Weltweit hat das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) unter den Krebserkrankungen die schlechteste Prognose. Aufgrund der unspezifischen Symptome wird die Erkrankung meist erst in einem lokal fortgeschrittenem Stadium diagnostiziert, wenn eine kurative Tumorresektion nicht mehr möglich ist und es bereits zur Metastasierung gekommen ist. Trotz intensiver klinischer Forschung wird mit bisherigen Therapieansätzen wie zum Beispiel Gemcitabin (auch in Kombination mit nab-Paclitaxel) nur eine geringfügige Verbesserung des medianen Überlebens erzielt. Diese Therapieresistenz gegenüber Gemcitabin wurde in in vitro Versuchen mit verschiedenen humanen PDAC-Zelllinien bestätigt. Die zusätzlich behandelte nichttumorigene Pankreasdukt-Zelllinie HDPE-E6E7 zeigte hingegen eine starke Sensitivität gegenüber dem Chemotherapeutikum. Ursächlich beteiligt an der generellen Resistenz dieser Tumore gegenüber Chemo- und Strahlentherapie sind verschiedene Apoptose-Evasionsmechanismen. Diese sind vor allem durch ein Ungleichgewicht pro- und antiapoptotischer Faktoren bedingt (Lowe 2004). Zusätzlich fördern KRAS-Mutationen, die nahezu universell in allen PDACs vorliegen, die Proliferation der Tumorzellen und unterstützen die Apoptose-Dysregulation durch eine verstärkte Expression antiapoptotischer Proteine. Nach umfangreichen Literaturrecherchen (Werner 2011a, Werner 2011b) wurden verschiedenste PDAC-Zelllinien hinsichtlich ihrer Expression von Apoptose-assoziierten Genen analysiert. Untersucht wurden diesbezüglich verschiedene humane PDAC-Zelllinien, aber auch Primärzellkulturen (PaCaDD-Zellen), die in unserem Labor per Outgrowth-Methode aus Patiententumorgewebe etabliert wurden. Ergänzend wurden murine Zelllinien analysiert, die aus einem genetischen PDAC-Mausmodell (KRASG12D; P53R172H; PDX1 CRE) stammen. Normiert bezüglich der Expression der HDPE-E6E7-Zellen wurde eine vielfältige, sehr heterogene Dysregulation von verschiedenen, mit der Apoptose assoziierten Proteinen festgestellt. Per siRNA-basiertem Knockdown wurden verschiedene Kandidatengene hinsichtlich ihrer funktionellen Bedeutung für die Zellproliferation und Apoptose-Induktion näher charakterisiert. In einem dynamischen Prozess wurde eine multimodale Therapie entwickelt, bei der fünf antiapoptotische Zielgene (BCLXL, FLIP, MCL1L, SURVIVIN und XIAP) kombiniert mit KRAS als zentralem Onkogen simultan in ihrer Expression inhibiert wurden. Ziel war es, hierdurch sowohl die extrinsische als auch intrinsische Apoptose zu normalisieren und eine möglicherweise durch Caspase-Inhibitoren blockierte Signaltransduktion zu ermöglichen. Ein zusätzlicher Knockdown von KRAS sollte einer Gegenregulierung dieser Therapie vorbeugen und die gesteigerte Proliferation der Tumorzellen unterbinden. Dieser so genannte SGS6-Therapieansatz zeigte in vitro in allen fünf getesteten humanen sowie in zwei murinen Zelllinien eine starke Apoptose-Induktion und Verminderung der Zellzahl. Durch Zweit-siRNAs wurde die spezifische Wirksamkeit der Knockdowns bestätigt und zelluläre off-target-Effekte wurden ausgeschlossen. Auch in vivo wurde in einem subkutanen Allograftmodell mit dem SGS6-Therapiekonzept eine starke Tumorreduktion erzielt. Die analoge Untersuchung der nichttumorösen Pankreasdukt-Zelllinie HDPE-E6E7 zeigte, dass die SGS6-Therapie deutlich spezifischer für die Krebszellen war verglichen zur Behandlung mit Gemcitabin.

L’angiogenèse est le processus biologique par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins se forment à partir du réseau vasculaire pré-existant. Sa première étape, l’activation endothéliale, est caractérisée par la prolifération des cellules endothéliales, la sécrétion de facteurs pro-angiogéniques comme l’Angiopoïétine-2 (Ang-2) et la relocalisation de la nucléoline du noyau vers la surface cellulaire. Dans les vaisseaux matures, les cellules endothéliales sont quiescentes et l’endothélium est recouvert de péricytes. L’activation endothéliale induit un détachement des péricytes favorisant le remodelage du réseau vasculaire. L’objectif de cette thèse est d’étudier les mécanismes de l’activation endothéliale au cours de l’angiogenèse physiologique et d’évaluer les effets de son inhibition dans un contexte d’angiogenèse tumorale. Des études in vivo dans la rétine de souris et in vitro sur des cellules endothéliales humaines ont montré que le VEGF régule l’exocytose des Corps de Weibel et Palade (WPBs), des compartiments cytoplasmiques spécifiques des cellules endothéliales pouvant contenir de l’Ang-2. Ce travail suggère que l’exocytose des WPBs induite par le VEGF régule la sécrétion de l’Ang-2 par les cellules endothéliales activées et que l’Ang-2 sécrétée régule à son tour le recrutement des péricytes sur les vaisseaux. Le ciblage de la nucléoline dans un modèle de cancer du pancréas a inhibé l’activation endothéliale et cette inhibition a diminué la croissance et l’angiogenèse tumorales tout en favorisant le recrutement des péricytes et la normalisation des vaisseaux tumoraux. La normalisation vasculaire induite par l’inhibition de l’activation endothéliale via le ciblage de la nucléoline représente une stratégie prometteuse pour le traitement de pathologies associées à une dérégulation de l’angiogenèse comme les cancers ou les rétinopathies. / Angiogenesis is the biological process of new blood vessel formation from the pre-existing vascular network. Its first step, endothelial activation, is characterized by endothelial cell proliferation, the secretion of pro-angiogenic factors such as Angiopoietin-2 (Ang-2) and the relocation of nucleolin from the nucleus to the cell surface. In the mature vessels, endothelial cells are quiescent and the endothelium is covered by pericytes. Endothelial activation induces pericyte detachment which promotes the remodeling of the vascular network. The aim of this thesis is to study the mechanisms of endothelial activation during physiological angiogenesis and to evaluate the effects of its inhibition in a context of tumor angiogenesis. In vivo studies in mouse retina and in vitro studies on human endothelial cells showed that VEGF regulates the exocytosis of Weibel-Palade bodies (WPB), cytoplasmic compartments specific for endothelial cells that may contain Ang-2. This work suggests that the exocytosis of WPBs induced by VEGF regulates the secretion of Ang-2 by activated endothelial cells and that secreted Ang-2 regulates the recruitment of pericytes on the vessels. Nucleolin targeting in a pancreatic cancer model inhibited endothelial activation and this inhibition decreased tumor growth and angiogenesis while promoting recruitment of pericytes and normalization of tumor vessels. Vascular normalization induced by the inhibition of endothelial activation via nucleolin targeting may be a promising strategy for the treatment of pathologies associated with dysregulation of angiogenesis, such as cancers or retinopathies.

Non transmis / Not transmitted

Weltweit hat das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) unter den Krebserkrankungen die schlechteste Prognose. Aufgrund der unspezifischen Symptome wird die Erkrankung meist erst in einem lokal fortgeschrittenem Stadium diagnostiziert, wenn eine kurative Tumorresektion nicht mehr möglich ist und es bereits zur Metastasierung gekommen ist. Trotz intensiver klinischer Forschung wird mit bisherigen Therapieansätzen wie zum Beispiel Gemcitabin (auch in Kombination mit nab-Paclitaxel) nur eine geringfügige Verbesserung des medianen Überlebens erzielt. Diese Therapieresistenz gegenüber Gemcitabin wurde in in vitro Versuchen mit verschiedenen humanen PDAC-Zelllinien bestätigt. Die zusätzlich behandelte nichttumorigene Pankreasdukt-Zelllinie HDPE-E6E7 zeigte hingegen eine starke Sensitivität gegenüber dem Chemotherapeutikum. Ursächlich beteiligt an der generellen Resistenz dieser Tumore gegenüber Chemo- und Strahlentherapie sind verschiedene Apoptose-Evasionsmechanismen. Diese sind vor allem durch ein Ungleichgewicht pro- und antiapoptotischer Faktoren bedingt (Lowe 2004). Zusätzlich fördern KRAS-Mutationen, die nahezu universell in allen PDACs vorliegen, die Proliferation der Tumorzellen und unterstützen die Apoptose-Dysregulation durch eine verstärkte Expression antiapoptotischer Proteine. Nach umfangreichen Literaturrecherchen (Werner 2011a, Werner 2011b) wurden verschiedenste PDAC-Zelllinien hinsichtlich ihrer Expression von Apoptose-assoziierten Genen analysiert. Untersucht wurden diesbezüglich verschiedene humane PDAC-Zelllinien, aber auch Primärzellkulturen (PaCaDD-Zellen), die in unserem Labor per Outgrowth-Methode aus Patiententumorgewebe etabliert wurden. Ergänzend wurden murine Zelllinien analysiert, die aus einem genetischen PDAC-Mausmodell (KRASG12D; P53R172H; PDX1 CRE) stammen. Normiert bezüglich der Expression der HDPE-E6E7-Zellen wurde eine vielfältige, sehr heterogene Dysregulation von verschiedenen, mit der Apoptose assoziierten Proteinen festgestellt. Per siRNA-basiertem Knockdown wurden verschiedene Kandidatengene hinsichtlich ihrer funktionellen Bedeutung für die Zellproliferation und Apoptose-Induktion näher charakterisiert. In einem dynamischen Prozess wurde eine multimodale Therapie entwickelt, bei der fünf antiapoptotische Zielgene (BCLXL, FLIP, MCL1L, SURVIVIN und XIAP) kombiniert mit KRAS als zentralem Onkogen simultan in ihrer Expression inhibiert wurden. Ziel war es, hierdurch sowohl die extrinsische als auch intrinsische Apoptose zu normalisieren und eine möglicherweise durch Caspase-Inhibitoren blockierte Signaltransduktion zu ermöglichen. Ein zusätzlicher Knockdown von KRAS sollte einer Gegenregulierung dieser Therapie vorbeugen und die gesteigerte Proliferation der Tumorzellen unterbinden. Dieser so genannte SGS6-Therapieansatz zeigte in vitro in allen fünf getesteten humanen sowie in zwei murinen Zelllinien eine starke Apoptose-Induktion und Verminderung der Zellzahl. Durch Zweit-siRNAs wurde die spezifische Wirksamkeit der Knockdowns bestätigt und zelluläre off-target-Effekte wurden ausgeschlossen. Auch in vivo wurde in einem subkutanen Allograftmodell mit dem SGS6-Therapiekonzept eine starke Tumorreduktion erzielt. Die analoge Untersuchung der nichttumorösen Pankreasdukt-Zelllinie HDPE-E6E7 zeigte, dass die SGS6-Therapie deutlich spezifischer für die Krebszellen war verglichen zur Behandlung mit Gemcitabin.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal form of cancerwith very few available treatment options of which none has great effect.Cancer cells and stromal cells such as stellate cells which exist in abundancein PDAC interact by crosstalk, resulting in a tumorigenic collective response.With the help of a previously developed 3D co-culture spheroid model theeffect of a CRISPR/cas9 knockout of the cellular communication cetworkfactor 1 (CCN1) gene together with gemcitabine (GEM) treatment has beeninvestigated in terms of Panc1 cell viability and gene expression. Spheroidsconsisting of wild-type and knockout cell lines, each identified by westernblots were cultured, imaged and treated. Viability assays and RNA extractionfollowed by PCR showed that the viability of the cancer cells in the spheroidswere higher for the cells with CCN1 knockout. Cancer cells were also coculturedwith stellate cells with the goal of investigating the effect of thecellular crosstalk on chemoresistance. / Pankreatisk duktal adenokarcinom (PDAC)  är en ytterst dödlig form av cancermed få tillgängliga behandlingsalternativ, varav ingen är särskilt effektiv.Cancerceller och stromala celler så som de stellatceller som rikligt förekommeri PDAC interagerar med varandra genom överhörning, vilket leder till en effektsom hjälper tumören att proliferera. Effekten av en CRISPR/cas9 knockoutav genen CCN1 tillsammans med behandling med gemcitabin vad gällercellviabilitet och genuttryck studerades med hjälp av en tidigare utveckladfleratig sfäroidmodell. Sfäroider, bestående av vildtypceller och knockoutcellerlinjersom identifierades med western blots, odlades, fotades och behandlades.Viabilitetstester och extraktion av RNA följt av PCR visade att viabilitetenav cancerceller i sfäroiderna var högre för de celler som var knockout.Cancerceller samodlades även med stellatceller med målet att undersökaeffekten av cellernas överhörning på motståndet mot kemoterapi.

Im Vergleich zu anderen Krebsentitäten, konnten Patienten mit PDAC bisher kaum von Therapieerfolgen der Präzisionsmedizin profitieren. Um diese Problematik zu adressieren, habe ich eine umfassende molekularbiologische Studie durchgeführt, um prädiktive Biomarker zu identifizieren und die Risikostratifizierung der Patienten zu verfeinern. Mittels gen-spezifischer Sequenzierung und gezielter RNA-Expressionsanalyse wurden 293 R0-resezierte Patienten aus einer multizentrischen Phase-III-Studie untersucht. Ziel der klinischen Studie war der Vergleich von adjuvanter Chemotherapie mit Gemcitabin entweder mit oder ohne Zusatz von Erlotinib. Für meine Arbeit wurden die Patientenproben unter Verwendung einer nicht-negativen Matrixfaktorisierung (NMF) basierend auf ihren Einzelnukleotidvarianten (SNV) und ihren Kopienzahlveränderungen (CNA) gruppiert und auf klinische und molekularbiologische Unterschiede untersucht. Um die biologischen Hintergründe der identifizierten genetischen Besonderheiten zu verstehen, wurden anschließend Zelllinien genetisch modifiziert und in vitro modelliert. Es wurden 1086 SNVs und 4157 CNAs identifiziert. Dabei wiesen 99% aller Patienten mindestens eine genetische Veränderung auf, mit durchschnittlich 18 Aberrationen pro Patient. In Übereinstimmung mit früheren Berichten waren KRAS, TP53, CDKN2A und SMAD4 die am häufigsten betroffenen Gene. Alterationen in diesen Genen konnten in 63-93 % der Fälle nachgewiesen werden. Basierend darauf konnte ich fünf Patientengruppen identifizieren die sich in ihren biologischen Charakteristika unterscheiden und Angriffspunkte für gezielte Therapien bieten. Mittels NMF wurden zudem SMAD4alt MAPK9low als prognostische Biomarker für Erlotinib identifiziert. Anschließende in vitro Experimente zeigten, dass dies nicht auf eine Erhöhung der Erlotinib-Zelltoxizität zurückzuführen ist. Zuletzt definiere ich einen prognostischen Score der genutzt werden kann um das Überleben von R0-resizierten PDAC Patienten abzuschätzen. / In contrast to other cancer entities, PDAC patients have not benefited from recent improvements in precision medicine. To address this gap, I embarked on a comprehensive molecular study to identify predictive biomarkers and refine risk stratification. I performed targeted sequencing and targeted RNA expression analysis of 293 R0-resected patients from a multicenter phase III trial comparing adjuvant chemotherapy of gemcitabine with or without erlotinib. Patients were clustered using non-negative matrix factorization (NMF) based on their single nucleotide variant (SNV) and copy number alteration (CNA) statuses. Overall (OS) and disease-free survival (DFS) were analysed with the multivariate cox hazard and log rank tests. Finally, using a method based on CRISPR/Cas, findings from the patient cohort where modeled in vitro to assess their biological backgrounds. A total of 1,086 SNVs and 4,157 CNAs were found with at least one genetic alteration in 99% of all patients, and an average of 18 aberrations per patient. In line with previous reports, KRAS, TP53, CDKN2A, and SMAD4 were the most frequently affected genes, detected in 63–93 % of cases. In this thesis, I identified five biologically distinct patient subgroups with different actionable lesions that may serve for refined PDAC classification and tailored treatment approaches. NMF based clustering and subsequent differential expression analysis revealed SMAD4alt (SNV and/or CAN in SMAD4) MAPK9low (MAPK9 expression below median) as prognostic erlotinib biomarker. Modeling of SMAD4alt MAPK9low status in vitro showed that the effect is not based on increased erlotinib toxicity. Finally, I proposed a genetic risk score for prognostic evaluation of newly diagnosed R0-resected PDAC patients.

L'hétérogénéité de l'adénocarcinome canalaire pancréatique (ADCP) est l'obstacle majeur au traitement efficace des patients. En effet, les caractéristiques cliniques et la sensibilité aux traitements sont associés à un phénotype donné et sont plutôt régis à un niveau transcriptomique. Nous avons donc analysé le transcriptome de xénogreffes provenant des patients (Patients Derived Xenografts : PDX) lors des biopsies de tumeurs ou de pièces chirurgicales. Après extraction d’ARN, nous avons trouvé une signature moléculaire capable de diviser les patients en deux groupes, en fonction de leur survie. Nous avons également montré que la réponse autraitement pouvait être prédite par l‘analyse transcriptomique. Nous avons ensuite analysé les tumeurs et leurs stromas, et mis en évidence deux soustypesde stromas et deux sous-types de tumeurs, définis par la transcriptomique basée sur l'ARN, ou la méthylation de l'ADN. Nous avons étudié la réponse aux traitements administrés seuls ou en combinaison avec des chimiothérapies de routine. Nous avons mis en évidence des sous-groupes de patients plus chimiosensibles à certains traitements. Tous ces résultats sont encourageants,mais pas encore applicables en pratique clinique. Nous développons maintenant les organoïdes, véritable représentation de la tumeur en 3dimensions. Contrairement aux PDX, les organoïdes nous permettent d'obtenir des résultats rapidement exploitables. Nous pensons que dans un avenir proche, le traitement des cancers du pancréas sera précédé d'une caractérisation moléculaire étendue afin de sélectionner les traitements les plus appropriés et de pouvoir enfin proposer une médecine personnalisée. / Heterogeneity of Pancreatic Ductal AdenoCarcinoma (PDAC) has become the majorimpediment to the effective treatment of patients. Clinical outcome and sensitivity to treatments are associated with a given phenotype and associated at a transcriptomic level. Recent data indicate that studying the expressionof a selected gene set could inform selection of the most appropriate treatments.We areoptimizing this approach by analysing transcriptome of Patient-Derived Xenografts (PDX)from surgical as well as endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration (EUS-FNA)biopsies of tumors, as a source of RNA. We have found a molecularsignature capable of dividing patients into two groups, function of theirsurvival.Independently, we have shown that treatment response pattern can also be foundat a transcriptomic level. We thenanalysed tumors and their stromas, and have found two sub-types of stromas and two sub-types of tumors. These wereindinstinctly defined by RNAseq-based transcriptomics, or DNA methylation. We also studied response to treatments administered alone or incombination to routine chemotherapies. All these results are encouraging, but not yetapplicable in clinical pratice. We are now developing the PDAC Biopsy DerivedPancreatic Cancer Organoids (BDPCO): BDPCO culture represents an excellent source of “exvivo” material. Unlike PDX, which take many months to grow, BDPCO allow us to obtainexploitable material rapidly useful for clinical application. We are convinced that in the near future, the treatment ofpancreatic cancers will be preceded by an extensive molecular characterization of cancercells in order to select the most appropriate treatments.

