O colesterol é um importante componente das membranas celulares em eucariotos superiores, desempenhando papéis estruturais e funcionais. O colesterol possui uma insaturação em sua estrutura sendo, portanto, alvo de oxidação mediada por espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio. A oxidação não enzimática do colesterol gera, como produtos primários, os hidroperóxidos de colesterol. Tais moléculas, por sua vez, são altamente reativas e podem reagir com metais livres e/ou metaloproteínas, trazendo consequências à celula. Neste sentido, o primeiro capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação dos hidroperóxidos de colesterol (ChOOH) com o citocromo c (citc), uma heme proteína envolvida no transporte de elétrons na mitocôndria. Análises de espectroscopia no UV-Vis mostraram que o ChOOH promove o bleaching da banda Soret do citc de uma maneira dose-dependente. Mais ainda, esta reação leva à formação de radicais centrados em carbono tanto na proteína como no lipídeo, sugerindo uma redução homolítica do ChOOH. Como consequências, pode-se observar a oligomerização do citc, um processo que pode influenciar no transporte de elétrons bem como na sinalização para a apoptose. A partir da reação do citc com ChOOH podem surgir, direta ou indiretamente, outras espécies reativas, como aldeídos, cetonas e epóxidos. Dentre estas, destacam-se os aldeídos de colesterol, em particular o colesterol secoaldeído (CSec) e o carboxialdeído (ChAld), uma vez que foram encontrados elevados em placas ateroscleróticas e em tecidos cerebrais de pacientes com doenças neurodegenerativas. Tais espécies podem reagir com resíduos de aminoácidos provocando alterações estruturais e funcionais em proteínas. Neste sentido, o segundo capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação do ChAld com citc. Usando modelos mimétivos de membrana e espectrometria de massas, foi mostrado que o ChAld modifica covalentemente o citc por um mecanismo consistente com a formação de bases de Schiff. Tal modificação ocorre preferencialmente em resíduos de lisina que interagem com a membrana. Estas modificações influenciam na afinidade do citc pela membrana, aumentando sua aderência, o que pode ter influência no transporte de elétrons e sinalização para a apoptose. No terceiro e último capítulo deste trabalho nós buscamos uma ferramente analítica que permitisse analisar modificação de proteínas promovidas por produtos de oxidação de colesterol e outros esteróis. Em um estudo realizado em colaboração com o grupo do professor Porter na Universidade de Vanderbilt, utilizamos ensaios baseados em click chemistry para buscar proteínas modificadas. Para isso, foram sintetizados derivados de colesterol e 7-deidrocolesterol (7-DHC, precursor imediato do colesterol) contendo um grupo alquinil na sua cadeia lateral. Este grupo pode ser ligado a um grupo azida por meio de uma reação de cicloadição, em um processo conhecido como click chemistry. Após a síntese e caracterização dos derivados lipídicos contendo o grupo alquinil na cadeia lateral, células Neuro2a foram tratadas com o alquinil-7-DHC e o alquinil-colesterol para averiguar seu metabolismo. Análises por HPLC-MS/MS mostraram que ambos derivados contendo o grupo alquinil foram metabolisados e convertdos nos respectivos ésteres. Usando um modelo celular para a doença conhecida como Sindrome de Smith-Lemli-Opitz (SLOS), doença caracterizada pela deficiência na enzima 7-deidrocolesterol redutase, foi mostrado que o acúmulo característico de 7-DHC nos pacientes pode levar a uma maior modificação de proteínas promovidas por seus derivados, o que pode contribuir para o desenvolvimento da doença. / Cholesterol is an important component of eukaryotic cellular membranes, where it has an influence in the fluidity and stability. Due to the presence of a double bond in its structure, cholesterol can be oxidized by reactive oxygen and nitrogen species. This non-enzymatic oxidation generates, as primary products, cholesterol hydroperoxides. Such molecules, in turn, are highly reactive and can react with free metal ions and/or metalloproteins, affecting cell metabolism. Therefore, the first chapter of the present study aims to investigate the reaction of cholesterol hydroperoxides (ChOOH) with cytochrome c (cytc), a heme protein involved in the mitochondrial electron transport. Spectroscopic analyses in the UV-Vis region showed that ChOOH induces a dose-dependent bleaching of cytc\'s Soret band. In addition, this reaction leads to the formation of carbon-centered radicals on both protein and lipid, suggesting a homolytic reduction of ChOOH. As consequences, cytc