Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-02Bitstream added on 2014-11-10T11:58:26Z : No. of bitstreams: 1 000736350.pdf: 1151932 bytes, checksum: 4d60dd50232ef660af2db1b6ab836487 (MD5) / A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb), endêmica na América Latina. A resposta imune inata do hospedeiro contra o fungo já foi bem caracterizada e vários estudos demonstraram claramente a importância do papel desempenhado pelas células fagocíticas. O nosso laboratório têm estudado a relação entre os neutrófilos humanos (PMNs)/Pb, concentrando objetivos nos mecanismos efetores destas células contra o fungo. No entanto, nos últimos anos, os estudos demonstraram que, em adição às suas funções fagocíticas e “killing”, os PMNs podem modular e instruir a resposta imune, uma vez que estas células têm sido mostradas liberando e produzindo várias citocinas. Assim, avaliamos se PMNs estimulados com Pb podem modular a resposta imune para um padrão de resposta do tipo Th1, através da produção de IFN- (IFN-gama), bem como o papel dos receptores de reconhecimento de estruturas moleculares padrões” (PRRs), tais como o TLR2, TLR4 e Dectina-1 nesta produção. Além disso, foi perguntado se a ativação das células com as citocinas IL-12, IL-15 e IL-18 poderiam resultar em níveis aumentados dessa citocina. Os PMNs foram obtidos do sangue periférico de 20 dadores saudáveis e foram ativados ou não com IL-12, IL-15 ou IL-18 em diferentes concentrações e desafiados com a cepa (Pb18) durante 2h, 4h, 12h, 24h e 48h e avaliados para a produção de IFN-, por meio de ELISA. Em outros experimentos, os PMNs foram tratados com anticorpos monoclonais anti-TLR2, TLR4 e Dectina-1, estimulados com Pb e avaliados para a produção de IFN-. Descobrimos que o Pb induz PMNs humanos para produção de IFN-, provavelmente por ligação aos receptores TLR4 e Dectina-1 expressos por estas células. Além disso, os níveis de IFN- foram significativamente aumentado, quando as células foram ativadas com cada uma das citocinas testadas, ou uma combinação ... / Paracoccidiodomycosis is a systemic mycosis caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb), which is endemic in Latin America. The host innate immune response against the fungus has been well characterized and several studies have clearly shown the important role played by phagocytic cells. Our laboratory has studied the relationship between human neutrophils (PMNs)/ Pb, focusing the effector mechanisms of these cells against the fungus. However, in last years, studies have shown that in addition to their phagocytic and killer functions, PMNs can modulate and instruct the immune response, since these cells have been shown to produce and release several cytokines. Thus, we evaluated whether PMNs stimulated with Pb can modulate the immune response to a Th1 phenotype through the production of IFN-γ (IFN-gamma), as well as the role of “pattern-recognition receptors” (PRRs) such as TLR2, TLR4 and Dectin-1 in this production. Furthermore, we asked whether activation of the cells with the cytokines IL-12, IL-15 and IL-18 could result in increased levels of this cytokine. Peripheral blood PMNs obtained from 20 healthy donors were nonactivated or activated with IL-12, IL-15 or IL-18 in different concentrations and challenged with strain 18 Pb (Pb18) for 2h, 4h, 12h, 24h and 48h and evaluated for IFN- production, by ELISA. In other experiments, PMNs were treated with monoclonal antibodies anti-TLR2, TLR4 and Dectin-1, challenged with Pb and evaluated for IFN- production. We found that Pb induces human PMNs to produce IFN-, probably by binding to TLR4 and Dectin-1 receptors expressed by these cells. Moreover, IFN-γ levels were significantly increased when cells were activated with each of the tested cytokines or a combination of two of them, being the association IL-12 plus IL-15 the most effective. The results support our hypothesis that during infection by Pb, human PMNs via the of IFN-γ production modulate ...

