Orientador: Vanderlan da Silva Bolzani / Resumo: O gênero Croton, um dos maiores da família Euphorbiaceae, é conhecido pela sua riqueza de metabólitos secundários de origem terpênica, como os clerodânicos. No entanto, estudos recentes apontam para a presença de uma classe de compostos que vem ganhando visibilidade e interesse dos cientistas e de indústrias farmacêuticas, os peptídeos cíclicos. Os peptídeos naturais, especialmente aqueles de natureza cíclica e de baixo peso molecular (orbitídeos), constituem uma classe de moléculas promissoras para a identificação de novos hits e leads de fármacos. Nessa perspectiva, esse trabalho trata do estudo de duas espécies da Mata Atlântica: Croton floribundus e Croton campanulatus na busca por peptídeos cíclicos, mais precisamente por orbitídeos. Assim sendo, inicialmente investigou-se em pequena escala folhas e caules de ambas as espécies, raiz da espécie C. floribundus e látex da espécie C. campanulatus e após essas análises preliminares selecionou-se a raiz da de C. floribundus e o látex de C. campanulatus para dar continuidade com os estudos. O processo de extração das substâncias de interesse da raiz foi feito por maceração hidroetanólica e do látex, por partição líquido-líquido com acetato de etila. Em seguida esses extratos foram submetidos à cromatografia em coluna, empregando octadecilsilano (C18) como fase estacionária para a obtenção das frações contendo peptídeos. O processo de purificação dessas frações foi feito por HPLC em modo analítico e preparativo que permitiu o is... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Croton genus, the largest of the Euphorbiaceae family, is known for its richness of secondary metabolites of terpenic origin, such as the clerodanic ones. However, recent studies point to the presence of a class of compounds that has gained visibility and interest from scientists and pharmaceutical industries, the cyclic peptides. Natural peptides, especially those of a cyclic and low molecular weight nature (orbitides), represent a class of promising molecules for identification of hits and leads in drug discovery. In this perspective, this research deals with the study of two species from the Atlantic Forest: Croton floribundus and Croton campanulatus in the search for cyclic peptides, more precisely for orbitides. Thus, leaves and stems of both species, root from C. floribundus and latex from C. campanulatus were investigated in a small scale, and after these preliminary analyzes, the C. froribundus’ root and the latex from C. campanulatus were selected to continue the studies. The extraction process of the root's compounds of interest was performed by hydroethanolic maceration, while the latex extraction consisted by liquid-liquid partition with ethyl acetate. Then, these extracts were submitted to a chromatographic column using octadecylsilane (C18) as a stationary phase to obtain fractions containing peptides. The fractions purification process was carried out by analytical and preparative HPLC, which allowed the isolation of 2 compounds from C. campanulatus and 4 c... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vanderlan da Silva Bolzani / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Luis Octávio Regasini / Resumo: Peptídeos cíclicos compreendem uma classe de substâncias que ocorrem em algumas plantas superiores e que exibem uma ampla quantidade de atividades biológicas. Estes compostos bioativos vem despertando o interesse de setores estratégicos no desenvolvimento de fármacos e cosméticos devido sua característica cíclica, o que gera maior afinidade e seletividade para determinado alvo, isso ocorre pela restrição de rotação de suas ligações químicas. O estudo de orbitídeos presentes em Jatropha ribifolia e Croton sphaerogynus (Euphorbiaceae) foi dividido nas seguintes etapas: identificação e caracterização química dos compostos, síntese dos orbitídeos e atividade antitumoral. Neste estudo foi isolado e caracterizado o peptídeo ribifolina oriunda de J. ribifolia. Visando avaliar a polaridade e a carga da extremidade amino-terminal foi planejada a síntese de três peptídeos análogos, visto que substâncias com maior hidrofobicidade possuem maior atividade antitumoral de acordo com a literatura. Para tanto, o aminoácido serina foi substituído por alanina (não possui grupo hidroxila), treonina (possui um grupo metila adicional) e lisina (possui uma carga positiva na sua cadeia lateral). Os peptídeos foram sintetizados, purificados e avaliados em função anticâncer. Contudo, apenas o análogo da lisina cíclica gerou uma boa inibição de crescimento