undergoes oligomerization, a process that can influence electron transport and apoptosis signaling. The reaction of cytc and ChOOH can produce, directly or indirectly, reactive species such as epoxides, aldehydes and ketones. Among them, cholesterol aldehydes, such as cholesterol secoaldehyde (CSec) and cholesterol carboxyaldehyde (ChAld), are of particular interest, since they were previously found elevated in atherosclerotic plaques and brain tissue of patients bearing neurodegenerative diseases. These species can also react with amino acid residues leading to protein denaturation and malfunction. With that in mind, the second chapter of this study aims to investigate the reaction of ChAld and cytc. Using mimetic membrane models and mass spectrometry analyses, we showed that ChAld covalently modifies cytc through a mechanism consistent with the formation of Schiff base adducts. Such modification occurs mostly at lysine residues that are known to interact with the membrane. The modifications have an influence in the affinity of cytc to the membrane, where they increase its binding to the membrane, a process that could affect the electron transport and apoptosis signaling. In the last and third chapter of this study we wanted an analytical tool that allowed the investigation of protein adduction promoted by cholesterol and other sterols-derived oxidation products. In a study performed in collaboration with the Porter group from Vanderbilt University, we used analyses based on click chemistry to search for protein adduction. To address that, we first synthesized derivatives of cholesterol and 7-dehydrocholesterol (7-DHC, the immediate precursor of cholesterol) containing an alkynyl group in the side chain. The alkynyl group can be ligated to an azide group through a cycloaddition reaction, in a process known as click chemistry. After the synthesis and characterization of alkynyl derivatives, Neuro2a cells were treated with alkynyl-7-DHC and alkynyl-cholesterol to check their metabolism. HPLC-MS/MS analyses showed that both alkynyl derivatives are metabolized and converted into their respective esters. In addition, using a cell model for Smith-Lemli-Optiz Syndrome (SLOS), a disease characterized by the deficiency in the dehydrocholesterol reductase 7, we showed that the characteristic accumulation of 7-DHC in SLOS patients might be associated with protein adduction promoted by its oxidation products, which might contribute to the development of the disease.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-21Bitstream added on 2014-06-13T19:48:23Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_rn_me_botfca.pdf: 805571 bytes, checksum: 48ebc7d7877fece0da474aafb2d812b0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A retenção de clorofila tem afetado a produção de sementes de soja no Brasil, principalmente na região dos cerrados. Como conseqüência, tem-se a redução da qualidade dos lotes, constatada por queda na germinação e vigor, com prejuízos no estabelecimento de população adequada de plantas, no momento da semeadura. A degradação da clorofila pode ser afetada pelo estádio de maturação, por condições de secagem, aplicação de produtos químicos dessecantes e pelas condições climáticas, especialmente durante as fases de acúmulo de reservas e maturação das sementes. O processo de maturação, além de ter grande efeito na degradação da clorofila, influencia a produção de enzimas específicas da germinação. A presença do pigmento verde pode estar relacionada à produção de radicais livres que causam danos oxidativos, os quais afetam a longevidade das sementes. Este estudo teve como objetivo averiguar a relação entre a clorofila, a qualidade fisiológica e os danos oxidativos que afetam o potencial de conservação das sementes de soja. A pesquisa foi conduzida no Departamento de Produção Vegetal – Agricultura, da Faculdade de Ciências Agronômicas, UNESP, Campus de Botucatu. Os tratamentos constaram de 67 lotes de soja, de diferentes cultivares, provenientes de áreas dos Estados do Mato Grosso, de São Paulo e do Paraná, com variações nos graus de retenção... / The retention of chlorophyll has affected the production of soybeans in Brazil, mainly in the cerrado biome. As a result there has been a reduction in the quality of the lots, evidenced by a decrease in germination and vigor, with losses in the establishment of appropriate plants population at sowing time. The degradation of chlorophyll can be affected by ripening stage, by drying conditions, application of chemical desiccants, and climatic conditions, especially during periods of reserve accumulation and seed maturation. The maturation process, besides having great effect on the degradation of chlorophyll, has importance in the production of specific enzymes of germination. The presence of green pigment may be related to the production of free radicals that cause oxidative damage, which affects seed longevity. This study aimed to investigate the relationship between chlorophyll, the physiological quality and oxidative damage affecting the conservation potential of soybean seeds. The research was conducted at the Department of Crop Production - Agriculture, Faculty of Agronomic Sciences, UNESP, Botucatu. The treatments consisted of 67 soybean lots of different cultivars from areas in Mato Grosso, Sao Paulo and Parana, with variable degrees of chlorophyll retention. For each batch was determined the percentage of green seeds using a visual method of classification with the aid of the Munsell color card, and the chlorophyll content by chemical extraction, using the method of Arnon (1949) adapted in this study. The fluorometer was used to evaluate the photosynthetic activity of the seeds with chlorophyll retention. We evaluated also the oxidative damage suffered by each lot by determining lipoperoxide. All parameters were related to the quality of seeds valued at three times; initial date, soon after receiving the seed and after 3 and 6 months of storage. The data were analyzed by correlation... (Complete abstract click electronic access below)

Os fungos de decomposição branca são organismos capazes de degradar os materiais lignocelulósicos de maneira eficiente através de reações catalisadas por enzimas hidrolíticas e oxidativas ou ainda por meio de metabólitos de baixa massa molar que iniciam o processo degradativo. Ceriporiopsis subvermispora é um fungo de decomposição branca que se destaca como um dos mais seletivos na degradação da lignina, possuindo grande potencial de aplicação tecnológica. Este fungo é capaz de iniciar reações de peroxidação de lipídeos a partir da formação de íons Mn3+ oriundos da ação da enzima manganês peroxidase (MnP) sobre Mn2+. No presente estudo avaliou-se a secreção de enzimas oxidativas por C. subvermispora agindo sobre madeira de Eucalyptus grandis em cultivos suplementados ou não com milhocina e milhocina e glicose. Os extratos enzimáticos obtidos a partir desses cultivos apresentaram elevada atividade de MnP, principalmente quando o meio foi suplementado com milhocina. Os mesmos extratos foram capazes de peroxidar ácido linoleico in vitro. Nessas reações ocorreu um acúmulo de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS) que foi proporcional ao nível de MnP existente nos extratos. A taxa de consumo de oxigênio nessas reações também foi proporcional aos teores de MnP presente nos extratos. A caracterização da madeira biotratada indicou que as maiores perdas de massa e de lignina ocorreram nos cultivos suplementados, sendo que aparentemente há uma correlação entre a extensão da degradação de madeira e lignina com a atividade peroxidativa dos extratos. Lacases foram detectadas somente em baixos níveis nos extratos enzimáticos oriundos da madeira. Por outro lado, cultivos em meio líquido composto de 2% de extrato de malte e 0,2% de extrato de levedura induziram a produção de lacases e nenhuma secreção de MnP. Também as lacases foram capazes de peroxidar ácido linoleico, desde que na presença de um mediador, o ácido _-hidróxi-benzóico. De qualquer forma, durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora, lacase foi detectada somente no início dos cultivos e mesmo assim em níveis bastante baixos o que significa que a participação de lacase na peroxidação de lipídeos durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora deve ser pouco significante. / The white-rot fungi are able to degrade lignocellulosic materials in an efficient way through reactions catalyzed by hydrolytic and oxidative enzymes or still by means of low molar mass metabolites that begin the degradative process. Ceriporiopsis subvermispora is a white-rot fungus that stands out as one of the most selective in lignin degradation, possessing great potential for technological applications. This fungus is able to initiate lipid peroxidation reactions based on the Mn3+ produced by the catalytic action of the enzyme manganese peroxidase (MnP) on Mn2+ ions. In the present study, the secretion of oxidative enzymes by C. subvermispora was evaluated in cultures containing Eucalyptus grandis wood chips and some supplements such as corn steep liquor and corn steep liquor plus glucose. The enzymatic extracts obtained from these cultures contained high MnP activity, mainly when corn steep liquor was used as a culture supplement. The same extracts were able to peroxidize linoleic acid in vitro. In these reactions, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) accumulated over reaction time and the TBARS levels were proportional to the MnP present in the extracts. The rate of oxygen consumption in these reactions was also proportional to the level of MnP present in the extracts. The characterization of the biotreated wood indicated that the largest lignin and wood mass losses were observed in supplemented cultures, with an apparent correlation between the peroxidative activity in the extracts and the extension of the wood and lignin degradation. Laccase was detected only in low levels in the enzymatic extracts originating from the wood-containing cultures. On the other hand, submerged cultures in which the liquid medium was composed of 2% malt-extract and 0,2% yeast extract induced laccase production without simultaneous secretion of MnP. The laccase active extract was also able to peroxidize linoleic acid, since in the presence of a mediator (_-hydroxy-benzoic acid). Anyway, during E. grandis biodegradation by C. subvermispora, laccase was only detected in the beginning of the cultivations and even so at low levels suggesting that laccase were not involved in lipid peroxidation during the E. grandis wood biodegradation by C. subvermispora.

O sêmen eqüino é muito utilizado na forma refrigerada, porém, para alguns garanhões, a longevidade espermática é baixa. Durante a refrigeração o espermatozóide pode ser afetado por vários fatores, que podem causar a perda da integridade da membrana plasmática, danos no acrossomo e disfunções mitocondriais, resultando em perda irreversível de motilidade e capacidade fecundante. A composição e concentração do plasma seminal podem causar efeitos deletérios ao espermatozóide, sendo a centrifugação do sêmen uma alternativa para minimizar estes efeitos. Este experimento foi realizado para verificar o efeito da centrifugação nas características de movimento, integridade e peroxidação lipídica das membranas do espermatozóide eqüino refrigerado a 5°C por até 72h. Foram realizadas cinco colheitas de sêmen de quatro garanhões. O sêmen foi avaliado quanto ao volume e concentração, e em seguida dividido em dois tratamentos, sem centrifugação (S) e centrifugado (C) (300g/10min). Ambos foram diluídos na concentração final de 30 x106 eptz/mL em diluidor a base de leite desnatado e então refrigerados. Foram analisadas as características do movimento espermático (CASA), morfologia espermática (DIC), integridade das membranas plasmática e acrossomal (PI/FITC-PSA), potencial de membrana mitocondrial (JC-1) e peroxidação lipídica das membranas (C11-BODIPY581/591), sendo estas três últimas análises por citometria de fluxo. As análises foram realizadas no tempo 0 e 24, 48 e 72 horas após a refrigeração. O delineamento experimental foi em blocos generalizados adicionado do fator medidas repetidas no tempo. Os dados foram analisados pelo programa SAS, submetidos à análise de variância e às interações determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisser ao nível de 5% de significância. O espermatozóide do sêmen centrifugado apresentou valores médios maiores de motilidade total e progressiva, ALH, STR e LIN (P<0,05), porém os valores das velocidades e BCF foram menores (P<0,05). Houve efeito do tempo nas características de movimento espermático (P<0,05), exceto para STR. Não houve efeito da centrifugação e nem do tempo quanto às características morfológicas dos espermatozóides refrigerados, esta só diferiu entre os garanhões (P<0,05). Por sua vez, a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial espermáticas foram maiores nos sêmen centrifugado (P<0,05) e suas porcentagens decresceram com o tempo (P<0,05). A peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide refrigerado aumentou somente nas primeiras 24h (P<0,05) e não foi influenciada pela centrifugação. Conclui-se que a centrifugação e a retirada do plasma seminal melhoram a qualidade do sêmen refrigerado eqüino, principalmente em garanhões com baixa longevidade, sendo esta influenciada pelas características iniciais da morfologia espermática. Ainda, tempo de refrigeração induz a um declínio da qualidade seminal. E, por fim, a peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide parece não ser a principal causa de alterações da integridade das membranas e do potencial de membrana mitocondrial durante a refrigeração do sêmen eqüino. / Equine cooled semen is frequently used, although the longevity for some stallions