Im Zuge der Überarbeitung der DVG-Richtlinie zur Prüfung der Viruzidie chemischer Desinfektionsmittel in der Nutztierhaltung wurden BVDV, EAV und PPV auf ihre Eignung als potentielle Prüfviren getestet. Das bisher vorgeschriebene Newcastle-Disease-Virus und das Vacciniavirus sollen mit anderen behüllten Viren wie BVDV oder EAV verglichen werden. Beweggründe für einen möglichen Austausch sind die derzeitige Situation in der Tierseuchenbekämpfung, die Erhöhung der Anwendersicherheit durch Wegfall des zoonotischen Potentials, die einfachere Kultivierung und Handhabung der Prüfviren sowie speziell bei NDV die höhere Aussagekraft der gewonnenen Ergebnisse. Die Desinfektionsmittelversuche wurden gemäß DVG-Richtlinie auf Pappelholzkeimträgern durchgeführt, wobei das jeweilige, mit fetalem Kälberserum vermischte, Virus auf die Keimträger aufgetragen und angetrocknet wurde. Die DVG schreibt eine Trocknung im Brutschrank von 60 Minuten bei 37°C vor. Um die Trocknungsverluste der eingesetzten Viren zu untersuchen, wurden vergleichende Trocknungsversuche wie vorgeschrieben im Brutschrank und im Exsikkator bei Raumtemperatur durchgeführt. Die nach der Trocknung im Brutschrank durchgeführten Desinfektionsmittelversuche wurden mit chemischen Grundsubstanzen kommerziell erhältlicher Desinfektionsmittel durchgeführt. Dabei kamen verschiedene Anwendungskonzentrationen von Ameisensäure, Glutaraldehyd, Natriumhypochlorit, Natronlauge und Peressigsäure zum Einsatz. Bei der vorgeschriebenen Trocknung im Brutschrank kam es zu Titerverlusten von 0,8 bis zu 2,75 log10KID50/ml. Durch eine Trocknung der Holzkeimträger von 30 Minuten bei Raumtemperatur im Exsikkator konnten die Titerverluste auf 0,3 bis 1,0 log10KID50/ml reduziert werden. In den nachfolgenden Desinfektionsversuchen zeigte sich die besonders hohe Tenazität von PPV. Es war den eingesetzten Desinfektionsmitteln gegenüber deutlich resistenter als alle anderen untersuchten Viren. In den Trocknungsversuchen zeigte PPV mit Abstand die niedrigsten Titerverluste. Mit BVDV und EAV konnten zwar ausreichend hohe Titer erzielt werden, allerdings waren die Trocknungsverluste beider Viren sehr hoch. In den Keimträgerversuchen konnte nur in wenigen Versuchen eine Titerreduktion von mehr als 3 Logarithmusstufen erreicht werden. Hier könnte zukünftig die Trocknung im Exsikkator Abhilfe schaffen, um die Trocknungsverluste zu minimieren und eine höhere Titerreduktion zu ermöglichen. Die Ergebnisse einer früheren Arbeit zeigen identische Ergebnisse von NDV und BVDV im Keimträgertest. Ein Ersatz von NDV durch BVDV ist somit zu empfehlen. Eine Verwendung der untersuchten Viren gemäß den derzeitigen DVG-Richtlinien ist möglich, allerdings müssten im Zuge der weiteren Harmonisierung von CEN- und DVG-Richtlinie die Kontrolltiter entsprechend erhöht werden, um die von der CEN geforderte Titerreduktion von vier Logarithmusstufen für eine vollständige Virusinaktivierung einzuhalten. Die Vermehrung der untersuchten Viren zu höheren Ausgangs-, bzw. Kontrolltitern sollte daher Gegenstand weiterer Forschungsarbeit sein. Einer weiteren Verwendung der bisherigen Prüfviren BEV und REOV steht nichts im Wege. Aufgrund der Ergebnisse der vergleichenden Trocknungsversuche wird für alle untersuchten Viren zukünftig eine 30 minütige Trocknung im Exsikkator empfohlen.

