Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:32:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338960.pdf: 1255271 bytes, checksum: 64a9e5455dbcf43db4a59b3a33b12660 (MD5) Previous issue date: 2015 / A suinocultura é uma importante atividade social e econômica para todo o país, entretanto, esta atividade é reconhecida por causar problemas ambientais significativos. O tratamento de águas residuárias por processo de ficorremediação está atraindo o interesse renovado devido às suas potenciais aplicações da biomassa para produção de biocombustíveis e compostos de alto valor, agregando valor econômico ao agronegócio. A presente pesquisa teve como objetivo avaliar a remoção de nutrientes dos efluentes do UASB (Upflow Anaerobioc Sludge Blanket) e sistema de lodos ativados (LA) de um processo de tratamento de dejetos suínos por ficorremediação, e a composição química celular. O cultivo foi realizado em escala laboratorial com fotobiorreatores verticais (FBRs) com luminosidade artificial (44,8 mmol m-2 s-1) temperatura de 23 ºC e escala piloto numa casa de vegetação sob a luz natural, com intensidade luminosa variando de 90-733 µmol m-2 s-1 e temperatura ambiente com variação de 15,4-48 ºC, utilizando consórcio com Chlorella spp. e Scenedesmus spp. A biomassa foi coletada por centrifugação e precipitação química usando polímero orgânico catiônico (tanino). A eficiência de remoção para a amônia foi de 44,3 e 76,7% com efluente do UASB e LA, respectivamente. A eficiência da remoção de fósforo da cultura com UASB alcançou 89,6%, em contraste, com LA foi de 76,5%, após 96h de ficorremediação. A biomassa colhida a partir do efluente do UASB apresentou 56,1, 34,4 e 1,1% de proteínas, carboidratos e lipídios, respectivamente. Comparativamente, a composição celular das microalgas cultivadas com efluente LA teve diminuição nas proteínas (44%) mas os teores de carboidratos foram mais elevados (41,9%) e não houve diferença nos teores de lipídios (2%). No entanto, a biomassa separada por centrifugação os níveis foram de 25,2, 58,9 e 3% em carboidratos, proteínas e lipídios, respectivamente. Quando privadas de nutrientes (N e P) o teor de carboidratos foi de 56,8%, proteínas 22% e lipídios 16,3%. Os resultados demonstraram que a amônia e fósforo foram satisfatoriamente removidos. Biomassas de microalgas a partir de processos de tratamento terciário são ricos em proteínas e carboidratos, mas com baixo teor de lipídios. O processo de colheita pode alterar a composição química. A privação de nutrientes aumenta a acumulação de lipídios no interior das células e são ricas em ômega 3 e 6.<br> / Abstract : The swine is an important social and economic activity for the whole country, however, this activity is known to cause significant environmental problems, the treatment of wastewater by phycoremediation process is attracting renewed interest due to their potential applications of biomass production biofuels and high value compounds, adding economic value to agribusiness. This research aimed at evaluating the removal of nutrients from the effluent UASB (Upflow Sludge Blanket Anaerobioc) and AL system (Activated sludge) of a treatment process of swine manure by phycoremediation, and cellular biochemical composition. Cultivation was carried out in laboratory scale with vertical photobioreactors (PBRs) with artificial light (44.8 mmol m-2 s-1) temperature of 23 ° C and pilot scale reactor in greenhouse indoors under natural light with luminous intensity ranging from 90-733 µmol m-2 s-1 and room temperature ranging from 15.4-48 ° C using polyculture with Chlorella sp. and Scenedesmus sp. The biomass was collected for centrifugation and chemical precipitation using cationic organic polymer (tannin). The removal efficiency for ammonia was 44.3 and 76.7% with effluent from the UASB and LA, respectively. The efficiency of phosphorus removal of the culture with UASB reached 89.6%, in contrast with the LA was 76.5% after 96h of phycoremediation. The efficiency of phosphorus removal of the culture with UASB reached 89.6%, in contrast with the LA was 76.5% after 96h of phycoremediation. The harvested biomass from the UASB effluent showed 56.1, 34.4 and 1.1% protein, carbohydrates and lipids, respectively. Comparatively, the cellular composition of cultivated microalgae with LA effluent had decreased in protein (44%) but the carbohydrate content was higher (41.9%) and no difference in lipid content (2%). However, the biomass separated by centrifugation levels were 25.2, 58.9 and 3% of carbohydrates, proteins and lipids, respectively. When starved the carbohydrate content was 56.8%, proteins 22% and lipids 16.3%. The results showed that ammonia and phosphorus have been removed satisfactorily. Biomass of microalgae from tertiary treatment processes are rich in protein and carbohydrates, but low in lipids. The process of crop can change the biochemical composition. The nutrient deprivation increases the accumulation of lipids within cells and are rich in omega 3 and 6.