is low. During the cooling process the spermatozoon can be affected by several factors that can cause loss of plasma membrane integrity, acrosomal damage and mitochondrial dysfunctions, resulting in irreversible loss of motility and fertilizing capacity. The composition and concentration of seminal plasma could cause harmful effects to the sperm, being semen centrifugation an alternative to minimize these effects. This experiment was designed to verify the effects of the centrifugation in motion characteristics, membranes integrity and lipid peroxidation of cooled equine sperm to 5°C until 72 hours. Five ejaculates from four stallions were collected. The semen was evaluated for volume and concentration, then split in two treatments, no centrifugation (N) and with centrifugation (W) (300g/10min). Both were diluted in the final concentration 30 x106 spermatozoa/mL in a skin milk extender and then cooled. The following analyses were performed: the sperm motion characteristics (CASA), morphology (DIC), plasma and acrosomal membranes integrity (PI/FITC-PSA), mitochondrial membrane potential (JC-1) and membrane lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591), the last three analyses were assessed in flow citometry. The analyses were performed in time 0 and 24, 48 and 72 hours after cooling. The experimental design was random blocks with repeated-measures. The data were analyzed by the SAS program, submitted to analysis of variance and the interactions by the test of Greenhouse-Geisser at the level of 5% of significance. The values were larger in W semen for total and progressive motility, ALH, STR and LIN (P<0,05), however the values of the three types of speed and BCF were smaller (P<0,05). There was effect of time in the motion characteristics of sperm (P<0,05), except for STR. There was not any effect of centrifugation and time for the morphologic characteristics of cooled spermatozoa, that only differed among stallions (P<0,05). On the other hand, the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane were larger in W semen (P<0,05) and their percentages decreased within time (P<0,05). The membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm only increased in the first 24 hours (P<0,05) and it was not influenced by centrifugation. In conclusion, the centrifugation and withdrawal of the seminal plasma improve semen quality of the cooled equine sperm, mainly in stallions with low longevity, which is influenced by the initials characteristics of sperm morphology. Moreover, time of cooling induces a decline of seminal quality. Finally, the membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm seems not to be the main cause of alterations in the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane during the cooling of equine semen.

As Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) conferem proteção aos seres vivos contra os contínuos ataques de microrganismos, além de serem responsáveis por diversos eventos fisiológicos. No entanto um desequilíbrio entre a produção das EROs e os agentes antioxidantes resulta diversos processos patológicos nos mais variados sistemas em seres humanos e em animais. Durante a gestação ocorrem alterações do metabolismo que podem levar a um aumento de subprodutos da oxidação. Assim como a gestação, o nascimento também impõe um período com alta demanda energética, alta tensão de oxigênio e, por consequência, determina um momento crítico na vida do neonato, por ser exigida uma rápida adaptação da condição hipóxica (intra útero) para hiperóxica (extra útero). Desta forma, o objetivo desta dissertação foi verificar o estado oxidativo das éguas no terço final da gestação, no periparto e no pós-parto levando em consideração o efeito da paridade, bem como a condição oxidativa de neonatos durante os primeiros sete dias de vida. Como indicadores de oxidação foram mensurados os níveis de TBARS e oxidação de proteína. Foi quantificado o ferro total e como parâmetros antioxidantes, foram medidas as atividades das enzimas GPx e SOD, e as concentrações de bilirrubina. Nos potros verificamos que a SOD não apresentou diferença significativa no periodo analisado. As concentrações de bilirrubina foram mais baixas no primeiro tempo avaliado, e tanto a bilirrubina total quanto a indireta elevaram-se às 12 horas e então caíram entre as 72h e 168h. Já a GPx demonstrou aumento da sua atividade nos tempos 12 e 72h quando comparada ao tempo 0h. Verificou-se altos níveis de TBARS no primeiro momento pós-nascimento, uma conseguinte diminuição às 12h seguida de estabilização nos demais tempos. Já a avaliação do período gestacional das