Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2018-04-24T12:44:41Z No. of bitstreams: 1 KARINA_VIDARTE_GASPARY_DIS.pdf: 1111674 bytes, checksum: e2b2dc4b1b1eea8b10007b7c07f592ec (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2018-05-11T17:57:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KARINA_VIDARTE_GASPARY_DIS.pdf: 1111674 bytes, checksum: e2b2dc4b1b1eea8b10007b7c07f592ec (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-11T18:03:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KARINA_VIDARTE_GASPARY_DIS.pdf: 1111674 bytes, checksum: e2b2dc4b1b1eea8b10007b7c07f592ec (MD5) Previous issue date: 2018-02-08 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Memory and learning allow animals to adapt and modify their behavior towards new experiences. Some factors may result in memory deficits such as: neurodegenerative diseases, changes due to intoxication and the use of drugs. Zebrafish can be used to model complex human behavioral traits such as learning and memory. This study aims to establish a protocol for evaluating the object recognition memory or object location tasks in zebrafish. We evaluated novel object recognition memory and analyzed the exploration time of novel and familiar objects in the training and test sessions. There was a preference of the animal to explore the new object in comparison to the familiar object (61% of exploration time). We also evaluated the object location task and measured the exploration time of each object in the familiar and novel object locations. There was a preference of the animal to explore the object in the novel location in comparison to the object in the familiar location (63% of exploration time). We also evaluated the effect of the non-competitive NMDA receptor antagonist MK-801 on the object recognition and object location memory in zebrafish. In this regimen treatment, control (water only) and treated animals (5 ?M MK-801) presented a significant preference in exploring the familiar object in comparison to the new object (66 and 68% of exploration time, respectively); however, 10 ?M MK-801-treated animals did not show differences in the exploration time of the objects. In the object location task, the animals treated with the 5 or 10 ?M MK-801 did not show a significant preference for the familiar or novel location whereas the control group had a higher preference in exploring the object in the familiar location (64% of exploration time). Therefore, it is possible to suggest that 5 ?M MK-801 impaired the memory formation in an object location task, which is in agreement with previous studies demonstrating the cognitive deficit induced by MK-801 treatment in aversive and spatial memory. Considering the different responses of the control group between original task and in the regimen treatment, we evaluated the impact of habituation on cortisol levels of animals in three different protocols: 1) habituated at the experiment apparatus for 3 days (Condition 1 ? C1), 2) habituated at the experiment apparatus for 3 days plus treatment tank exposure at fourth day (Condition 2 - C2), 3) habituated at the treatment tank exposure and experiment apparatus for 3 days and exposed to treatment tank again at fourth day (Condition 3 ? C3). The results showed higher levels of cortisol in animals submitted to C2 and C3 conditions compared to animals submitted to C1. These results demonstrated that the animals submitted to treatment tank exposure have a different performance in object recognition and object location memory due to stress responses. Therefore, these tasks are prone to evaluate memory in physiological and pathological conditions, but its use is limited to perform pharmacological studies due to sensitivity to stress caused by manipulation. / A mem?ria permite que os animais possam adaptar e modificar seu comportamento diante de novas experi?ncias. Uma s?rie de fatores pode resultar num d?ficit de mem?ria como: doen?as neurodegenerativas, altera??es decorrentes de intoxica??es e uso de f?rmacos. O peixe-zebra vem sendo usado para modelar caracter?sticas comportamentais humanas complexas, como o aprendizado e mem?ria. Este estudo tem como objetivo estabelecer um protocolo para avaliar tarefas de mem?ria de reconhecimento de objetos ou de localiza??o de objetos no peixe-zebra. N?s avaliamos a mem?ria de reconhecimento de objeto novo e analisamos o tempo de explora??o de objetos novos e familiares nas sess?es de treino e teste. Houve uma prefer?ncia do animal em explorar o novo objeto em compara??o com o objeto familiar (61% do tempo de explora??o). Tamb?m avaliamos a tarefa de localiza??o de objeto e medimos o tempo de explora??o de cada objeto nos locais familiares e novos. Houve uma prefer?ncia do animal para explorar o objeto na localiza??o nova em compara??o com o objeto na localiza??o familiar (63% do tempo de explora??o). Tamb?m avaliamos o efeito do antagonista n?o competitivo do receptor NMDA MK-801 na mem?ria de reconhecimento de objeto novo e na localiza??o de objeto em peixe-zebra. Neste tratamento, o controle (somente ?gua) e os animais tratados (MK-801 5 ?M) apresentaram uma prefer?ncia significativa na explora??o do objeto familiar em compara??o com o novo objeto (66 e 68% do tempo de explora??o, respectivamente); no entanto, animais tratados com MK-801 10 ?M n?o mostraram diferen?as no tempo de explora??o dos objetos. Na tarefa de localiza??o de objeto, os animais tratados com MK-801 5 ou 10 ?M n?o mostraram prefer?ncia significativa pelo objeto na localiza??o familiar ou nova, enquanto que o grupo controle teve uma prefer?ncia maior em explorar o objeto na localiza??o familiar (64% de tempo de explora??o). Portanto, sugere-se que o MK-801 5 ?M prejudicou a forma??o da mem?ria em uma tarefa de localiza??o de objeto, o que est? de acordo com estudos pr?vios, demonstrando o d?ficit cognitivo induzido pelo MK-801 em mem?rias aversivas ou espaciais. Considerando as diferentes respostas do grupo controle entre a tarefa original e no tratamento, avaliamos o impacto da habitua??o nos n?veis de cortisol dos animais em tr?s protocolos diferentes: 1) habituado ao aparato experimental por 3 dias (Condi??o 1 - C1) 2) habituado ao aparato experimental por 3 dias mais a exposi??o ao aqu?rio de tratamento no quarto dia (Condi??o 2 - C2), 3) habituado na exposi??o ao aqu?rio de tratamento e no aparato experimental por 3 dias e exposto ao aqu?rio de tratamento novamente no quarto dia (Condi??o 3 - C3). Os resultados mostraram n?veis mais elevados de cortisol em animais submetidos a condi??es C2 e C3 em compara??o com animais submetidos a C1. Esses resultados demonstraram que os animais submetidos ? exposi??o ao aqu?rio de tratamento apresentam desempenho diferente nas tarefas de mem?ria de reconhecimento de objetos e de localiza??o do objeto devido ao estresse. Portanto, essas tarefas s?o adequadas para avaliar a mem?ria em condi??es fisiol?gicas e patol?gicas, mas seu uso ? limitado em estudos farmacol?gicos devido ? sensibilidade ao estresse causado pela manipula??o.

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, afetando em média 2-3% dos indivíduos com idade superior a 65 anos. Além dos sintomas motores altamente debilitantes, os sintomas não-motores podem preceder em muitos anos o aparecimento dos sintomas motores, podendo caracterizar uma fase prodrômica da DP. Uma potencial estratégia farmacológica é a introdução de agentes neuroprotetores no estágio inicial da doença, a fim de prevenir a morte neuronal decorrente do progresso da neurodegeneração. A N-acetilcisteína (NAC) é um antioxidante, anti-inflamatório e modulador glutamatérgico que mostrou vários benefícios terapêuticos em transtornos psiquiátricos. Neste estudo, foi avaliado o efeito da NAC na prevenção dos danos induzidos por 6-Hidroxidopamina (6-OHDA) sobre parâmetros motores, cognitivos e morfológicos em um modelo de DP em larvas de peixes-zebra. Nossos resultados mostraram que NAC foi capaz de prevenir os déficits motores e cognitivos e as alterações morfológicas causadas pela exposição a 6-OHDA, o que reforça a relevância de seus efeitos neuroprotetores. Por atuar em diferentes alvos relevantes na fisiopatologia da DP, NAC é um potencial candidato para prevenção e tratamento de DP. / Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder, affecting on average 2-3% of the individuals older than 65 years. In addition to its highly debilitating motor symptoms, non-motor symptoms may precede by many years their motor counterparts, which may characterize a prodromal phase of PD. A potential pharmacological strategy is to introduce neuroprotective agents at an earlier stage in order to prevent further neuronal death. N-acetylcysteine (NAC) is an antioxidant, anti-inflammatory and glutamatergic modulator that has shown various therapeutic benefits in brain disorders. In this study, it was evaluated the effect of NAC to prevent the damage induced by 6-OHDA on motor, cognitive and morphological parameters in a PD model in larval zebrafish. NAC was able to prevent the motor and cognitive deficits and morphological alterations caused by exposure to 6-OHDA, which reinforce the relevance of its neuroprotective effects. By acting on different relevant targets in the pathophysiology of PD, NAC is a potential candidate for prevention and treatment of PD.

O consumo desenfreado de etanol traz consequências negativas, que envolvem problemas fisiopatológicos e de socialização do indivíduo, além de questões de saúde pública. Seu consumo por mulheres grávidas acarreta em danos ao desenvolvimento e formação cerebral do feto, causando a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF). Uma forma mais abrangente deste distúrbio é a FASD (Fetal Alcohol Spectrum Disorder), que inclui formas brandas de SAF, bem como qualquer desordem neurológica ou congênita em decorrência do etanol. O objetivo do estudo é avaliar as alterações comportamentais e neuroquímicas em peixezebra adulto após a exposição a diferentes concentrações de etanol na fase inicial do seu desenvolvimento. Para a indução desta desordem, utilizamos ovos de peixe-zebra com 24h pós-fertilização, expostos a diferentes concentrações de etanol: 0%, 0,1%, 0,25%, 0,5% e 1%, durante duas horas. Acompanhamos o desenvolvimento destes animais até a fase adulta (4 meses), onde foram realizadas diferentes tarefas comportamentais: exploração do aparato novel tank e interação social, além de captação de glutamato, como medida neuroquímica. Como resultados mais relevantes, destacam-se a exploração de todo o aparato pelo grupo controle e uma diminuição concentração-dependente da exploração pelos grupos expostos previamente ao etanol; maior permanência no fundo do novel tank nas concentrações elevadas de etanol; uma diminuição concentração-dependente do tempo de permanência próximo ao cardume de acordo com o aumento da concentração de etanol. Quanto às análises bioquímicas, a captação de glutamato mostrou uma diminuição significativa na função de transporte deste neurotransmissor nos animais tratados com concentrações mais elevadas de etanol. A posterior intervenção farmacológica com buspirona reverteu o perfil comportamental previamente observado pelo efeito do etanol. Considerando as análises bioquímicas, a captação de glutamato mostrou uma diminuição significativa na função de transporte deste neurotransmissor nos animais tratados com concentrações intermediárias (0.25 e 0,5%)de etanol. Concluímos que a exposição prévia a diferentes concentrações de etanol na fase embrionária leva a alterações comportamentais na fase adulta, tais como diminuição de exploração frente a novidades, ansiedade e diminuição de interação social. / The excessive consumption of ethanol has negative consequences, which involve pathophysiological and individual socialization issues, and public health issues. Its consumption by pregnant women causes damage to brain development and formation of the fetus, causing fetal alcohol syndrome (FAS). A broader form of this disorder is the FASD (Fetal Alcohol Spectrum Disorder), which includes milder forms of FAS, as well as any neurological disorder or congenital due to ethanol. This project proposes to assess the behavioral and neurochemical alterations in adult zebrafish after exposure to different concentrations of ethanol in the initial phase of its development. To induce this disorder, we use zebrafish eggs and 24h post-fertilization exposed to different concentrations of ethanol, 0%, 0.1%, 0.25%, 0.5% and 1%, for two hours. We observed the development of these animals to juvenile and adulthood, which will be performed different behavioral tasks: exploration of novel apparatus tank and social interaction, as well as glutamate uptake, as measured neurochemistry. Among the most relevant results, we highlight the exploration of the whole apparatus for the control group and a concentration-dependent decrease of exploration by groups previously exposed to ethanol. It was observed high time spent in the bottom of the novel tank in high concentrations of ethanol. Furthermore, elevated spend time close to social interaction chamber was observed, with a dose-dependent decrease of this time in accordance with the increase of ethanol concentration. Further pharmacological intervention with buspirone reversed the behavioral profile previously observed the effect of ethanol. Considering biochemical analysis, glutamate uptake showed a significant decrease in the transport function of this neurotransmitter in animals treated with intermediated doses of ethanol. We conclude that prior exposure to different concentrations of ethanol in infancy leads to behavioral changes in adulthood, such as decreased operating front the news, anxiety and decreased social interaction.

Orientador: Renata Fracácio Francisco / Abstract: Metals are known for their toxic potential to the aquatic environment, as well as being bioaccumulative and persistent elements, which increases the concern with the concentration allowed by legislation, considering protection of biota Often, these compounds are released in the water bodies in concentrations which may not cause acute effects but may compromise the viability of biological systems in the long term, considering the continuous exposure to said elements and concentrations. In this context, liver is an important organ for the evaluation of metals toxicity due to its function of excretion and its potential to accumulate exogenous substances. In gonads metals can trigger disturbances in the production, release, transport, metabolism and action of natural hormones, which can lead to fecundity loss, males feminization and consequently imbalance to living organisms, compromising the viability of the species. Exogenous substances that act in this way are known as endocrine disrupters and their influences on individual organisms and aquatic life are not well established. One ways to identify them is through histological and histochemical analysis. Metals copper and nickel originate from natural and also artificial sources due to the generation of domestic and industrial waste, depending on the anthropic activities. They can be considered toxic or essential depending on the organism, the environment and its concentrations. In addition, they have the potential to be endocri... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Os metais são conhecidos pelo seu potencial tóxico ao ambiente aquático, além de serem elementos bioacumulativos e persistentes, o que aumenta a preocupação com a concentração permitida pela legislação, considerando-se proteção da biota Muitas vezes, estes compostos são liberados nos corpos hídricos em concentrações subletais as quais não provocam efeitos agudo, mas , podem comprometer a viabilidade dos sistemas biológicos a longo prazo, considerando-se a contínua exposição aos referidos elementos e concentrações Nesse contexto, fígado é um importante órgão para avaliação da toxicidade de metais devido a sua função de excreção e seu potencial para acumular substâncias exógenas. Nas gônadas os metais podem desencadear perturbações na produção, liberação, transporte, metabolismo e ação dos hormônios naturais, que podem levar a perda de fecundidade, feminização de machos e consequentemente desequilíbrio aos organismos vivos, comprometendo a viabilidade das espécies. Substâncias exógenas que atuam dessa maneira são conhecidos como interferentes endócrinos e suas influências sobre os organismos individualmente e a vida aquática ainda não são bem estabelecidos. Uma das maneiras de identificá-los é através de análises em nível histológico e histoquímico. Os metais cobre e níquel originam-se de fontes naturais e também artificiais devido a geração de resíduos domésticos e industriais, em função das atividades antrópicas. Podem ser considerados tóxicos ou essenciais dependendo do orga... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O conteúdo de zinco (Zn) reativo cerebral é importante para o equilíbrio da sinaptofisiologia neural. A prova disto é que um aumento nos seus níveis, após evento hipóxico-isquêmico, resulta em neurotoxicidade, o que tem estimulado o tratamento desta disfunção cerebral com quelantes de Zn, tal como o dietilditiocarabamato (DEDTC). No caso do DEDTC, o uso deste composto sobre esta disfunção deve ser analisado com cuidado, pois ele também apresenta muitos efeitos colaterais sobre o sistema nervoso central. Desta forma, para atender este propósito, é necessário antes obter uma concentração de DEDTC com menores efeitos colaterais. Por esta razão, no presente trabalho, nós decidimos usar um modelo vertebrado mais simples, tal como o peixe-zebra, o qual permitiria a triagem, em larga escala, dos efeitos de DEDTC sobre o Zn reativo. Entretanto, jamais foi mostrada a presença de Zn reativo no cérebro de peixe-zebra. Com isto, através de marcações histológicas, nós conseguimos mostrar pela primeira vez a distribuição citoarquitectônica de Zn reativo em neurônios glutamatérgicos, bem como o número desses neurônios contendo Zn no cérebro de peixe-zebra. Isto nos permitiu avaliar o efeito de diferentes concentrações de DEDTC sobre o conteúdo de Zn cerebral do peixe-zebra, o qual foi intensamente quelado por elevadas quantidades do composto, induzindo comportamentos tipo-crise. Neste mesmo estudo nós obtemos também uma concentração de DEDTC com poucos efeitos colaterais que poderia exercer neuroproteção sobre o aumento de Zn reativo induzido pela hipóxia-isquemia. Assim, após a padronização de um modelo de hipóxia em peixe-zebra, que demonstra danos relacionados à isquemia, nós testamos se essa concentração de DEDTC poderia ser neuroprotetora sobre este modelo. Contudo, DEDTC apresentou efeitos pró-oxidantes, embora ele tenha atenuado o elevado conteúdo de Zn reativo induzido pela hipóxia. Portanto, mesmo que o DEDTC tenha falhado, este modelo, agora, está apto para a triagem de outros fármacos com potencial ação sobre o alterado conteúdo de Zn reativo que ocorre em eventos hipóxicos-isquêmicos. / The content of brain reactive zinc (Zn) is important for the synaptophysiology in the central nervous system (CNS). This is evidenced in hypoxic-ischemic events, when an increase in their levels results in neurotoxicity. Consequently, this has stimulated the treatment of cerebral ischemia with Zn chelators, such as diethyldithiocarbamate (DEDTC). In the case of DEDTC, the use of this compound in this dysfunction should be examined carefully, because it also has many side effects on the (CNS). Thus, to meet this, it is necessary first to obtain a concentration of DEDTC with negligible side effects. Here, we decided to use a simpler vertebrate model, such as zebrafish, which would allow large-scale screening of DEDTC effects on reactive Zn. However, the presence of reactive Zn has never been shown in zebrafish brain. Then, using histological markers, we were able to show for the first time the cytoarchitectonic distribution of reactive Zn in glutamatergic neurons as well as the number of these neurons containing Zn in the zebrafish brain. This allowed us to evaluate the effect of different DEDTC concentrations on the brain content of Zn in zebrafish. As a result, high levels of the compound did strongly chelate the metal, inducing seizure-like behaviors. In this study we also obtained a DEDTC concentration with few side effects that could exert neuroprotection on the increased reactive Zn induced by hypoxia-ischemia. Then, after the standardization of an ischemic-sensitive model of hypoxia in zebrafish, we tested if this DEDTC concentration could be neuroprotective on this model. Nevertheless, DEDTC showed pro-oxidant effects, though it had mitigated the elevated content of reactive Zn induced hypoxia. Therefore, despite the DEDTC have failed as neuroprotective drug, this model enables the screening of other chemical agents with potential action on the increased content of reactive Zn that occurs in hypoxic-ischemic events.

Orientador: Renata Fracácio Francisco / Resumo: Chemicals with potential to cause endocrine disruption in vertebrates and invertebrates have been detected at low concentrations in the world's aquatic environments. Therefore, the search for removal methodologies in aquatic environments became a worldwide interest. The aim of this research was to investigate three materials (powered activated carbon - PAC, powered natural zeolites - ZP and aquatic humic substances - AHS) in chemical and ecotoxicological remediation of 17ß-estradiol (E2) and 17α-ethinylestradiol (EE2) in water through chemical and biological tests in vitro and in vivo. An environmentally relevant concentration of hormones (30 ng.L-1) was used during laboratory tests. The results obtained through an extensive list of morphological, reproductive and histological parameters showed the significant impact of HSFs on the development and maintenance of exposed fish. The superior efficiency of PAC was verified in relation to the other substrates in the endocrine disrupting chemicals (EDCs) removal in water. Nevertheless, their properties did not guarantee the same performance to the environmental samples, neither allow biological injuries monitored to be recovered after the period of depuration investigated. An additional study also allowed the development of a histochemical protocol capable of identifying the production of vitellogenin (VTG) prompted by exposure to the synthetic steroid EE2. / Doutor

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, afetando em média 2-3% dos indivíduos com idade superior a 65 anos. Além dos sintomas motores altamente debilitantes, os sintomas não-motores podem preceder em muitos anos o aparecimento dos sintomas motores, podendo caracterizar uma fase prodrômica da DP. Uma potencial estratégia farmacológica é a introdução de agentes neuroprotetores no estágio inicial da doença, a fim de prevenir a morte neuronal decorrente do progresso da neurodegeneração. A N-acetilcisteína (NAC) é um antioxidante, anti-inflamatório e modulador glutamatérgico que mostrou vários benefícios terapêuticos em transtornos psiquiátricos. Neste estudo, foi avaliado o efeito da NAC na prevenção dos danos induzidos por 6-Hidroxidopamina (6-OHDA) sobre parâmetros motores, cognitivos e morfológicos em um modelo de DP em larvas de peixes-zebra. Nossos resultados mostraram que NAC foi capaz de prevenir os déficits motores e cognitivos e as alterações morfológicas causadas pela exposição a 6-OHDA, o que reforça a relevância de seus efeitos neuroprotetores. Por atuar em diferentes alvos relevantes na fisiopatologia da DP, NAC é um potencial candidato para prevenção e tratamento de DP. / Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder, affecting on average 2-3% of the individuals older than 65 years. In addition to its highly debilitating motor symptoms, non-motor symptoms may precede by many years their motor counterparts, which may characterize a prodromal phase of PD. A potential pharmacological strategy is to introduce neuroprotective agents at an earlier stage in order to prevent further neuronal death. N-acetylcysteine (NAC) is an antioxidant, anti-inflammatory and glutamatergic modulator that has shown various therapeutic benefits in brain disorders. In this study, it was evaluated the effect of NAC to prevent the damage induced by 6-OHDA on motor, cognitive and morphological parameters in a PD model in larval zebrafish. NAC was able to prevent the motor and cognitive deficits and morphological alterations caused by exposure to 6-OHDA, which reinforce the relevance of its neuroprotective effects. By acting on different relevant targets in the pathophysiology of PD, NAC is a potential candidate for prevention and treatment of PD.

O zebrafish (Danio rerio) é uma espécie utilizada como modelo experimental em diversas áreas, tais como neurociências toxicologia. Seu genoma já está praticamente sequenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares aos de mamíferos. Além disso, o zebrafish é um excelente modelo para estudar a função de diferentes sistemas de neurotransmissão. O consumo do etanol exerce diversas mudanças na coordenação motora, percepção sensorial e cognição promovendo um amplo espectro de alterações bioquímicas e fisiológicas nas células nervosas. Aqui, nós investigamos o efeito promovido pela exposição crônica de etanol nos sistemas purinérgico e glutamatérgico, e níveis de BDNF no SNC de zebrafish. Os transportadores de alta afinidade de aminoácidos (EAAT) regulam os níveis extracelulares de glutamato. Nós identificamos e descrevemos o padrão de expressão dos genes relacionados aos transportadores e as propriedades de captação de glutamato nas três importantes estruturas cerebrais de zebrafish (telencéfalo, tecto óptico e cerebelo). As pesquisas nos bancos de dados do seu genoma através de análise filogenética confirmaram a presença de diversos EAATs (EAAT2, EAAT3, três EAAT1 parálogos e duas sequências parálogas para EAAT5). Também, a captação de glutamato dependente de sódio foi significativamente maior no tecto óptico, indicando diferenças funcionais entre as estruturas cerebrais. Os EAATs pertencem à família dos carreadores de soluto 1 (SLC1), que constitui os transportadores de alta afinidade de aminoácidos e transportadores de aminoácidos neutros. Recentemente, foi demonstrada uma análise filogenética e clonagem dos genes SLC1/EAAT identificando distintos membros desta família de transportadores. No sentido de unificar a designação dos genes SLC1/EAAT em zebrafish, foi proposta uma nomenclatura comum para estes grupos. O etanol promoveu uma diminuição significativa na captação de glutamato após 7 e 14 dias de exposição (30% e 54%, respectivamente), enquanto que após 28 dias, não foram observadas alterações. Na,K-ATPase, a enzima responsável pelo controle do gradiente iônico, não teve sua atividade alterada após todos os períodos de exposição testados. Além disso, os peixes expostos ao etanol durante 7 e 14 dias tiveram uma redução nos níveis de mRNA para SLC1A1/EAAT3. Entretanto, a expressão gênica do SLC1A8a,b/EAAT6a,b aumentou após todos os períodos testados, enquanto que SLC1A3a,b/EAAT1b aumentou somente após 28 dias. A prolongada exposição ao etanol não foi capaz de alterar as atividades da glutamina sintetase e glutaminase. Da mesma forma, etanol não alterou a hidrólise de ATP e GTP. Entretanto, foi verificada uma diminuição na hidrólise de ADP (46% e 34%) e GDP (48% e 36%) após 7 e 14 dias respectivamente. Após 7 e 14 dias de exposição ao etanol, também foi observada uma significativa alteração na hidrólise de AMP (48% e 36%), enquanto que a hidrólise de GTP foi inibida somente após 7 dias (46%). Os níveis de transcritos das nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDases) foram alteradas após 7, 14 e 28 dias. Em contraste, a expressão da 5′-nucleotidase não foi alterada. A atividade da adenosina deaminase (ADA) na fração solúvel não foi modificada, mas uma redução da atividade na fração de membrana após 28 dias de exposição ao etanol (44%) foi observada. A análise da expressão gênica demonstrou que ADA1 permaneceu inalterada, enquanto que os transcritos de ADAL, ADA2-2, ADA2-1, e sua isoforma truncada de ―splicing‖ alternativo (ADA2-1/T) foram alteradas após a ação prolongada do etanol. Após 14 e 28 dias, etanol aumentou a expressão gênica do BDNF, mas não alterou os níveis de transcritos para trkB. A determinação da proteína BDNF através dos métodos de ELISA indicou um aumento de (51%), sendo confirmando imunohistioquímicamente. Estes resultados sugerem que a homeostase da função neurotrófica pode ser alterada pelo prolongado consumo de etanol. Esta tembém inclui uma revisão sobre o papel de diferentes neurotransmissores excitatórios e inibitórios em zebrafish, tais como, dopaminérgico, serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, purinérgico, histaminérgico, nitrérgico, glicinérgico, gabaérgico, enfatizando aspectos farmacológicos e toxicológicos. Em suma, esta tese demonstra o efeito da exposição crônica ao etanol afeta o sistema glutamtérgico e purinérgico, expressão de BDNF em cérebro de zebrafish. O aumento do conhecimento global sobre os sistemas de neurotransmisão em zebrafish e o esclarecimento de efeitos farmacológicos e toxicológicos poderia contribuir para novas estratégias de pesquisa em ciências básicas e biomédicas. / The zebrafish (Danio rerio) is a species used as experimental models in various fields such as neurosciences, toxicology. Its genome has already been sequenced and studies have shown that many genes are similar to those of mammals. Furthermore, zebrafish provides an excellent model to study the function of different neurotransmitter systems. The ethanol consumption exerts several changes in motor coordination, sensory perception and cognition, promoting a wide-spectrum of biochemical and physiological alterations on nervous cells. Here we investigated the effects promoted by chronic ethanol exposure on glutamatergic and purinergic systems, and BDNF levels in zebrafish CNS. High-affinity excitatory amino acid transporters (EAATs) regulate extracellular glutamate levels. We identified and described the expression profile of EAATs-related genes and the functional properties of glutamate uptake in three major brain structures from zebrafish (telencephalon, optic tectum and cerebellum). Searches on zebrafish genome databases and a phylogenetic analysis confirmed the presence of several EAAT-related genes (EAAT2, EAAT3, three EAAT1 paralogs and two EAAT5 sequences). Moreover, the glutamate uptake was significantly higher in optic tectum, which indicates functional differences within zebrafish brain structures. EAATs belong to the solute carrier family 1 (SLC1), that constitute high-affinity glutamate and neutral amino acid transporters. Recently, the phylogenetic analysis and cloning reporting of SLC1/EAAT genes from zebrafish identified distinct members of this transporter family. In order to unify the nomenclature of SLC1/EAAT genes in zebrafish, it was proposed a common nomenclature for these groups. The actions of ethanol on glutamate uptake showed a significant decrease in glutamate transport (30% and 54%) after 7 and 14 days of exposure, whereas after 28 days, no significant changes were detected. Na,K-ATPase, the enzyme responsible to generate ion gradients, did not alter after all exposure periods. Moreover, fish exposed to ethanol during 7 and 14 days exhibit a decrease of mRNA levels for SLC1A1/EAAT3. However, the gene expression of SLC1A8a,b/EAAT6a,b increased after all exposure periods, whereas SLC1A3a,b/EAAT1b increased only after 28 days. The prolonged ethanol exposure did not significantly change the glutamine synthetase and glutaminase activities. In the same way, ethanol did not alter the ATP and GTP hydrolysis. However, a decrease in ADP (46% and 34%) and GDP (48% and 36%) hydrolysis was verified after 7 and 14 days, respectively. After 7 and 14 days of ethanol exposure, a significant decrease in AMP hydrolysis (48% and 36%) was also observed, whereas GMP hydrolysis was inhibited only after 7 days (46%). Furthermore, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) transcript levels were altered after 7, 14, and 28 days. In contrast, 5′-nucleotidase expression was not altered. Adenosine deaminase (ADA) activity from soluble fraction was not modified, but a decrease of ADA activity in membrane fraction after 28 days (44%) of ethanol exposure was observed. Gene expression analysis demonstrated that ADA1 remained unaltered, whereas ADAL, ADA2-2, ADA2-1 transcripts, and its truncated alternative splice isoform (ADA2-1/T) were altered after prolonged ethanol exposure. After 14 and 28 days, ethanol increased the BDNF gene expression, but did not change the levels of trkB transcripts. The measurement of BDNF protein through ELISA kit anti-BDNF showed increased amounts after 28 days of exposure (51%), which was also confirmed by immunohistochemstry. These results suggest that the homeostasis of neurotrophic functions may be altered by prolonged ethanol consumption. Moreover, we present a review about the role of different excitatory and inhibitory neurotransmitters systems in zebrafish, such as dopaminergic, serotoninergic, cholinergic, glutamatergic, purinergic, histaminergic, nitrergic, glycinergic, and GABAergic systems, emphasizing pharmacological and toxicological aspects. In conclusion, this thesis demonstrates that chronic ethanol exposure affects the glutamatergic and purinergic systems, and BDNF expression in zebrafish brain. The significant increase in the global knowledge about the neurotransmitters systems in zebrafish and the elucidation of pharmacological and toxicological effects could lead to new strategies and appropriate priorities in research in order to support complementary insights on basic sciences and biomedical research.

