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Purificação e atividade antibacteriana de peptídios sintetizados durante a germinação de sementes de soja (Glycine Max [L.] Merrill) / Purification and Antibacterial Activity of Synthesized Peptides During the Germination of Soybean Seeds (Glycine Max [L.] Merrill)Barbosa, Meire de Oliveira 30 July 2004 (has links)
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Previous issue date: 2004-07-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Peptídios antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível, com consumo mínimo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs como parte da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Este trabalho visou identificar e purificar peptídios de sementes de soja sintetizados durante a germinação e avaliar a atividade antibacteriana, com o objetivo de desenvolver defensivos agrícolas naturais e agentes antimicrobianos para as indústrias farmacêutica e veterinária. Sementes de soja da variedade UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) foram germinadas por 24, 48, 72 e 96 h, trituradas e maceradas em 2,5 volumes do tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 contendo EDTA, PMSF e benzamidina. As sementes não germinadas foram moídas e adicionadas de tampão fosfato de sódio 25 mM na proporção de 1:5, contendo KCL, EDTA, tiouréia, PMSF e benzamidina. Os homogenatos de ambas foram mantidos sob agitação branda em geladeira por 2 h, centrifugados, e os sobrenadantes foram precipitados com sulfato de amônio. Cada sobrenadante foi aquecido a 80oC/15 min para precipitação diferencial de proteínas, e centrifugado. Seguiu-se cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-Sepharose com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, em equipamento tipo FPLC. O pool catiônico obtido foi submetido à cromatografia de troca catiônica em coluna CM-Sepharose com tampão MES 25 mM, pH 6,0, em equipamento tipo FPLC, e o pico eluído em 0,35 M de NaCl foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18-HPLC. Os perfis obtidos após cromatografia de fase reversa das sementes germinadas e não germinadas foram comparados para análise dos AMPs sintetizados durante a germinação. A semente germinada por 48 h mostrou duas regiões de síntese de diferentes proteínas. Foram realizados testes de atividade antimicrobiana utilizando o pool catiônico após troca aniônica e o pico eluído com 0,35 M de NaCl após troca catiônica, para as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum (gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (gram- positiva), mostrando inibição parcial e total para os extratos após troca aniônica e catiônica, respectivamente. Paralelamente, análises de espectrometria de massa com os extratos obtidos após RP-HPLC indicaram a presença de peptídio de 1 a 9 kDa e de proteína de massa maior que 20 kDa, em regiões do perfil cromatográfico correspondentes à eluição em concentrações inferiores e superiores a 40% de acetonitrila, respectivamente. Outros picos peptídicos sintetizados durante a germinação por 48, estão sendo submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídios efetivos contra fitopatógenos de interesse. / Purification and Antibacterial Activity of Synthesized Peptides During the Germination of Soybean Seeds (Glycine Max [L.] Merrill). Adiver: Maria Cristina Baracat Pereira. Committee Members: Elizabeth Pacheco Batista Fontes and Reginaldo da Silva Romeiro. Antimicrobial peptídes (AMPs) they are produced by animals, plants, insects and other organisms as strategy of efficient, flexible defense, with minimum consumption of energy and biomass, in function of its small size. In plants, they were identified ten families of AMPs as part of the constituent barrier of defense of the plant, with molecular masses that vary of 2 to 9 kDa. This work aiming t to identify and to purify peptides of soybean seeds synthesized during the germination and to evaluate the antibacterial activity, objectifying the development of defensive agricultural natural and agents antimicrobial for the pharmaceutical and veterinary industries. Soybean of seeds of the variety UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) they were germinated by 24, 48, 72 and 96 h, triturated in the proportion of 1:2,5 using Tris-HCl buffer 0,1 M, pH 7,0 contends EDTA, PMSF and benzamidine. The no germinated seeds were triturated and added of phosphate of sodium buffer 25 mM in the proportion of 1:5, containing KCL, EDTA, thiourea, PMSF and benzamidine. . Both obtained extracts were maintained under agitation and ice-bath in refrigerator for 2 h, and centrifuged . As the first step of purification procedure, protein extracts were recovered after ammonium sulfate precipitation and centrifugation, heating up to 80oC/15 min for precipitation of proteins and a new centrifugation. Anion-exchange chromatography was followed in column DEAE-Sepharose using Tris-HCl buffer, 25 mM, pH 7.0 in equipment type FPLC. The obtained cationic pool was submitted to the cationic exchange cromatography in column CM Sepharose using MES buffer 25 mM, pH 6,0, in equipment type FPLC, and a fraction were recovered in NaCl 0,35 M, that was submitted to a C18- RP-HPLC. The