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Luciane Alarcão Dias-Melicio / Banca: Sueli Aparecida Calvi / Banca: Dulce Constantino / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Banca: Ramon Kaneno / Resumo: A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb), endêmica na América Latina. A resposta imune inata do hospedeiro contra o fungo já foi bem caracterizada e vários estudos demonstraram claramente a importância do papel desempenhado pelas células fagocíticas. O nosso laboratório têm estudado a relação entre os neutrófilos humanos (PMNs)/Pb, concentrando objetivos nos mecanismos efetores destas células contra o fungo. No entanto, nos últimos anos, os estudos demonstraram que, em adição às suas funções fagocíticas e "killing", os PMNs podem modular e instruir a resposta imune, uma vez que estas células têm sido mostradas liberando e produzindo várias citocinas. Assim, avaliamos se PMNs estimulados com Pb podem modular a resposta imune para um padrão de resposta do tipo Th1, através da produção de IFN- (IFN-gama), bem como o papel dos "receptores de reconhecimento de estruturas moleculares padrões" (PRRs), tais como o TLR2, TLR4 e Dectina-1 nesta produção. Além disso, foi perguntado se a ativação das células com as citocinas IL-12, IL-15 e IL-18 poderiam resultar em níveis aumentados dessa citocina. Os PMNs foram obtidos do sangue periférico de 20 dadores saudáveis e foram ativados ou não com IL-12, IL-15 ou IL-18 em diferentes concentrações e desafiados com a cepa (Pb18) durante 2h, 4h, 12h, 24h e 48h e avaliados para a produção de IFN-, por meio de ELISA. Em outros experimentos, os PMNs foram tratados com anticorpos monoclonais anti-TLR2, TLR4 e Dectina-1, estimulados com Pb e avaliados para a produção de IFN-. Descobrimos que o Pb induz PMNs humanos para produção de IFN-, provavelmente por ligação aos receptores TLR4 e Dectina-1 expressos por estas células. Além disso, os níveis de IFN- foram significativamente aumentado, quando as células foram ativadas com cada uma das citocinas testadas, ou uma combinação ... / Abstract: Paracoccidiodomycosis is a systemic mycosis caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb), which is endemic in Latin America. The host innate immune response against the fungus has been well characterized and several studies have clearly shown the important role played by phagocytic cells. Our laboratory has studied the relationship between human neutrophils (PMNs)/ Pb, focusing the effector mechanisms of these cells against the fungus. However, in last years, studies have shown that in addition to their phagocytic and killer functions, PMNs can modulate and instruct the immune response, since these cells have been shown to produce and release several cytokines. Thus, we evaluated whether PMNs stimulated with Pb can modulate the immune response to a Th1 phenotype through the production of IFN-γ (IFN-gamma), as well as the role of "pattern-recognition receptors" (PRRs) such as TLR2, TLR4 and Dectin-1 in this production. Furthermore, we asked whether activation of the cells with the cytokines IL-12, IL-15 and IL-18 could result in increased levels of this cytokine. Peripheral blood PMNs obtained from 20 healthy donors were nonactivated or activated with IL-12, IL-15 or IL-18 in different concentrations and challenged with strain 18 Pb (Pb18) for 2h, 4h, 12h, 24h and 48h and evaluated for IFN- production, by ELISA. In other experiments, PMNs were treated with monoclonal antibodies anti-TLR2, TLR4 and Dectin-1, challenged with Pb and evaluated for IFN- production. We found that Pb induces human PMNs to produce IFN-, probably by binding to TLR4 and Dectin-1 receptors expressed by these cells. Moreover, IFN-γ levels were significantly increased when cells were activated with each of the tested cytokines or a combination of two of them, being the association IL-12 plus IL-15 the most effective. The results support our hypothesis that during infection by Pb, human PMNs via the of IFN-γ production modulate ... / Doutor

