliferative effect against four tumorigenic cell lines tested. / Sementes de leguminosas constituem uma das principais fontes de proteína na alimentação humana e animal. Outros interesses têm sido despertados para o potencial nutracêutico inerente a essas proteínas vegetais, uma vez que muitas proteínas bioativas, até então referidas apenas como fatores antinutricionais, têm exercido efeitos benéficos no organismo, atuando na cura e/ou prevenção de várias doenças. Dentre esses, destacam-se os inibidores de proteases, os quais desempenham importantes funções na defesa de plantas e apresentam propriedades biológicas de interesse para aplicações biotecnológicas nas áreas farmacológica e médica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial nutricional e nutracêutico de sementes de Enterolobium contortisiliquum, enfocando a purificação e caracterização parcial de inibidores de quimotripsina e avaliar seu efeito antiproliferativo contra células tumorigênicas humanas. As sementes de E. contortisiliquum são uma excelente fonte de proteínas, apresentando cerca de 50% desse macronutriente em base seca. A presença de inibidores de proteases em quantidades elevadas sugere que essas moléculas possam vir a ter uma aplicação nutracêutica. Dessa forma, foram purificados três inibidores de quimotripsina, denominados EcCI1, EcCI2 e EcCTI, os quais foram parcialmente caracterizados. As massas moleculares aparentes determinada para os três inibidores é de 17, 17 e 19 kDa, respectivamente. EcCI1 e EcCI2 são inibidores do tipo não competitivo e apresentam ki de 4 x 10-8 e 2,5 x 10-8 M, respectivamente. Em contrapartida, EcCTI inibe a quimotripsina de forma competitiva e apresenta ki de 5 x 10-8 M. Apenas EcCTI foi capaz de inibir a tripsina (98%). EcCI1 e EcCI2 inibiram satisfatoriamente a elastase neutrofílica (ca. de 70%), mas não EcCTI (20%). Os três inibidores inibiram sutilmente a elastase pancreática (ca. de 20%) e nenhum foi capaz de inibir a papaína. Os três inibidores são altamente estáveis às condições extremas de temperatura (de 37 a 90 °C para EcCI2 e de 37 a 100 °C para EcCI1 e EcCTI ), pH (2 a 12) e DTT nas concentrações de 1 a 100 mM para EcCI1 e EcCTI e de 1 a 10 mM para EcCI2. Outros estudos são necessários para melhor caracterizar esses inibidores. Nenhum dos inibidores promoveu efeito antiproliferativo contra as quatro linhagens de células tumorigênicas testadas.

Submitted by PPGASFAR FARMACIA (ppgasfar.rede.ufba@gmail.com) on 2018-07-27T12:46:29Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO FINAL JANE CARNEIRO.pdf: 2383278 bytes, checksum: 6f6b2843d42c0a2e8e1aedee93dd637c (MD5) / Approved for entry into archive by Setor de Periódicos (per_macedocosta@ufba.br) on 2018-07-27T17:03:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO FINAL JANE CARNEIRO.pdf: 2383278 bytes, checksum: 6f6b2843d42c0a2e8e1aedee93dd637c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-27T17:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO FINAL JANE CARNEIRO.pdf: 2383278 bytes, checksum: 6f6b2843d42c0a2e8e1aedee93dd637c (MD5) / A hepatite C crônica no Brasil tem baixa prevalência, mas afeta 2,3 milhões de pessoas, sendo responsável por 75% dos óbitos por hepatites virais. Os inibidores de protease (IP), boceprevir (BOC) e telaprevir (TVR), foram autorizados para uso no Brasil devido melhor padrão de cura em relação ao tratamento convencional para hepatite C, apesar da maior frequência de eventos adversos observados. O objetivo deste estudo foi demonstrar a efetividade do tratamento com IP por meio da resposta virológica sustentada (RVS), a frequência de eventos adversos ocorridos e os fatores associados, em um serviço de referência de Salvador/Bahia. Este estudo foi realizado de forma retrospectiva e foram selecionados os pacientes assistidos em um ambulatório de referência que usaram algum dos IP. Os dados foram coletados dos prontuários usando um questionário semiestruturado. A análise foi descritiva, utilizando frequências absoluta e relativa dos dados e a razão de prevalência como medida de associação. A maioria dos pacientes já havia realizado tratamento anterior, com recidiva. A RVS por intenção de tratar foi de 44,9% com TVR e 40% com BOC. A ocorrência de evento adverso motivou a interrupção da terapia de 13,2% pacientes quando usado TVR e de 7,5% no uso de BOC. A ocorrência de suspeita de reação adversa grave relacionada ao tratamento