obtained RP-HPLC profiles of the germinated and no-germinated seeds were compared each other and two different groups of proteins were observed when seeds were germinated by 48 h, if compared with no-germinated seeds, indicating expression of different proteins. Tests of antimicrobial activity were realized using the anionic-exchange pool and the cationic exchange-pool, against the plant pathogens Ralstonia solanacearum (Gram-negative) and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Gram-positive), showing partial- or full-inhibition, respectively . Simultaneously, analysis of mass spectrometry with the C18-RP-HPLC extracts shows peptides (1 to 9 kDa) and proteins (20 kDa in areas of the profile cromatography corresponding to the eluted in inferior and superior concentrations at 40% of acetonitrile). Other peptide fractions were submitted to the mass spectrometry analysis, amino acids-sequence determination, and antimicrobial test, aiming to select effective peptides to control important plant patogens of commercial interest. / Dissertação importada do Alexandria
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Papel regulatório da Anexina-1 e de seu derivado Ac2-26 no modelo murino de silicose agudaTrentin, Patrícia Gonçalves January 2011 (has links)
Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:57:07Z
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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A silicose, uma doença ocupacional causada pela inalação de partículas de sílica
cristalina, é caracterizada por intensa resposta inflamatória seguida de fibrose e
formação de granulomas, e até o momento permanece sem tratamento efetivo. O
processo inflamatório é regulado fisiologicamente por agentes antiinflamatórios
endógenos que são capazes impedir a sua exacerbação. Glicocorticóides
endógenos, cuja parte de suas ações antiinflamatórias são mediadas pela proteína
anexina-1 (ANX-1), fazem parte desse contexto. No presente estudo, investigamos o
papel da proteína ANX-1, e de seu derivado peptídico Ac2-26 (50 - 200 µg), na fase
aguda da silicose. O esteróide clássico, dexametasona (25 µg; Dexa), foi utilizado
como controle. A instilação intranasal de sílica (10 mg) em camundognos Swiss-
Webster desencadeou a ocorrência de aumento no nível basal de resistência e
elastância pulmonar, e hiperreatividade das vias aéreas ao agente colinérgico
metacolina. Este quadro mostrou-se associado um intenso infiltrado inflamatório e
deposição de colágeno, com formação de granulomas. O tratamento com Ac2-26
inibiu acentuadamente o infiltrado leucocitário, a deposição de colágeno e a
formação de granulomas nos animais silicóticos, condições que foram apenas
parcialmente afetadas pela Dexa. A geração de citocinas (TNFαe TGFβ) e
quimiocinas (KC e MCP-1) foi reduzida pelo peptídeo, porém não pela Dexa. O
aumento da resistência e da elastância pulmonar, assim como a hiperreatividade à
metacolina, foram inibidos tanto pelo peptídeo comopela Dexa. In vitro, os
fibroblastos pulmonares estimulados com IL-13 e TGFβtiveram a produção de
colágeno e MCP-1 inibida pelo peptídeo Ac 2-26, resposta dependente de sua ação
em receptores FPR1 e FPR2. A proliferação celular não foi afetada pelo peptídeo.
De forma paralela, vimos que os animais nocautes para a proteína ANX-1 e
silicóticos apresentaram intensificação do infiltrado inflamatório, deposição de
colágeno e produção de citocinas (KC, MIP-2 e TNFα) no parênquima pulmonar. A
deficiência da ANX-1 não alterou a resistência pulmonar de animais silicóticos,
porém a elastância mostrou-se exacerbada. Verificamos, ainda, que os animais
nocautes para ANX-1 controles mostraram-se mais responsivos à estimulação com
metacolina, porém não à serotonina, fenômeno verificado também quando da
avaliação da resposta contrátil de anéis de traquéia ex-vivo. Em conjunto, nossos
resultados mostram, de forma original, que o peptídeo Ac 2-26 foi capaz de inibir o
componente inflamatório e fibrótico da fase aguda da silicose, indicando ser este um
composto promissor para utilização no tratamento dedoenças inflamatórias
fibróticas como a silicose. Além disso, demonstramos que a ausência da ANX-1
exacerbou a fase aguda da silicose, reforçando achados prévios que apontam para
a atividade antiinflamatória desta proteína também ao nível de fisiopatologias
pulmonares. / Silicosis is an occupational disease caused by inhalation of crystalline silica particles
and is characterized by an intense inflammatory response followed by fibrosis and
granuloma formation. There is no effective treatment for silicosis until now. The
inflammatory process is physiologically regulated by endogenous antiinflammatory
agents that are able to prevent its exacerbation. Endogenous glucocorticoids, which
have part of their antiinflammatory actions mediated by the protein annexin-1
(ANX1), are very important in that context. We investigated the role of ANX1, and its
derived peptide, Ac2-26 (50 - 200 µg) on the acute silicosis. The classical steroid
dexamethasone (25 µg; Dexa) was used as a control. The intranasal instillation of
silica (10 mg) in mice induced an increase of the baseline of pulmonary resistance
and elastance and airways hyperreactivity to bronchoconstrictor methacholine,