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With a five-year survival rate of less than 5%, pancreatic cancer is one of the deadliest cancers. The most common activating mutations in pancreatic cancer are found in the KRAS gene, causing a constitutively-active KRAS protein in approximately 90% of pancreatic ductal adenocarcinomas (PDAC). PDAC-derived cell lines that harbor oncogenic KRAS mutations can be divided into two classes, KRAS dependent (or addicted) cells and KRAS independent cells. Oncogene dependency (or addiction) is a phenomenon where tu-mors require sustained activity of a single aberrantly activated gene despite the accumulation of multiple oncogenic lesions. In the case of PDAC, the single aberrantly activated gene is KRAS. KRAS independent cells have acquired various other oncogenic lesions that confer alternative cell survival signaling pathways to bypass oncogenic KRAS dependency. The Spleen Tyrosine Kinase (Syk) is highly expressed in KRAS dependent cells, while KRAS independent cells have low Syk expression. This pattern suggests that in KRAS dependent cells, constitutively active KRAS and Syk play a role in stimulating pro-survival pathways. One of these pro-survival pathways is known as mTORC1, which causes increased anabolic processes like protein and lipid synthesis. Accordingly, mTORC1 causes suppression of catabolic processes like autophagy. The net effect is in-creased cellular growth and proliferation. However, mTORC1 inhibitors have limited clinical efficacy, and potential therapeutic targets upstream of mTORC1 have drawn interest. Syk is a non-receptor tyrosine kinase that is an upstream activator of the mTORC1 pathway in hematopoietic malignancies. Through Syk inhibition studies using the small molecule PRT062607 (SYKi), we demonstrated that Syk is also involved in activating the mTORC1 pathway in KRAS dependent PDAC cells. However, the mechanism by which Syk-mediated activation of mTORC1 occurs is currently unknown. Moreover, it is unclear whether SYK kinase activity is required for the activation of the mTORC1 pathway. To address this issue, we introduced a single nucleotide mutation in the kinase do-main of Syk to render it kinase-inactive and found that Syk requires its kinase function to activate mTORC1. Studies using Syki also revealed that mTORC1 activity was also inhibited in KRAS independent PDAC cells that lack significant Syk expression. Interestingly, substrate specificity studies indicate that Syki also binds to and inhibits structurally similar protein tyrosine kinases such as the SRC Family Kinases (SFKs). Therefore, we designed an experiment to look for Syk and SFK cooperativity in regards to mTORC1 activation in PDAC cells. Our results indicate that the SFKs, Yes1 and Src display the most significant cooperative effect with Syk in activating the mTORC1 pathway. Src and Yes1 may even be involved in the upstream activation of Syk. To establish the physiological significance of Syk signaling in pancreatic cancer, it is important to establish model organisms that could be used for future studies. Thus, we test-ed Syk expression and function in PDAC cell lines derived from genetically-engineered mouse models (GEMM), which develop pancreatic cancer via oncogenic mutations in KRAS and TP53. We found that Syk is indeed expressed in murine PDAC cell lines and that the use of Syki in the murine PDAC cell lines results in decreased mTORC1 activity. These results recapitulate those obtained in human KRAS dependent PDAC cell lines. In summary, our studies show that Syk is a key regulator of mTORC1 signaling in human and mouse-derived pancreatic cancer cells. Syk kinase activity is required for mTORC1 activation. Finally, SFKs cooperate with Syk to promote robust mTORC1 activation. The mechanisms of SFK and Syk cooperativity in mTORC1 pathway activation will require further investigation. Additionally, our findings provide a strong rationale to study the effects of Syk kinase inhibition in physiologically-relevant murine models of pancreatic cancer. / 2021-06-08T00:00:00Z

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