para as linhagens celulares de HCT-116 e MCF-7. Paralelamente, foi realizada a coleta da espécie C. sphaerogynus (caule e folhas) na cidade do Rio d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cyclic peptides comprise a class of naturally occurring compoundsin some higher plants and exhibit a wide range of biological activities. These bioactive compounds have aroused the interest from strategic sectors fordrugs and cosmetics development due to their cyclic characteristic, which generates greater affinity and selectivity used todetermine target,due the restriction of rotation of their chemical bonds. The study onorbitides present in Jatropha ribifoliaand Croton sphaerogynus(Euphorbiaceae) wasdivided into the following stages:identification and chemical characterization of compounds, synthesis of orbitidesand antitumor activity.In this study, ribifoline peptidefrom J. ribifoliawas isolated and characterized. In order to evaluate the polarity and the charged at the aminoterminus, the synthesis of three analogous peptides was planned, since substances with higher hydrophobicity have higher antitumor activity according to the literature. Therefore, the serine amino acid has been replaced by alanine (no hydroxyl group), threonine (has an additional methyl group) and lysine (has a positive charge on its side chain). The peptides were synthesized, purified and evaluated in anticancer activity. However, only the cyclic lysine analog generated good growth inhibition for the HCT-116 and MCF-7 cell lines. At the same time, the specie C. sphaerogynus(stem and leaves) was collected in the city Rio de Janeiro-RJ, the vegetal material was extracted in ethanol and fractionated in p... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vanderlan da Silva Bolzani / Co-orientador: Alberto José Cavalheiro / Banca: Humberto Márcio Santos Milagre / Banca: Alessandra Regina Pepe Ambrozin / Resumo: Os ciclotídeos são produtos natura is de estrutura polipeptídica, contendo de 2 8 a 37 resíduos de aminoácidos, sendo seis deles resíduos de cisteína, altamente conservados e formados por ligações dissulfeto as quais exib em ciclização tipo "cabeça - cauda". Ess e arranjo estrutura l característico co nfere aos ciclotí deos uma estabilidade excepcional e resistência à proteólise . Devido a estas peculiaridades moleculares os ciclotídeos são substâncias com importante s funç ões biológica s, entre elas, de stacam - se as de defesa e adaptação dos organismos que as acumulam . São de gran de interesse para agricultura, agindo como inseticida s e, no uso medicinal p or apresentarem atividades anti - HIV, anti - helmíntic a, antimicrobian a e efeitos uterotônicos . A presente dis sertação trata d o estudo de ciclotídeos isolados d a planta Noisettia orchidiflora (Rudge) Gingins, pertencente à família Violaceae, um táxon de ocorrência frequente n a Mata Atlântica . Já existem dados na literatura sobre o estudo de ciclotídeos das raíze s e o presente estudo é importante na medida que registra a ocorrência desta classe de substâncias e a sua caracterização nas folhas e galhos desta espécie, levando a informações mais completas sobre a ocorrência de ciclotídeos em Violaceae . A extração de c iclotídeos do material vegetal ( galhos e folhas secos e moído s ) foi feita mediante maceração hidrometanólica até esgotamento do material vegetal, seguid a de partição líquido - líquido com diclorometano. A fase polar foi concentrada e submetida à crom atografia em coluna, empregando octadecilsilano (C 18 ) como fase estacioná ria, obtendo - se frações ricas em peptídeos. O processo de purificação foi realizado p or HPLC preparativ o e/ou analític o com eluição gradiente, empregando - se acetonitrila e ág ua como fase móv e l, o que permitiu a obt... / Abstract: C yclotides are pol ypeptide str uctures, c omprise 2 8 - 37 amino acid residues, six of the m, are cysteine residues, highly conserved and formed by disulfide bonds, which exhibit "head - tail" cyclization type. This structural feature gives to cyclotides remarkable stability and resistance to proteolysis. Due to these singularities, such compound s have disclosed important biological functions . A mong the m ; the literature has highlighted important ecological properties as defense and adaptation of the organisms, which accumulate these natural products. Accordingly, they are of great interest to agri culture, acting as insecticide, and to medicine, since some compounds have displayed anti - HIV activity, anthelmintic, antimicrobial and uterotonic properties. This research deals with the study of cyclotides