associated with an intense inflammation and collagen deposition with granuloma
formation. Treatment with Ac2-26 inhibited markedlyleukocyte infiltration, collagen
deposition and granuloma in silicotic Swiss-Webstermice, phenomena partially
affected by Dexa. The generation of cytokines (TNFαand TGFβ) and chemokines
(KC and MCP- 1) was inhibited by Ac2-26 but not by Dexa. Increased lung resistance
and elastance as well as airways hyperreactivity tomethacholine were abolished by
Dexa and Ac2-26. In vitro, incubation of lung fibroblasts with Ac2-26 inhibited IL-13
and TGFβcollagen and MCP-1 production, a response mediatedby FPR1 and FPR2
receptors. Cell proliferation was not affected by the peptide. In parallel, we found that
silicotic ANX1 knockout mice showed more intense inflammatory infiltrate, collagen
deposition and mediator production (KC, MIP-2 and TNFα) in the lung parenchyma.
ANX1 deficient mice deficient showed exacerbation of elastance, but not of
pulmonary resistance. Airways hyperreactivity in silicotic mice was more intense
under condition of stimulation with methacholine. Interestingly, we showed that the
ANX1 knockout mice were more responsive to methacholine stimulation, but not to
serotonin, a phenomenon also observed in the systemof tracheal ring contraction ex-
vivo. Taken together, our results show that the Ac2-26 peptide was able to inhibit the
inflammatory and fibrotic components of the acute phase of silicosis, indicating that
this compound is a promising tool for future use inthe treatment of inflammatory
diseases such as silicosis. Furthermore, we demonstrated that the absence of ANX1
exacerbated the acute phase of silicosis, reinforcing previous findings and showing
that the antiinflammatory activity of this protein is also extended to the respiratory
system. A potential regulatory role of ANX1 of the contractile response of the airways
was also proposed.
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Termolisina como catalisador na síntese de DI- e tripeptídeos contendo asparagina / Thermolysin as a catalyst in the synthesis of di-and tripeptides containing asparagineMachini, Maria Teresa 26 March 1985 (has links)
Com o objetivo de estudar a potencialidade do emprego de termolisina como catalisador nas reações de incorporação de N-acil-asparagina a ésteres de aminoácidos e peptídeos, foram sintetizados os seguintes di- e tripeptídeos: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu- OBzl, Z-Asn-Leu-OBzl, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe- OEt, Z-Asn-Val-OBzl, Moz-Asp-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn- Ile-Phe-OBzl. Todos os peptídeos foram obtidos na forma pura, com bom rendimento e foram analisados e caracterizados por cromatografia em camada delgada, ponto de fusão, análise elementar, análise de aminoácidos e ressonância magnética protônica. Entre os grupos protetores de asparagina, benziloxicarbonil e p-metoxibenziloxicarbonil permitiram a obtenção dos dipeptídeos com excelentes rendimentos. Foi observado que os tripeptídeos requerem para a sua síntese menores concentração de enzima e tempo de reação em relação aos dipeptídeos. Não foi possível estabelecer a especificidade secundária da termolisina para o resíduo P\'2 pois os rendimentos dos tripeptídeos sintetizados não apresentaram diferença significativa. Foi também realizado um estudo metodológico para determinar as condições ótimas de síntese de Boc-Asn-Ile-OBzl, que consistiu em analisar a influência do pH, concentração de enzima, concentraçao e volume da solução de acetato de sódio, proporção entre os componentes carboxílico e amínico, temperatura e adição de solvente orgânico ao meio de reação. / With de objective of studying the potential for the use of thermolysin as a catalyst in reactions of incorporation of N-acyl-asparagine into esters of aminoacids and peptides, the following di- and tripeptides were synthesized: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OBzI, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl,Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Z-Asn-Phe-OEt, Z-Asn-Val-OEt, Moz-Asn-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn-Ile-Phe-OBzl. All of these peptides were obtained in pure form in good yield and analyzed and characterized by thin layer chromatography, melting point, elemental analysis, aminoacid analysis and proton magnetic resonance. Among the protecting groups of asparagine, benzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl gave excellent yields of the dipeptides. Relative to the dipeptides, the synthesis of the tripeptides was found to require lower enzyme concentrations and temperatures. Since the yields of the tripeptides failed to exhibit significant differences, it was not possible to establish the existence of a secondary specificity of thermolysin for the residue P\' 2 . A methodological study was also performed to determine the optimum conditions for synthesis of Boc-Asn-Ile-OBzl. This study consisted of an analysis of the influence of pH, enzyme concentration, concentration and volume of the solution of sodium acetate, relative proportions of the carboxyl and amino components, temperature, and addition of organic solvent to the reaction medium.