apresentou associação com o sexo feminino, idade superior a 60 anos, existência de outra patologia, uso de outro medicamento, história prévia de alergia medicamentosa e alcoolismo prévio. Os resultados sugerem menor eficácia do que os apresentados nos estudos de incorporação e baixa segurança. Desta forma, é feito um alerta para usar melhores procedimentos de análise na incorporação de novas tecnologias. Palavras-chave: Inibidores de Proteases, Hepatite C, Hepatite C crônica, Efetividade do tratamento. / Chronic hepatitis C has a low prevalence in Brazil, but affects 2.3 million people, accounting for 75% of deaths from viral hepatitis. The protease inhibitors (PI), boceprevir (BOC) and telaprevir (TVR), were authorized for use in Brazil because of a better effectiveness compared to standard therapy – peginterferon alfa + ribavirin, but with the higher frequency of adverse events observed. The objective this study is evaluate the sustained virologic response and adverse effects associated to the triple therapy in patients that were going through this treatment in reference service in Salvador / Bahia. A retrospective and descriptive observational study was out sing information from patients assisted in a reference service public hospital who used some of the PI were selected. The data were collected from the medical records using a semi-structured questionnaire and performed descriptive analysis. Most of the patients had already gone through previous treatments, with relapse. The RVS by intention to treat was 44.9% with TVR and 40% with BOC. The occurrence of adverse event motivated the interruption of the therapy of 13.2% patients when used TVR and of 7.5% in the use of BOC. The occurrence of a suspected serious adverse reaction related to the treatment was associated with the female sex, age 60 years old or more, another pathology, another medication use, previous drug allergy and previous alcoholism. The results suggest lower effectiveness than those presented in the incorporation studies and poor safety. In this way an alert is made to use better analysis procedures in the incorporation of new technologies. Key words: Protease Inhibitors, Hepatitis C, Chronic C hepatitis, Treatment Outcome.

Interleukin-1 alpha (IL-1a) is a powerful inflammatory cytokine that modulates both innate and adaptive immunity. As such, IL-1a is implicated in the development of multiple inflammatory and autoimmune diseases including atherosclerosis, arthritis and cancer. Therefore, understanding the mechanisms that regulate IL-1a activity is extremely important. For many years, pro-IL-1a was considered to be a fully active alarmin. However, we have previously shown that the removal of the pro-domain by calpain, a protease that is activated upon necrosis, significantly increases IL-1a bioactivity. The work presented in this thesis demonstrates that multiple proteases from diverse biological systems cleave and activate IL-1a. We therefore suggest that IL-1a is an important signalling hub that integrates diverse proteolytic danger signals to alert the immune system. In particular we have identified the inflammatory caspase, caspase-5, as a novel and potent activator of IL-1a. We show that caspase-5 directly cleaves pro-IL-1a during the activation of the non-canonical inflammasome by cytosolic LPS, which mimics intracellular bacterial infection. We also demonstrate that caspase-5-cleaved IL-1a mediates the senescence-associated secretory phenotype (SASP), which drives the deleterious effects of senescent cells in multiple age-related diseases. Therefore, therapeutically targeting caspase-5 may be of interest for pathologies mediated by the non-canonical inflammasome and/or senescent cells. Finally we find that rs17561, a common IL1A polymorphism, reduces active IL-1a release. We find that blood from minor allele homozygotes releases significantly less IL-1a than major allele homozygotes upon LPS stimulation. Therefore, genotyping patients under consideration for anti-IL-1a therapy could predict who would be likely to respond well to the treatment. In conclusion, the work presented in this thesis enhances our understanding of how IL-1a activity is regulated. The identification of both the caspase-5-mediated pathway of IL-1a activation and the defect conferred by the rs17561 SNP could have important clinical implications for the treatment of multiple inflammatory diseases.

Orientadora : Profª. Drª. Iara José de Messias-Reason / Co-orientadora : Profª. Drª. Angelica B. Winter Boldt / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 23/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração: Análises clínicas / Resumo: A hanseníase é causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium leprae, que infecta principalmente macrófagos e células Schwann do hospedeiro. A lectina ligante de manose (MBL) e as ficolinas (FCNs) reconhecem padrões de açúcares e resíduos acetilados (PAMP), respectivamente, em uma ampla variedade de patógenos, incluindo o M. leprae. Este reconhecimento desencadeia a transativação das serina-proteases 1 e 2, associadas a MBL (MASP-1 e MASP-2), e em seguida, a ativação da via das lectinas do sistema complemento. O gene MASP1 apresenta diversos polimorfismos que estão associados à modulação das concentrações de MASP-1 e de mais duas outras proteínas, resultantes de processamento alternativo do pré-mRNA: MASP-3 e a forma não-enzimática MAp44, ambas envolvidas na regulação negativa do sistema complemento, através da competição pelos sítios de ligação aos PAMP nas moléculas de reconhecimento. Neste estudo, avaliamos possível associação entre polimorfismos do gene MASP1 e concentrações séricas de MASP-1, MASP-3 e MAp44 em 389 indivíduos da população brasileira e 210 da dinamarqueses (segundo grupo controle), assim como com a susceptibilidade à hanseníase em 196 pacientes e 193 controles do Sul do Brasil. As amostras foram genotipadas por PCR sequência-específica multiplex para g.8113G>A (rs7609662) e g.8795C>T (rs13064994), localizados no intron 01, e g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) e g.62224G>A (rs850314), localizados no exon 12 do gene MASP1. Os níveis séricos das proteínas foram quantificados com ensaio imunofluorimétrico cronometrado (TRIFMA). Pacientes com hanseníase apresentaram concentrações séricas de MASP-3 e MAp44 menores do que controles (medianas: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml para MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml para MAp44, p<0.0001). Pacientes com a forma lepromatosa de hanseníase também apresentaram concentrações reduzidas de MASP-3 e MAp44, quando comparados a não-lepromatosos (P=0,0016 e P<0,0001). Houve também uma associação entre a presença do alelo T para o SNP rs1109452 e níveis séricos elevados de MASP-1 e diminuídos de MASP-3 nos três diferentes grupos analisados. O haplótipo GC CCG se associou com a susceptibilidade à hanseníase (P=0,028, OR=1,43 [IC95%=1,04-1,94]). O haplótipo do exon 12 apresentou associação com os níveis de MASP-3 em controles (P=0,012) e no grupo comparação (P=0,0006), e os genótipos destas variantes também apresentaram associação com níveis de MAp44 em pacientes (P=0,023), e com os níveis de MASP-3 nos controles (P=0,024) e no grupo de dinamarqueses (P<0,0001). Concentrações baixas de MAp44 e MASP-3 em pacientes com hanseníase podem ser decorrentes de polimorfismos no gene MASP1. Este efeito pode estar aliado a possível consumo das proteínas no processo da doença e/ou baixa produção das mesmas nesses indivíduos. Palavras-chave: MASP1, MASP-3, MAp44, serina protease associada a MBL, complemento, via das lectinas, hanseníase. / Abstract: Leprosy is caused by the obligate intracellular pathogen Mycobacterium leprae, which infects mainly macrophages and Schwann cells of the host. The mannose-binding lectin (MBL) and Ficolins (FCNs) recognize sugar patterns and acetylated molecules (PAMP) respectively in a wide range of pathogens including M. leprae. This recognition triggers the transactivation of mannan-binding lectin serine protease 1 and 2 (MASP-1 e MASP-2) followed by the activation of complement system lectin pathway. MASP1 gene presents several polymorphisms associated to the modulation of MASP-1 concentration as well as two other proteins resulting from alternative processing of pre-mRNA: MASP-3 and the non-enzimatic MAp44, both involved in the down-regulation of complement system by competing for PAMP binding sites at the recognition molecules. Here, we aimed to assess possible associations between MASP1 gene polymorphisms and the serum levels of MASP-1, MASP-3 and MAp44 in 