isolated Noisettia orchidiflora (Rudge) Gingins, belonging to the taxon Violaceae, which frequently occurs in the Atlantic Forest. There are several studies in the literature on the occurr ence of this class of compounds and their characterization in the leaves and branches of Violaceae plant species, le ading to more complete information on the occurrence of cyclotides, and their biological significance for these plants. The cyclotides extraction of plant material (dried and ground branches and leaves) was carried out by maceration with methanol/water, fo llowed by a liquid - liquid partition with dichloromethane. The polar phase was concentrated and subjected to chromatographic column using octadecylsilane (C 18 ) as stationary phase, achieving several fractions rich in peptides. The purification process was p erformed by analytical and/or preparative HPLC, in gradient of acetonitrile and water as mobile phase, which led to the isolation of the cyclotides. The amino acid sequence (primary structure) of the isolated compounds was established by MALDI - TOF /TOF by r eduction and alkylation re... / Mestre

O uso de peptídeos na terapêutica apresenta inúmeras limitações, desde características físico-químicas até perfil farmacocinético inadequado para absorção oral. Entretanto, novas estratégias sintéticas para redução de custos e aumento da estabilidade química e metabólica de peptídeos, associada a vias alternativas de administração foram desenvolvidas e permitiram o acesso a essas moléculas no mercado farmacêutico. Diante disso, peptídeos naturais bioativos, subexplorados do ponto de vista químico medicinal, são considerados bons protótipos para o desenvolvimento de biblioteca de análogos não-naturais, gerando informações relevantes para a compreensão da relação entre a estrutura química e a atividade biológica destes compostos. No presente estudo, os peptídeos cíclicos rufomicina B (tuberculostático), chaiyaphumine A (anti-malárico), ciclozantoxilano A e desotamide B (antibiótico) foram estudados do ponto de vista sintético sob diferentes metodologias. Para tal, os aminoácidos Fmoc-N-Metil-L-Leucina e Fmoc-L-crotil-glicina foram sintetizados com rendimentos satisfatórios para síntese do antibiótico rufomicina B. O aminoácido Fenil-acetil-L-treonina foi obtido em bons rendimentos e a síntese de chaiyaphumine A e derivado foi testada em fase sólida, em solução e empregando combinação dos dois métodos. O peptídeo desotamide B e ciclozantoxilano A foram sintetizados, mesmo que em baixo rendimentos, em fase sólida com ciclização solução. Ainda, a síntese de desotamide B também foi possível através da metodologia \"safety-catch\". Por fim, realizamos análise sistemática das propriedades físico-químicas e estruturais dos peptídeos no mercado e em fase clínica e comparamos os resultados obtidos com os alvos desse estudo / The use of peptides in therapy presents several limitations, from physicochemical characteristics to inadequate pharmacokinetic profile for oral absorption. However, new synthetic strategies for cost reduction and increase of the chemical and metabolic stability of peptides associated with alternative routes of administration were developed and allowed access to these molecules in the pharmaceutical market. Therefore, natural bioactive peptides, is an underexploited class from the medicinal chemist\'s point of view, are considered good prototypes for the development of similar series, generating information relevant to understanding the relationship between chemical structure and biological activity of these compounds. In the present study, cyclic peptides rufomycin B (antituberculosis activity), chaiyaphumine A (anti-malarial), cyclozanthoxylane A and desotamide were studied from the synthetic point of view, through different metodologies. In this sense, the amino acids Fmoc-N-Methyl-L-Leu and Fmoc-L-crotyl-Gly were synthetized in good yields for the total synthesis of rufomycin B. The amino acid Phenyl-acetyl-L-threonine was obtained in high yield and the synthetic studies on the chaiyaphumine A and analogue has been performed in solution and solid phase peptide synthesis and also through the combination of the 2 methods. The peptides desotamide B and cyclozanthoxylane A were synthetized, in low yields, in solid phase and in solution cyclization. Desotamide B could also be synthetized through safety-catch solid phase method. At end, we performed a systematic review of the physical chemical properties of all market and on clinical trial peptide drugs and we compared the results with the target molecules in this study.

As florações de cianobactérias em reservatórios de águas utilizadas para consumo humano são freqüentes hoje em dia e normalmente são atribuídas à crescente eutrofização destas águas. Em anos recentes o aparecimento de linhagens de cianobactérias produtoras de toxinas tem preocupado bastante os responsáveis pelo monitoramento da qualidade das águas, uma vez que estas toxinas representam risco para a saúde pública. A detecção precoce da presença de linhagens tóxicas nesses reservatórios é essencial para que ações corretivas de controle das florações tenham sucesso. No presente trabalho, a diversidade de cianobactérias presentes em alguns locais das represas Billings e Guarapiranga foi avaliada utilizando a técnica de DGGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante) e/ou construções de mini-bibliotecas de amplicons do gene de rRNA 16S e da região do espaço intergênico da ficocianina (PC-IGS). A DGGE, utilizando os iniciadores CYA359F/CYA781R específicos para o gene de rRNA 16S de cianobactérias, mostraram que estes organismos estavam presentes nas onze amostras de água analisadas. Microcystis aeruginosa (94-97% de identidades), Geitlerinema (89% de identidade) e Synechococcus (89% de identidade) puderam ser identificadas. A mini-biblioteca construída com os amplicons de rRNA 16S obtidos usando os iniciadores 27F1/1494Rc produziu seqüências de outro grupo de bactéria (Actinobacteria), indicando a inespecificidade desses iniciadores. Entretanto, na mini-biblioteca construída com os amplicons de PC-IGS obtidos usando os iniciadores PCβF/PCαR, somente seqüências de cianobactérias foram geradas. Nessa mini-biblioteca foram identificadas várias linhagens de Microcystis aeruginosa (98-100% de identidades) e também de Anabaena (89% de identidade). Esses dois gêneros de cianobactérias conhecidos por produzirem microcistinas, foram detectados na amostra de água que continha alta concentração desta toxina (23,49 μg/L). Os oligonucleotídeos iniciadores OMETF/OMETR foram desenhados para amplificar uma região pequena e variável do domínio da N-metiltransferase do gene mcyA e foram testados em treze espécies de cianobactérias isoladas das represas Billings e Guarapiranga. Seqüências geradas por esses iniciadores foram isoladas, clonadas e sequenciadas com sucesso em duas espécies controle (M. aeruginosa NPJB1 e M. panniformis SPC702) e em dois isolados das represas (M. aeruginosa SPC777 e M. protocystis SPC697). A amplificação dessa região do mcyA a partir dos DNAs dos isolados de cianobactérias permitiu identificar linhagens do gênero Microcystis potencialmente produtoras da toxina microcistina. Essa técnica uma vez bem estabelecida para organismos isolados, poderá proporcionar base suficiente para uma melhor detecção de comunidades aquáticas de cianobactérias potencialmente produtoras de microcistinas em ambientes naturais. / Cyanobacterial blooms in water reservoirs used for human consumption are frequent nowadays and are usually attributed to the increasing water eutrophization. In recent years, the appearance of toxin-producing cyanobacterial strains has concerned managers of water quality since these toxins represent a public health risk. Early detection of the presence of toxic strains in these reservoirs is essential for the success of bloom control corrective actions. In the present work, cyanobacterial diversity was evaluated in several sites of Billings and Guarapiranga reservoirs using DGGE (denaturing gradient gel eletrophoresis) and/or mini-library constructions of both 16S rRNA gene and phycocyanin intergenic spacer (PC-IGS) region amplicons. The DGGE, using CYA359F/CYA781R primers, specific for cyanobacterial 16S rRNA gene, showed the presence of these organisms in the eleven water samples analyzed. Microcystis aeruginosa (identities of 94-97%), Geitlerinema (identity of 89%) and Synechococcus (identity of 89%) were identified. The mini-library constructed with 16S rRNA amplicons obtained using 27F1/1494Rc primers produced sequences of another group of bacteria (Actinobacteria), indicating the unespecificity of these primers. However, the mini-library constructed with PC-IGS amplicons obtained using PCβF/PCαR primers, generated cyanobacterial sequences only. In this mini-library several Microcystis aeruginosa strains (identities of 98-100%) and Anabaena (identity of 89%) were identified. These two cyanobacterial genera known to produce microcystins were detected in a water sample containing a high concentration of this toxin (23.49 g/L). The OMETF/OMETR primers were designed to amplify a small and variable region of the N-methyltransferase domain of mcyA gene and were tested in thirteen cyanobacterial strains isolated from Billings and Guarapiranga reservoirs. Sequences generated with these primers were successfully isolated, cloned and sequenced in two control species (M. aeruginosa NPJB1 and M. panniformis SPC702) and in two isolates from these reservoirs (M. aeruginosa SPC777 and M. protocystis SPC697). The amplification of this region of mcyA using cultured cyanobacteria DNAs allowed the identification of Microcystis strains with the potential to produce microcystin toxin. This technique, after it is well established for cultured organisms, will provide a basis for better detection of potential microcystin-producing cyanobacterial aquatic communities in natural environments.

Submitted by ANTONIO FERNANDEZ BOBEY null (antoniofernandezbobey86@yahoo.es) on 2016-04-12T19:44:51Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Versão Final_ Repositorio Unesp.pdf: 2495633 bytes, checksum: f7ff8d9ec49134a24d9a1082b09926dc (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-04-15T17:37:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandezbobey_a_me_araiq_par.pdf: 909965 bytes, checksum: 12ae7f0b3b5f6a97678bcbd7f2a70506 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-15T17:37:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandezbobey_a_me_araiq_par.pdf: 909965 bytes, checksum: 12ae7f0b3b5f6a97678bcbd7f2a70506 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os ciclotídeos são produtos naturais de estrutura polipeptídica, contendo de 28 a 37 resíduos de aminoácidos, sendo seis deles resíduos de cisteína, altamente conservados e formados por ligações dissulfeto as quais exibem ciclização tipo "cabeça-cauda". Esse arranjo estrutural característico confere aos ciclotídeos uma estabilidade excepcional e resistência à proteólise. Devido a estas peculiaridades moleculares os ciclotídeos são substâncias com importantes funções biológicas, entre elas, destacam-se as de defesa e adaptação dos organismos que as acumulam. São de grande interesse para agricultura, agindo como inseticidas e, no uso medicinal por apresentarem atividades anti-HIV, anti-helmíntica, antimicrobiana e efeitos uterotônicos. A presente dissertação trata do estudo de ciclotídeos isolados da planta Noisettia orchidiflora (Rudge) Gingins, pertencente à família Violaceae, um táxon de ocorrência frequente na Mata Atlântica. Já existem dados na literatura sobre o estudo de ciclotídeos das raízes e o presente estudo é importante na medida que registra a ocorrência desta classe de substâncias e a sua caracterização nas folhas e galhos desta espécie, levando a informações mais completas sobre a ocorrência de ciclotídeos em Violaceae. A extração de ciclotídeos do material vegetal (galhos e folhas secos e moídos) foi feita mediante maceração hidrometanólica até esgotamento do material vegetal, seguida de partição líquido-líquido com diclorometano. A fase polar foi concentrada e submetida à cromatografia em coluna, empregando octadecilsilano (C18) como fase estacionária, obtendo-se frações ricas em peptídeos. O processo de purificação foi realizado por HPLC preparativo e/ou analítico com eluição gradiente, empregando-se acetonitrila e água como fase móvel, o que permitiu a obtenção das substâncias. A sequência de aminoácidos (estrutura primária) dos ciclotídeos isolados foi estabelecida por Espectrometria de Massas MALDI-TOF/TOF com o auxílio das reações de redução, alquilação e digestão enzimática empregando as enzimas: endoproteinase de ácido glutâmico (endoGlu-C), tripsina e quimiotripsina. Também, foi realizada a análise de aminoácidos das substâncias, permitindo a quantificação de cada aminoácido presente. A presente pesquisa resultou no isolamento de seis compostos de galhos e três oriundos de folhas, totalizando sete diferentes possíveis ciclotídeos, visto que dois deles foram comuns para ambos os tecidos. Até o momento foi possível determinar a estrutura primária de quatro deles: Os ciclotídeos Nor B (substância F20-2), massa molecular 3180,416 Da, Nor C (substância F20-3), massa molecular 3282,472 Da, Nor D (substância F17-1), massa molecular 3249,474 Da e Nor E (substância F21-1), massa molecular 3170,472 Da. Todos eles reportados pela primeira vez no presente estudo. As demais substâncias isoladas se encontram em processo caracterização estrutural. / Cyclotides are polypeptide structures, comprise 28-37 amino acid residues, six of them, are cysteine residues, highly conserved and formed by disulfide bonds, which exhibit "head-tail" cyclization type. This structural feature gives to cyclotides remarkable stability and resistance to proteolysis. Due to these singularities, such compounds have disclosed important biological functions. Among them; the literature has highlighted important ecological properties as defense and adaptation of the organisms, which accumulate these natural products. Accordingly, they are of great interest to agriculture, acting as insecticide, and to medicine, since some compounds have displayed anti-HIV activity, anthelmintic, antimicrobial and uterotonic properties. This research deals with the study of cyclotides isolated Noisettia orchidiflora (Rudge) Gingins, belonging to the taxon Violaceae, which frequently occurs in the Atlantic Forest. There are several studies in the literature on the occurrence of this class of compounds and their characterization in the leaves and branches of Violaceae plant species, leading to more complete information on the occurrence of cyclotides, and their biological significance for these plants. The cyclotides extraction of plant material (dried and ground branches and leaves) was carried out by maceration with methanol/water, followed by a liquid-liquid partition with dichloromethane. The polar phase was concentrated and subjected to chromatographic column using octadecylsilane (C18) as stationary phase, achieving several fractions rich in peptides. The purification process was performed by analytical and/or preparative HPLC, in gradient of acetonitrile and water as mobile phase, which led to the isolation of the cyclotides. The amino acid sequence (primary structure) of the isolated compounds was established by MALDI-TOF/TOF by reduction and alkylation reactions as well as enzymatic digestion using the enzymes: endoproteinase glutamic acid (endoGlu-C), trypsin and chymotrypsin. Also, the quantification of each amino acid present in the cyclotide structures was performed, and this amino acid analysis was fundamental for the characterization of these substances. Therefore, this research resulted in the isolation of the six compounds accumulated in the branches, and 3 of them were also found in the leaves. A complete analysis of all peptides suggested that seven are cyclotides, while two of them were common for both twigs and leaves tissues. Until now it was possible to determine the primary structure of four cyclotides, which is being described in plants for the first time: The cyclotides Nor B (F20-2 substance), molecular weight 3180.416 Da, Nor C (F20-3 substance), molecular weight 3282.472 Da, Nor D (substance F17-1), molecular mass 3249.474 Da Nor E (F21-1 substance), molecular weight 3170.472 Da. All these cyclotides are being reported for the first time in this study, however, 3 of these are currently under further analytical studies aimed at the complete structural characterization. / CNPq: 133418/2014-6

As florações de cianobactérias em reservatórios de águas utilizadas para consumo humano são freqüentes hoje em dia e normalmente são atribuídas à crescente eutrofização destas águas. Em anos recentes o aparecimento de linhagens de cianobactérias produtoras de toxinas tem preocupado bastante os responsáveis pelo monitoramento da qualidade das águas, uma vez que estas toxinas representam risco para a saúde pública. A detecção precoce da presença de linhagens tóxicas nesses reservatórios é essencial para que ações corretivas de controle das florações tenham sucesso. No presente trabalho, a diversidade de cianobactérias presentes em alguns locais das represas Billings e Guarapiranga foi avaliada utilizando a técnica de DGGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante) e/ou construções de mini-bibliotecas de amplicons do gene de rRNA 16S e da região do espaço intergênico da ficocianina (PC-IGS). A DGGE, utilizando os iniciadores CYA359F/CYA781R específicos para o gene de rRNA 16S de cianobactérias, mostraram