A fragmentação e a invasão de florestas tropicais e a crescente concentração de assentamentos humanos aumentaram exponencialmente as chances de exposição a vírus emergentes e emergentes. Dado o grande potencial de espalhamento de patógenos em população humanas, a identificação e caracterização de agentes patogênicos circulantes podem melhorar a atenção primária e as capacidades de diagnóstico para um agente emergente futuro. As abordagens moleculares e metagenômicas que utilizam as tecnologias de sequenciação da próxima geração levaram a descoberta e caracterização de muitos vírus emergentes na última década. Além disso, as abordagens in silico também podem ajudar a identificar vírus emergentes usando apenas dados de sequenciamento publicamente disponíveis. Além disso, estimar a ascendência filogenética e até mesmo analisar as mudanças no uso de codons são ferramentas adicionais que podem melhorar a nossa compreensão de vírus emergentes ou reemergentes. Este projeto visou aplicar essas ferramentas em ambos os vírus que poderiam estar circulando no Brasil: Parvovírus B19 e vírus da Febre Amarela. Também exploramos as aplicações de modelos ocultos de Markov e índice de adaptação de codons usando dados publicamente disponíveis. Esperamos que este trabalho forneça uma prova de conceito para futuros projetos metagenômicos e demonstre a utilidade das várias técnicas moleculares e bioinformáticas no estudo de vírus emergentes. / Fragmentation and encroachment of tropical rainforests and the growing concentration of human settlements have exponentially increased chances of exposure to re-emerging and emerging viruses. Given the large potential for pathogens to spillover and spread in a population, identifying and characterizing circulating human pathogens could improve the readiness and diagnostic capabilities for a future emergence. Molecular and metagenomic approaches using next-generation sequencing technologies have led to the discovery and characterization of many emerging viruses over the last decade. In complement, in silico approaches can also help identify emerging viruses using only publicly available sequencing data. Moreover, estimating the phylogenetic ancestry and even analyzing changes in codon usage are additional tools that can improve our understanding of an emerging or re-emerging virus. This project aimed to apply these tools to two viruses that could be circulating in Brazil: Parvovirus B19 and Yellow Fever virus. We also explored the applications of Hidden Markov models and codon adaptation index using publicly available data. We expect this work to provide a proof-of-concept for future metagenomic projects, and demonstrate the utility for several molecular and bioinformatics techniques in the study of emerging viruses.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present study reports a serologic survey of the main viral infections of dogs in Santa Maria, RS, Brazil, and the production of cell lines of canine, swine and leporine origin resistant to bovine viral diarrhea virus (BVDV). Canine distemper virus (CDV), parvovirus (CPV), adenovirus (CAV) and coronavirus (CCoV) infections have been associated with significant morbidity and mortality among dogs worldwide. The aim of this study was to determine the prevalence of antibodies against these viruses in the canine population of Santa Maria. To this purpose, 817 blood samples were collected from non-vaccinated dogs of 14 neighborhoods and tested by virus neutralization (CDV, CAV and CCoV) and by hemagglutining inhibition (CPV). Specific antibodies to CDV were detected in 27.3% (223/817) of the samples, to CPV in 68.7% (561/817), to CAV in 43% (353/817) and to CCoV in 50.4% (412/817) of the dogs. These results indicate that CDV, CPV, CAV and CCoV infections are spread among dogs in Santa Maria. However, a significant part of the population is seronegative and therefore unprotected against these viruses. This indicates a need for extending the vaccination programs against these viruses. During the standardization of serologic tests and expansion of cell cultures for virus amplification, the canine MDCK cell line was found to be contaminated with BVDV, the main viral contaminant of cultured cells. The inadverted contamination of cultured cells with BVDV may represent a serious problem for diagnostic virology, research and production of biologicals. The second part of this dissertation reports the production and characterization of three cell lines resistant BVDV, obtained out of each parental cell line (canine MDCK, porcine PK-15 and leporine RK-13) that were contaminated with BVDV. Initially, the cells were submitted to four rounds of infection with a highly cytolytic BVDV strain. The cells surviving infection were then cloned out, expanded and assayed for their susceptibility to