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Termolisina como catalisador na síntese de DI- e tripeptídeos contendo asparagina / Thermolysin as a catalyst in the synthesis of di-and tripeptides containing asparagineMaria Teresa Machini 26 March 1985 (has links)
Com o objetivo de estudar a potencialidade do emprego de termolisina como catalisador nas reações de incorporação de N-acil-asparagina a ésteres de aminoácidos e peptídeos, foram sintetizados os seguintes di- e tripeptídeos: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu- OBzl, Z-Asn-Leu-OBzl, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe- OEt, Z-Asn-Val-OBzl, Moz-Asp-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn- Ile-Phe-OBzl. Todos os peptídeos foram obtidos na forma pura, com bom rendimento e foram analisados e caracterizados por cromatografia em camada delgada, ponto de fusão, análise elementar, análise de aminoácidos e ressonância magnética protônica. Entre os grupos protetores de asparagina, benziloxicarbonil e p-metoxibenziloxicarbonil permitiram a obtenção dos dipeptídeos com excelentes rendimentos. Foi observado que os tripeptídeos requerem para a sua síntese menores concentração de enzima e tempo de reação em relação aos dipeptídeos. Não foi possível estabelecer a especificidade secundária da termolisina para o resíduo P\'2 pois os rendimentos dos tripeptídeos sintetizados não apresentaram diferença significativa. Foi também realizado um estudo metodológico para determinar as condições ótimas de síntese de Boc-Asn-Ile-OBzl, que consistiu em analisar a influência do pH, concentração de enzima, concentraçao e volume da solução de acetato de sódio, proporção entre os componentes carboxílico e amínico, temperatura e adição de solvente orgânico ao meio de reação. / With de objective of studying the potential for the use of thermolysin as a catalyst in reactions of incorporation of N-acyl-asparagine into esters of aminoacids and peptides, the following di- and tripeptides were synthesized: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OBzI, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl,Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Z-Asn-Phe-OEt, Z-Asn-Val-OEt, Moz-Asn-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn-Ile-Phe-OBzl. All of these peptides were obtained in pure form in good yield and analyzed and characterized by thin layer chromatography, melting point, elemental analysis, aminoacid analysis and proton magnetic resonance. Among the protecting groups of asparagine, benzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl gave excellent yields of the dipeptides. Relative to the dipeptides, the synthesis of the tripeptides was found to require lower enzyme concentrations and temperatures. Since the yields of the tripeptides failed to exhibit significant differences, it was not possible to establish the existence of a secondary specificity of thermolysin for the residue P\' 2 . A methodological study was also performed to determine the optimum conditions for synthesis of Boc-Asn-Ile-OBzl. This study consisted of an analysis of the influence of pH, enzyme concentration, concentration and volume of the solution of sodium acetate, relative proportions of the carboxyl and amino components, temperature, and addition of organic solvent to the reaction medium.
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Dinâmica conformacional de peptídeos: um estudo por fluorescência / Conformational dynamics of peptides: a fluorescence study.Souza, Eduardo Sérgio de 05 November 2004 (has links)
Realizamos estudos, por espectroscopia de fluorescência de estado estacionário e resolvida no tempo, de dinâmica conformacional de três famílias de peptídeos: o terminal carboxílico do peptídeo neuroendócrino (7B2CT); o peptídeo estimulador do melanócito (alfa-MSH); e os peptídeos derivados da seqüência consensual de peptídeos que se ligam a heparina (peptídeo Cardin). Utilizamos os métodos de fluorescência baseados na supressão da emissão do fluoróforo presente no peptídeo, tanto por interação colisional com um supressor como por transferência de energia para um grupo aceitador presente no peptídeo. No segundo caso, dentro da hipótese de que diferentes conformações do peptídeo estão presentes durante o decaimento da fluorescência, supusemos que o decaimento da intensidade era modulado por uma função de distribuição de distâncias doador-aceitador, f(r). Foi desenvolvido um procedimento computacional usando o programa CONTIN, para recuperar, a partir dos dados de fluorescência resolvida no tempo, a distribuição de distância entre o doador e o aceitador presentes nos peptídeos. A metodologia se mostrou útil para obter informações quantitativas sobre a dinâmica conformacional dos peptídeos, sua dependência com o solvente e sua interação com outras moléculas presentes no meio. O peptídeo 7B2CT e seus análogos A12 e A18 foram estudados pela fluorescência da tirosina, presente na posição cinco na seqüência de aminoácidos. Não houve diferenças significativas no decaimento da intensidade, no decaimento da anisotropia e na supressão por iodeto entre os três peptídeos, que pudessem ser correlacionados com as diferenças observadas na inibição da pro-hormone convertase 2 (PC2). O peptídeo alfa-MSH e seu análogo mais potente [Nle(4),0-Phe(7)] alfa-MSH (NDP-alfa-MSH), que contém o resíduo fluorescente triptofano, foram modificados no seu terminal amino com o grupo ácido amino benzóico (Abz), e foram estudados por métodos de fluorescência. Observamos transferência de energia entre o resíduo triptofano, atuando como doador, e o aceitador o-Abz. Verificamos a uma ampla distribuição de distâncias Trp-o-Abz para o alfa-MSH em água, enquanto três populações de distâncias foram observadas para o análogo modificado NDP-alfa-MSH em água, indicando estados com conformações distintas para o petídeo sintético, comparado com o hormônio nativo. Medidas em trifluoroetanol resultaram em duas populações de distâncias, tanto para o hormônio nativo como para o hormônio análogo, refletindo a diminuição, induzida pelo solvente, das conformações disponíveis para os peptídeos. Os peptídeos Cardin foram estudados na presença de heprarina, de micelas de SDS e na mistura TFE/água. O grupo fluorescente Abz foi incorporado no terminal amino e o grupo aceitador etilenodiamina-N-[2,4- dinitrofenil] (Eddnp) foi incorporado ao terminal carboxílico dos peptídeos. A distribuição de distâncias entre as extremidades, recuperadas dos dados de fluorescência resolvida no tempo, indicaram a presença de conformações estendidas em solução aquosa e a ocorrência de conformações compactas na interação com heparina e SDS ou em soluções com TFE. As distâncias entre as extremidades recuperadas foram maiores que aquelas esperadas para osI peptídeos na conformação hélice alfa, sugerindo a ocorrência de estruturas dobradas além da hélice alfa. A metodologia da transferência de energia se mostrou útil para os estudos de dinâmica de peptídeos em solução. / Steady state and time-resolved fluorescence spectroscopy were used to study the conformational dynamics of three families of peptides: the carboxyl terminal of the neuroendocrine peptide (782Cl), the alpha melanocytestimulating hormone (alpha-MSH) and heparin-binding consensus sequence peptides (Cardin motif peptides). The fluorescence methods were based on quenching of the emission of a fluorophore present in the peptide, either by collisional interaction with a quencher, as by energy transfer to an acceptor group. In the second case, within the hypothesis that different peptide conformations are in equilibrium during the fluorescence decay, we supposed that the intensity decay was modulated by an acceptor-donor distance distribution function, f(r). A computational procedure was developed using the CONTIN program, to recover, from the time-resolved fluorescence data, the distance distribution between donor and acceptor groups attached to the peptides. The methodology proved to be useful to provide quantitative information about conformational dynamics of peptides, its dependency on the solvent and its interaction with other molecules present in the medium. The peptide 782CT and its analogs A12 and A18 were studied by examination of fluorescence from the tyrosine residue present in the position five of the amino acid sequence. There were no appreciable differences in the intensity decay, anisotropy decay and iodide quenching between the three peptides, that could be correlated to observed differences in the inhibition of the pro-hormane convertase 2 (PC2). The peptide hormone alpha-MSH and its more potent analog [Nle(4),0- Phe(7)]alpha-MSH (NDP-alpha-MSH), containing the fluorescent residue tryptophan, were labeled at the amino terminal with the amino benzoic acid (Abz) group, and were also examined by fluorescence methods. We observed energy transfer between the tryptophan residue acting as donor and Abz as acceptor, and verified a broad Trp-o-Abz distance distribution for alpha-MSH in aqueous medium, while three different distance populations could be identified for the labeled analog NDP-alpha-MSH in water, indicating distinct conformational states for the synthetic peptide, compared with the native hormone. Measurements in trifluoroethanol resulted in the recovery of two Abzlrp distance populations, both for the native and the analog hormones, reflecting the decrease, induced by the solvent, of the conformational states available to the peptides. The Cardin motif peptides were examined in the presence of heparin, SDS micelles and in TFE/water mixtures. The fluorescent group Abz was attached to the amino terminal and the acceptor group N-(2,4 dinitrophenyl)ethylenediamine (Eddnp) was bound to the carboxyl terminal of the peptides. The end-to-end distance distribution recovered from time-resolved fluorescence data indicated extend conformation in aqueous medium and the occurrence of compact conformations under interaction with heparin and SDS or in the medium containing TFE. The end-to-end distances recovered were lower than those expected for the peptides in alpha helix conformation, suggesting the occurrence of turned structures beyond the alpha helix. The energy transfer methodology shows to be useful to study conformational dynamics of peptides in solution.
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Dinâmica conformacional de peptídeos: um estudo por fluorescência / Conformational dynamics of peptides: a fluorescence study.Eduardo Sérgio de Souza 05 November 2004 (has links)
Realizamos estudos, por espectroscopia de fluorescência de estado estacionário e resolvida no tempo, de dinâmica conformacional de três famílias de peptídeos: o terminal carboxílico do peptídeo neuroendócrino (7B2CT); o peptídeo estimulador do melanócito (alfa-MSH); e os peptídeos derivados da seqüência consensual de peptídeos que se ligam a heparina (peptídeo Cardin). Utilizamos os métodos de fluorescência baseados na supressão da emissão do fluoróforo presente no peptídeo, tanto por interação colisional com um supressor como por transferência de energia para um grupo aceitador presente no peptídeo. No segundo caso, dentro da hipótese de que diferentes conformações do peptídeo estão presentes durante o decaimento da fluorescência, supusemos que o decaimento da intensidade era modulado por uma função de distribuição de distâncias doador-aceitador, f(r). Foi desenvolvido um procedimento computacional usando o programa CONTIN, para recuperar, a partir dos dados de fluorescência resolvida no tempo, a distribuição de distância entre o doador e o aceitador presentes nos peptídeos. A metodologia se mostrou útil para obter informações quantitativas sobre a dinâmica conformacional dos peptídeos, sua dependência com o solvente e sua interação com outras moléculas presentes no meio. O peptídeo 7B2CT e seus análogos A12 e A18 foram estudados pela fluorescência da tirosina, presente na posição cinco na seqüência de aminoácidos. Não houve diferenças significativas no decaimento da intensidade, no decaimento da anisotropia e na supressão por iodeto entre os três peptídeos, que pudessem ser correlacionados com as diferenças observadas na inibição da pro-hormone convertase 2 (PC2). O peptídeo alfa-MSH e seu análogo mais potente [Nle(4),0-Phe(7)] alfa-MSH (NDP-alfa-MSH), que contém o resíduo fluorescente triptofano, foram modificados no seu terminal amino com o grupo ácido amino benzóico (Abz), e foram estudados por métodos de fluorescência. Observamos transferência de energia entre o resíduo triptofano, atuando como doador, e o aceitador o-Abz. Verificamos a uma ampla distribuição de distâncias Trp-o-Abz para o alfa-MSH em água, enquanto três populações de distâncias foram observadas para o análogo modificado NDP-alfa-MSH em água, indicando estados com conformações distintas para o petídeo sintético, comparado com o hormônio nativo. Medidas em trifluoroetanol resultaram em duas populações de distâncias, tanto para o hormônio nativo como para o hormônio análogo, refletindo a diminuição, induzida pelo solvente, das conformações disponíveis para os peptídeos. Os peptídeos Cardin foram estudados na presença de heprarina, de micelas de SDS e na mistura TFE/água. O grupo fluorescente Abz foi incorporado no terminal amino e o grupo aceitador etilenodiamina-N-[2,4- dinitrofenil] (Eddnp) foi incorporado ao terminal carboxílico dos peptídeos. A distribuição de distâncias entre as extremidades, recuperadas dos dados de fluorescência resolvida no tempo, indicaram a presença de conformações estendidas em solução aquosa e a ocorrência de conformações compactas na interação com heparina e SDS ou em soluções com TFE. As distâncias entre as extremidades recuperadas foram maiores que aquelas esperadas para osI peptídeos na conformação hélice alfa, sugerindo a ocorrência de estruturas dobradas além da hélice alfa. A metodologia da transferência de energia se mostrou útil para os estudos de dinâmica de peptídeos em solução. / Steady state and time-resolved fluorescence spectroscopy were used to study the conformational dynamics of three families of peptides: the carboxyl terminal of the neuroendocrine peptide (782Cl), the alpha melanocytestimulating hormone (alpha-MSH) and heparin-binding consensus sequence peptides (Cardin motif peptides). The fluorescence methods were based on quenching of the emission of a fluorophore present in the peptide, either by collisional interaction with a quencher, as by energy transfer to an acceptor group. In the second case, within the hypothesis that different peptide conformations are in equilibrium during the fluorescence decay, we supposed that the intensity decay was modulated by an acceptor-donor distance distribution function, f(r). A computational procedure was developed using the CONTIN program, to recover, from the time-resolved fluorescence data, the distance distribution between donor and acceptor groups attached to the peptides. The