389 individuals from Brazil and 210 from Denmark (second control group), as well as with susceptibility to Leprosy in 196 patients and 193 control subjects from South Brazil. Samples were genotyped by multiplex sequence-specific PCR for g.8113G>A (rs7609662) and g.8795C>T (rs13064994) located in intron 01 and g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) and g.62224G>A (rs850314) located in exon 12 of MASP1 gene. Protein serum levels were quantified by time-resolved immunofluorometric assays (TRIFMA). Leprosy patients presented lower MASP-3 and MAp44 serum levels (median: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml for MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml for MAp44, p<0.0001). Patients presenting the lepromatous clinical form of Leprosy also showed lower MASP-3 and MAp44 serum levels when compared to non-lepromatous patients (P=0.0016 and P<0.0001). There was an association between the T allele of rs1109452 with higher MASP-1 and lower MASP-3 serum levels in all three groups. The GC CCG haplotype was related to susceptibility to Leprosy (P=0.028, OR=1.43 [CI95%=1.04-1.94]). The exon 12 haplotype distribution is associated to MASP-3 levels in controls (P=0.012) and Danish (P=0.0006), and the genotypes of this variants, also revealed an association with MAp44 levels in patients (P=0.023), with MASP-3 levels in controls (P=0.024) and MASP-3 levels in the Danish cohort group (P<0,0001). Low MASP-3 and MAp44 serum levels in leprosy may be conferred by haplotypes/genotypes of MASP1 gene in addition to possible protein consumption and/or low production in leprosy patients. Key-words: MASP1, MASP-3, MAp44, MBL-associated serine-protease, complement, lectin pathway, leprosy.

Sementes das plantas pertencentes à família Leguminosae são excelentes fontes de inibidores de proteases. O gênero Acacia é um dos membros mais importantes deste grupo. Neste trabalho, foram descritos novos inibidores de proteases das sementes de Acacia plumosa Lowe. A partir do extrato salino das sementes maduras, os inibidores foram purificados por cromatografia de exclusão molecular em coluna Superdex-75 (equilibrada e eluída com PBS) e cromatografia de troca iônica em coluna Mono-S, equilibrada e eluída com o tampão Acetato de Sódio 50 mM (pH 5.0) num gradiente linear de \'NA\'\'CL\' 0-0.5 M. Quatro frações (eluídas por volta de 0.1 8, 0.22, 0.33 e 0.37 M de \'NA\'\'CL\') apresentaram atividade anticoagulante e ação inibitória sobre serinoproteases, estas frações foram denominadas ApTIA, ApTIB, ApTIC e ApTID, respectivamente. Em condições nativas, a espectrometria de massas mostrou as massas moleculares de três deles (A, B e C): 19.709; 19.869 e 20.378 Dáltons, enquanto que em SDS-PAGE na presença de \'beta\'-mercaptoethanol, foram observadas duas cadeias para cada um dos inibidores. A análise dos primeiros 10 resíduos de aminoácidos da região N-Terminal das duas cadeias das formas A, B, C revelou identidade com inibidores do tipo Kunitz, e também mostrou dois resíduos diferentes na ApTIC, em relação as formas A e B. Estes dados levam a interpretação de que estes inibidores são diferentes isoformas encontradas nesta semente. O espectro de dicroísmo circular foram compatíveis com proteínas que majoritariamente apresentam elementos- &#946; e não-ordenados em sua estrutura, apresentando máximos positivos por volta de 230 nm e mínimos em 202 nm. Os três isoinibidores foram muito estáveis em pHs ácidos e alcalinos, e suas estruturas foram afetadas somente acima de 75oC. As constantes de associação (KA) e de dissociação(KD) determinadas por SPR (num sistema BIACORE) com enzimas proteolíticas indicaram que a afinidade destes inibidores por tripsina foi até 20 vezes maior que para quimotripsina (tripsina: KA2.57x109 M-1 e quimotripsina: KA 1.34x108M-1), e o complexo tripsina-inibidor mostrou maior estabilidade (tripsina: KD por volta de 0,5 nM e quimotripsina: 6 nM). Estes inibidores também apresentaram ação inibitória sobre o crescimento dos fungos Aspergillus niger, Thielaviopsis paradoxa, Colletotrichum sp P10 e Fusarium moniliforme, mostrando que provavelmente a inibição de suas serinoproteases possa ser um mecanismo de controle das suas proliferações. / Seeds