BVDV. The resistance to BVDV was investigated by search for viral proteins by immunofluorescence and by cocultivation with susceptible cells following inoculation of BVDV at high titers. All three cell lines were resistant to three standard BVDV strains (Singer, NADL e Oregon) and 10 field isolates. Inoculation of these cells with BVDV at a multiplicity of infection of 10 TCID50/cell resulted in frequencies of infection of <10-5 for MDCK-R and PK-15R cells and of 3,3x10-4 for RK- 13R. Compared to the parental ones, the resistant cells were >10.000 (MDCK-R), >20.000 (PK-15R) and 600 (RK-13R) times less susceptible to BVDV. The inoculation of virus in the resistant cells in the presence of polyethylene-glicol (PEG) resulted in an increase in susceptibility in the order of >437 (MDCK-R), >346 (PK-15R) and 87 (RK-13R) times. These results indicate that the resistance of these cell lines is probably due to a block in viral entry which can be overcome by addition of PEG. On the other hand, each resistant cell line retained the susceptibility to other three viruses of interest which replicate in the parental cells. Thus, these cells may be useful for virology diagnostic, virus propagation and for vaccine production, without the risk of being inadvertedly contaminated with BVDV. / O presente trabalho relata um inquérito sorológico das principais infecções víricas de cães em Santa Maria, RS, Brasil e a obtenção de linhagens celulares de origem canina, suína e leporina resistentes ao vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV). As infecções pelo vírus da cinomose (CDV), parvovírus (CPV), adenovírus (CAV) e coronavírus (CCoV) são importantes causas de morbidade e de mortalidade em cães em todo o mundo. Com o objetivo de determinar a prevalência de anticorpos contra esses vírus na população canina da cidade de Santa Maria, coletou-se amostras de sangue de 817 cães não-vacinados, em 14 bairros. Estas foram testadas pela técnica de soroneutralização (CDV, CAV e CCoV) ou inibição da hemaglutinação (CPV). Anticorpos específicos contra o CDV foram detectados em 27,3% (223/817) das amostras, contra o CPV em 68,7% (561/817), contra o CAV em 43% (353/817) e contra o CCoV em 50,4% (412/817) dos cães. Esses resultados demonstram que esses vírus estão difundidos na população canina dos bairros da cidade. Por outro lado, demonstram também que uma parte considerável da população é soronegativa e, portanto está desprotegida contra esses agentes, indicando a necessidade de se ampliar os programas de vacinação para essas infecções. Durante a padronização das técnicas sorológicas e expansão dos cultivos celulares para amplificação dos vírus, detectou-se a contaminação da linhagem de células caninas MDCK com o BVDV, o principal vírus contaminante de cultivos celulares. A contaminação inadvertida de cultivos celulares com o BVDV pode representar um sério problema para o diagnóstico virológico, pesquisa e produção de imunobiológicos. A segunda parte dessa dissertação descreve a produção e caracterização de três linhagens celulares resistentes ao BVDV, obtidas a partir das células parentais de origem canina (MDCK), suína (PK-15) e leporina (RK-13) que estavam contaminadas com o BVDV. Essas células foram submetidas a quatro ciclos de infecção com uma cepa citolítica de BVDV. As células que sobreviveram a infecção lítica foram clonadas, expandidas e testadas para a sua susceptibilidade ao BVDV e outros vírus de interesse. A resistência ao BVDV foi investigada pela pesquisa de antígenos virais por imunofluorescência indireta e por cocultivo com células susceptíveis após a inoculação do vírus em altos títulos. As três linhagens celulares demonstraram ser resistentes a três cepas-padrão (Singer, NADL e Oregon) e a 10 isolados de campo do BVDV. A inoculação do BVDV nessas células com uma multiplicidade de infecção de 10 DICC50/célula resultou em freqüências de infecção de <10-5 para as células MDCK-R e PK-15R; e de 3,3x10-4 para as células RK-13R. Comparando-se com as células parentais, verificou-se que as linhagens resistentes são >10.000 (MDCK-R), >20.000 (PK-15R) e 600 (RK-13R) vezes menos susceptíveis ao BVDV. A inoculação do vírus nas células resistentes na presença de polietilenoglicol (PEG) resultou em um aumento na susceptibilidade dessas células na ordem de >437 (MDCK-R), >346 (PK-15R) e 87 vezes (RK-13R). Esses resultados indicam que a resistência dessas linhagens ao BVDV reside em um bloqueio na penetração do vírus, que pode ser parcialmente revertido pela adição do PEG. Por outro lado, cada linhagem resistente conservou a susceptibilidade a outros três vírus que replicam nas células parentais. Essas características tornam essas linhagens celulares potencialmente úteis para o diagnóstico, amplificação de vírus e produção de vacinas, sem o risco de contaminação acidental com o BVDV.