Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der antigenen Eigenschaften aktueller Isolate (PPV-143a und PPV-27a) des porzinen Parvovirus (PPV). Des Weiteren sollten die Virulenzeigenschaften dieser Isolate sowie zweier Virusstämme (PPV-NADL-2 und PPV-IDT [Master Seed Virus]), die zur Produktion von inaktivierten Vollvirus-Vakzinen genutzt werden, bestimmt werden. In der in vitro-Studie wurden die untersuchten PPV-Isolate sowie ein weiteres Isolat (PPV-Challenge [Engl.]) zur Herstellung von Hyperimmunseren im Kaninchen und - nach experimenteller Infektion von Sauen (s.u.) – zur Herstellung von Postinfektionsseren genutzt. Die Seren wurden im Neutralisationstest gegen die verschiedenen Isolate geprüft und eine Kreuzneutralisation bewertet. Das Serum-IDT (MSV) zeigte generell eine begrenzte Neutralisation gegen die heterologen PPV-Isolate. Des Weiteren ergab die Untersuchung, dass alle Seren gegen das Isolat PPV-27a als Testvirus einen geringeren Neutralisationstiter aufwiesen als gegen die anderen Isolate. Interessanterweise wurde PPV-27a durch homologe Antiseren deutlich schlechter neutralisiert als alle anderen getestete Viren. Dieser offensichtliche „Immune Escape“ wurde bei den Seren aller beiden Kaninchen und aller drei Sauen gesehen. Die experimentellen Infektionen erfolgten bei 12 tragenden Jungsauen am 40. Trächtigkeitstag (3 Tiere pro Isolat PPV-143a, PPV-27a, PPV-NADL-2, PPV-IDT [MSV]). Es konnten neben dem Serum der infizierten Sauen fetale Gewebeproben von Lunge und Niere sowie Nabelvenenblut von insgesamt 157 Feten aus diesen Trächtigkeiten untersucht werden. Zur Antikörperbestimmung wurde der HAH-Test angewendet. Spezifische Antikörper konnten bei den Feten jeder Infektionsgruppe (PPV-143a, PPV-27a, PPV-IDT [MSV]) und PPV-NADL-2) detektiert werden. Somit konnte eine transplazentare Übertragung für alle PPV-Isolate gezeigt werden. Der Antigennachweis erfolgte durch Untersuchung der Hämagglutination aus dem Gewebe beziehungsweise nach Anzucht des Erregers in Zellkultur durch Bewertung des cytopathischen Effekts und Bestätigung durch direkte Immunfluoreszenz. Der Virusnachweis gelang ausschließlich bei den Feten der Gruppe Sauen die mit PPV-27a infiziert wurden. Die fetale Mortalitätsrate der Feten der Infektionsgruppe PPV-27a lag bei 85 % und war signifikant höher im Vergleich zu den anderen Infektionsgruppen (5-18 %). Schlussfolgernd konnte in vivo lediglich für PPV-27a eine Virulenz nachgewiesen werden. In vitro zeigte sich nur für PPV-27a ein differenziertes Kreuzneutralisations-Verhalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Isolat PPV-27a tasächlich eine neue antigene Variante des porzinen Parvovirus darstellt, gegen die derzeit verfügbare Impfstoffe möglicherweise nur unvollständig schützen.

Das canine Parvovirus (CPV-2)wurde erstmals bei Hunden im Jahr 1978 beschrieben. Dieses Virus verbreitete sich innerhalb weniger Monate weltweit in einer schweren Pandemie. Retrospektiv wird angegnommen, dass es sich aud dem Felinen Panleukopenie-Virus oder einem nah verwandten Virus entwickelt hat. Ziel dieser Arbeit war es, durch Untersuchungen von archivierten paraffineingebetteten Gewebeproben von Hunden und Katzen aus den frühen 1970iger Jahren einen möglichen Anzestor des caninen Parvovirus zu identifizieren und die Hypothese zu überprüfen, dass CPV-2 schon vor 1978 in den Hundepopulationen zirkulierte.

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Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2001. / Härtill 6 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 5 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2000. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 160-169). Also available on the Internet.