éguas indicou um efeito de interação entre paridade e tempo gestacional apenas para o ferro total. SOD e oxidação proteica não apresentaram alterações significantes no período estudado. Tanto a GPx quanto as TBARS apresentaram efeito de tempo, com evidente alteração entre o parto, apresentando aumento e o pós-parto apresentando diminuição de atividade e das concentrações dessas variáveis. Concluímos que em potros, a peroxidação lipídica ao nascimento apresentou-se alta sugerindo um balanço pró-oxidativo durante tal período, o que poderia caracterizar um aumento nos níveis de EROs com finalidade de completar importantes eventos fisiológicos. Quanto a bilirrubina indireta e a GPx podemos sugerir que frente aos altos níveis da peroxidação lipídica houve um estímulo para ativação dos sistemas antioxidantes que envolvem essas biomoléculas e que as duas tenham agido concomitantemente visando equilibrar os níveis de EROs. Com relação às éguas, apontamos que a paridade não tem influencia sobre o estabelecimento da homeostase oxidativa em éguas e que no momento do parto as mesmas passam por um desbalanço oxidativo transiente. Ou seja, o desbalanço oxidativo faz parte tanto do momento do parto quanto da primeira semana de vida dos potros, possivelmente desempenhando um papel fisiológico em abas categorias. / Reactive Oxygen Species (ROS) produced protect living beings against the continuous attacks of microorganisms, as well as being responsible for several physiological events, so oxidative homeostasis is a premise. However, an imbalance between the production of ROS and the antioxidant agents causes several pathological processes in the most varied systems in humans and animals. During pregnancy it is suggested that alterations of the metabolism take place, consequently the increase of by-products of the oxidation during the gestational period. Like gestation, the birth also imposes a period with high energy demand, high oxygen tension and, consequently, it determines a critical moment in the life of the newborn because it is required a rapid adaptation of the same to the change of hypoxic condition (intra uterus) To hyperoxic (extra uterus). The aim of this dissertation was to verify the oxidative status of mares in the final third of gestation, peripartum and postpartum, taking into account the parity effect, as well as the oxidative condition of neonates during the first seven days of life. As oxidation indicators, the levels of TBARS and protein oxidation were measured. Total iron was quantified and as antioxidant parameters, activities of GPx and SOD enzymes, and bilirubin concentrations were measured. In the foals we verified that the SOD showed no significant difference in the analyzed time. Bilirubin concentrations were lower in the first time evaluated, and both total and indirect bilirubin increased at 12 hours and then fell between 72h and 168h. On the other hand, GPx showed an increase in its activity in times 12 and 72h when compared to time 0h. There were high levels of TBARS at the first post-birth moment, a consequent decrease at 12h, followed by stabilization at the other times. The results with mares indicated interaction effect between parity and gestational time only for total iron. SOD and protein oxidation did not present significant alterations in the studied period. Both GPx and TBARS presented a time effect, with an evident alteration between childbirth and postpartum, and there was an increase and decrease, respectively, in the activity and concentrations of these variables. We conclude that in foals, lipid peroxidation at birth was high suggesting a pro-oxidative balance during such period, which could characterize an increase in the levels of ROS in order to complete important physiological events. Regarding indirect bilirubin and GPx, we can suggest that in the face of the high levels of lipid peroxidation there was a stimulus for the activation of the antioxidant systems that involve these biomolecules and that the two have acted concomitantly in order to maintain the high levels of EROs at non detrimental levels. Regarding mares, we pointed out that parity has no influence on the establishment of oxidative homeostasis in mares and that at the time of delivery they undergo transient oxidative imbalance. That is, oxidative imbalance is part of both the calving moment and the first week of life of foals, possibly playing a physiological role in categories.