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA10MA046.pdf: 2836538 bytes, checksum: df03fbb548e05bbfeb41e5f0f1ba5a4f (MD5) Previous issue date: 2010-05-13 / Porcine parvovirosis is a disease that causes reproductive failure and its causative agent is the Porcine Parvovirus Type 1 (PPV1). This disease, with high prevalence and worldwide distribution, affects mostly non-immune nulliparous sows. Clinically, it is observed return to estrus, delayed parturition date, birth of unviable piglets, weak, stillborn and particularly mummified fetuses in different sizes. These reproductive problems lead economic losses demonstrated by low productivity. This study aimed to implement and validate techniques for laboratory diagnosis PPV1 in natural infections in pig herds with reproductive problems and perform the characterization of these isolates. More specifically, it aimed to diagnose through nested-PCR, and characterize, through phylogenetic analysis, PPV1 isolates from tissue samples and stomach fluid from fetuses and reproductive tract from culled sows. The objectives were to further evaluate histologically the tissues that were positive by nested-PCR; to standardize an internal amplification control (IAC) for PVS1 nested-PCR; to standardize immunohistochemistry technique (IHC) in fetal tissues and to standardize PCR for Porcine Parvovirus Type 4 (PPV4). A total of 27 pig herds were studied, where 230 fetuses stillborn, mummified, aborted and unviable piglets were necropsied to harvest organs and stomach fluid. PPPV1 viral DNA was detected by nested-PCR in organs of six (2.61%) out of 230 fetuses analyzed, the cerebellum and spinal cord were the organs where the virus was detected more frequently (50%). Stomach fluids of three (2.75%) fetuses were positive by nested-PCR, out of 109 examined. In addition, samples of reproductive organs from 83 culled sows were collected also ovarian follicular fluid from 71 of them. The genetic material of PPV1 was diagnosed in six organs from sows (7.23%) and follicular fluid of three (4.22%) of them. Histological lesions were observed in four of 19 PPV1 positive organs of fetuses. Also, six ovaries and six uteri of six culled sows were PPV1 positive by nested-PCR. Exams showed that five of those ovaries were cycling, one was in anestrous and four uterus had some degree of endometritis. The IAC developed for nested-PCR was amplified in all reactions, as expected. In the IHC test the virus presence was confirmed in fetal tissue. The PCR for PPV4 was standardized and tested in fetal organs and reproductive organs from culled sows. Some samples from sow s reproductive organs were positive for this new porcine parvovirus. The results from this study show a low detection of PPV1 in herds analyzed, as well as from the reproductive organs of culled sows, considering the reduced PPV1 involvement in reproductive failure. Moreover, standardized techniques can be incorporated into routine diagnostic of PPV1 and PPV4 / A parvovirose suína é uma doença causadora de falhas reprodutivas e seu agente etiológico é o Parvovírus Suíno Tipo 1 (PVS1). Essa enfermidade, de alta prevalência e distribuição mundial, afeta principalmente porcas nulíparas não imunes. Clinicamente observa-se retorno ao cio, atraso na data de parição, nascimento de leitões inviáveis, fracos, natimortos e, principalmente, mumificados em diferentes tamanhos. Estes problemas reprodutivos acarretam prejuízos econômicos demonstrados pelos baixos índices produtivos. O presente trabalho objetivou implantar e validar técnicas de diagnóstico laboratorial para detecção de PVS1 em infecções naturais em rebanhos suínos que apresentam problemas reprodutivos e realizar caracterização desses isolados. Mais especificamente, objetivou-se diagnosticar, através de nested-PCR, e caracterizar, através de análise filogenética, isolados de PVS1 em amostras de tecidos e líquido estomacal de fetos e em aparelho reprodutivo de porcas descartadas. Objetivou-se ainda avaliar histologicamente os tecidos que resultaram positivos na nested-PCR; padronizar um controle interno de amplificação (CIA) para a nested-PCR de PVS1; padronizar técnica de imunohistoquímica (IHQ) em tecidos fetais e padronizar PCR para Parvovírus Suíno Tipo 4 (PVS4). De 27 rebanhos de suínos, foram colhidos 230 fetos entre natimortos, mumificados e abortados, os quais foram necropsiados para colheita de órgãos e líquido estomacal. O DNA viral foi detectado por nested-PCR em órgãos de seis (2,61%) fetos dos 230 analisados, sendo o cerebelo e a medula os órgãos onde o vírus foi detectado com maior frequência (50%). Líquido estomacal de três (2,75%) fetos foram positivos por nested-PCR, de 109 analisados. Além disso, amostras de órgãos reprodutivos de 83 porcas descartadas foram colhidas e também fluido