Resumo: A parvovirose canina, uma das principais doenças infecto-contagiosas que acomete cães, é causada pelo Parvovírus canino-2 (CPV-2). Desde sua '" escrição importantes mutações ocorreram originando três tipos: CPV-2a e 2b, comumente detectados no Brasil, e o CPV-2c. Essas alterações antígênicas caracterizam o CPV como um dos principais modelos de evolução viral, sendo etectáveis com painéis de anticorpos monoclonais em técnicas simples como hemaglutinação e neutralização in vitro. A tecnologia de apresentação de :J oteínas em bacteriófagos (Phage display) tem diversas aplicações, dentre elas a apresentação de fragmentos recombinantes de anticorpos funcionais scFv), que podem ser produzidos em grande quantidade. Este trabalho utilizou Phage Display para expressar fragmentos scFv contra o CPV-2 , com uma etodologia descrita (Krebber, 1997). Após o cultivo e purificação do vírus, camundongos da linhagem High seleção IV A foram imunizados com o CPV-2 , sendo em seguida extraído RNA total do baço. A amplificação das cadeias leve e pesada, e sua ligação por SOE-PCR, permitiu a clonagem do scFv no fagomídeo pAK 100. Após a transformação da E.coli XL-1 blue, bacteriófagos 13 foram expressos apresentando o fragmento scFv. Três processos de seleção foram realizados, e após '0 Phage-ELlSA, um grupo de fagos foi selecionado. A partir deste um screening foi realizado por PCR sendo dois lones detectados. Após nova expressão de ambos uma nova reação de Phage-ELlSA foi realizada e demonstrou a especificidade destes clones com o CPV-2. Até o presente momento esta é a primeira descrição da técnica de Phage display apresentando fragmentos de anticorpo anti-CPV-2. / Abstract: Canine parvoviral disease, one of the most common infectious disorders of dogs, is caused by canine parvovirus (CPV-2). Several mutations have accurred since it was described in the late 1970s, originating three antigenic pes: CPV-2a and 2b, most commonly found in Brazil, and the CPV-2c. These tigenic differences characterize CPV-2 as an important model of virus evolution, and could be detected by monoclonal antibody panel in hemmaglutination and in vitro neutralization. Phage display has many a plications and have been used displaying functional antibodies fragments scFv) , which can be produced in large amount. The technology described here :: the expression of antibody recombinant fragments - scFv - against CPV-2, the methodology previously described (Krebber, 1997). After cultivation and purification of virus, High IV A mice were immunized with CPV-2, total RNA s extracted from spleen cells. Light and heavy chains were amplified, and en linked by SOE-PC R; and the product was cloned into a phagemid (pAK ). After the transformation on E. coli XL-1 blue, M13 bacteriophages were - ressed presenting the scFv fragment. Series of 3 rounds of panning was ied out, and after a Phage-ELlSA a group of phage was selected. A PCR - eening was conducted and two clones detected. After new expression a age-ELlSA was performed and demonstrated the specificity of these clones against the CPV-2. Until the moment this is the first description of the use of the :J age display, producing antibody fragments against CPV-2. - / Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Coorientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Ramon Kaneno / Banca: Alice A. F. Alfieri / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Alexandre S. Borges / Doutor

A síndrome da má absorção (SMA), caracterizada pelo mau desenvolvimento e desuniformidade do lote de aves, causa importantes prejuízos econômicos à avicultura comercial. No entanto, por se tratar de uma doença multifatorial e possivelmente polimicrobiana, o envolvimento do parvovírus de galinha (ChPV) na ocorrência da SMA ainda é pouco conhecido. Com o propósito de elucidar a possível associação entre a presença do ChPV e a ocorrência da SMA, foram desenvolvidas e aplicadas ferramentas moleculares para a detecção e quantificação do ChPV em amostras de frangos comerciais no Estado do Rio Grande do Sul. Uma PCR quantitativa foi desenvolvida para detectar e quantificar cópias do genoma (CG) do ChPV em amostras de suabes de cloaca de 59 frangos saudáveis e 68 frangos com sinais clínicos sugestivos de SMA. Os resultados revelaram que todas as amostras dos dois grupos investigados, continham o genoma do ChPV. No entanto, a carga viral em frangos com SMA foi significativamente (p≤0,0001) maior (1x105 CG/100 ng DNA) do que em frangos saudáveis (1,3x103 