Orientador: Paulo Mazzafera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Purcino_RubiaPadilha_D.pdf: 1224493 bytes, checksum: 875e464b9ac37fd8cf61d27335a57537 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Xylella fastidiosa (Xf) é uma bactéria fitopatogênica que se desenvolve exclusivamente no xilema de uma grande variedade de plantas cultivadas. Na cultura do citros essa bactéria é conhecida como o agente causal da clorose variega do citros (CVC), doença responsável por prejuízos econômicos consideráveis, desde a década de 80. Embora muitos trabalhos tenham sido realizados com essa bactéria, pouco se conhece sobre o mecanismo de infecção, a composição do meio em que ela se desenvolve, o xilema e o desenvolvimento dos sintomas. Grande parte dos estudos sobre a nutrição da bactéria são realizados in vitro, o que pode não caracterizar a interação entre a bactéria e xilema. Este trabalho é resultado de um subprojeto do genoma funcional, cujo principal objetivo é a caracterização da constituição da seiva do xilema, na tentativa de melhor compreender a nutrição da bactéria e o desenvolvimento da doença. Ao longo da realização dos experimentos e análises dos resultados foram surgindo questões que levaram a necessidade do melhor entendimento do metabolismo do nitrogênio em plantas com CVC. Por isso os resultados gerados foram agrupados em dois capítulos, onde no primeiro são encontrados resultados da caracterização qualitativa e quantitativa das principais substâncias nitrogenadas presentes na seiva do xilema de plantas de citros com CVC, bem como atividade das principais enzimas envolvidas no metabolismo do nitrogênio. A atividade da Redutase do nitrato (RN) nas folhas não sofreu alteração em plantas doentes (PD), porém a atividade da Glutamina Sintetase (GS) foi significativamente maior nos extratos das folhas dessas plantas. Embora a concentração de aminoácidos tenha sido suavemente maior na seiva do xilema de PD, caiu drasticamente no extrato de folhas dessas plantas. O teor de proteínas solúveis também foi menor na seiva do xilema e no extrato de folhas de PD. PD e Planta Sadia (PS) apresentaram o mesmo perfil de aminoácidos em HPLC, contudo em proporções bem diferentes, principalmente dos aminoácidos ASN, GLN e ARG. A poliamina putrescina foi identificada em grande concentração somente em PD. Estes resultados demonstram que PD apresentam alterações no metabolismo de compostos nitrogenados provavelmente em resposta a mudanças na interação dos processos de absorção, assimilação e redistribuirão do nitrogênio. No segundo capítulo são agrupados os dados das análises do metabolismo de açúcares, ácidos orgânicos e investigação das alterações no metabolismo da parede celular. A seiva de PD apresenta menor concentração de glicose, acompanhada de frutose e glicose. Grande quantidade de ácido cítrico também foi determinada nessas plantas. Baseados nesses resultados cultivamos a bactéria em meios com diferentes fontes de carbono e verificamos que o meios que permitiram maior crescimento foram aqueles que a fonte de carbono utilizada foi glicose (I glL), sacarose combinada com citrato nas concentrações de 3g/L de cada fonte de cardono, e citrato na concentração de 3 g/L, o que demonstra que a composição química da seiva do xilema é importante tanto para o processo de agregação como para a formação do biofilme. A infecção com Xi também promoveu modificações nas paredes celulares dos pecíolos. Verificamos por imunocitoquímica em microscópio confocal utilizando os anticorpos 11M 5 e JIM 7, diferenças entre PD e PS nos padrões de esterificação da fração pectina, assim como encontramos no fracionamento da parede celular alterações na composição dos principais carboidratos que constituem a fração hemicelulose / Abstract: Xylellafastidiosa (Xj) is a fastidious bacterium which grows exclusively in the xylem of several plants. In citrus the disease caused by Xf is known as "clorose variegada do citros" (CVC), being responsible for marked loss of productivity since the 80s. Although a meaningful number of reports have been published in the literature about Xf, little is know about the mechanisms controlling infection, the biochemical composition of the xylem fluid where the bacteria develops and how the disease symptoms develop. Most of the studies on the nutritional requirements by the bacteria were carried out with artificial media in vitro, what may not be the exact situation in the xylem. The aim of this thesis was to characterize the xylem sap composition of citrus plants in order to better understand nutritional aspects of the bacteria and this can influence the disease development. During the experiments new questions arose and focus was given to the nitrogen metabolism of citrus plants infected with Cvc. Therefore, the thesis has two chapters. The first chapter contains results on the qualitative and quantitative characterization of the xylem sap of health and diseased plants as well as the activity of enzymes ofthe nitrogen metabolism in plants. The activity ofNitrate reductase (NR) in leaves did not change in diseased plant (PD), however, the activity of Glutamine synthethase (GS) was significantly higher in these leaves. Although amino acids concentration was slightly higher in the sap of diseased plants the leveI dropped drastically in the leaves. The protein contents were lower in the sap and in leaves of diseased plants. Diseased and health plants showed the same amino acid profile in HPLC, but different proportions were observed among amino acids, mainly for the amino acids ASN, GLN and ARG. The polyamine putrescine was found in high concentrations only in diseased plants. These results showed that significant changes take place in the nitrogen metabolism of diseased plants, probably as a response to the alterations in the absorption, assimilation and distribution of nitrogen in the plant. In the second chapter the data on carbohydrates, organic acids and cell wall are presented. The xylem sap of diseased plants showed lower concentration of glucose than health plants. High amounts of citric acid were also found in diseased plants. This information was used to design artificial media to grow the bacteria and study its nutritional need. Best growth was observed with media containing glucose (l g/L), sucrose plus citrate both at 3g/L, and citrate alone at 3 g/L, indicating that the composition of the sap might play a role both in the bacterial agregation as well as in the biofilm formation. Infection with XI also promoted changes in the cell wall of leaf peduncle of infected plants. Immunocytochemical analysis with confocal microscopy, using the antibodies 11M 5 and 11M 7, showed marked differences between diseased and health plants regarding the pectin esterification. Additionally the hemicelullose fraction was also affected. / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alexandre Morais do Amaral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T05:44:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_JulianaCristina_M.pdf: 1606790 bytes, checksum: 2559d8ff6d67422a6685a6a8d5a31cd6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e responsável por consideráveis prejuízos para a produção de laranja, no Brasil e no mundo. A doença e altamente agressiva para a planta de citros, provocando, entre outros, lesões em folhas e frutos, com redução tanto na qualidade de frutos quanto na produtividade. Devido a sua importância, recentemente a bactéria teve seu genoma completamente seqüenciado, onde foram identificados, por homologia de seqüência de proteínas, varias ORFs ("open reading frames") associadas ao processo de infecção. Dentre elas, varias seqüências que teoricamente codificam para proteínas envolvidas na degradação da parede celular vegetal, o que pode ser um indicativo de que a bactéria utiliza mecanismos relacionados a este evento durante o seu processo infeccioso e de adaptação. Entretanto, não ha ate o momento informação experimental a respeito da funcionalidade de seqüências em Xac que permitam a degradação da parede celular. O objetivo principal deste trabalho foi identificar funcionalmente, em Xac, através de ensaios in Vectra e in vitro, genes envolvidos na produção ou transporte de proteínas relacionadas a degradação de celulose e com isso analisar a sua relevância na capacidade infectiva ou adaptativa da bactéria. Para tal, foram produzidos mutantes a partir de inserções aleatórias de transposon e sitio-dirigidas, estabelecendo-se uma coleção de linhagens, cujo fenótipo e genótipo foram avaliados por ensaios biológicos e sequenciamento. Verificou-se que o operon xps do sistema de secreção do tipo II e funcional em Xac e que os genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 e XAC4231 participam da degradação de celulose / Abstract: The citrus canker, caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is responsible for considerable losses for the orange production, in Brazil and abroad. The disease is highly aggressive for citrus plants, resulting, among others, in injuries on leaves and fruits, with a reduction in the quality of fruits as much as in the productivity. Due to its importance, recently the bacterium had its genome completely sequenced and a number of open reading frames (ORFs) where identified by homology with protein sequences and annotated as associated to the infection process. Amongst them, some sequences that theoretically code for proteins involved in the degradation of the plant cell wall, which may indicate that the bacterium uses mechanisms related to this event during the process of adaptation and infection. However, there is no experimental data regarding such sequences to prove their real function during the pathogenesis of Xac. The main objective of this work was to identify functionally, in Xac, through in vitro and in vivo assays, genes involved in the production or transport of proteins related to the degradation of cellulose and, therefore, to analyze its relevance in the capacity of adaptation and infection of the bacterium. During the investigation, a collection of mutant strains of Xac was produced by random and site-directed mutagenesis, which were analyzed through the identification of leaf lesions and their action on degradation of artificial cellulose in plate as well as the growth in leaves. Through tests of mutagenesis and in vitro assays, this study shows that the xps operon that is present in Xac and encodes a type II secretion system machinery is functional and the genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 and XAC4231 participate in cellulose degradation. In summary, for the first time it was experimentally demonstrated that Xac is capable in hydrolizing cellulose / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:05:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavalari_AlineAndreia_D.pdf: 2066715 bytes, checksum: 503395a4dfdc3832fc20cbf4193ea790 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A parede celular é um componente particular dos tecidos vegetais e conhecer a composição dos polissacarídeos que a constituem e suas interações é essencial para compreender a textura dos alimentos e suas alterações pós-colheita, em especial em frutos climatérios, como é caso do mamão. A parede celular esta dividida por três domínios: o primeiro é formado por celulose e hemiceluloses, o segundo domínio é formado por pectinas e o terceiro um domínio composto por proteínas. As modificações dos polímeros e suas proporções nestes respectivos domínios são resultados de ações enzimáticas, que no caso dos frutos carnosos, leva ao amaciamento da polpa. Portanto, estudar as modificações nesses polímeros através da análise dos OXG obtidos por hidrolise com celulase, é um caminho importante para entender as alterações neste polissacarídeo ao longo do desenvolvimento de frutos. O presente trabalho teve como objetivo compreender as modificações da parede celular durante o desenvolvimento do fruto do mamoeiro. Foram utilizados frutos de Carica papaya L. cv. Sunrise solo, coletados diretamente do produtor (Caliman S/A- Unhares- ES). As amostras de frutos foram colhidas em intervalos de 30 dias, sendo os estádios analisados de 30 a 150 após a antese (dpa). Os resultados demonstram queda acentuada na proporção de parede celular em relação a outros compostos, como açúcares, por exemplo, o que é possivelmente uma indicação do processo de expansão celular e conseqüentemente uma alteração de textura da parede celular durante o desenvolvimento. Observou-se que o principal açúcar solúvel é a sacarose, sendo esta provavelmente a principal fonte energética para o desenvolvimento do fruto de mamão, uma vez que este não sintetiza amido. De maneira geral, a proporção de oligossacarídeos de xiloglucano menos ramificados diminuiu aos 120 dpa, enquanto que os de maior peso molecular e ou grau de ramificação (com fucose) aumentaram proporcionalmente. Estes resultados sugerem que xiloglucanos (ou parte das moléculas destes) pobremente ramificados com fucose, são retirados da parede celular, consequente enriquecimento de oligosasacarídeos fucosilados. Como estes últimos tornam o xiloglucano mais interativo com ele próprio e com a celulose, é possivel que estes sejam os principais efeitos que as transformações na parede promovam no fruto. As alterações na parede foram acompanhadas pelo aumento concomitante nas ativades de beta­galacosidase e beta-glucosidase, duas das principais hidrolases de xiloglucano. Concumitantemente, observou-se uma diminuição acentuada na proporção de celulose na parede. Com base nestas observações, sugere-se que as paredes celulares