folicular ovariano de 71 delas. O material genético do PVS1 foi diagnosticado em órgãos de seis porcas (7,23%) e em fluido folicular de três (4,22%) delas. De 19 órgãos positivos de fetos na nested-PCR, quatro tiveram lesão histológica. De seis ovários e seis úteros das seis fêmeas suínas descartadas positivas na nested-PCR, cinco ovários estavam ciclando, um estava em anestro e quatro úteros tinham algum grau de endometrite. O CIA desenvolvido para a nested-PCR foi amplificado em todas as reações, conforme o esperado. Nos testes de IHQ a presença do vírus foi confirmada em tecido fetal. A PCR para o PVS4 foi padronizada e testada em órgãos fetais e de porcas descartadas. Algumas amostras de porcas foram positivas para este novo parvovírus suíno. Os resultados obtidos no estudo evidenciam baixa freqüência do PVS1 nos rebanhos analisados, bem como nos órgãos reprodutivos de porcas descartadas, considerando baixo o envolvimento do PVS1 nas falhas reprodutivas. Além disso, as técnicas padronizadas podem ser incorporadas na rotina de diagnóstico de PVS1 e PVS4

L’immunothérapie anticancéreuse est basée sur la capacité du système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales comme étrangères et à les éliminer. Les stratégies immunothérapeutiques abordées dans ce travail, incluent l’activation du système immunitaire par l’expression de facteurs immunomodulateurs (l’interleukine-2) via l’utilisation d’un vecteur dérivé du parvovirus MVM, ou par présentation des antigènes tumoraux par la machinerie des cellules dendritiques (DC), via la génération d’hybrides entre DC et cellules tumorales (TC).<p>L’intérêt majeur du parvovirus autonome MVM en tant que vecteur pour la thérapie génique du cancer vient de son expression préférentielle dans les cellules transformées (oncotropisme) et de son aptitude à lyser celles-ci (oncolyse). Les vecteurs générés au laboratoire conservent l’unité de transcription NS et expriment l’IL2 humaine sous contrôle du promoteur P38, à la place des protéines de capside. Malgré les améliorations apportées à la production de vecteurs recombinants, la faible concentration des stocks reste un problème. Il a été montré que, de nombreux virus sont mieux produits en conditions de faible tension en oxygène (hypoxie). Nous avons tenté d’améliorer les titres des vecteurs en les produisant sous faible tension d’oxygène mais sans y parvenir (annexe 1). Dans un modèle in vivo utilisant la lignée de mélanome K-1735 dans des souris immunocompétentes, des cellules tumorales infectées in vitro avant leur implantation en sous-cutané ont montré un effet anti-tumoral du vecteur MVM/IL2 (annexe 2). Afin de mettre en évidence l’apport de l’oncolyse parvovirale dans l’activité anti-tumorale, nous avons mis au point des expériences, dans le même modèle de tumeur, visant à comparer l’efficacité du vecteur MVM/IL2 à celle d’autres vecteurs, Ad/IL2 et Rétrovirus/IL2, ne possédant pas d’activité oncolytique. Dans le but de mettre en évidence une éventuelle réponse immune in vivo, nous avons utilisé le modèle de tumeur TC-1 mais ce modèle s’est montré moins sensible à l’effet du vecteur MVM/IL2 et nous n’avons pas pu démontrer d’activation de cellules cytotoxiques spécifiques de la tumeur.<p>Il a été proposé d’utiliser des hybrides entre DC/TC pour la vaccination anti-tumorale pour optimaliser la présentation des antigènes tumoraux. Une lignée cellulaire exprimant la protéine fusogène du virus de la leucémie du Gibbon (GaLV-FMG, Gibbon ape leukemia virus) a été dérivée de la lignée cellulaire CHO (cellules ovariennes de hamster chinois) au laboratoire. Cette lignée CHO-FMG, utilisée comme partenaire intermédiaire, a permis la fusion entre cellules tumorales et dendritiques (annexe 3). Nous avons montré que l’expression transitoire après infection par un vecteur AAV-FMG ou après transfection transitoire ne génère pas un pourcentage significatif d’hybrides. En effet, le niveau d’expression ainsi que le pourcentage de cellules transduites exprimant FMG s’est révélé trop faible. Ceci a mis en valeur l’efficacité de la lignée stable CHO-FMG comme intermédiaire de la fusion. De plus, nous avons intégré dans la lignée fusogène, le gène de l’interleukine-2, qui devrait permettre d’augmenter l’efficacité de l’induction de la réponse immune. <p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le parvovirus adéno-associé (AAV) possède un génome à ADN linéaire simple brin de 4,7kb encadré par deux séquences palindromiques inversées et identiques de 145 nucléotides appelées ITRs, requises en cis pour la réplication et l’encapsidation de l’ADN viral. Dans un AAV recombinant (rAAV), la totalité de la partie codante du génome viral est remplacée par une cassette d’expression et seuls les ITRs sont conservés.<p>\ / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished