A doença de Alzheimer é a principal e a mais comum desordem neurodegenerativa relacionada à idade. O número de pessoas afetadas pela doença de Alzheimer vem crescendo bastante nos últimos anos, principalmente devido ao aumento da expectativa de vida da população. As causas para o desenvolvimento da doença de Alzheimer são bastante complexas, envolvendo uma combinação de fatores genéticos, moleculares e ambientais. Os emaranhados neurofibrilares, constituídos pela proteína tau hiperfosforilada, e as placas senis, compostas pelo peptídeo β-amiloide, são as duas principais alterações fisiopatológicas encontradas nessa patologia. Existe uma ampla variedade de evidências genéticas, fisiológicas e bioquímicas que suportam a ideia que o peptídeo β-amiloide é ao menos uma das causas que originam a doença de Alzheimer. Na forma monomérica, o peptídeo β-amiloide parece não exercer efeitos tóxicos. Porém, conforme estas formas monoméricas se polimerizam formando intermediários solúveis denominados oligômeros, e por fim protofibrilas e fibrilas, exercem consideráveis efeitos neurotóxicos. Os oligômeros do peptídeo β-amiloide são capazes de se correlacionar de forma mais consistente com os distúrbios cognitivos observados na doença de Alzheimer. Além disso, diversos trabalhos atribuem às alterações sinápticas um dos principais mecanismos de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β- amiloide. Para isso, diversas vias de sinalização sofrem alteração no seu funcionamento, como a via das MAPKs, destacando as proteínas JNK1/2 e ERK1/2, e a via Wnt/β-catenina. Neste trabalho nós procuramos avaliar os mecanismos moleculares de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β-amiloide em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Para isso, as culturas foram expostas às concentrações de 0,5; 1 e 2 μM por um período de 48h. A morte celular foi avaliada a partir da incorporação do iodeto de propídeo, um marcador de morte celular de células principalmente em processo de necrose. A exposição das culturas a todas as concentrações testadas não foi capaz de causar um aumento significativo na morte celular. Entretanto, observamos um decréscimo nos níveis da proteína sinaptofisina por Western blotting em todas as concentrações utilizadas. Essas alterações nos níveis de sinaptofisina foram acompanhadas pela ativação da proteína JNK, ou seja, pelo aumento da sua fosforilação, e pela inibição da proteína ERK, que teve seus níveis de fosforilação diminuídos. Nós também observamos uma diminuição no imunoconteúdo da proteína β-catenina. A avaliação dos níveis de fosforilação da GSK-3β e β-catenina não apresentou resultado significativo. Embora mais estudos sejam necessários para avaliar os mecanismos de toxicidade dos oligômeros do peptídeo β-amiloide, nossos resultados sugerem uma perda sináptica nas culturas organotípicas, uma das primeiras características observadas na doença de Alzheimer. Acreditamos que esse modelo possa ser utilizado no estudo de fatores fisiológicos e compostos farmacológicos relacionados com a doença de Alzheimer. / Alzheimer’s disease is the principal and the most common neurodegenerative age-related disorder. The number of patients affected by Alzheimer’s disease has increased greatly in recent years, mainly due to increase in life expectancy of the population. The causes for the development of Alzheimer’s disease are quite complex, involving a combination of genetics, molecular, and environmental factors. Neurofibrillary tangles, formed by hyperphosphorylated tau protein, and senile plaques, composed of amyloid-β peptide, are the two major pathological changes found in Alzheimer’s disease. A wide variety of genetic, physiological, and biochemical evidences support the idea that amyloid-β peptide is at least one of the main causes of Alzheimer’s disease. In monomeric form the amyloid-β peptide appears did not exert toxic effects. However, as these monomers polymerize forming soluble intermediates called oligomers, and after protofibrils and fibrils, exert considerable neurotoxic effects. The amyloid-β oligomers peptide are more consistently correlated to cognitive disturbances observed in Alzheimer’s disease. In addition, several works have attributed to synaptic changes a major mechanism of amyloid-β oligomers toxicity. Several signaling pathways become altered in their work due to amyloid-β oligomers, such as MAPK pathway, highlighting JNK1/2 and ERK1/2 proteins, and Wnt/β-catenina. In this work, we evaluated the molecular mechanisms of amyloid-β oligomers toxicity in rat organotypic hippocampal slice cultures. For this purpose, cultures were exposed to concentrations of 0.5, 1, and 2 μM of amyloid-β oligomers for 48h. Cell death was assessed from the incorporation of propidium iodide, a marker of cell that are mainly in the necrosis process death. Exposure of all concentrations tested was not able to induce a significant increase in cell death in cultures. However, a decrease in synaptophysin protein levels by Western blotting occured in all concentrations. These changes in synaptophysin levels were accompanied by JNK activation and ERK inhibition. We also observed a decrease in β-catenin protein immunocontent. The evaluation of GSK-3β and β-catenin phosphorylation showed no significant alterations. Although further studies are necessary for understanding the mechanisms underlying amyloid-β oligomers toxicity, our data suggest synaptic loss in organotypic cultures, one of the earlier characteristics of AD, may be considered a good model to study physiologic factors and pharmacologic compounds AD-related.