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina, causada pela inalação de propágulos micelianos do fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp.(Pb). Dentre os mecanismos de resposta imune contra o fungo, destacam-se os exercidos pelas células fagocitárias como os macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (DCs). Além do importante papel efetor, isto é, de destruição do fungo, essas células, por terem capacidade de produzir citocinas tanto pró como anti-inflamatórias, desempenham um importante papel modulador da resposta imune inata, assim como de instrução da resposta imune adaptativa que será gerada posteriormente. Para essa última função, as células dendríticas merecem destaque por constituírem a população de células fagocitárias mais adaptada ao processo de ligar, fagocitar, destruir, processar microrganismos e após migrarem aos órgãos linfóides periféricos, locais onde elas maturam para desenvolver o processo de apresentação de antígeno, desencadear e instruir a resposta imune adaptativa. No entanto, de forma similar às outras células fagocíticas, as DCs são capazes de liberar potentes moléculas citotóxicas que as capacita a destruírem eficientemente os microrganismos. Essa capacidade, embora necessária ao papel modulador das DCs citado acima, representa um mecanismo efetor importante durante a resposta imune inata. A maior ou menor capacidade das DCs destruírem os vários microrganismos pode resultar em diferenças na disseminaçã... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:56:14Z : No. of bitstreams: 1 minatel_io_me_botfm.pdf: 544547 bytes, checksum: 59badd66f5a35b170a0b8a597f1cc3f0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho objetivou desenvolver um protocolo para produção, isolamento e purificação de clamidósporos do P. brasiliensis (Pb) e estudar seu potencial infectante em camundongos. A cepa Bt83 foi cultivada em meio líquido por 14 dias à temperatura de 25 ºC e posteriormente incubada por 36 horas a 32°C para a produção de clamidósporos. Os clamidósporos foram liberados por agitação magnética e sonicação. A purificação foi realizada em gradiente de concentração com Percoll a 95%, resultando em suspensão de clamidósporos com viabilidade de 90% e com poucos (8%) fragmentos miceliais. Para avaliar seu potencial infectante, os clamidósporos foram inoculados em camundongos por via intranasal, e os animais eutanasiados após 24h, 1, 2 e 4 semanas de infecção foram estudados através da histologia e quantificação da carga fúngica pela contagem de unidades formadoras de colônia dos pulmões, baço e fígado. Vinte e quatro horas pós-infecção observaram-se no pulmão focos de broncopneumonia contendo grande número de leveduras, algumas em brotamento múltiplo. Nos períodos subseqüentes observaram-se lesões granulomatosas, com presença de fungos, principalmente nos pulmões. A disseminação para baço e fígado foi precoce, iniciando na 1ª semana de infecção. Neste trabalho demonstramos que os clamidósporos do Pb podem ser, fácil e rapidamente, produzidos e isolados. Também mostramos que estes esporos são altamente infectantes e capazes de disseminação precoce. Os resultados indicam que os clamidósporos podem desempenhar um importante papel na infecção e desenvolvimento da paracoccidioidomicose / This study aimed at development a protocol for production, isolation and purification of chlamydospores of P. brasiliensis (Pb) and study their potential infectious in mice. Bt83 strain was grown in liquid medium for 14 days at 25 °C and then incubated for 36 hours at 32°C to produce chlamydospores. The chlamydospores were released by magnetic stirring and sonication. The purification was performed in concentration gradient with Percoll to 95%, resulting in a suspension of chlamydospores 90% viable and few (8%) mycelia non-viable fragments. To assess their potential infectious the chlamydospores, mice were inoculated intranasally and euthanized after 24 h, 1, 2 and 4 weeks of infection and their lungs, spleen and liver studied histologically and quantified the fungal burden by colony forming units counting. Twenty-four hours postinfection, multiple foci of bronchopneumonia were seen containing many multibudding yeast cells. In subsequent periods there were granulomatous lesions with the presence of fungi, mainly in the lungs. Dissemination to the spleen and liver was an early event, starting at 1 week of infection. This work provided evidences that the chlamydospores of Pb can be quickly and easily produced and isolated. It was also shown that these spores are highly infectious and have great ability to disseminate soon after infection. These results indicate that chlamydospores might be elected as an important infectious particle in paracoccidioidomycosis

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-25Bitstream added on 2014-06-13T18:55:57Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_hc_me_arafcf.pdf: 1420769 bytes, checksum: b06f79633d6d6736be281777e90904a5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, micose sistêmica de grande importância no Brasil, país que possui a maior concentração de áreas endêmicas para essa doença no mundo. Uma das estratégias possivelmente utilizadas pelo patógeno seria a expressão de genes envolvendo adaptação às condições do hospedeiro, que pode também estar relacionadas à captação de micronutrientes. A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel importante na regulação da adesão celular, diferenciação, migração e proliferação das células. Este estudo propõe uma análise de transcritos e de proteínas expressas em condições de depleção de cobre, na presença de quatro matrizes extracelulares – laminina, fibronectina e colágeno I e IV, mimetizando as condições de infecção por P. brasiliensis por meio das técnicas de RDA (Representational Difference Analysis) e eletroforese bidimensional. Para isso, o isolado Pb01 foi cultivado por 3 horas no meio quimicamente definido (MVM), depletado de cobre (Cu) e a seguir colocado em contato com os quatro diferentes componentes da MEC e a adesão foi avaliada por citometria de fluxo. Um aumento significativo (p ≤ 0,05) na adesão frente a todos os componentes da MEC foi observado quando o fungo foi cultivado sem Cu. Então, o RNA e os extratos protéicos foram obtidos de Pb sem Cu e Pb sem Cu em contato com os diferentes componentes da MEC. Ensaios de RDA foram realizados para demonstrar os genes envolvidos neste processo. Duas hibridizações foram realizadas nas proporções de 1:10 e 1:100 de tester e driver, respectivamente, com um excesso de driver para remover as seqüências comuns em ambas condições. Os produtos diferencialmente expressos foram amplificados, resultando em padrões distintos que foram seqüenciados... / Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis of great importance in Brazil, which has the highest concentration of endemic areas for this disease in the world. One of the strategies used by the pathogen may be the expression of proteins related to the adaptation to the host conditions, which may also be related to the uptake of micronutrients. Extracellular matrix (ECM) plays an important role in the regulation of cell adhesion, differentiation, migration and proliferation of cells. This study proposes an analysis of transcripts and proteins expressed in condition of copper depletion in the presence of four components of extracellular matrix - laminin, fibronectin and collagen I and IV, mimicking the conditions of infection by P. brasiliensis, using techniques of RDA (Representational Difference Analysis) and two-dimensional electrophoresis. For this, we cultured the Pb 01 strain at 3 hours in a chemically defined media (MVM) with depletion copper (Cu). After, the fungus was placed at contact with the four differents ECM components and the adhesion was evaluated by flow cytometry. A significant increase of binding (p ≤ 0,05) to all ECM components was observed when the fungal was cultured without Cu. So RNA and protein extracts were obtained of Pb without Cu, and Pb without Cu in contact with the differents ECM components. RDA assay was developed to demonstrate the genes involved in this process. Two hybridizations were performed in the proportions of 1:10 and 1:100 of tester and driver respectively, with an excess of driver to remove the common sequences in both conditions. The differentially expressed products were amplified, resulting in distinct patterns that were sequenced revealing genes involved in differents process like virulence (25%), protein synthesis... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-06Bitstream added on 2014-06-13T19:14:39Z : No. of bitstreams: 1 donofrio_fc_me_arafcf.pdf: 611507 bytes, checksum: 2ca5a08dde5671c30f12d9904897bfcb (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A capacidade de Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), de causar doença com manifestações clínicas variadas, depende de seus fatores de virulência, em particular daqueles envolvidos na interação celular. Neste estudo pretendeu-se isolar e caracterizar adesina(s) de P. brasiliensis ligante(s) de fibronectina relacionadas à interação do fungo com células epiteliais de origem pulmonar, comparando amostras de P. brasiliensis, antes (18a) e depois (18b) da passagem em animal, posteriormente cultivadas em meio de Fava Netto e em meio sólido (ágar base) e líquido (BHI) contendo 5% de sangue de carneiro. Os extratos 18a e 18b obtidos dos diferentes meios apresentaram proteínas variando de 106 a 12 kDa. Os extratos da amostra 18a e 18b cultivados em meios sólido e líquido acrescidos de sangue demonstraram maior expressão de algumas proteínas, quando comparado às amostras 18a e 18b cultivadas apenas em meio de Fava Netto. Aparentemente, o uso de meios de cultura acrescidos de sangue é semelhante ao verificado após a passagem em animal. As proteínas com massas moleculares de 54 kDa e pI de 5,6; 58 kDa e pI de 5,9 e 60 kDa com pI de 6,3 foram caracterizadas como adesinas ligantes de fibronectina. Uma delas, a proteína de 54 kDa foi purificada por cromatografia de afinidade e eluída por eletroeluição. O sobrenadante contendo a proteína purificada foi avaliado por eletroforese bidimensional, confirmando a presença da proteína de 54 kDa e pI de 5,6 e seu papel como adesina. Os extratos cell-free dos isolados 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 de P. brasiliensis... / The capacity of Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), to provoke illnesses with great variety of clinical manifestations depends on its virulence factors, particularly on those involved in the cellular interaction. The present study was designed to isolate and characterize the adhesin fibronectin-binding related to the capacity of this fungus to adhere to the host by comparing P. brasiliensis samples, taken before (18a) and after (18b) animal inoculation and cultured on Fava Netto s medium and on blood base agar solid medium and liquid (BHI) medium with 5% sheep blood. The 18a and 18b extracts, independent of the medium, presented proteins with the molecular weights of 106 and 12 kDa. Extracts from Pb18a and 18b cultured in blood agar solid and liquid (BHI) medium showed higher levels of protein expression than that from samples cultured on Fava Netto. Apparently, the use of the sheep blood in the medium is similar to the animal passage. Ligand affinity binding assays showed that proteins of 54 kDa, pI 5.6; 58 kDa and pI of 5.9 and 60 kDa and pI de 6.3 were evident in all P. brasiliensis cell-free extracts, and all had properties of adhesin fibronectin-binding. A fibronectin-binding protein of 54 kDa was purified by affinity chromatography and by electro elution. The protein purified was evaluated by isoelectric focusing, confirming the presence of protein of 54 kDa and pI of 5.6 and its role as an adhesin. The cell-free extracts from 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 P. brasiliensis isolates, also showed the expression of 54 kDa protein, and it was more evident in 113 and 339 isolates. Our experiments... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002Bitstream added on 2014-06-13T19:15:40Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_fh_me_botfm.pdf: 692507 bytes, checksum: a7f91088d5074d8d040c054c5989981c (MD5) / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais importante da América Latina. A espécie de tatu Dasypus novemcinctus mostrou ser um importante reservatório do fungo e o estudo de isolados destes animais será útil para uma melhor compreensão da ecologia e epidemiologia desta doença. O objetivo deste trabalho foi comparar a virulência e variabilidade genética de isolados de tatus e de pacientes para melhor compreender a importância do tatu na PCM. Os isolados animais foram obtidos da área endêmica de Botucatu, São Paulo, Brasil, com exata informação dos locais de coleta. Os isolados clínicos, exceto a cepa padrão Pb265, foram obtidos de pacientes residentes nos municípios de Pratânia, Manduri e Botucatu. A virulência foi avaliada no modelo experimental do hamster através da contagem de UFC (Unidades Formadoras de Colônias), histopatologia e dosagem de anticorpos específicos e a caracterização molecular por meio da técnica de RAPD e sequenciamento do DNA ribossômico. Todos isolados de tatus foram virulentos, disseminando-se para vários órgãos. A cepa Pb265, isolada de paciente, apresentou baixa virulência. A contagem de UFC nos diferentes órgãos permitiu uma classificação do fungo em 4 categorias: virulência muito alta, virulência alta, virulência intermediária e baixa virulência. A análise molecular mostrou grande diversidade genética entre os isolados, porém não houve separação entre os fungos isolados de pacientes e de tatu. Estes resultados indicam