methodology proved to be useful to provide quantitative information about conformational dynamics of peptides, its dependency on the solvent and its interaction with other molecules present in the medium. The peptide 782CT and its analogs A12 and A18 were studied by examination of fluorescence from the tyrosine residue present in the position five of the amino acid sequence. There were no appreciable differences in the intensity decay, anisotropy decay and iodide quenching between the three peptides, that could be correlated to observed differences in the inhibition of the pro-hormane convertase 2 (PC2). The peptide hormone alpha-MSH and its more potent analog [Nle(4),0- Phe(7)]alpha-MSH (NDP-alpha-MSH), containing the fluorescent residue tryptophan, were labeled at the amino terminal with the amino benzoic acid (Abz) group, and were also examined by fluorescence methods. We observed energy transfer between the tryptophan residue acting as donor and Abz as acceptor, and verified a broad Trp-o-Abz distance distribution for alpha-MSH in aqueous medium, while three different distance populations could be identified for the labeled analog NDP-alpha-MSH in water, indicating distinct conformational states for the synthetic peptide, compared with the native hormone. Measurements in trifluoroethanol resulted in the recovery of two Abzlrp distance populations, both for the native and the analog hormones, reflecting the decrease, induced by the solvent, of the conformational states available to the peptides. The Cardin motif peptides were examined in the presence of heparin, SDS micelles and in TFE/water mixtures. The fluorescent group Abz was attached to the amino terminal and the acceptor group N-(2,4 dinitrophenyl)ethylenediamine (Eddnp) was bound to the carboxyl terminal of the peptides. The end-to-end distance distribution recovered from time-resolved fluorescence data indicated extend conformation in aqueous medium and the occurrence of compact conformations under interaction with heparin and SDS or in the medium containing TFE. The end-to-end distances recovered were lower than those expected for the peptides in alpha helix conformation, suggesting the occurrence of turned structures beyond the alpha helix. The energy transfer methodology shows to be useful to study conformational dynamics of peptides in solution.
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Efficacy of glutamine, peptides and vitamins A and E supplementation on diarrheal disease induced by methotrexate and cholera toxin: improvement of intestinal barrier function / EficÃcia da suplementaÃÃo com glutamina, peptÃdeos, vitaminas A e E, na doenÃa diarrÃica induzida por metotrexato e pela toxina do Vibrio cholerae: restabelecimento da barreira morfofuncional intestinalSandra Maria Nunes Monteiro 19 April 2004 (has links)
CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A desnutriÃÃo, desidrataÃÃo e agentes antineoplÃsicos, tais como o
metotrexato (MTX), sÃo imediatos causadores das doenÃas diarrÃicas.
Objetivando investigar a mucosite intestinal (MI) induzida por MTX, a eficÃcia das
soluÃÃes de reidrataÃÃo oral (SRO) acrescidas com glutamina (Gln), alanilglutamina
(Ala-Gln), Hyprol 4107 (HYP) e hyfoama (HYFO) utilizou-se a perfusÃo
intestinal. E para a suplementaÃÃo com vitaminas A (VITA) e E (VITE), Gln e
peptÃdeos, utilizou-se as avaliaÃÃes morfomÃtricas, metabÃlicas e a de
permeabilidade intestinal [(teste lactulose/manitol (L/M)], em camundongos
(n=344) e em coelhos (n=72). A mucosite intestinal por MTX (2,75 mg/kg/24h s.c.,
durante 3 dias) foi validada em camundongos, atravÃs da constataÃÃo do quadro
diarrÃico e do prejuÃzo no estado nutricional (-1.89Â0,52 g) estabelecido apÃs o 3o
dia de tratamento. A anÃlise morfomÃtrica demonstrou achatamento de vilos
(364,8Â19.9 mm) e hiperplasia de criptas (251Â19.2 mm) intestinais com aumento
do nÃmero de apoptoses (7.48Â1, 23/cripta), no duodeno e no jejuno. A taxa L/M
no grupo MTX foi maior c que no controle (0,35). A perfusÃo intestinal com toxina
da cÃlera aumentou a secreÃÃo de Na+ (-12,8Â1.4 mEq/g/min), Cl- (-12,9Â4,6
mEq/g/min) e de Ãgua (-0,02 Â0,04 ml/g/min). As SRO acrescidas de Gln e
peptÃdeos, restauram este efeito secretÃrio. A suplementaÃÃo de Gln e peptÃdeos,
VITA e VITE, melhoram o ganho ponderal, a ingestÃo de raÃÃo, as alteraÃÃes
morfolÃgicas e a apoptose, no modelo de mucosite intestinal. Nenhuma alteraÃÃo
foi observada no padrÃo de mitoses nas criptas intestinais, apÃs o 3o dia de
tratamento com MTX. A suplementaÃÃo nutricional reduziu na mucosite, a
elevaÃÃo das taxas de L/M (0,35 para 0,73) nas vias paracelular e transcelular.