A poluição ambiental causada por resíduos de metais tóxicos é muito relevante pelo seu amplo uso em processos industriais e agrícolas, sendo que muitos efluentes chegam ao ambiente aquático sem qualquer tratamento. A contaminação da água com estes poluentes tornaram-se iminentes e, consequentemente efeitos adversos são inevitáveis em humanos, plantas e animais, onde um dos táxons mais atingidos são os peixes. O peixe zebra (Danio rerio) é uma espécie muito utilizada como modelo experimental em diversas áreas, como neurociências e toxicologia. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos da adenina exercem efeitos sinalizadores no espaço extracelular por meio da ativação de receptores específicos. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ectonucleotidases, na qual se destacam as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5'-nucleotidase. Após hidrólise pelas ectonucleotidases, o ATP produz o nucleosídeo adenosina. A adenosina pode ser desaminada pela enzima adenosina desaminase (ADA), gerando inosina. Evidências demonstram que o ATP é coliberado com a acetilcolina em terminais colinérgicos. A acetilcolina é uma molécula transmissora que age nos receptores muscarínicos e nicotínicos e seu catabolismo é promovido pela enzima acetilcolinesterase (AChE). Nosso laboratório já demonstrou a presença de diferentes membros da família das NTPDases e da família da ADA, além de uma ecto-5'-nucleotidase em cérebro de peixe zebra. A presença da enzima AChE também já foi descrita nesta espécie. No capítulo I foi testado o efeito in vitro do zinco e cádmio na atividade da AChE e das ectonucleotidases em cérebro de peixe zebra. Ambos os metais não alteraram a atividade da AChE. A hidrólise de ATP teve um aumento na presença de 1 µM de zinco (17 %) e a hidrólise de AMP teve um aumento dose dependente nas concentrações 0,5 e 1 µM de zinco (188 % e 199 %). Após a exposição a 0,5 e 1 µM de cádmio, a atividade ATPásica foi aumentada significativamente (53 % e 48 %). O cádmio na faixa de 0,25 a 1 µM inibiu a hidrólise de ADP de forma dose-dependente (13,4 - 69 %). A atividade da ecto-5'-nucleotidase foi inibida (38 %) apenas na presença de 1 µM de cádmio. No capítulo II foi investigado o efeito da exposição ao alumínio na atividade da AChE cerebral e em parâmetros comportamentais em peixe zebra. A exposição in vivo a 50 µg/L de AlCl3 durante 96 h a pH 5,8 aumentou significativamente (36 %) a hidrólise de acetiltiocolina em cérebro de peixe zebra. Não foram observadas mudanças na atividade da AChE quando os peixes foram expostos a mesma concentração de AlCl3 em pH 6,8. RT-PCR semi-quantitativo não demonstrou alterações significativas nos níveis de expressão do RNAm do gene da ache em cérebro de peixe zebra. Concentrações in vitro de AlCl3 variando de 50 a 250 µM aumentaram a atividade da AChE (28 a 33 %). Além disso, animais expostos ao AlCl3 em pH 5,8 apresentaram uma diminuição na atividade locomotora, avaliada pelo número de cruzamentos (25 %), distância viajada (14,1 %) e velocidade máxima (24 %). No capítulo III, foi verificado o efeito de metais tóxicos na atividade e expressão da ADA em frações solúveis e de membrana em cérebro de peixe zebra. Dos metais testados, apenas o mercúrio foi capaz de inibir a desaminação da adenosina em ambas as frações in vitro. A inibição foi observada de 5 a 250 µM de HgCl2 (84,6 - 92,6 %) na fração solúvel enquanto nas frações de membrana a inibição variou de 50 a 250 µM (20,9 - 26 %). A exposição in vivo do peixe zebra a 20 µg/L de HgCl2 foi avaliada após exposição aguda (24 h) e subcrônica (96 h). A atividade da ADA na fração solúvel foi inibida após a exposição aguda (24,5%) e subcrônica (40,8%) enquanto que a atividade da ADA na fração de membrana foi inibida somente após a exposição subcrônica (21,9 %). Em contraste, não foram observadas mudanças na expressão dos genes da ADA após os tratamentos. Nossos resultados apresentados demonstraram que as enzimas envolvidas na degradação de nucleotídeos e nucleosídeos (NTPDase, 5'-nucleotidase e ADA) e a acetilcolinesterase são afetadas por metais tóxicos em cérebro de peixe zebra. Além de serem possíveis alvos da neurotoxicidade dos metais, a alteração destas atividades enzimáticas pode ser utilizada como bioindicador da presença ambiental destes poluentes. / The environmental pollution caused by toxic metals is relevant due to its widespread use in industrial and agricultural process, and many effluents enter in the aquatic environment without treatment. The contamination of water by toxic metals has become imminent and, consequently, adverse effects are inevitable in humans, plants, and animals, which fish are one of the most affected taxons. Zebrafish (Danio rerio) is a specie consolidated as a model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. Evidence has show that nucleotides and nucleosides exert signaling effects at the extracellular space by the activation of specific receptors. The inactivation of extracellular ATP signaling is promoted by a family of enzymes named ectonucleotidases, whivh inlude NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5'-nucleotidase. After hydrolysis promoted by ectonucleotidases, ATP forms the nucleoside adenosine. The adenosine could be deaminated by the enzyme adenosine deaminase (ADA). Evidence demonstrates that ATP is coreleased with acetylcholine in cholinergic terminals. Acetylcholine is a transmitter molecule that acts on muscarinic and nicotinic receptors and its catabolism is promoted by acetylcholinesterase (AChE) activity. Our laboratory has already characterized NTPDases, ecto-5'-nucleotidase and ADA activity in zebrafish brain. The AChE activity has been reported in this specie. In chapter I we tested the in vitro effect of zinc and cadmium on AChE and ectonucleotidase (NTPDase and ecto-5-nucleotidase) activities in zebrafish brain. Both zinc and cadmium treatments did not alter significantly the zebrafish brain AChE activity. ATP hydrolysis presented a significant increase at 1 mM zinc (17 %) and the AMPase activity had a dose-dependent increase at 0.5 and 1µM zinc exposure (188 % and 199 %). After cadmium treatment, ATPase activity was significantly increased (53 % and 48 %) at 0.5 and 1 µM, respectively. Cadmium, in the range 0.25-1 µM, inhibited ADP hydrolysis in a dose-dependent manner (13.4-69 %). Ecto-5-nucleotidase activity was only inhibited (38 %) in the presence of 1 µM cadmium. In chapter II we have investigated the effect of aluminum exposure on brain AChE activity and behavior parameters in zebrafish. In vivo exposure of zebrafish to 50 µg/L AlCl3 during 96 h at pH 5.8 significantly increased (36 %) acetylthiocholine hydrolysis in zebrafish brain. There were no changes on AChE activity when fish were exposed to the same concentration of AlCl3 at pH 6.8. Semi-quantitative RT-PCR has not shown significant alterations on the expression levels of ache mRNA gene in zebrafish brain. In vitro concentrations of AlCl3 varying from 50 to 250 µM have increased AChE activity (28 to 33 %, respectively) Moreover, we observed that animals exposed to AlCl3 at pH 5.8 presented a significant decrease in locomotor activity, as evaluated by the number of line crossings (25 %), distance traveled (14.1 %) and maximum speed (24 %). In chapter III we have investigated the effects of toxic metals on soluble and membrane ADA activity and gene expression in zebrafish brain. Regarding the metals tested, only HgCl2 was able to inhibit the adenosine deamination in vitro in both fractions. The inhibition was observed from 5 to 250 µM HgCl2 (84.6 - 92.6 %) in soluble fraction while in membrane fractions the inhibition varied from 50 to 250 µM (20.9 - 26 %). The in vivo exposure of zebrafish to 20 µg/L of HgCl2 was evaluated after acute (24 h) and subchronic (96 h) treatments on ADA activity in soluble and membrane fractions. The ADA activity from soluble fraction was inhibited after both acute (24.5 %) and subchronic (40.8 %) exposures whereas the ADA activity from brain membranes was inhibited only after subchronic exposure (21.9 %). In contrast, semi-quantitative RT-PCR analysis showed that HgCl2 was not able to modulate the ADA gene expression. Our results have show that the enzymes involved in the degradation of nucleotides and nucleosides (NTPDase, 5'-nucleotidase and ADA) and AChE are modulated by toxic metals in zebrafish brain. Besides been a possible target in the neurotoxicity mediated by metals, the alteration of these enzyme activities can be used as bioindicator of the environmental presence of these pollutants.

Este estudo investiga, através de indicadores cienciométricos, as características da produção científica, do impacto e da colaboração de pesquisas com zebrafish (Danio rerio) na ciência brasileira indexada na Web of Science. Os dados de citações foram coletados na Web of Science e os dados do Fator de Impacto dos periódicos no Journal Citation Reports. A colaboração é analisada a partir dos dados de coautoria, criando-se redes a partir da ferramenta VosViewer. O uso do zebrafish como organismo modelo experimental tem alcançado notória importância em pesquisa científica nos últimos anos, constatando-se um crescimento na produção científica no Brasil e no mundo. Identifica que o Rio Grande do Sul é o estado com maior produção e a instituição com maior número de registros é a Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. Identifica crescimento e estabilidade no impacto das citações. A média do Fator de Impacto dos periódicos é mais alta nos trabalhos com coautoria internacional. Constata que 90% dos trabalhos são em colaboração. As instituições brasileiras que apresentam maior número de colaborações são: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Fundação Universidade Federal de Rio Grande e Universidade de São Paulo. / Using scientometric indicators, this study researches the features of scientific production and of researches collaboration and impact about zebrafish (Danio rerio) in Brazilian Science indexed by Web of Science. Citation data were collected in Web of Science and data about Impact Factor from journals in Journal Citation Reports. Collaboration is evaluated according to co-authorship data, creating nets through the tool VosViewer. Zebrafish use as an experimental model organism has been achieving a remarkable importance in recent years and an increase in scientific production could be observed in Brazil and around the world. The state of Rio Grande do Sul is identified as one with the greatest production and the institution with the largest number of registers is Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. We could also point out an increase and stability in citation impact. Journals' average Impact Factor is higher in works with international co-authorship. We are verified that 90% of works are collaborative. And Brazilian institutions presenting the greatest number of collaborations are: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Fundação Universidade Federal de Rio Grande and Universidade de São Paulo.