sofrem transformações importantes nos frutos do mamoeiro até os 120 dpa I sendo que a partir deste estádio a parede se torna mais acessível à hidrólise e denotando a preparação do fruto para o amadurecimento. / Abstract: The plant cell wall is a unique component of plant tissues and its polysaccharide composition essential to understand food texture and its changes during post-harvestingl especially of climateric fruits, as is the case of papaya. The plant cell wall is composed of three domains: the first is formed by cellulose and hemicelluloses, the second of pectins and the third of proteins. The changes in polymers and their proportions in these domains are a result of enzyme action, which in the case of fleshy fruits lead to the softening of the pulp. Hydrolysis of hemicelluloses such as xyloglucan can play important functions in cell expansion, cell growth and cell wall degradation. Therefore, studying the modifications in xyloglucan by looking at is fine structure (Le. oligosaccharide (OXG) pattern obtained after cellulase action) may be an important way to understand polysaccharide change during fruit development. The present work aimed at understanding the modifications in cell wall during the development of the papaya fruit. Fruits of Carica papaya L. Cv.Sunrise solol were collected directly by the producer (Calimanl SAI Unharesl Espirito Santol Brazil). Samples of fruits were harvested at intervals between 30 and 150 days after anthesis (daa). Our results showed that there were drastic changes in the cell wall of the mesocarp in relation to other compoundsl such as soluble sugars. This is probably an indication that cell expansion process is at least part of the cause of the changes in texture during development. We observed that the main soluble sugar found in fruits is sucrose, this being probably the principal source of energy for development of the organ, as no starch is synthesised in this fruit. In general, the proportion of less branched xyloglucan oligosaccharides decreased at 120 daa, whereas the OXG branched with fucose increased constantly during development up to the same stage. These results suggest that xyloglucans (or part of their molecules) that are poorely brached with fucose are retrieved from the cell wall. This seems to lead to enrichment of fucosylation of xyloglucan. As these OXG turn xyloglucan more interactive with itself and with cellulose, it is possible that these would be the principal effects that the cell walls provoke in the fruit. The changes in the wall were followed by a concomitant increase in activities of beta-galactosidase and betaglucosidase, both thought to be related to xyloglucan hydrolysis in vivo. At the same time, we observed a decrease in the proportion of cellulose in the walls during development. On the basis of these results, we suggest that the cell walls of papaya fruits undertake structural changes untill 120daa after which the wall becomes more accessible to hydrolases denoting the preparation of the papaya fruit for ripening. / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

This study provides information to support the use of plant cell wall, from sugarcane bagasse, to produce cellulosic ethanol. Therewith, cell wall proteins from sugarcane cells cultures, leaves and culms were identified. To do so, different protocols were used. Using two-month-old leaves and culms, the extractions were performed using a destructive method, based on griding the tissues, submitting them to a growing gradient of succrose and centrifugation, being the cell wall extract later isolated by washing on a nylon net. After that, the cell wall proteins were extracted using two salts, 0,2 M CaCl2 and 2 M LiCl. Using cultured cells, a similar protocol was used, but it had a previous step of separation of the cell wall through grinding and precipitation in glycerol 15%. Using culms of the same age, a nondestructive protocol was tested based on vacuum infiltration of the tissues in the same salts already described, 0,2 M CaCl2 and 2 M LiCl, and posterior centrifugation. Two replicates were used from two-month-old plants and three in the case of suspension cells. The complex samples were digested, fractionated and sequenced through mass spectrometry, using SYNAPT G2HDMS coupled to nanoACQUITY, both from Waters. Peptides were processed using ProteinLynx 2.5 Global Server against sugarcane translated-EST database. Using bioinformatic programs, such as Blast2GO, it was possible to find the annotation and classification of similar proteins. Only proteins equally found in all repetitions were considered in the main analysis. SignalP, WolfPSORT, TargetP, TMHMM and Predotar were used to predict the subcellular location, both from ESTs and blasted proteins, and only the proteins predicted to be secreted in two or more programs were considered as cell wall proteins. Altogether, 157 different SAS related to sugarcane cell wall were found. Among these, 101 different cell wall proteins were characterized from eight functional classes. The method based on vacuum infiltration seems to be the most efficient one, since it had almost half, 48,84% of the proteins predicted to be secreted, which is a good percentage when comparing to other studies. From secreted proteins most of them were related to lipid metabolism, as lipid-transfer proteins, oxido-reductases, such as peroxidases, cell wall modifying enzymes, like glycoside-hydrolases, proteases, proteins with interacting domains, signaling proteins and several others. Results are in agreement with the expected role of the extracellular matrix in polysaccharide metabolism and signaling phenomena. Therefore, this work provided valuable information about sugarcane cell wall that can lead to future studies to enhance cellulosic ethanol production. / Este estudo fornece informação para auxiliar o uso da parede celular vegetal, a partir do bagaço de cana, para a produção de etanol celulósico. Com isso, as proteínas da parede celular de folhas, colmos e células em suspensão foram identificadas. Para isso, foram utilizados diferentes protocolos. Utilizando folhas e colmos de cana-de-açúcar de dois meses de idade, as extracções foram realizadas por meio de método destrutivo, com base na trituração dos tecidos, submetendo-os a gradiente crescente de sacarose e centrifugação, sendo a parede da célula extraída e depois isolada por lavagem sobre uma rede de nylon. Depois disso, as proteínas de parede celular foram extraídas utilizando dois sais, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl. Para células em suspensão, um protocolo semelhante foi utilizado, contendo, no entanto, um passo anterior de separação da parede celular por meio de maceração e precipitação em glicerol 15%. Usando colmos da mesma idade, dois meses, um protocolo não destrutivo foi testado com base na infiltração a vácuo dos tecidos nos mesmos sais já descritos, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl, e posterior centrifugação. Duas repetições foram usadas nos experimentos com plantas de dois meses de idade, e três, no caso de células em suspensão. As amostras complexas foram digeridas, fracionadas e seqüenciadas por espectrometria de massas, utilizando o equipamento SYNAPT G2HDMS acoplado ao cromatógrafo nanoACQUITY, ambos da Waters. Os peptídeos foram processadas utilizando ProteinLynx 2,5 comparando com a base de dados de ESTs traduzidos da cana. Utilizando programas de bioinformática, como Blast2GO, foi possível encontrar a anotação e classificação de proteínas semelhantes. Apenas proteínas igualmente encontradas em todas as repetições foram consideradas na análise principal. SignalP, WolfPSORT, TargetP, TMHMM e Predotar foram softwares utilizados para prever a localização subcelular, tanto para ESTs como proteínas, e apenas as proteínas preditas para serem secretadas por dois ou mais programas foram consideradas como proteínas de parede celular. Ao todo, 157 SAS diferentes relacionados à parede celular da cana foram encontrados. Dentre eles, 101 diferentes proteínas de parede foram caracterizadas em oito classes funcionais. O método baseado na infiltração a vácuo mostrou-se o mais eficiente, uma vez que apresentou quase metade, 48,84%, das proteínas preditas para serem secretadas, o que é um bom valor quando comparado com outros estudos. A maioria das proteínas secretadas estava relacionada com o metabolismo lipídico, como proteínas de transporte de lípidos, oxido-redutases, tais como peroxidases, enzimas modificadoras da parede, como as glicosil-hidrolases, proteases, proteínas com domínios de interação, proteínas sinalizadoras, entre outras. Os resultados estão de acordo com o papel que se espera da matriz extracelular no metabolismo de polissacarídeos e fenômenos de sinalização. Portanto, este trabalho forneceu informações valiosas sobre a parede celular da cana, tornando possível a utilização desses dados em futuros estudos para otimizar a produção de etanol celulósico.

De todas as adaptações que as plantas sofreram durante a evolução, a aquisição do sistema vascular à 400 milhões de anos atrás, foi sem dúvida um evento decisivo para sua bem sucedida existência na terra. A madeira é considerada o mais importante recurso natural de energia renovável e o setor econômico baseado na produção florestal cresce a cada ano. Inúmeros fatores como rápida taxa de crescimento, grande produção de biomassa, adaptabilidade a diversos ambientes e solos, boa qualidade de madeira para produção de uma ampla gama de produtos e presença de celulose de fibra curta, ideal para a produção de papel e celulose, contribuíram para o grande sucesso das espécies de Eucalyptus e tornaram o Brasil o maior produtor mundial de celulose de fibra curta utilizando o eucalipto como matéria prima. Devido à reconhecida importância econômica e também ambiental das árvores, o desenvolvimento do sistema vascular se tornou um importante e fascinante processo biológico para se estudar. No entanto, existe ainda pouco conhecimento sobre os processos celulares, moleculares e bioquímicos envolvidos na formação da madeira. Dessa forma, no presente trabalho foi utilizada a técnica de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) para caracterizar o perfil transcricional do caule de plantas de E. grandis com 6 meses de idade. A partir do sequenciamento de 826 clones, foi possível analisar 2.274 tags/genes, sendo que 989 (43,5%) genes puderam ser identificados e ter uma possível função atribuída. Genes que codificam enzimas e proteínas muito importantes durante o processo de formação da madeira, como aqueles relacionados à biossíntese e deposição da parede celular e organização do citoesqueleto, apresentaram elevada expressão, sendo possível ainda sugerir a ocorrência de possíveis mecanismos comuns de controle transcricional para grupos de genes funcionalmente relacionados. A posterior comparação com as proteínas identificadas por espectrometria de massas através do sistema LC-MS/MS a partir do mesmo material biológico mostrou que muitos desses genes representam também as proteínas mais abundantes. Juntamente com outros projetos que vêm sendo desenvolvidos no laboratório, o presente trabalho contribuiu para a construção de um banco de dados local com informações do transcritoma e do proteoma de diferentes idades e tecidos, fornecendo uma visão global sobre os genes envolvidos no processo de formação da madeira e possivelmente responsáveis pelo rápido crescimento nas espécies de Eucalyptus, indicando importantes alvos para futuros programas de melhoramento. / From the numerous adaptations that plants have developed during evolution, the acquisition of the vascular system some 400 million years ago was been a decisive event for their successful existence on earth. Wood is considered the most important natural resource of renewable energy and the Forest-based economical sector grows every year. Several factors like the fast growth rate, large biomass production, adaptability to a wide range of environments and soils, good wood quality for the production of a wide range of products and the presence of short cellulose fiber, suitable for pulp and paper production, have contributed to the great success of Eucalyptus species making Brazil the main producer of short cellulose fiber using eucalypt as raw material. Due to the recognized economical and also environmental importance of trees, the development of the vascular system became an important and fascinating biological process to study. However, little is known about the cellular, molecular and biochemical processes involved in wood formation. In this way, in the current work SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) technique was used to characterize the transcriptional profile in stems of 6 months old Eucalyptus grandis. From the sequencing of 826 clones, it was possible to analyse 2,274 tags/genes, and 989 (43,5%) genes could be identified and to have a possible function attributed. Genes that code for enzymes and proteins important for wood formation process, like those related to cell wall biosynthesis and deposition, and cytoskeleton organization had high expression, making it possible to suggest the occurrence of a common transcriptional control for a few functionally related genes. The posterior comparison with the set of proteins identified by LC ESI-MS/MS from the same biological material showed that some of these genes also represent the most abundant proteins. Taken together with other projects that are being developed in the laboratory, the present work contributed for the construction of a local data-base with transcriptome and proteome information from different ages and tissues, giving a global vision of the genes involved in the wood formation process and potentially responsible for the fast growth in the Eucalyptus species, indicating important targets for future breedings programs.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T09:47:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salazar_MarcelaMendes_D.pdf: 4370521 bytes, checksum: 99869d0c9655d47c4e3b2c29de58a274 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A celulose é o polímero mais abundante do planeta e está presente principalmente na parede secundária de células vegetais maduras. O conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na sua biossíntese, bem como a regulação deste processo é recente e ainda elementar, apesar da sua grande importância. O Eucalyptus é o gênero florestal mais plantado no mundo, especialmente por ser matéria-prima para fabricação de celulose. Investimentos em pesquisas e desenvolvimento estão sendo realizados pelo setor florestal, no intuito de aumentar os ganhos de produtividade de celulose através da pesquisa na área da biologia molecular. Os dados analisados desmostram que a expressão gênica das espécies estudadas (E. globulus, E. grandis e E. urophylla) difere em genes essenciais para a formação dos compostos da parede celular e por fim da madeira. Os dados moleculares são condizentes com dados diferenciais aqui encontrados em relação à composição dos açúcares da parede. Os resultados gerados pela análise de composição da parede por diferentes técnicas, incluindo a recentemente desenvolvida "Perfil Glicômico" mostram uma grande diversidade e quantidade dos carboidratos da parede celular diferentemente distribuídos no xilema das espécies Eucalyptus globulus, grandis e urophylla, bem como em folha. Tais resultados apresentam um grande avanço para o entendimento da composição das paredes celulares de tais espécies. Assim, o objetivo do presente trabalho foi correlacionar os dados moleculares, com dados highthroughput do Perfil Glicômico para entender a composição e arquitetura da parece celular. Espera-se que esses dados possam contribuir para o entendimento da xilogênese e de como os genes trabalham para gerar árvores com características tão distintas, podendo direcionar o melhoramento das mesmas / Abstract: Cellulose is the most abundant polymer in the world and it is present mainly in secondary cell walls of plant mature cells. The knowledge of molecular mechanisms involved in biosynthesis and regulation of this process is recent despite its great importance. The Eucalyptus is the most planted forest genus in the world, especially for being raw material for pulp production. Investments in research and development, especially in the molecular biology field, are being carried out by the forestry sector in order to increase pulp productivity. The data analyzed showed that gene expression of the species the tree species studied here (E. globulus, E. grandis e E. urophylla) differs in essential genes of cell wall compounds formation. Molecular data are consistent with differential data found here in relation to the composition of cell wall sugars. The results generated by the wall composition analysis by various techniques, including the recently developed "Glycome Profiling", showed a wide diversity of carbohydrate of cell wall differently distributed in the xylem of the the Eucalyptus species. These results are a breakthrough in understanding the cell wall composition of these species. The objective of this study was to correlate molecular data with data highthroughput Glycome Profiling to understand the composition and architecture of the cell walls. It is hoped that these data will contribute to the understanding of wood formation and how genes work to generate trees with such different characteristics / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Mary Anne Heide Dolder, Phillippe Matile / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-31T09:44:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rossetto_EsteladeSousa_D.pdf: 10579170 bytes, checksum: 599f6dea90da54726ade3bc1b4ec56e3 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Xerophyta plicata Spreng. (Velloziaceae) é uma Angiosperma brasileira tolerante à dessecação, que ocorre em afloramentos graníticos do RJ ao RN. Embora não perca as folhas nos períodos secos, elas ficam amarelas, encolhidas, dobradas e torcidas. Quando a água volta, as folhas se distendem e voltam a ficar verdes. As células do mesófilo sobrevivem aos ciclos de saída e entrada de água por meio de alterações ultra-estruturais responsáveis pela manutenção da viabilidade celular. Essas alterações parecem processos degradativos limitados, que mantém remanescentes das estruturas vitais. A utilização de solução fixadora não aquosa previne a ocorrência de artefatos de técnica nas folhas secas, que são muito reativas a água. O acompanhamento passo a passo dos nove dias de dessecação, por meio de Microscopia Eletrônica de Transmissão, revelou a permanência do núcleo de maneira intacta e de remanescentes identificáveis de cloroplastos, mesmo em folhas com conteúdo relativo de água (CRA) igual a 0%. As demais organelas desaparecem ou deixam de ser identificáveis nas células secas. Células dessecadas apresentam uma massa citoplasmática central e compacta, quase sem ligação com as paredes celulares, muito dobradas. Durante a re-hidratação alterações físicas de volume e forma (estudadas por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura ¿ SEM) ocorrem paralelamente a alterações morfo-metabólicas de reorganização ultra-estrutural. O acompanhamento detalhado dos dois primeiros dias de re-hidratação por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM), com o uso de fixadores aquosos e não aquosos, revelaram uma seqüência de eventos celulares: dilatação das organelas, formação de vesículas que resultam na ocupação homogênea de todo o espaço interno da célula, deslocamento do citoplasma para a porção parietal da célula e reorganização da estrutura interna das células. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Xerophyta plicata Spreng. (Velloziaceae) is a Brazilian desiccation tolerant Angiosperm that occurs in granitic rock outcrops from Rio de Jane1ro State to Rio Grande do Norte State. Although leaves do not fall during the drought periods, they become yellow, shrinked, folded and twisted. When water is available again, leaves distend and retake the green colour. Mesophyll cells survive the water inlet and outlet cycles by means of ultrastructural changes that are responsable for maintaining their viability. These changes are similar to limited degradative processes in which remnants of the vital structures are preserved. The use of a non-aqueous fixative solution for dry tissues prevent the occurrency of fixation artefacts in these that are very reactive to water. A step by step 9-day study of the desiccation process by Transmission Electron Microscopy recognizable (TEM) showed few changes in the nucleus and modified-chloroplasts even in totally dry leaves (relative water content (RWC) of 0%). Other organelles disappear or are not recognizable. Desiccated cells show a compact and central cytoplasm that maintains contact with the cell walls by a few thread-like projections. Cell walls are very folded. During rehydration, changes in shape and volume (studied by Scanning Electron Microscopy, SEM) occur along with morphological metabolical changes, in order to reorganize the cell ultrastructure. A step by step study on the first 2 days of rehydration fixatives was carried out by TEM with aqueous and non-aqueous fixatives. Resurrection occurs through a sequence of cellular events: swelling of the organelles, vacuolation of the cytoplasm, motion of the cytoplasm to the peripheral portion of the cell and reorganization of the internal structure of the cells¿Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

A associação de tecnologias como transgenia, genômica e proteômica aos programas de melhoramento convencional de árvores, pode acelerar o processo de obtenção de exemplares com características específicas da madeira para a indústria de papel e celulose. A parede celular vegetal é extremamente importante para este setor industrial, pois fornece polissacarídeos como celulose e hemiceluloses. A UDP-glucose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na produção de UDP-glucose, precursor relevante na interconversão de nucleotídeoaçúcares que constituem os monômeros desses polissacarídeos. O objetivo deste trabalho foi clonar os cDNAs que codificam a UGPase, extraídos do tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.) e da raiz de eucalipto (Eucalyptus grandis), e inseri-los por meio de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens, respectivamente, no genoma de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto, para alterar o fluxo de carbono de modo a aumentar o conteúdo de pentosanas (xilose e arabinose). O maior teor de pentosanas é benéfico economicamente para a indústria de papel e celulose, pois diminui a energia consumida no refino da polpa além de benificiar a qualidade do papel que se torna mais resitente ao rasgo. O impacto da superexpressão do gene ugp nas plantas de tabaco e de eucalipto obtidas da transformação genética, foi avaliado por meio de análises bioquímicas e morfológicas. A análise de Southern blot indicou uma a quatro cópias do transgene no DNA genômico de dez linhagens T2 de tabaco, e uma cópia em uma linhagem T0 de eucalipto. A análise de qPCR mostrou que todas as linhagens T2 de tabaco apresentaram expressão do gene ugp exógeno, sendo que em quatro o nível de expressão foi maior que nas demais. As linhagens com menor expressão do gene ugp exógeno, com exceção de uma delas, também expressaram menos o gene ugp endógeno, sugerindo que nessas linhagens algum mecanismo de regulação atuou alterando a expressão desse gene, tanto endógeno, quanto exógeno. As linhagens transgênicas de tabaco foram morfologicamente semelhantes às plantas controle quando comparadas quanto à altura da planta, comprimento de internós, área foliar total, diâmetro do caule e massa seca da raiz. As alterações nos tabacos transgênicos, em relação aos controles, verificadas através das análises químicas, foram estatisticamente mais significativas na medula caulinar, onde houve aumento no conteúdo dos monossacarídeos e dos ácidos urônicos. As poucas diferenças encontradas no tecido xilemático sugerem que a planta, de alguma forma, tende a alterar menos a composição da parede celular secundária, do que da parede primária. Também sugerem que o metabolismo dos carboidratos pode afetar o conteúdo de lignina, embora seja sintetizada por outra rota metabólica. A parede celular primária, analizada utilizando a medula das plantas de tabaco e folhas de eucalipto, mostrou um aumento no conteúdo de pentosanas, o que não foi observado na análise de plântulas de tabaco. / Assossiating technologies like transgenesis, genomics and proteomics with conventional forestry breeding can accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties for the paper and pulp industry. Plant cell wall is extremely important for this industry, providing polysaccharides like cellulose and hemicelluloses. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9) is a key enzyme producing UDP-glucose, an important forerunner for nucleotide sugars that constitute the monomers of these polysaccharides. The goal in this work was to clone the cDNAs that encode UGPase, extracted from potato (Solanum tuberosum L.) tuber, and eucalypt (Eucalyptus grandis) root, and transfer through genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens, respectively, in tobacco (Nicotiana tabacum) plants and eucalypts, in order to change the carbon flux, increasing the pentosans (arabinose and xylose) content. Higher pentosans content is economicaly important for the paper and pulp industry, as decreases energy consumption at pulp refining and also can benefit paper quality that becomes more resistant to rip. The impact of the ugp gene overexpression over tobacco and eucalypt plants obtained through genetic transformation were morphological and biochemicaly evaluated. Southern blot analysis showed one to four copies of the transgene in the genomic DNA of ten tobacco T2 lines, and one copy in one eucalypt T0 line. The qPCR analysis showed that all tobacco T2 lines expressed exogenous ugp gene, being the expression level in four of them biger than the others. Lines that expressed less exogenous ugp gene, with exception of one of them, equally had less endogenous ugp gene expression level, suggesting that in these lines, some kind of regulation acted changing the gene expression. The transgenic tobacco lines were morphologicaly similar to the control plants when compared for total height, internode lenght, total leaf area, stem diameter and root dry mass. Alterations in transgenics tobacco plants, in relation to controls, checked by chemical analysis, were statisticaly more significants in the pith, where the monosaccharides and uronic acids contents increased. The few diferences founded in the xilematic tissue sugest that the plant, somehow, tends to change less the secondary cell wall composition than the primary wall. They also suggest that the carbohydrate metabolism can affect lignin content, thought it\'s sintetizaded in another metabolic pathway. The primary cell wall, evaluated using tobbaco plants pith and eucalypt leaves, showed an increase in pentosanas content, that wasn\'t observed analising tobacco seedlings.

A ocorrência de mamões Golden com casca verde e polpa mole, em determinadas épocas do ano, tem sido relatada por produtores da região Norte do Espírito Santo. Não sendo possível distinguir frutos com o distúrbio do amolecimento precoce (DAP) apenas pela análise da cor da casca e da firmeza da polpa no momento da colheita, o objetivo deste trabalho foi estudar aspectos da fisiologia e bioquímica do amadurecimento que pudessem auxiliar no entendimento da perda precoce da firmeza. As coletas ocorreram no período de maior frequência de frutos com o distúrbio (meados de verão a final de outono). Os frutos foram coletados no estádio 1 de maturação, armazenados a 10º±1oC e 85±10% UR, durante 10 dias e submetidos à metodologia do Índice de Amolecimento (IA). O sintoma do amolecimento precoce foi observado claramente no 4°dia após o armazenamento sendo verificada a perda de firmeza nos frutos com DAP entre o 2° e o 8°dia a 10°C, sendo o decréscimo na firmeza equivalente a 71% da firmeza inicial, comportamento atípico para frutos armazenados sob refrigeração. Frutos com e sem DAP não apresentaram diferença significativa no teor de sólidos solúveis, acidez titulável e ácido ascórbico. A atividade respiratória e a produção de etileno foram reduzidas com o armazenamento refrigerado, sem diferença entre os frutos com e sem DAP, o que sugere que o aparecimento do distúrbio não se deve ao aumento na produção de etileno no período póscolheita. Os resultados indicam forte associação entre o amolecimento precoce e mudanças na parede celular. O rendimento das frações solúvel em água (FSA) e em NaOH (FSH) nos frutos com DAP, foi superior ao observado nos frutos sem DAP, durante todo o período de armazenamento. O menor nível da fração solúvel em imidazol (FSI) no tempo 0 pode estar associado à maior atividade da pectinametilesterase nos frutos com DAP. O decréscimo na fração celulose (CEL) em frutos com DAP pode indicar modificação na parede celular, ao nível celulose-hemicelulose. A produção de etileno não acompanhou as modificações na parede celular, sugerindo que alterações na estrutura da parede podem ter ocorrido durante o crescimento do fruto. Frutos com DAP apresentaram níveis de auxina (AIA) 6 vezes menor do que frutos sem DAP, no dia 0, sem diferença durante o armazenamento. Possivelmente os níveis de AIA nos frutos com DAP estavam reduzidos quando o fruto ainda estava ligado à planta. O distúrbio possivelmente está relacionado à alteração na parede celular e níveis de AIA. Desta forma, uma alteração hormonal durante o desenvolvimento do fruto anterior à colheita -, associada à sensibilidade do fruto à essa sinalização hormonal, levaria à mudanças na parede celular, o que determinaria a ocorrência do distúrbio do amolecimento precoce. / The occurrence of green skin and soft pulp in Golden papaya fruit during certain seasons has been reported by orchards in northern Espírito Santo State, Brazil. It is not possible solely by skin color and pulp firmness analysis to distinguish early softening disorder fruits (DAP), at the time of harvest, from those without the disorder. The aim of this work was to study the physiological and biochemical ripening aspects that might help to understand the early softening disorder. Fruits were harvested on the most common seasons (mid-summer to mid-autumn) in maturity stage 1 and evaluated for 10 days. Fruits were stored at 10°C, and submitted to softening index (IA). The symptoms of early softening disorder were clearly observed on the 4th day after storage. However, the firmness decrease in DAP fruits happened between the 2nd and 8th day at 10°C, with a decrease of 71% of initial firmness, presenting an atypical behavior for fruits stored under refrigeration. There was no difference between fruits with DAP and without DAP for soluble solids, titratable acidity and ascorbic acid content. Besides that, there was no difference between fruits with DAP and without DAP for respiration rate and ethylene production under refrigerated storage, which suggests that the disorder occurrence is not related to an increase in ethylene in the postharvest period. The results indicate a strong association between early softening disorder and changes in the cell wall composition. The cell wall polymers fractionation show that the yield of water soluble polymers (FSA) and NaOH soluble polymers (FSH) was higher in fruits with DAP than on fruits without DAP during the entire storage period. The smallest level of the imidazole soluble fraction (FSI) in DAP fruit, on day 0, may be related to a higher activity of pectinmethylesterase. The decrease in cellulose-rich polysaccharides (CEL) in the DAP fruit suggest modifications in the cellulose-hemicellulose domain. Ethylene production did not follow cell wall modification, suggesting that changes in the cell wall structure could be happening during fruit growth. DAP fruit presented an AIA level 6 times smaller than fruit without DAP, in day 0, without storage differences. Possibly, AIA levels in DAP fruit were reduced while fruits were still connected to the plant. The disorder may be related to cell wall changes and to AIA level. Should a hormonal change occur during fruit development i. e. prior to harvesting -- and still depending on fruit sensibility to hormonal signaling, cell wall changes could have different intensities, which determine if the fruit will or not have the flesh early softening observed after harvest.