que estes organismos estavam presentes nas onze amostras de água analisadas. Microcystis aeruginosa (94-97% de identidades), Geitlerinema (89% de identidade) e Synechococcus (89% de identidade) puderam ser identificadas. A mini-biblioteca construída com os amplicons de rRNA 16S obtidos usando os iniciadores 27F1/1494Rc produziu seqüências de outro grupo de bactéria (Actinobacteria), indicando a inespecificidade desses iniciadores. Entretanto, na mini-biblioteca construída com os amplicons de PC-IGS obtidos usando os iniciadores PCβF/PCαR, somente seqüências de cianobactérias foram geradas. Nessa mini-biblioteca foram identificadas várias linhagens de Microcystis aeruginosa (98-100% de identidades) e também de Anabaena (89% de identidade). Esses dois gêneros de cianobactérias conhecidos por produzirem microcistinas, foram detectados na amostra de água que continha alta concentração desta toxina (23,49 μg/L). Os oligonucleotídeos iniciadores OMETF/OMETR foram desenhados para amplificar uma região pequena e variável do domínio da N-metiltransferase do gene mcyA e foram testados em treze espécies de cianobactérias isoladas das represas Billings e Guarapiranga. Seqüências geradas por esses iniciadores foram isoladas, clonadas e sequenciadas com sucesso em duas espécies controle (M. aeruginosa NPJB1 e M. panniformis SPC702) e em dois isolados das represas (M. aeruginosa SPC777 e M. protocystis SPC697). A amplificação dessa região do mcyA a partir dos DNAs dos isolados de cianobactérias permitiu identificar linhagens do gênero Microcystis potencialmente produtoras da toxina microcistina. Essa técnica uma vez bem estabelecida para organismos isolados, poderá proporcionar base suficiente para uma melhor detecção de comunidades aquáticas de cianobactérias potencialmente produtoras de microcistinas em ambientes naturais. / Cyanobacterial blooms in water reservoirs used for human consumption are frequent nowadays and are usually attributed to the increasing water eutrophization. In recent years, the appearance of toxin-producing cyanobacterial strains has concerned managers of water quality since these toxins represent a public health risk. Early detection of the presence of toxic strains in these reservoirs is essential for the success of bloom control corrective actions. In the present work, cyanobacterial diversity was evaluated in several sites of Billings and Guarapiranga reservoirs using DGGE (denaturing gradient gel eletrophoresis) and/or mini-library constructions of both 16S rRNA gene and phycocyanin intergenic spacer (PC-IGS) region amplicons. The DGGE, using CYA359F/CYA781R primers, specific for cyanobacterial 16S rRNA gene, showed the presence of these organisms in the eleven water samples analyzed. Microcystis aeruginosa (identities of 94-97%), Geitlerinema (identity of 89%) and Synechococcus (identity of 89%) were identified. The mini-library constructed with 16S rRNA amplicons obtained using 27F1/1494Rc primers produced sequences of another group of bacteria (Actinobacteria), indicating the unespecificity of these primers. However, the mini-library constructed with PC-IGS amplicons obtained using PCβF/PCαR primers, generated cyanobacterial sequences only. In this mini-library several Microcystis aeruginosa strains (identities of 98-100%) and Anabaena (identity of 89%) were identified. These two cyanobacterial genera known to produce microcystins were detected in a water sample containing a high concentration of this toxin (23.49 g/L). The OMETF/OMETR primers were designed to amplify a small and variable region of the N-methyltransferase domain of mcyA gene and were tested in thirteen cyanobacterial strains isolated from Billings and Guarapiranga reservoirs. Sequences generated with these primers were successfully isolated, cloned and sequenced in two control species (M. aeruginosa NPJB1 and M. panniformis SPC702) and in two isolates from these reservoirs (M. aeruginosa SPC777 and M. protocystis SPC697). The amplification of this region of mcyA using cultured cyanobacteria DNAs allowed the identification of Microcystis strains with the potential to produce microcystin toxin. This technique, after it is well established for cultured organisms, will provide a basis for better detection of potential microcystin-producing cyanobacterial aquatic communities in natural environments.