Nossos resultados sugerem que, o restabelecimento da barreira morfofuncional,
induzido pela suplementaÃÃo, foi obtido atravÃs de um aumento do transporte de
cÃtions (Na+ e K+) na mucosa, do fornecimento de substrato energÃtico para o
enterÃcito, inibiÃÃo da apoptose (0,25Â0,05), de cÃlulas indiferenciadas
incremento no potencial redox e reduÃÃo da peroxidaÃÃo lipÃdica das cÃlulas
intestinais diferenciadas. EntÃo sugerimos que o uso de SRO acrescidas de Gln e
peptÃdeos podem prevenir a desnutriÃÃo e reduzir as doenÃas diarrÃicas, e a
suplementaÃÃo com VITE e VITA melhorar a morfo fisiologia da barreira
intestinal / A desnutriÃÃo, desidrataÃÃo e agentes antineoplÃsicos, tais como o
metotrexato (MTX), sÃo imediatos causadores das doenÃas diarrÃicas.
Objetivando investigar a mucosite intestinal (MI) induzida por MTX, a eficÃcia das soluÃÃes de reidrataÃÃo oral (SRO) acrescidas com glutamina (Gln), alanilglutamina (Ala-Gln), Hyprol 4107 (HYP) e hyfoama (HYFO) utilizou-se a perfusÃo intestinal. E para a suplementaÃÃo com vitaminas A (VITA) e E (VITE), Gln e peptÃdeos, utilizou-se as avaliaÃÃes morfomÃtricas, metabÃlicas e a de permeabilidade intestinal [(teste lactulose/manitol (L/M)], em camundongos (n=344) e em coelhos (n=72). A mucosite intestinal por MTX (2,75 mg/kg/24h s.c., durante 3 dias) foi validada em camundongos, atravÃs da constataÃÃo do quadro diarrÃico e do prejuÃzo no estado nutricional (-1.89Â 0,52 g) estabelecido apÃs o 3o dia de tratamento. A anÃlise morfomÃtrica demonstrou achatamento de vilos (364,8Â 19.9 Âm) e hiperplasia de criptas (251Â 19.2 Âm) intestinais com aumento do nÃmero de apoptoses (7.48Â 1, 23/cripta), no duodeno e no jejuno. A taxa L/M no grupo MTX foi maior c que no controle (0,35). A perfusÃo intestinal com toxina da cÃlera aumentou a secreÃÃo de Na+ (-12,8Â 1.4 ÂEq/g/min), Cl- (-12,9Â 4,6 ÂEq/g/min) e de Ãgua (-0,02 Â 0,04 ml/g/min). As SRO acrescidas de Gln e peptÃdeos, restauram este efeito secretÃrio. A suplementaÃÃo de Gln e peptÃdeos, VITA e VITE, melhoram o ganho ponderal, a ingestÃo de raÃÃo, as alteraÃÃes morfolÃgicas e a apoptose, no modelo de mucosite intestinal. Nenhuma alteraÃÃo
foi observada no padrÃo de mitoses nas criptas intestinais, apÃs o 3o dia de
tratamento com MTX. A suplementaÃÃo nutricional reduziu na mucosite, a
elevaÃÃo das taxas de L/M (0,35 para 0,73) nas vias paracelular e transcelular.
Nossos resultados sugerem que, o restabelecimento da barreira morfofuncional, induzido pela suplementaÃÃo, foi obtido atravÃs de um aumento do transporte de cÃtions (Na+ e K+) na mucosa, do fornecimento de substrato energÃtico para o enterÃcito, inibiÃÃo da apoptose (0,25Â 0,05), de cÃlulas indiferenciadas incremento no potencial redox e reduÃÃo da peroxidaÃÃo lipÃdica das cÃlulas intestinais diferenciadas. EntÃo sugerimos que o uso de SRO acrescidas de Gln e peptÃdeos podem prevenir a desnutriÃÃo e reduzir as doenÃas diarrÃicas, e a suplementaÃÃo com VITE e VITA melhorar a morfo fisiologia da barreira intestinal
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