que tanto o homem quanto o tatu podem estar sendo infectados por patógenos com mesmo genótipo, provavelmente localizados em foco ambiental comum. Portanto, os tatus como reservatórios do P. brasiliensis na natureza, representam importantes elos na cadeia da doença... / Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM), the most important systemic mycosis in Latin America. The armadillo Dasypus novemcinctus has been confirmed as the first natural reservoir of this fungus and its geographic distribution is similar to the distribution of human PCM. This work analysed the virulence profiles and genetic diversity of P. brasiliensis isolates from different armadillos and clinical isolates. The animal isolates were obtained from the Botucatu endemic area of PCM, with exact information of the collection sites. The clinical isolates, except Pb265, were obtained from patients that live in the same endemic area (Pratânia, Manduri and Botucatu county). Virulence was evaluated in an experimental hamster model by colony-forming units (CFU) and histopathological analysis in the testis, liver, spleen, lung and circulating specific antibodies measured by ELISA. Molecular characterisation was evaluated by RAPD methods and sequencing analyses of the internal transcribed spacer regions (ITS 1 and ITS 2) and 5.8 S ribosomal gene. All isolates from armadillos were virulent, with dissemination to many organs. The clinical isolate Pb 265 was less virulent. The isolates were classified into four categories according to number of CFU per gram of tissue: very high, high, intermediate and low virulence. Molecular analysis showed large genetic similarity between all isolates and did not separate armadillos from clinical isolates. This study confirms that armadillos harbor pathogenic genotypes of P. brasiliensis, probably the same ones that infect man. Thus, the armadillos are very important animals in the epidemiology this disease.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-15Bitstream added on 2014-06-13T18:50:11Z : No. of bitstreams: 1 bannwart_cf_me_botfm.pdf: 462065 bytes, checksum: 2e3988993f9db6f1ef7a8c8058e75e6a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A interleucina-15 (IL-15) é uma citocina pró-inflamatória produzida principalmente por monócitos e macrófagos em resposta a agentes infecciosos, desempenhando importante papel modulador na imunidade inata e adaptativa. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da IL-15 sobre a atividade fungicida, metabolismo oxidativo e a produção de citocinas por monócitos humanos, infectados in vitro com cepa virulenta de Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Monócitos de sangue periférico, obtidos de indivíduos saudáveis, foram préincubados na ausência ou presença de IL-15 (12,5, 25 e 50 ng/mL) por 24 h a 37oC e infectados com Pb18 na proporção de 50 monócitos para uma célula fúngica durante 4 h e 18 h. A atividade fungicida de monócitos foi determinada após 4 h pela recuperação de fungos viáveis por plaqueamento das co-culturas em meio BHI-ágar. O metabolismo oxidativo foi avaliado pela liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) e de ânion superóxido (O2 -) nas culturas desafiadas com Pb18 e estimuladas com phorbol myristate acetate (PMA) durante 60 mim. A produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a), IL-6, IL-10 e IL-15 foi determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA) nos sobrenadantes das coculturas obtidos após 4 e 18 h de incubação. Os resultados mostraram que a préincubação de monócitos com IL-15 induziu aumento significativo na atividade fungicida contra Pb18 de maneira dose-dependente, sendo esse efeito neutralizado pela adição de anticorpo monoclonal anti-IL-15. O tratamento com IL- 15 não interferiu na capacidade de liberação de H2O2 e O2 - por monócitos desafiados com Pb18 sugerindo que a atividade fungicida estimulada por IL-15 ocorre por mecanismos independentes do metabolismo oxidativo. Monócitos infectados com o fungo, na ausência de IL-15, produziram níveis de TNF-a, IL-6 e IL-10... / Interleukin-15 (IL-15) is a pro-inflammatory cytokine especially produced by monocytes and macrophages against infectious agents and that play a pivotal role in teh innatte and adaptive immune response. The aim of this study was to analyze the effects of IL-15 on fungicidal activity, oxidative metabolism and cytokine production by human monocytes challenged in vitro with a virulente strain of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were pre-incubated for 24h with or without human recombinant IL-15 (12.5,25 and 50 ng/mL), and then challenged with Pb18 in a ratio of 50:1 monocytes:fungi. Fungicidal activity of monocytes against Pb18 was assessed by viable fungi recovery from 4 h co-cultures after plating in BHI-agar. Oxidative metabolism was evaluated by hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide anion (O2 -) release in the monocyte cultures challenged by Pb18 and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) for 60 min. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-a), IL-6, IL-10 and IL-15 production by monocytes were determined in culture supernatants by enzyme immunoassay (ELISA). The results showed that IL-15 ehanced fungicidal activity against Pb18 in a dose-dependent pattern. This effect was abrogated by additon of anti-IL-15 monoclonal antibody to the co-cultures. No significant effect of IL-15 on H2O2 and O2 - release by monocytes was observed suggesting that the fungicidal activity was independent of oxidative metabolism activation. Monocytes infected with P. brasiliensis in the absence of IL-15, produced significantly higher levels of TNF-a, IL-6 and IL-10 after 18 h of coculture in comparison to experiments of 4h-incubation with the fungus. The pretreatment of monocytes with IL-15 induced significant higher levels of TNF-a, IL-10 and IL-15 production by these cells challenged with the fungus... (Complete abstract click eletronic address below)

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Gil Benard / Banca: Andréa de Faria Fernandes Belone / Resumo: Células gigantes multinucleadas (CGM) são células características, presentes em lesões granulomatosas, induzidas por agentes infecciosos e, sua formação pode ser modulada por citocinas produzidas por células da resposta imune. No presente trabalho avaliou-se o efeito modulador de citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β1) na formação de CGM in vitro, a partir de monócitos humanos, estimulados com antígenos de Paracoccidioides brasiliensis (AgPb) e sobre a atividade fungicida dessas células desafiadas com a cepa Pb18 de P.brasiliensis. Monócitos do sangue periférico de indivíduos saudáveis foram cultivados na ausência de estímulo (controle), com AgPb (100ug/mL) ou com associações de AgPb e GM-CSF (100 U/ml) com as citocinas: IFN-γ (300UI/mL), IL-10 (50U/mL), TGF- β1 (250pg/mL) ou TNF-α (50U/mL). A formação de CGM foi avaliada após três dias de cultivo, estabelecendo-se o índice de fusão (IF) e a percentagem de CGM após fixação e coloração das células com May-Grunwald-Giemsa. Além disso, a atividade fungicida dessas células foi avaliada após 4 h de co-cultivo das CGM com 4 x 104 células leveduriformes viáveis da cepa Pb18 de P. brasiliensis, por plaqueamento das co-culturas em meio BHI-ágar e determinação da recuperação de fungos viáveis. O método estatístico empregado para comparação dos resultados foi análise de variância, com nível de significância de 5%. Os resultados mostraram que a incubação de monócitos com AgPb+GM-CSF+IFN-γ induziu IF significativamente mais elevados em relação a todas as demais culturas: controle, apenas estimulados com AgPb ou AgPb adicionado das demais citocinas. A adição de TNF- α+AgPb+GM-CSF não resultou em IF maiores do que os obtidos na cultura estimulada apenas com o AgPb, enquanto as citocinas IL-10 e TGF-β1 apresentaram efeito supressor... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Multinucleated giant cells (MGC) are characteristics cells present in granulomatous lesions induced by infectious agents and also may be modulated by cytokines produced by cells of the immune response. The present study evaluated the modulatory effect of interferon-gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) pro-inflammatory cytokines, and interleukin-10 (IL-10) and transforming growth factor beta (TGF-β1) anti-inflammatory cytokines on in vitro formation of MGC derived from human monocytes, stimulated with Paracoccidioides brasiliensis antigen (PbAg) and on fungicidal activity of these cells challenged with the Pb18 strain of P.brasiliensis. Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were cultured for three days without stimulus (control) or with PbAg (100 ug/mL) or with association of PbAg and granulocyte macrophage colony stimulator factor (GMCSF (100 U/mL) with the following cytokines: IFN-γ (300 UI/mL), IL-10 (50 UI/mL), TGF-β1 (250 pg/mL) or TNF-α (50 UI/mL). The generation of MGC was evaluated by fusion index (FI) and the percentage of MGC formation after cell fixing and May-Grumwald-Giensa staining. Fungicidal activity of monocytederived MGC was evaluated 4h after co-culture of MGC with 4 x 104 viable yeast cells of Pb18 strain, by plating the cultures in BHI-agar and determination of viable fungi recovery. The statistical method employed for the comparison of the results was analysis of variance with the significance set at p< 0.05. The results showed that the incubation of monocytes with PbAg+GM-CSF+IFN-γ induced FI significantly higher than those observed in all the other cultures, such as control cultures, cultures stimulated with PbAg only or cultures stimulated with PbAg associated with the other cytokines. Stimulation with PbAg+TNF+GM-CSF did not result in FI higher than those obtained in the culture stimulated with PbAg only... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eduardo Bagagli / Resumo: O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais importante da América Latina. A espécie de tatu Dasypus novemcinctus mostrou ser um importante reservatório do fungo e o estudo de isolados destes animais será útil para uma melhor compreensão da ecologia e epidemiologia desta doença. O objetivo deste trabalho foi comparar a virulência e variabilidade genética de isolados de tatus e de pacientes para melhor compreender a importância do tatu na PCM. Os isolados animais foram obtidos da área endêmica de Botucatu, São Paulo, Brasil, com exata informação dos locais de coleta. Os isolados clínicos, exceto a cepa padrão Pb265, foram obtidos de pacientes residentes nos municípios de Pratânia, Manduri e Botucatu. A virulência foi avaliada no modelo experimental do hamster através da contagem de UFC (Unidades Formadoras de Colônias), histopatologia e dosagem de anticorpos específicos e a caracterização molecular por meio da técnica de RAPD e sequenciamento do DNA ribossômico. Todos isolados de tatus foram virulentos, disseminando-se para vários órgãos. A cepa Pb265, isolada de paciente, apresentou baixa virulência. A contagem de UFC nos diferentes órgãos permitiu uma classificação do fungo em 4 categorias: virulência muito alta, virulência alta, virulência intermediária e baixa virulência. A análise molecular mostrou grande diversidade genética entre os isolados, porém não houve separação entre os fungos isolados de pacientes e de tatu. Estes resultados indicam que tanto o homem quanto o tatu podem estar sendo infectados por patógenos com mesmo genótipo, provavelmente localizados em foco ambiental comum. Portanto, os tatus como reservatórios do P. brasiliensis na natureza, representam importantes elos na cadeia da doença... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM), the most important systemic mycosis in Latin America. The armadillo Dasypus novemcinctus has been confirmed as the first natural reservoir of this fungus and its geographic distribution is similar to the distribution of human PCM. This work analysed the virulence profiles and genetic diversity of P. brasiliensis isolates from different armadillos and clinical isolates. The animal isolates were obtained from the Botucatu endemic area of PCM, with exact information of the collection sites. The clinical isolates, except Pb265, were obtained from patients that live in the same endemic area (Pratânia, Manduri and Botucatu county). Virulence was evaluated in an experimental hamster model by colony-forming units (CFU) and histopathological analysis in the testis, liver, spleen, lung and circulating specific antibodies measured by ELISA. Molecular characterisation was evaluated by RAPD methods and sequencing analyses of the internal transcribed spacer regions (ITS 1 and ITS 2) and 5.8 S ribosomal gene. All isolates from armadillos were virulent, with dissemination to many organs. The clinical isolate Pb 265 was less virulent. The isolates were classified into four categories according to number of CFU per gram of tissue: very high, high, intermediate and low virulence. Molecular analysis showed large genetic similarity between all isolates and did not separate armadillos from clinical isolates. This study confirms that armadillos harbor pathogenic genotypes of P. brasiliensis, probably the same ones that infect man. Thus, the armadillos are very important animals in the epidemiology this disease. / Mestre