of plants belonging to Leguminosae family are rich sources of protease inhibitors. The Acacia genus is one of the most important members of this group. In this work, novel protease inhibitors from Acacia plumose Lowe seeds have been described. From the saline extract of mature seeds, the inhibitors were purified by size exclusion chromatography on Superdex-75 column (equilibrated and eluted with PBS) and ionic exchange chromatography on Mono-S column, equilibrated and eluted with Sodium Acetate 50 mM (pH 5.0) in a linear gradient of NaCl 0-0.5M. Four fractions (eluted around 0.18, 0.22, 0.33 and 0.37 M of NaCl) presented anticoagulant activity and inhibitory action on serineprotease, these fractions were denoted ApTIA, ApTIB, ApTIC and ApTID, respectively. In native conditions, mass spectrometry showed the molecular weights of three of them (A, B and C): 19,709; 19,869 and 20,378 Daltons, while in SDS-PAGE in ?-mercaptoethanol presence, two chains for each inhibitor were observed. The N-terminal analysis of the first 10 amino acid residues of both chains of the isoforms A, B, and C revealed identity with Kunitz protease inhibitors and also showed two different residues in ApTIC, comparing with A and B isoforms. These data indicate that the inhibitors are different isoforms present in this seeds. The circular dichroism spectra were compatible with proteins that majority present unordered and beta-elements in these structures, presenting positive maxima around 230 nm and minima about 202 nm. The three isonhibitors were very stable at acids and alkalines pH, and their structures are only affected over 75ºC. The association (KA) and dissociation constants (KD) determined by SPR (BIACORE system) with proteolytic enzymes indicated that the affinity of these inhibitors for trypsin was up to 20 times bigger than for chymotrypsin (trypsin: KA 2.57x109 M-1 and chymotrypsin: KA 1.37x108 M-1), and the complex inhibitor-trypsin showed higher stability (trypsin: KD around 0,5 nM and chymotrypsin: 6 nM). These inhibitors also presented inhibitory action on the fungi growth of Aspergillus niger, Thielaviopsis paradoxa, Colletotrichum sp P10 e Fusarium moniliforme showing that probably the inhibition of their serineproteases can be a mechanism of control of their proliferation.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T12:31:48Z No. of bitstreams: 2 TESE Marina Marcuschi.pdf: 36600890 bytes, checksum: 8fe67b125b035ecb70519097b1f641d1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T12:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Marina Marcuschi.pdf: 36600890 bytes, checksum: 8fe67b125b035ecb70519097b1f641d1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / FINEPE; CAPES; CNPq; FACEPE / A presente tese reporta a estrutura, função e aplicação como aditivo pré lavagem de uma tripsina do peixe amazônico tambaqui (Colossoma macropomum). O capítulo um traz a aplicação de tripsinas purificada dos peixes tambaqui e tilapia do Nilo (Oreochromis niloticus) como componentes para soluções de pré-lavagem de roupas, comparando-as com tripsina de porco, subtilisina bacteriana e quimotripsina bovina. No capítulo dois, o efeito do cálcio sobre a tripsina do tambaqui e do porco foi comparado através de ensaios bioquímicos, eletroforéticos, de espectrometria de massas e de fluorescência intrínseca. Já o capítulo três abordou o uso de dinâmica molecular e dicroísmo circular na análise da estrutura da tripsina do tambaqui, porco e salmão submetidas a variações de temperatura, bem como a criação de um banco de dados com sequências aniônicas e catiônicas de tripsinas de peixes e animais homeotérmicos. Com os resultados apresentados na presente tese, pode-se afirmar que a tripsina do tambaqui apresenta uma estrutura mais flexível que a do porco, e que consegue suportar um leque maior de temperaturas e agentes denaturantes, principalmente por conta de sua baixa propensão à autodigestão. Assim, considerando que a tripsina do tambaqui é mais ativa e robusta do que as tripsinas de mamíferos, pode-se dizer que ela apresenta potencial para aplicações industriais, principalmente aquelas que se dão em presença de agentes denaturantes e em temperaturas entre 25 e 60 °C.