Diante da ausência de tratamentos eficazes para a esclerose múltipla (EM) e sabendo que compostos animais têm sido usados como protótipos para o desenvolvimento de novas drogas, avaliamos o efeito do Tnp, um peptídeo cíclico inédito e com potencial antiinflamatório derivado do veneno de Thalassophryne nattereri, na encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo representativo da EM. Demonstramos que o Tnp em distintos esquemas de tratamento por mecanismos também dependentes de IL-10 consegue diminuir a intensidade dos sintomas clínicos e adiar o pico de aparecimento dos sintomas graves na EAE por suprimir DC convencionais e propiciar DC plasmocitóides; por bloquear a infiltração de leucócitos e a reativação de clones Th1, Th17, microglia e macrófagos no SNC; por favorecer o aumento de células reguladoras e ainda por ultrapassar a BHE e alcançar o órgão alvo. O Tnp atenua a neuroinflamação e previne a desmielinização, refletindo assim na melhoria dos sinais clínicos na EAE, tornando-se um importante candidato para o tratamento da EM. / Given the lack of effective treatments for multiple sclerosis (MS) and knowing that venomous have been used as prototype for the development of new drugs here we evaluated the effect of the Tnp, a described antiinflammatory cyclic peptide identified in the venom of Thalassophryne nattereri, on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a representative model of MS. We found that distinct treatments of Tnp by mechanisms also dependent on IL-10 significantly reduced the clinical severity of EAE. Tnp was related with: suppression of the activation state of conventional DC and the emergence of plasmacytoid DC; blocking the leukocyte infiltration and the reactivation of Th1, Th17, microglia cells and macrophages in the CNS; increasing of regulatory cells and also Tnp can overcome the BBB and reach the target organ. Tnp can reduce the severity of symptoms and delay the peak of onset of severe symptoms. These results shed light on the role of Tnp a small molecule in the regulation of inflammation and provides a new therapeutic opportunity for the treatment of MS.

Diante da ausência de tratamentos eficazes para a esclerose múltipla (EM) e sabendo que compostos animais têm sido usados como protótipos para o desenvolvimento de novas drogas, avaliamos o efeito do Tnp, um peptídeo cíclico inédito e com potencial antiinflamatório derivado do veneno de Thalassophryne nattereri, na encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo representativo da EM. Demonstramos que o Tnp em distintos esquemas de tratamento por mecanismos também dependentes de IL-10 consegue diminuir a intensidade dos sintomas clínicos e adiar o pico de aparecimento dos sintomas graves na EAE por suprimir DC convencionais e propiciar DC plasmocitóides; por bloquear a infiltração de leucócitos e a reativação de clones Th1, Th17, microglia e macrófagos no SNC; por favorecer o aumento de células reguladoras e ainda por ultrapassar a BHE e alcançar o órgão alvo. O Tnp atenua a neuroinflamação e previne a desmielinização, refletindo assim na melhoria dos sinais clínicos na EAE, tornando-se um importante candidato para o tratamento da EM. / Given the lack of effective treatments for multiple sclerosis (MS) and knowing that venomous have been used as prototype for the development of new drugs here we evaluated the effect of the Tnp, a described antiinflammatory cyclic peptide identified in the venom of Thalassophryne nattereri, on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a representative model of MS. We found that distinct treatments of Tnp by mechanisms also dependent on IL-10 significantly reduced the clinical severity of EAE. Tnp was related with: suppression of the activation state of conventional DC and the emergence of plasmacytoid DC; blocking the leukocyte infiltration and the reactivation of Th1, Th17, microglia cells and macrophages in the CNS; increasing of regulatory cells and also Tnp can overcome the BBB and reach the target organ. Tnp can reduce the severity of symptoms and delay the peak of onset of severe symptoms. These results shed light on the role of Tnp a small molecule in the regulation of inflammation and provides a new therapeutic opportunity for the treatment of MS.