CG/100 ng DNA). Adicionalmente às amostras de cloaca, o ChPV também foi investigado em amostras de tecidos (fígado, timo, baço, bursa de Fabricius - BF e intestino) e soros provenientes de nove frangos saudáveis e 50 frangos com sinais indicativos da SMA. O ChPV foi encontrado tanto em aves saudáveis como nas aves com SMA, no entanto, observou-se uma diferença na distribuição deste agente nos tecidos analisados. O genoma do vírus foi mais frequentemente detectado na BF, baço e intestino das aves com SMA, sendo que o intestino foi o tecido que apresentou maior carga viral. Os resultados encontrados nestes estudos demonstraram que o genoma viral estava altamente disseminado nas aves investigadas. Além disso, observou-se uma maior carga viral em frangos de corte com SMA quando comparado com aves sadias. Com base nos resultados encontrados, sugere-se que a maior carga viral de ChPV existente em aves com SMA, em relação a aves saudáveis, seja um dos fatores que favoreça a ocorrência da síndrome. / The malabsorption syndrome (MAS), characterized by the poor development and lack of uniformity of chicken flocks, causes significant economic losses to commercial poultry. However, because it is a multifactorial and possibly polymicrobial disease, the involvement of Chicken parvovirus (ChPV) in the MAS occurrence is still not clear. In order to elucidate the possible association between the presence of ChPV and the occurrence of MAS, molecular tools were developed and applied for the detection and quantification of ChPV DNA in commercial poultry samples in the state of Rio Grande do Sul. A quantitative PCR was developed to detect and quantify the ChPV genome copies (GC) in cloacal swab samples of 59 healthy broilers and 68 broilers with clinical signs suggestive of MAS. The results showed that all investigated samples of the two groups contained the genome ChPV. However, viral loads in MAS-affected animals were significantly (p≤0.0001) higher (1x105 GC/100 ng DNA) than in healthy broilers (1.3x103 GC/100 ng DNA). In addition to the cloacal samples, the presence of ChPV DNA was also investigated in tissue samples (liver, thymus, spleen, bursa of Fabricius - BF and intestine) and sera from nine healthy broilers and 50 broilers with signals indicative of MAS. The ChPV was found in healthy avian as well MAS-affected, however, there was a difference in the distribution of this agent in those tissues. The virus genome was more frequently detected in the BF, spleen and intestines of the MAS-affected broilers, and the intestines contained the highest viral loads, in comparison with other tissues. Our results demonstrated that the viral genome can be found in both healthy and MAS-affected broilers. In addition, higher viral loads were detected in broilers with signs suggestive of MAS compared to healthy birds. Based on these results, it is suggested that the greatest viral load of ChPV existing in MAS-affected broilers when compared to healthy birds, is one of the factors that favor the occurrence of the syndrome.

O parvovírus suíno (PPV) apresenta grande importância, principalmente em fêmeas nãoimunes, por causar perdas reprodutivas significativas. O primeiro trabalho foi desenvolvido sobre forma de revisão, e serviu como base para realização dos estudos seguintes. O segundo trabalho foi conduzido para determinar a resposta de anticorpos para PPV em 127 leitoas após a vacinação, avaliar a transferência de imunidade passiva e estimar a queda de anticorpos colostrais para PPV na leitegada. Foi realizada coleta de sangue nas leitoas em: (A) antes da primeira vacinação para PPV, (B) após a segunda dose; (C) no parto e (D) durante a segunda gestação. Além disto, colostro também foi coletado (E). Três leitões de cada fêmea foram selecionados e amostras de sangue foram coletadas: antes de mamar o colostro, 7, 21, 57, 87 e 128 dias de idade, a fim de verificar o declínio da imunidade passiva e estimar a meia-vida de anticorpos para PPV. O número de fetos mumificados, natimortos, nascidos vivos e nascidos totais do primeiro e segundo parto foram analizados. Os anticorpos para PPV foram testados por inibição da hemaglutinação (HI) e enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), a fim de verificar a concordância entre estes dois métodos. A possível associação entre os títulos de anticorpos das fêmeas e dos leitões no soro e no colostro com os dados reprodutivos também foi investigada. A maioria das fêmeas (85,83%) tiveram anticorpos para PPV antes da