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por perda da memória e das demais funções cognitivas. Sua patogenia envolve a produção do peptídeo β-amiloide (Aβ), através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) por β- e γ-secretases (amiloidogênese), e a posterior agregação do Aβ em oligômeros e/ou fibrilas. A toxicidade do Aβ tem sido associada a diversos mecanismos, a incluir desde seu efeito oxidante e inflamatório, até sua propriedade de induzir necrose por ruptura das membranas neurais, ou apoptose via ativação de cascatas sinalizatórias. Como etapa comum a estes mecanismos de toxicidade, a interação do peptídeo com membranas neurais, em particular com o gangliosídio GM1 (constituinte dos rafts), parece ser indispensável ao dano neural associado ao peptídeo, bem como à ativação da cascata amiloide que caracteriza o ciclo patológico Aβ-amiloidogênese. O GM1 é um gangliosídio de membrana que, quando administrado exogenamente, apresenta propriedades neurotróficas e neuroprotetoras, inclusive em modelos de DA. Os mecanismos envolvidos nesta neuroproteção, no entanto, ainda precisam ser melhor elucidados. Com isto, o objetivo da presente tese foi avaliar o potencial efeito neuroprotetor do GM1 em modelo in vivo e in vitro de toxicidade do Aβ1-42 fibrilado, e propor mecanismos para esta neuroproteção. Inicialmente, demonstramos que o GM1 (0,30 mg/kg), quando co-administrado (icv) com Aβ (2 nmol) previne o déficit cognitivo induzido pelo peptídeo (teste de reconhecimento de objetos), bem como a redução na atividade da Na+,K+-ATPase (enzima envolvida na regulação da transmissão sináptica) no hipocampo de ratos Wistar machos. Demonstrou-se, além disso, que este efeito neuroprotetor do GM1 é acompanhado de aumento nas defesas antioxidantes, em córtex e hipocampo (TRAP). Como a toxicidade do Aβ e a modulação da amiloidogênese parecem ser dependentes de alterações na estrutura dos microdomínios de membrana (rafts), investigamos o efeito da injeção (icv) de Aβ e do tratamento (icv) com GM1 sobre a integridade dos rafts e sobre a distribuição das proteínas APP e BACE1 (β-secretase) nestes microdomínios. Observamos que o Aβ promoveu um desmonte parcial nos rafts, acompanhado de um aumento na distribuição de APP e BACE1 nestes microdomínios, efeitos estes que foram prevenidos pelo tratamento com GM1. Em virtude de os rafts modularem diversas funções neurais, e de a co-localização de APP e BACE1 nos rafts ser um evento necessário a amiloidogênese, os resultados aqui obtidos, reforçam a ideia de que o GM1 exerça sua função neuroprotetora ao preservar a arquitetura das membranas e que o mesmo poderia frear a ativação da amiloidogênese induzida pelo Aβ, ao prevenir a redistribuição das proteínas APP e BACE1 aos rafts lipídicos. A fim de avaliar a atividade neuroprotetora do GM1 em modelo in vitro da DA, e de investigar a sua propriedade de interagir com o Aβ impedindo a interação deste às membranas neurais, avaliamos o efeito da incubação de GM1 (10, 20 e 30μM) frente à toxicidade do Aβ (0,5μM) em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como, verificamos o efeito de uma prévia incubação Aβ-GM1 (in vitro) sobre a toxicidade induzida pelo peptídeo. Como resultado, observamos que o GM1 promoveu neuroproteção nas três concentrações testadas e que esta neuroproteção foi, pelo menos parcialmente, mediada por sua capacidade de interagir in vitro com o Aβ. Nossos dados, em conjunto, reforçam as evidências que apontam o GM1 como uma potencial droga neuroprotetora em modelos de DA. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of memory and impairment of other cognitive functions. Its pathogenesis involves the production of β-amyloid peptide (Aβ) by cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases (amyloidogenesis) and the subsequent aggregation of Aβ into oligomers and/or fibrils. Aβ toxicity has been associated with several mechanisms, ranging from its oxidant and inflammatory effects until their property to induce necrosis by neural membrane rupture, or apoptosis via activation of signaling cascades. As a common step to these toxicity mechanisms, the peptide interaction with neural membranes, particularly with GM1 ganglioside (component of membrane rafts), seems to be pivotal to the peptide induced neural damage, as well as the amyloid cascade activation that characterizes the pathological vicious cycle Aβ- amyloidogenesis. GM1 is a membrane ganglioside provided of neurotrophic and neuroprotective properties in AD models, when exogenously administered. The mechanisms of neuroprotection, however, need to be further elucidated. By this way, the aim of this PhD thesis was to evaluate the potential neuroprotective effect of GM1 in in vivo and in vitro models of fibrilar Aβ1-42 toxicity, and to propose mechanisms for this neuroprotection. Initially, we demonstrated that GM1 (0.30 mg/kg.), when co-administered (icv) with Aβ (2nmol), prevents the peptide induced cognitive deficit (object recognition task), as well as Aβ induced reduction in Na+,K+-ATPase activity (a enzyme involved in synaptic transmission regulation) in the hippocampus from male Wistar rats. We have shown, furthermore, that this neuroprotective effect of GM1 is accompanied by an increase in antioxidant defenses in the cortex and hippocampus (TRAP). As Aβ toxicity, as well as the modulation of amyloidogenesis, appear to be dependent on changes in the structure of membrane microdomains (rafts), we have investigated the effect of Aβ icv injection and GM1icv treatment on raft integrity and on the distribution of APP and BACE1 (β- secretase) proteins in these microdomains. As result, Aβ promoted a partial raft disassemble, accompanied by an increase in the distribution of APP and BACE1 to these microdomains, effects that were prevented by GM1 treatment. Considering that rafts modulate several neural functions, and that APP and BACE1 co-localization into lipid rafts is pivotal to amyloidogenesis, our results reinforce the idea that GM1 neuroprotection is mediated by membrane architecture preservation, and that GM1 treatment could slow down the Aβ induced activation of amyloidogenesis, by prevention of APP and BACE1 redistribution into lipid rafts. In order to evaluate the GM1 neuroprotective activity in an in vitro AD model, and to investigate GM1 property of interacting with Aβ and preventing its interaction with neuronal membranes, we evaluated GM1 (10, 20 and 30μM) effect against Aβ (0,5 μM)-induced toxicity in SHSY5Y human neuroblastoma cells, as well as, we verified the effect of a Aβ-GM1 in vitro preincubation on the peptide-induced toxicity. As our results indicate, the three tested GM1 concentrations promoted neuroprotection and this effect was, at least partially, mediated by its ability to in vitro interact with Aβ peptide. Our data, when taken together, reinforce the evidence suggesting GM1 as a potential neuroprotective drug in AD models.

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Os Aβ são os principais componentes das placas amilóides, um dos marcos fisiopatológicos no encéfalo dos pacientes. A infusão intracerebral de Aβ em ratos é um modelo animal de DA muito utilizado, produzindo seu acúmulo em regiões cerebrais afetadas, como o hipocampo e o neocórtex e, produzindo déficits cognitivos compatíveis com os sintomas, como déficits na memória espacial. Porém, a maioria dos estudos evidencia déficits equivalentes aos estágios moderado e avançado da DA após a infusão prolongada de Aβ, sem avaliar déficits sutis de estágios iniciais. Isso seria relevante para compreensão dos mecanismos fisiopatológicos e para o teste de possíveis tratamentos neuroprotetores. Uma tarefa utilizada para avaliar déficits relacionados à disfunção hipocampal em ratos é o labirinto de Barnes. Os animais são expostos a uma plataforma circular, com buracos ao redor, sendo apenas um deles conectado a um esconderijo. Nessa tarefa, os animais guiam-se por pistas distais para encontrar o local seguro. O desempenho é avaliado por parâmetros, como latência e distância até o alvo, número de visitas a buracos errados, dentre outros, e por uma análise específica de estratégias de busca usadas para atingir o alvo. O animal pode se localizar pelas pistas distais (dispostas ao redor do labirinto), utilizando informação espacial (estratégia direta) ou outros tipos de busca, visitando de maneira aleatória ou seriada buracos do aparato (estratégias não diretas). Essa avaliação permite a detecção de alterações no modo de solução da tarefa. No presente trabalho, objetivamos investigar sinais cognitivos iniciais da DA em ratos Wistar submetidos à infusão intracerebral de Aβ, e os efeitos de um potencial tratamento neuroprotetor, por meio da avaliação da memória espacial no labirinto de Barnes. Utilizamos o extrato alcalóide de Erythrina velutina (“mulungu”), cujos componentes mostram ações ansiolíticas, antiinflamatórias, antioxidantes e pró-colinérgicas. Na 1ª etapa, padronizamos a tarefa de Barnes para as nossas condições experimentais, e verificamos se há influência da repetição de exposições ao labirinto (importante para verificação de progressão de sinais cognitivos) ou da implantação das cânulas intracerebrais no desempenho dos animais. Animais que passaram ou não pela cirurgia para implantação de cânulas (bilateralmente na sub-região hipocampal CA1 e no ventrículo lateral) passaram por 5 sequências de exposição ao labirinto de Barnes (4 treinos com 4 trials cada, um teste após 24h e um teste após 10 dias). Os resultados mostraram que houve aprendizado e evocação da tarefa. Concluímos que a tarefa pode ser realizada repetidamente, e em animais com implantes cerebrais de cânulas, sem prejuízo de desempenho. Na segunda etapa, investigamos o uso de diferentes estratégias no labirinto de Barnes na presença ou ausência de pistas distais. Ratos foram expostos aos treinos no labirinto de Barnes, e no teste (24h após) parte dos animais foi exposta ao labirinto na presença de pistas distais (condição ‘espacial’) e a outra parte passou pelo teste com uma cortina preta em volta do labirinto (condição ‘nãoespacial’). Ambos os grupos aprenderam e evocaram a tarefa, entretanto os animais expostos às pistas distais preferiram o uso de estratégia direta, enquanto o grupo nãoespacial preferiu outras estratégias. Concluímos que a retirada de pistas distais não impede que os animais encontrem o alvo, e para isso utilizam estratégias de busca alternativas ao uso de informação espacial. Na terceira etapa (2 experimentos) verificamos os efeitos da infusão intracerebral de peptídeos Aβ sobre o aprendizado e a memória no labirinto de Barnes. No experimento 1, ratos receberam 15 infusões diárias de salina ou Aβ (30, 100 ou 300 pmol) i.c.v., sendo que no 1º dia de tratamento houve infusões em CA1. Foram submetidos a 3 sequências de exposição ao Barnes (treinos, teste 24h e reteste 10 dias). A sequência I foi realizada antes da cirurgia (na qual ocorreu o aprendizado para todos os animais), a II a partir da 11ª infusão, e a III 10 dias depois. Nas sequências II e III, houve grande variação do comportamento dos animais Aβ, de modo que não foram observadas diferenças entre os grupos, além de uma alta mortalidade dos animais. Ao fim dos experimentos comportamentais, os animais foram eutanasiados e submetidos à imunohistoquímica para Aβ, cuja análise por densitometria ótica relativa mostrou aumento de sua marcação no hipocampo e neocórtex. No 2º experimento verificamos os efeitos da infusão de Aβ sobre o desempenho geral e estratégias de busca no labirinto de Barnes, com algumas alterações no protocolo de infusão e execução da tarefa. Os animais (salina ou Aβ 30 pmol) foram submetidos a uma sequência de exposição ao Barnes com 4 treinos de 2 trials cada e um teste realizado 3 dias depois, visando dificultar a tarefa. Não houve diferenças entre os grupos no aprendizado. No teste, embora os animais Aβ mostrassem alguma evocação, estes utilizaram preferencialmente estratégias aleatória e seriada, enquanto o grupo salina preferiu a estratégia direta. Concluímos que a infusão de Aβ promoveu alterações sutis na memória espacial compatíveis com a manifestação inicial da DA, indicando relevância para investigações mecanicísticas e terapêuticas em estágios precoces da doença. Na última etapa, animais submetidos ao mesmo tratamento de infusão com Aβ (30 pmol) foram tratados concomitantemente com 200 mg/kg do extrato de mulungu por via oral. Os grupos (salina, Amulungu e Amulungu) foram submetidos a 2 sequências de Barnes (a partir da 11ª infusão e dez dias depois). De forma geral, não foram observadas diferenças entre os grupos nos parâmetros referentes ao aprendizado ou à evocação da tarefa. Sendo assim, concluímos que o protocolo utilizado não foi capaz de detectar um efeito benéfico do extrato de mulungu no modelo de DA por infusão de peptídeos Aβ. / Alzheimer’s disease (AD) is present in 46.8 million people in the world, and is characterized by the progressive decline of cognition, mainly episodic memory. AD is multifactorial, and the accumulation of amyloid peptides (Aβ) is the main proposed mechanism underlying neurodegeneration. Aβ are the main components of the amyloid plaques in the brain, that are physiopathological hallmarks of the disease. Intracerebral infusion of Aβ in rats is usually used as an animal model of DA and generates the accumulation of these peptides in the brain together with spatial memory impairment. However, most studies show moderate to severe deficits after chronic Aβ infusion, without evaluation of possible subtle initial deficits. The study of the initial stages of AD is relevant for mechanicistic and therapeutic investigations. The Barnes maze has been used for investigating deficits in the hippocampal function in rats. The animals are exposed to a circular apparatus with holes in its periphery. One of the holes is connected to a safe place. In this task, rats navigate guided by distal cues to find this safe compartment. The evaluation is conduct by parameters of general performance (latency and distance to reach target, number of errors, among others) and by a specific analysis of search strategies. In this way, the animal use spatial information and move directly towards the target (direct strategy), visit sequential holes until reach the target (serial strategy) or visit holes in a non-systematic fashion until reach the target (aleatory search). The analysis of strategies allows the detection of alterations in the mode of solution of the task. In the present study, we aimed to investigate initial cognitive signs of AD in Wistar rats submitted to intracerebral infusions of Aβ, as well as the effects of a potentially neuroprotective treatment, by the evaluation of spatial memory in the Barnes maze. We used the alkaloid extract of Erythrina velutina (“mulungu”), which was previously studied for anxiolytic, anti-inflammatory, antioxidant and cholinergic actions. First, we standardized the task to our experimental conditions, and verified a possible influence of repeated expositions to the apparatus (for future long-term protocols) or of the implantation of the cannulas in the brain. Rats went through (or not) to implantation of cannulas (bilaterally in the hippocampal CA1 and in the lateral ventricle) and were exposed to 5 sequences of exposition to the Barnes maze (4 trainning sessions with 4 trials each, a 24h test and a 10-day retest sessions). Both groups showed task retrieval, and there was a slightly improved performance in the implanted group. We concluded that the task can be held repeatedly, and in implanted animals, without altering the performance. In the second phase, we investigated the use of different strategies in the Barnes maze by rats submitted to the presence of absence of distal cues. Rats were exposed to the training phase, and in the probe session (24 h later) half the animals were exposed to the maze in the presence of the same distal cues used in training (spatial group), while the other rats went through the probe test without those cues (a black curtain was placed around the maze – non-spatial group). Both groups learned the task, but the spatial group preferred the used of direct strategies, while the non-spatial group preferred other strategies. We concluded that the removal of distal cues does not hinder the execution of the task, and the animals use alternative search modes under this condition. In the third phase (two experiments) we verified the effects of the intracerebral infusion of Aβ on the acquisition and retrieval of Barnes task. In experiment 1, rats received 15 daily i.c.v. infusions of saline or Aβ (30, 100 or 300 pmol) plus bilateral CA1 infusions in the first day, and were exposed to 3 sequences of Barnes task (training, 24h test and 10-day retest in each sequence). Sequence I was held before surgery (all the animals learned the task), II started at 11th infusion and III started 10 days after II. The behavior of the Aβ-treated animals varied greatly at sequences II and III, and hence no differences were observed. There was high mortality due to treatment. At the end of the behavioral sessions, saline and Aβ 30pmol groups were euthanized for Aβ immunohistochemistry. The analysis by relative optical density showed increased Aβ staining in the hippocampus and neocortex. In experiment 2 we investigated the effects of Aβ (30 pmol) infusion on the search strategies in the Barnes maze. Animals went through one sequence of Barnes task (4 trainings with 2 trials each and a 3-day test, in order to increase difficulty). In the probe test, although Aβ animals showed some retrieval, they showed preference for nonspatial strategies, opposed to saline-treated rats. We concluded that Aβ infusion induced subtle alterations in spatial memory, compatible with the initial stages of AD, which is relevant for investigations of potential neuroprotective approaches. In the last stage, animals submitted to the same infusion protocol described above were concomitantly treated orally with 200 mg/kg of E. velutina (mulungu) extract and went through 2 Barnes task sequences. In general, no differences were observed among the groups in acquisition or retrieval. Thus, we concluded that the protocol used here was not able to detect a beneficial effect of mulungu extract in the Aβ infusion AD model.

O aumento da expectativa de vida da população mundial tem se associado com uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum e a principal causa de demência em indivíduos com mais de 60 anos, sendo caracterizada por um declínio progressivo na memória e função mental dos pacientes. Esses sintomas são acompanhados por alterações histopatológicas no cérebro desses indivíduos, incluindo a presença de uma grande quantidade de placas senis, formadas pela deposição do peptídeo beta-amiloide (Aβ), e de emaranhados neurofibrilares formados pela hiperfosforilação da proteína Tau. Estudos indicam que a deposição do Aβ é uma das principais responsáveis pelo desenvolvimento da DA, causando dano neuronal através da ativação de várias vias pró-apoptóticas e dando origem aos sintomas de demência típicos dessa doença. Até o momento, não existem tratamentos eficazes para o combate à DA, de forma que a maior parte das intervenções farmacológicas é destinada apenas ao tratamento de alguns de seus sintomas. A proteína translocadora (TSPO) se localiza em pontos de contato entre as membranas mitocondriais interna e externa e está relacionada com o transporte de colesterol para o interior da mitocôndria e com a regulação da esteroidogênese e da apoptose. Estudos mostram que ligantes da TSPO apresentam efeitos neuroprotetores em diferentes modelos experimentais de lesão cerebral e doenças neurodegenerativas. Especificamente em relação à DA, um estudo indicou que o 4’-clorodiazepam (4’-CD), um ligante da TSPO, apresenta efeitos neuroprotetores em um modelo animal dessa doença, sendo um possível candidato para o seu tratamento. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi verificar o efeito neuroprotetor do 4’-CD em diferentes modelos in vitro de toxicidade induzida pelo Aβ, além de seus efeitos sobre o desenvolvimento de neurônios hipocampais. Inicialmente, demonstramos que o 4’-CD reduziu a morte celular de células SH-SY5Y expostas a um modelo de toxicidade induzida pela administração de Aβ. Esses efeitos estiveram associados com a redução da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e com um aumento da expressão da survivina, uma proteína anti-apoptótica. A expressão das proteínas Bcl-xl e procaspase-3, por outro lado, não foi alterada pelos tratamentos. Posteriormente, estudamos os efeitos neuroprotetores do 4’-CD contra a toxicidade induzida pela administração do Aβ em culturas organotípicas de hipocampo. Nesses experimentos, foi demonstrado que o 4’-CD reduz a morte celular de culturas organotípicas de hipocampo expostas ao Aβ através de um aumento na expressão da enzima SOD, sem alterar, no entanto, a expressão das proteínas Akt e procaspase-3. Por fim, foi avaliado o efeito do 4’-CD sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais de camundongos machos e fêmeas. Foi observado que as culturas de neurônios hipocampais das fêmeas apresentaram um desenvolvimento mais rápido do que as dos machos. O 4’-CD acelerou a maturação e aumentou a ramificação neurítica dos neurônios hipocampais dos machos, mas não exerceu qualquer efeito sobre os neurônios das fêmeas. Em suma, foi observado que o 4’-CD apresenta efeitos neuroprotetores contra o Aβ em células SH-SY5Y e em culturas organotípicas do hipocampo, apresentando-se como um fármaco em potencial para o tratamento da DA. Além disso, foi observado que o 4’-CD exerceu um efeito dependente do sexo sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais, estimulando o desenvolvimento e a ramificação neurítica de neurônios hipocampais de machos, mas não de fêmeas. / The increase in life expectancy of the world population has been associated with a higher prevalence of neurodegenerative diseases. The Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the main cause of dementia among people over 60 years, being characterized by a progressive decline in the memory and mental function of the patients. These symptoms are associated with histopathological changes in the brain of these patients, including the presence of senile plaques, formed by the deposition of amyloid-beta (Aβ), and neurofibrillary tangles, which are related to the hyperphosphorylation of Tau protein. Studies indicate that Aβ deposition is a major contributor to AD progression, promoting neuronal damage through the activation of different pro-apoptotic pathways and giving rise to the typical dementia symptoms of this disease. To date, there are no effective treatments for AD, so that most of the pharmacological intervention is intended for the treatment of some of its symptoms. The translocator protein (TSPO) is located in contact sites between the outer and the inner mitochondrial membranes and is involved in the cholesterol transport into the mitochondria and in the regulation of steroidogenesis and apoptosis. Studies show that TSPO ligands present neuroprotective effects in different experimental models of brain injury and neurodegenerative diseases. Specifically regarding AD, a study indicated that 4’-chlorodiazepam (4’-CD), a TSPO ligand, is neuroprotective in an animal model of this disease, being a possible candidate for its treatment. Therefore, the aim of this study was to evaluate the neuroprotective effect of 4’-CD in different experimental models of Aβ- induced neurotoxicity in vitro, as well as its effects on the development of hipocampal neurons. First, it was demonstrated that 4’-CD decreased the cell death of SH-SY5Y cells exposed to the Aβ. This effect was associated with the inhibition of the Aβ-induced upregulation of Bax, a pro-apoptotic protein, and downregulation of survivin, a prosurvival protein. On the other hand, the expression of Bcl-xl and procaspase-3 was not change by the treatments. After, it was studied the neuroprotective effects of 4’-CD against Aβ in organotypic hipocampal cultures. In these experiments, it was shown that 4’-CD decreases the cell death of organotypic hippocampal slices exposed to the Aβ by increasing the protein expression of SOD, but without changing the expression of Akt and procaspase-3. Finally, due to the importance of the processes of neuronal development and maturation in the regeneration of CNS after injury, it was evaluated the effect of 4’-CD on the development of primary hippocampal neurons of male and female mice. It was observed that female primary hippocampal neurons presented an increased rate of development than male neurons. 4’-CD stimulated the development and increased the neuritic branching of male but not from female neurons. In summary, it was observed that 4’-CD presented a neuroprotective effect against Aβ in SH-SY5Y cells and in rat organotypical hippocampal slices, presenting itself as a promising agent for the treatment of AD. Also, it was observed that 4’-CD modulates the development of hippocampal neurons in a sex-dependent manner, stimulating the development of male but not from female cells.

As vias amiloidogênica e não-amiloidogênica, representadas pelas enzimas secretases como a enzima clivadora do sítio beta da APP (BACE) e a enzima conversora do fator de necrose tumoral-alfa (TACE) respectivamente, são responsáveis pela clivagem da proteína precursora amiloide (APP). Alterações no processamento da APP associadas ao acúmulo do peptídeo β-amiloide (Aβ) parecem estar relacionadas aos déficits cognitivos observados na doença de Alzheimer (DA), no entanto, estudos avaliando a maquinaria de processamento da APP durante o envelhecimento fisiológico são raros. O Aβ é formado através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) pela enzima BACE. Por outro lado, a APP pode ser clivada por secretases como a TACE gerando APPα, o qual é considerado neuroprotetor. Alguns estudos têm sugerido um envolvimento de vesículas denominadas exossomos no transporte de proteínas como o peptídeo Aβ além de um papel dos exossomos durante o estresse oxidativo e no processo de envelhecimento. No entanto, estudos avaliando a relação entre exossomos e marcadores oxidativos no envelhecimento ainda não foram realizados. Além disso, apesar de diversas evidências demonstrarem os efeitos benéficos do exercício físico, os efeitos exercidos sobre a modulação da atividade das secretases, especificamente TACE e BACE, e sobre o perfil dos exossomos durante o envelhecimento fisiológico têm sido pouco investigados. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do exercício físico sobre a atividade das secretases e sobre o perfil de exossomos circulantes em ratos durante o envelhecimento. Ratos Wistar de 3, 21 e 26 meses de idade foram divididos em sedentários e exercitados, o protocolo de exercício consistiu em 20 min/ dia durante 14 dias e após a última a sessão de exercício todos os animais foram submetidos ao teste da esquiva inibitória. As estruturas cerebrais e o sangue troncular foram coletados 1h (período da tarde) e 18 h (período da manhã) após a última sessão de exercício com o objetivo de avaliar os efeitos transitórios e tardios do protocolo de exercício. O hipocampo e o córtex pré-frontal foram dissecados e utilizados para quantificar o conteúdo de APP e avaliar a atividade das enzimas TACE e BACE. Os exossomos foram isolados do soro e utilizados para quantificar CD63, atividade da acetilcolinesterase (AChE), conteúdo de espécies reativas, atividade da superóxido dismutase (SOD) e conteúdo de Aβ. / The amyloidogenic and non-amyloidogenic pathways, represented by secretases named β-site APP cleaving enzyme(BACE) and tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE), respectively, are responsible for amyloid protein precursor (APP) processing. APP cleavage modifications leading to increased β-amyloid (Aβ) peptide levels seem to be related to cognitive decline observed in Alzheimer disease (AD), however, works evaluating the APP processing machinery in the normal aging process are rarely studied. The Aβ is formed through APP cleavage by BACE enzyme, named amyloidogenic pathway. On the other hand, APP can be cleaved by a non-amyloidogenic pathway through secretase enzymes such as TACE producing APPα, which is a neuroprotective product. Some evidences suggested that extracellular vesicles named exosomes could carry proteins including the Aβ peptide between different cells. Yet, exosomes appear to be linked to oxidative stress and aging process. However, studies evaluating the relationship between exosomes and oxidative stress marks in the aging were not yet performed. The beneficial exercise impact in the aging process are widely described, nevertheless, its effects on secretase activities, specifically BACE and TACE, and exosome profile during normal aging remains understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the exercise effects on secretase activities and circulating exosomes profile in the aging process. Wistar rats (3-, 21- and 26-month-old) were divided into sedentary and exercised groups; the exercise protocol consisted in a daily moderate treadmill exercise (20 min each day during 2 weeks). After the last exercise sessions, all animals were subjected to inhibitory avoidance task. To identify transitory and delayed exercise effects, specifically 1 and 18 hours after the last exercise training session, hippocampi and prefrontal cortices as well as blood were obtained at different times of day, respectively, in the afternoon and early morning. The brain areas were used to quantify the APP content and BACE and TACE activities. The circulating exosomes were isolated from serum and used to quantify CD63, reactive species and Aβ content, besides AChE and superoxide dismutase (SOD) activities.

O aumento da expectativa de vida da população mundial tem se associado com uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum e a principal causa de demência em indivíduos com mais de 60 anos, sendo caracterizada por um declínio progressivo na memória e função mental dos pacientes. Esses sintomas são acompanhados por alterações histopatológicas no cérebro desses indivíduos, incluindo a presença de uma grande quantidade de placas senis, formadas pela deposição do peptídeo beta-amiloide (Aβ), e de emaranhados neurofibrilares formados pela hiperfosforilação da proteína Tau. Estudos indicam que a deposição do Aβ é uma das principais responsáveis pelo desenvolvimento da DA, causando dano neuronal através da ativação de várias vias pró-apoptóticas e dando origem aos sintomas de demência típicos dessa doença. Até o momento, não existem tratamentos eficazes para o combate à DA, de forma que a maior parte das intervenções farmacológicas é destinada apenas ao tratamento de alguns de seus sintomas. A proteína translocadora (TSPO) se localiza em pontos de contato entre as membranas mitocondriais interna e externa e está relacionada com o transporte de colesterol para o interior da mitocôndria e com a regulação da esteroidogênese e da apoptose. Estudos mostram que ligantes da TSPO apresentam efeitos neuroprotetores em diferentes modelos experimentais de lesão cerebral e doenças neurodegenerativas. Especificamente em relação à DA, um estudo indicou que o 4’-clorodiazepam (4’-CD), um ligante da TSPO, apresenta efeitos neuroprotetores em um modelo animal dessa doença, sendo um possível candidato para o seu tratamento. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi verificar o efeito neuroprotetor do 4’-CD em diferentes modelos in vitro de toxicidade induzida pelo Aβ, além de seus efeitos sobre o desenvolvimento de neurônios hipocampais. Inicialmente, demonstramos que o 4’-CD reduziu a morte celular de células SH-SY5Y expostas a um modelo de toxicidade induzida pela administração de Aβ. Esses efeitos estiveram associados com a redução da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e com um aumento da expressão da survivina, uma proteína anti-apoptótica. A expressão das proteínas Bcl-xl e procaspase-3, por outro lado, não foi alterada pelos tratamentos. Posteriormente, estudamos os efeitos neuroprotetores do 4’-CD contra a toxicidade induzida pela administração do Aβ em culturas organotípicas de hipocampo. Nesses experimentos, foi demonstrado que o 4’-CD reduz a morte celular de culturas organotípicas de hipocampo expostas ao Aβ através de um aumento na expressão da enzima SOD, sem alterar, no entanto, a expressão das proteínas Akt e procaspase-3. Por fim, foi avaliado o efeito do 4’-CD sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais de camundongos machos e fêmeas. Foi observado que as culturas de neurônios hipocampais das fêmeas apresentaram um desenvolvimento mais rápido do que as dos machos. O 4’-CD acelerou a maturação e aumentou a ramificação neurítica dos neurônios hipocampais dos machos, mas não exerceu qualquer efeito sobre os neurônios das fêmeas. Em suma, foi observado que o 4’-CD apresenta efeitos neuroprotetores contra o Aβ em células SH-SY5Y e em culturas organotípicas do hipocampo, apresentando-se como um fármaco em potencial para o tratamento da DA. Além disso, foi observado que o 4’-CD exerceu um efeito dependente do sexo sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais, estimulando o desenvolvimento e a ramificação neurítica de neurônios hipocampais de machos, mas não de fêmeas. / The increase in life expectancy of the world population has been associated with a higher prevalence of neurodegenerative diseases. The Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the main cause of dementia among people over 60 years, being characterized by a progressive decline in the memory and mental function of the patients. These symptoms are associated with histopathological changes in the brain of these patients, including the presence of senile plaques, formed by the deposition of amyloid-beta (Aβ), and neurofibrillary tangles, which are related to the hyperphosphorylation of Tau protein. Studies indicate that Aβ deposition is a major contributor to AD progression, promoting neuronal damage through the activation of different pro-apoptotic pathways and giving rise to the typical dementia symptoms of this disease. To date, there are no effective treatments for AD, so that most of the pharmacological intervention is intended for the treatment of some of its symptoms. The translocator protein (TSPO) is located in contact sites between the outer and the inner mitochondrial membranes and is involved in the cholesterol transport into the mitochondria and in the regulation of steroidogenesis and apoptosis. Studies show that TSPO ligands present neuroprotective effects in different experimental models of brain injury and neurodegenerative diseases. Specifically regarding AD, a study indicated that 4’-chlorodiazepam (4’-CD), a TSPO ligand, is neuroprotective in an animal model of this disease, being a possible candidate for its treatment. Therefore, the aim of this study was to evaluate the neuroprotective effect of 4’-CD in different experimental models of Aβ- induced neurotoxicity in vitro, as well as its effects on the development of hipocampal neurons. First, it was demonstrated that 4’-CD decreased the cell death of SH-SY5Y cells exposed to the Aβ. This effect was associated with the inhibition of the Aβ-induced upregulation of Bax, a pro-apoptotic protein, and downregulation of survivin, a prosurvival protein. On the other hand, the expression of Bcl-xl and procaspase-3 was not change by the treatments. After, it was studied the neuroprotective effects of 4’-CD against Aβ in organotypic hipocampal cultures. In these experiments, it was shown that 4’-CD decreases the cell death of organotypic hippocampal slices exposed to the Aβ by increasing the protein expression of SOD, but without changing the expression of Akt and procaspase-3. Finally, due to the importance of the processes of neuronal development and maturation in the regeneration of CNS after injury, it was evaluated the effect of 4’-CD on the development of primary hippocampal neurons of male and female mice. It was observed that female primary hippocampal neurons presented an increased rate of development than male neurons. 4’-CD stimulated the development and increased the neuritic branching of male but not from female neurons. In summary, it was observed that 4’-CD presented a neuroprotective effect against Aβ in SH-SY5Y cells and in rat organotypical hippocampal slices, presenting itself as a promising agent for the treatment of AD. Also, it was observed that 4’-CD modulates the development of hippocampal neurons in a sex-dependent manner, stimulating the development of male but not from female cells.

O aumento da expectativa de vida da população mundial tem se associado com uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum e a principal causa de demência em indivíduos com mais de 60 anos, sendo caracterizada por um declínio progressivo na memória e função mental dos pacientes. Esses sintomas são acompanhados por alterações histopatológicas no cérebro desses indivíduos, incluindo a presença de uma grande quantidade de placas senis, formadas pela deposição do peptídeo beta-amiloide (Aβ), e de emaranhados neurofibrilares formados pela hiperfosforilação da proteína Tau. Estudos indicam que a deposição do Aβ é uma das principais responsáveis pelo desenvolvimento da DA, causando dano neuronal através da ativação de várias vias pró-apoptóticas e dando origem aos sintomas de demência típicos dessa doença. Até o momento, não existem tratamentos eficazes para o combate à DA, de forma que a maior parte das intervenções farmacológicas é destinada apenas ao tratamento de alguns de seus sintomas. A proteína translocadora (TSPO) se localiza em pontos de contato entre as membranas mitocondriais interna e externa e está relacionada com o transporte de colesterol para o interior da mitocôndria e com a regulação da esteroidogênese e da apoptose. Estudos mostram que ligantes da TSPO apresentam efeitos neuroprotetores em diferentes modelos experimentais de lesão cerebral e doenças neurodegenerativas. Especificamente em relação à DA, um estudo indicou que o 4’-clorodiazepam (4’-CD), um ligante da TSPO, apresenta efeitos neuroprotetores em um modelo animal dessa doença, sendo um possível candidato para o seu tratamento. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi verificar o efeito neuroprotetor do 4’-CD em diferentes modelos in vitro de toxicidade induzida pelo Aβ, além de seus efeitos sobre o desenvolvimento de neurônios hipocampais. Inicialmente, demonstramos que o 4’-CD reduziu a morte celular de células SH-SY5Y expostas a um modelo de toxicidade induzida pela administração de Aβ. Esses efeitos estiveram associados com a redução da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e com um aumento da expressão da survivina, uma proteína anti-apoptótica. A expressão das proteínas Bcl-xl e procaspase-3, por outro lado, não foi alterada pelos tratamentos. Posteriormente, estudamos os efeitos neuroprotetores do 4’-CD contra a toxicidade induzida pela administração do Aβ em culturas organotípicas de hipocampo. Nesses experimentos, foi demonstrado que o 4’-CD reduz a morte celular de culturas organotípicas de hipocampo expostas ao Aβ através de um aumento na expressão da enzima SOD, sem alterar, no entanto, a expressão das proteínas Akt e procaspase-3. Por fim, foi avaliado o efeito do 4’-CD sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais de camundongos machos e fêmeas. Foi observado que as culturas de neurônios hipocampais das fêmeas apresentaram um desenvolvimento mais rápido do que as dos machos. O 4’-CD acelerou a maturação e aumentou a ramificação neurítica dos neurônios hipocampais dos machos, mas não exerceu qualquer efeito sobre os neurônios das fêmeas. Em suma, foi observado que o 4’-CD apresenta efeitos neuroprotetores contra o Aβ em células SH-SY5Y e em culturas organotípicas do hipocampo, apresentando-se como um fármaco em potencial para o tratamento da DA. Além disso, foi observado que o 4’-CD exerceu um efeito dependente do sexo sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais, estimulando o desenvolvimento e a ramificação neurítica de neurônios hipocampais de machos, mas não de fêmeas. / The increase in life expectancy of the world population has been associated with a higher prevalence of neurodegenerative diseases. The Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the main cause of dementia among people over 60 years, being characterized by a progressive decline in the memory and mental function of the patients. These symptoms are associated with histopathological changes in the brain of these patients, including the presence of senile plaques, formed by the deposition of amyloid-beta (Aβ), and neurofibrillary tangles, which are related to the hyperphosphorylation of Tau protein. Studies indicate that Aβ deposition is a major contributor to AD progression, promoting neuronal damage through the activation of different pro-apoptotic pathways and giving rise to the typical dementia symptoms of this disease. To date, there are no effective treatments for AD, so that most of the pharmacological intervention is intended for the treatment of some of its symptoms. The translocator protein (TSPO) is located in contact sites between the outer and the inner mitochondrial membranes and is involved in the cholesterol transport into the mitochondria and in the regulation of steroidogenesis and apoptosis. Studies show that TSPO ligands present neuroprotective effects in different experimental models of brain injury and neurodegenerative diseases. Specifically regarding AD, a study indicated that 4’-chlorodiazepam (4’-CD), a TSPO ligand, is neuroprotective in an animal model of this disease, being a possible candidate for its treatment. Therefore, the aim of this study was to evaluate the neuroprotective effect of 4’-CD in different experimental models of Aβ- induced neurotoxicity in vitro, as well as its effects on the development of hipocampal neurons. First, it was demonstrated that 4’-CD decreased the cell death of SH-SY5Y cells exposed to the Aβ. This effect was associated with the inhibition of the Aβ-induced upregulation of Bax, a pro-apoptotic protein, and downregulation of survivin, a prosurvival protein. On the other hand, the expression of Bcl-xl and procaspase-3 was not change by the treatments. After, it was studied the neuroprotective effects of 4’-CD against Aβ in organotypic hipocampal cultures. In these experiments, it was shown that 4’-CD decreases the cell death of organotypic hippocampal slices exposed to the Aβ by increasing the protein expression of SOD, but without changing the expression of Akt and procaspase-3. Finally, due to the importance of the processes of neuronal development and maturation in the regeneration of CNS after injury, it was evaluated the effect of 4’-CD on the development of primary hippocampal neurons of male and female mice. It was observed that female primary hippocampal neurons presented an increased rate of development than male neurons. 4’-CD stimulated the development and increased the neuritic branching of male but not from female neurons. In summary, it was observed that 4’-CD presented a neuroprotective effect against Aβ in SH-SY5Y cells and in rat organotypical hippocampal slices, presenting itself as a promising agent for the treatment of AD. Also, it was observed that 4’-CD modulates the development of hippocampal neurons in a sex-dependent manner, stimulating the development of male but not from female cells.

As vias amiloidogênica e não-amiloidogênica, representadas pelas enzimas secretases como a enzima clivadora do sítio beta da APP (BACE) e a enzima conversora do fator de necrose tumoral-alfa (TACE) respectivamente, são responsáveis pela clivagem da proteína precursora amiloide (APP). Alterações no processamento da APP associadas ao acúmulo do peptídeo β-amiloide (Aβ) parecem estar relacionadas aos déficits cognitivos observados na doença de Alzheimer (DA), no entanto, estudos avaliando a maquinaria de processamento da APP durante o envelhecimento fisiológico são raros. O Aβ é formado através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) pela enzima BACE. Por outro lado, a APP pode ser clivada por secretases como a TACE gerando APPα, o qual é considerado neuroprotetor. Alguns estudos têm sugerido um envolvimento de vesículas denominadas exossomos no transporte de proteínas como o peptídeo Aβ além de um papel dos exossomos durante o estresse oxidativo e no processo de envelhecimento. No entanto, estudos avaliando a relação entre exossomos e marcadores oxidativos no envelhecimento ainda não foram realizados. Além disso, apesar de diversas evidências demonstrarem os efeitos benéficos do exercício físico, os efeitos exercidos sobre a modulação da atividade das secretases, especificamente TACE e BACE, e sobre o perfil dos exossomos durante o envelhecimento fisiológico têm sido pouco investigados. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do exercício físico sobre a atividade das secretases e sobre o perfil de exossomos circulantes em ratos durante o envelhecimento. Ratos Wistar de 3, 21 e 26 meses de idade foram divididos em sedentários e exercitados, o protocolo de exercício consistiu em 20 min/ dia durante 14 dias e após a última a sessão de exercício todos os animais foram submetidos ao teste da esquiva inibitória. As estruturas cerebrais e o sangue troncular foram coletados 1h (período da tarde) e 18 h (período da manhã) após a última sessão de exercício com o objetivo de avaliar os efeitos transitórios e tardios do protocolo de exercício. O hipocampo e o córtex pré-frontal foram dissecados e utilizados para quantificar o conteúdo de APP e avaliar a atividade das enzimas TACE e BACE. Os exossomos foram isolados do soro e utilizados para quantificar CD63, atividade da acetilcolinesterase (AChE), conteúdo de espécies reativas, atividade da superóxido dismutase (SOD) e conteúdo de Aβ. / The amyloidogenic and non-amyloidogenic pathways, represented by secretases named β-site APP cleaving enzyme(BACE) and tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE), respectively, are responsible for amyloid protein precursor (APP) processing. APP cleavage modifications leading to increased β-amyloid (Aβ) peptide levels seem to be related to cognitive decline observed in Alzheimer disease (AD), however, works evaluating the APP processing machinery in the normal aging process are rarely studied. The Aβ is formed through APP cleavage by BACE enzyme, named amyloidogenic pathway. On the other hand, APP can be cleaved by a non-amyloidogenic pathway through secretase enzymes such as TACE producing APPα, which is a neuroprotective product. Some evidences suggested that extracellular vesicles named exosomes could carry proteins including the Aβ peptide between different cells. Yet, exosomes appear to be linked to oxidative stress and aging process. However, studies evaluating the relationship between exosomes and oxidative stress marks in the aging were not yet performed. The beneficial exercise impact in the aging process are widely described, nevertheless, its effects on secretase activities, specifically BACE and TACE, and exosome profile during normal aging remains understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the exercise effects on secretase activities and circulating exosomes profile in the aging process. Wistar rats (3-, 21- and 26-month-old) were divided into sedentary and exercised groups; the exercise protocol consisted in a daily moderate treadmill exercise (20 min each day during 2 weeks). After the last exercise sessions, all animals were subjected to inhibitory avoidance task. To identify transitory and delayed exercise effects, specifically 1 and 18 hours after the last exercise training session, hippocampi and prefrontal cortices as well as blood were obtained at different times of day, respectively, in the afternoon and early morning. The brain areas were used to quantify the APP content and BACE and TACE activities. The circulating exosomes were isolated from serum and used to quantify CD63, reactive species and Aβ content, besides AChE and superoxide dismutase (SOD) activities.

As vias amiloidogênica e não-amiloidogênica, representadas pelas enzimas secretases como a enzima clivadora do sítio beta da APP (BACE) e a enzima conversora do fator de necrose tumoral-alfa (TACE) respectivamente, são responsáveis pela clivagem da proteína precursora amiloide (APP). Alterações no processamento da APP associadas ao acúmulo do peptídeo β-amiloide (Aβ) parecem estar relacionadas aos déficits cognitivos observados na doença de Alzheimer (DA), no entanto, estudos avaliando a maquinaria de processamento da APP durante o envelhecimento fisiológico são raros. O Aβ é formado através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) pela enzima BACE. Por outro lado, a APP pode ser clivada por secretases como a TACE gerando APPα, o qual é considerado neuroprotetor. Alguns estudos têm sugerido um envolvimento de vesículas denominadas exossomos no transporte de proteínas como o peptídeo Aβ além de um papel dos exossomos durante o estresse oxidativo e no processo de envelhecimento. No entanto, estudos avaliando a relação entre exossomos e marcadores oxidativos no envelhecimento ainda não foram realizados. Além disso, apesar de diversas evidências demonstrarem os efeitos benéficos do exercício físico, os efeitos exercidos sobre a modulação da atividade das secretases, especificamente TACE e BACE, e sobre o perfil dos exossomos durante o envelhecimento fisiológico têm sido pouco investigados. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do exercício físico sobre a atividade das secretases e sobre o perfil de exossomos circulantes em ratos durante o envelhecimento. Ratos Wistar de 3, 21 e 26 meses de idade foram divididos em sedentários e exercitados, o protocolo de exercício consistiu em 20 min/ dia durante 14 dias e após a última a sessão de exercício todos os animais foram submetidos ao teste da esquiva inibitória. As estruturas cerebrais e o sangue troncular foram coletados 1h (período da tarde) e 18 h (período da manhã) após a última sessão de exercício com o objetivo de avaliar os efeitos transitórios e tardios do protocolo de exercício. O hipocampo e o córtex pré-frontal foram dissecados e utilizados para quantificar o conteúdo de APP e avaliar a atividade das enzimas TACE e BACE. Os exossomos foram isolados do soro e utilizados para quantificar CD63, atividade da acetilcolinesterase (AChE), conteúdo de espécies reativas, atividade da superóxido dismutase (SOD) e conteúdo de Aβ. / The amyloidogenic and non-amyloidogenic pathways, represented by secretases named β-site APP cleaving enzyme(BACE) and tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE), respectively, are responsible for amyloid protein precursor (APP) processing. APP cleavage modifications leading to increased β-amyloid (Aβ) peptide levels seem to be related to cognitive decline observed in Alzheimer disease (AD), however, works evaluating the APP processing machinery in the normal aging process are rarely studied. The Aβ is formed through APP cleavage by BACE enzyme, named amyloidogenic pathway. On the other hand, APP can be cleaved by a non-amyloidogenic pathway through secretase enzymes such as TACE producing APPα, which is a neuroprotective product. Some evidences suggested that extracellular vesicles named exosomes could carry proteins including the Aβ peptide between different cells. Yet, exosomes appear to be linked to oxidative stress and aging process. However, studies evaluating the relationship between exosomes and oxidative stress marks in the aging were not yet performed. The beneficial exercise impact in the aging process are widely described, nevertheless, its effects on secretase activities, specifically BACE and TACE, and exosome profile during normal aging remains understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the exercise effects on secretase activities and circulating exosomes profile in the aging process. Wistar rats (3-, 21- and 26-month-old) were divided into sedentary and exercised groups; the exercise protocol consisted in a daily moderate treadmill exercise (20 min each day during 2 weeks). After the last exercise sessions, all animals were subjected to inhibitory avoidance task. To identify transitory and delayed exercise effects, specifically 1 and 18 hours after the last exercise training session, hippocampi and prefrontal cortices as well as blood were obtained at different times of day, respectively, in the afternoon and early morning. The brain areas were used to quantify the APP content and BACE and TACE activities. The circulating exosomes were isolated from serum and used to quantify CD63, reactive species and Aβ content, besides AChE and superoxide dismutase (SOD) activities.