vacinação, mas depois da vacina, todas as fêmeas soroconverteram. Aos sete dias de idade a maioria dos leitões apresentaram anticorpos para PPV e em torno dos 57 dias de idade somente 35,29% dos leitões eram positivos, alcançando a nulidade de anticorpos para PPV aos 87 dias de idade. A meia-vida estimada dos anticorpos colostrais foi 29,80 dias. A correlação entre o soro dos leitões e da fêmea no momento do parto foi r=0,77 (P<0,001) e com o colostro o valor de r foi 0,72 (P<0.001). A concordância entre os testes de ELISA e HI foi moderada (Spearman’s ρ= 0,89 e R2= 0.67). Houve diferença somente no número de mumificados entre o primeiro e segundo parto (P<0,001). O terceiro trabalho objetivou avaliar o perfil de anticorpos para PPV em diferentes sistemas de reposição de leitoas, correlacionando com dados reprodutivos. Cento e cinquenta 11 nulíparas com duas doses de vacina para PPV foram selecionadas de três sistemas de reposição diferentes: quarto sítio - A (n=36), granja receptora do quarto sítio - B (n=57) e granja multiplicadora - C (n=57). Os anticorpos para PPV foram medidos utilizando um teste de ELISA. Houve diferença entre as três granjas com relação ao título de anticorpos (P<0,05). Ao comparar os dados reprodutivos entre as granjas, houve diferença entre elas no número de nascidos totais e nascidos vivos, mas não foi observada diferença no percentual de natimortos e de mumificados (P>0,05). A correta preparação da leitoa, objetivando a proteção no momento da cobertura é fundamental para alcançar bom desempenho reprodutivo, independente do sistema de reposição utilizado. / Porcine parvovirus (PPV) has a great importance because causes significantly reproductive losses, mainly in non-immune gilts. The first study was developmented as a review, and served as a basis to carry out the following studies. The second study was conducted to determine the antibody response for PPV of 127 gilts in field conditions after vaccination, to evaluate the transfer of passive immunity and to estimate the decay of acquired colostral antibodies to PPV in the littermate. Gilts were bled at: (A) before the first vaccination to PPV, (B) after the second dose; (C) at farrowing and (D) during the second pregnancy. Added to these, colostrum was also collected (E). Three piglets of each gilt were selected and blood samples were collected: prior to initial colostrum intake, 7, 21, 57, 87 and 128 day-old, in order to verify the decrease of passive immunity and estimate the half-life of PPV antibodies. The number of mummified fetus, stillbirths, born alive and total born were analyzed from first and second parturition. The PPV antibodies were tested both with haemagglutination inhibition (HI) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in order to study the agreement between these methods. The possible association between gilts and piglets antibody titers in serum and colostrum with reproductive data was also investigated. Most gilts (85.83%) had antibodies to PPV before vaccination, but after vaccine, all gilts seroconverted. At 7 day-old most part of piglets had PPV antibodies and around 57 days-old only 35.29% of piglets were positive, reaching the PPV antibodies nullity at 87 days-old. The estimated average half-life of acquired colostral antibodies was 29.80 days. The correlation between piglets serum with gilt serum at farrowing time was r=0.77 (P<0.001) and with colostrum the r value was 0.72 (P<0.001). The agreement between ELISA and HI tests was moderate (Spearman’s ρ= 0.89 and R2= 0.67). The only difference between first and second parturition was observed on mummified fetuses (P<0.001). The objective of the third study was to evaluate the PPV antibodies profile in different gilts replacement systems, correlating with reproductive data. A hundred and fifty gilts with two doses of 13 PPV vaccine were selected from three different gilts replacement systems: Fourth site - A (n=36), fourth site receiver herd - B (n=57) and a farm producing dam lines - C (n=57). The PPV antibodies were measured by an ELISA test. There were a difference on antibody titers among the three herds (P<0.05). When we compared the reproductive data among herds, there were difference on total born and born alive, but this difference was not observed on the percentual of stillbirths and mummified (P>0.05). The correct gilt preparation, aiming the protection on mating time is fundamental to reach a great reproductive performance, independent of the replacement gilt system used.