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-09T02:33:51Z No. of bitstreams: 1 116110002.pdf: 901358 bytes, checksum: edf3d6fae4ace04065873f00039b9507 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-09T02:33:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 116110002.pdf: 901358 bytes, checksum: edf3d6fae4ace04065873f00039b9507 (MD5) Previous issue date: 2012-11-16 / A hiperglicemia leva a uma série de fenômenos bioquímicos que estão envolvidos na gênese do estresse oxidativo. O vinho é considerado um alimento antioxidante por conter uma grande quantidade de compostos fenólicos. O objetivo desse estudo foi observar o efeito antioxidante do vinho Tannat (safra 2006), produzido em Itaqui (RS), sobre o estresse oxidativo induzido por glicose ou frutose em eritrócitos in vitro. Eritrócitos foram incubados durante 24 horas a 37°C com concentrações de 5, 10, 30 e 100 mmol/L de glicose ou frutose, na presença ou ausência de diferentes volumes de vinho (0,075, 0,15 e 0,225 mL de vinho/mL de eritrócitos). Foram determinadas espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, consumo de glicose e fragilidade osmótica dos eritrócitos, além de polifenóis totais, antocianinas totais, ácido gálico, ácido caféico, epicatequina, resveratrol e a capacidade antioxidante (DPPH) do vinho. Os eritrócitos incubados com glicose e frutose apresentaram um aumento significativo da peroxidação lipídica quando comparados com eritrócitos incubados com 5 mmol/L de glicose ou frutose, o que foi prevenido com a adição de vinho. O vinho tinto apresentou altas concentrações de polifenóis totais, ácido gálico, ácido caféico, epicatequina e resveratrol, além de boa capacidade antioxidante. O consumo de glicose pelos eritrócitos nas concentrações de 5 e 10 mmol/L foi significativo, o que não ocorreu para os eritrócitos incubados com 30 e 100 mmol/L de glicose. O volume de 0,075 mL de vinho foi capaz de prevenir a inibição da captação de glicose pelos eritrócitos incubados com 30 e 100 mmol/L de glicose. No teste de fragilidade osmótica concentrações hipotônicas de NaCl induziram lise progressiva dos eritrócitos, que foi significativa apenas para os eritrócitos incubados com 30 e 100 mmol/L de frutose, sendo esta revertida através do tratamento dos eritrócitos com o vinho. Podemos concluir que o vinho tinto, a partir do volume mais baixo utilizado, pode diminuir a peroxidação lipídica, prevenir a inibição da captação de glicose pelos eritrócitos, além de diminuir a fragilidade osmótica de eritrócitos incubados com frutose. Este efeito antioxidante do vinho se deve, provavelmente, às altas concentrações de polifenóis encontrados e sua boa capacidade antioxidante. / Hyperglycemia leads a series of biochemical phenomena that are involved in the genesis of oxidative stress. The wine is considered an antioxidant food to contain a large amount of phenolic compounds. The aim of this study was to observe the antioxidant effect of Tannat wine (vintage 2006), produced in Itaqui (RS), on oxidative stress induced by glucose or fructose in erythrocytes in vitro. Erythrocytes were incubated for 24 hours at 37°C with concentrations of 5, 10, 30 and 100 mmol/L glucose or fructose in the presence or absence at different volumes of wine (0.075, 0.15 and 0.225 mL of red wine/mL of erythrocytes). Were determined Thiobarbituric acid reactive species, glucose consumption and osmotic fragility of erythrocytes; in addition total phenolic, anthocyanins, gallic acid, caffeic acid, epicatechin, resveratrol and the DPPH Scavenging Activity of wine. Erythrocytes incubated with glucose and fructose showed a significant increase in lipid peroxidation compared with erythrocytes incubated with 5 mmol/L glucose or fructose, which was prevented by addition of wine. The red wine presented high concentrations of total polyphenols, gallic acid, caffeic acid, epicatechin and resveratrol, further good antioxidant potential. The consumption of glucose by the erythrocytes at concentrations of 5 and 10 mmol/L was significant, this was not observed for the erythrocytes incubated with 30 and 100 mmol/L glucose. The volume of 0.075 ml of wine was able to prevent the inhibition of glucose uptake by erythrocytes incubated with 30 and 100 mmol/L glucose. In the test of osmotic fragility hypotonic concentrations of NaCl induced lysis of erythrocytes progressive, which was significant only for erythrocytes incubated with 30 and 100 mmol/L fructose, this being reversed by treating cells with wine. We conclude that red wine, from the lower volume used, can decrease lipid peroxidation, prevented the inhibition of glucose uptake and decreased osmotic fragility of erythrocytes incubated with fructose. This antioxidant effect of wine is probably due to high concentrations of polyphenols and its good antioxidant capacity.

O sêmen eqüino é muito utilizado na forma refrigerada, porém, para alguns garanhões, a longevidade espermática é baixa. Durante a refrigeração o espermatozóide pode ser afetado por vários fatores, que podem causar a perda da integridade da membrana plasmática, danos no acrossomo e disfunções mitocondriais, resultando em perda irreversível de motilidade e capacidade fecundante. A composição e concentração do plasma seminal podem causar efeitos deletérios ao espermatozóide, sendo a centrifugação do sêmen uma alternativa para minimizar estes efeitos. Este experimento foi realizado para verificar o efeito da centrifugação nas características de movimento, integridade e peroxidação lipídica das membranas do espermatozóide eqüino refrigerado a 5°C por até 72h. Foram realizadas cinco colheitas de sêmen de quatro garanhões. O sêmen foi avaliado quanto ao volume e concentração, e em seguida dividido em dois tratamentos, sem centrifugação (S) e centrifugado (C) (300g/10min). Ambos foram diluídos na concentração final de 30 x106 eptz/mL em diluidor a base de leite desnatado e então refrigerados. Foram analisadas as características do movimento espermático (CASA), morfologia espermática (DIC), integridade das membranas plasmática e acrossomal (PI/FITC-PSA), potencial de membrana mitocondrial (JC-1) e peroxidação lipídica das membranas (C11-BODIPY581/591), sendo estas três últimas análises por citometria de fluxo. As análises foram realizadas no tempo 0 e 24, 48 e 72 horas após a refrigeração. O delineamento experimental foi em blocos generalizados adicionado do fator medidas repetidas no tempo. Os dados foram analisados pelo programa SAS, submetidos à análise de variância e às interações determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisser ao nível de 5% de significância. O espermatozóide do sêmen centrifugado apresentou valores médios maiores de motilidade total e progressiva, ALH, STR e LIN (P<0,05), porém os valores das velocidades e BCF foram menores (P<0,05). Houve efeito do tempo nas características de movimento espermático (P<0,05), exceto para STR. Não houve efeito da centrifugação e nem do tempo quanto às características morfológicas dos espermatozóides refrigerados, esta só diferiu entre os garanhões (P<0,05). Por sua vez, a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial espermáticas foram maiores nos sêmen centrifugado (P<0,05) e suas porcentagens decresceram com o tempo (P<0,05). A peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide refrigerado aumentou somente nas primeiras 24h (P<0,05) e não foi influenciada pela centrifugação. Conclui-se que a centrifugação e a retirada do plasma seminal melhoram a qualidade do sêmen refrigerado eqüino, principalmente em garanhões com baixa longevidade, sendo esta influenciada pelas características iniciais da morfologia espermática. Ainda, tempo de refrigeração induz a um declínio da qualidade seminal. E, por fim, a peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide parece não ser a principal causa de alterações da integridade das membranas e do potencial de membrana mitocondrial durante a refrigeração do sêmen eqüino. / Equine cooled semen is frequently used, although the longevity for some stallions is low. During the cooling process the spermatozoon can be affected by several factors that can cause loss of plasma membrane integrity, acrosomal damage and mitochondrial dysfunctions, resulting in irreversible loss of motility and fertilizing capacity. The composition and concentration of seminal plasma could cause harmful effects to the sperm, being semen centrifugation an alternative to minimize these effects. This experiment was designed to verify the effects of the centrifugation in motion characteristics, membranes integrity and lipid peroxidation of cooled equine sperm to 5°C until 72 hours. Five ejaculates from four stallions were collected. The semen was evaluated for volume and concentration, then split in two treatments, no centrifugation (N) and with centrifugation (W) (300g/10min). Both were diluted in the final concentration 30 x106 spermatozoa/mL in a skin milk extender and then cooled. The following analyses were performed: the sperm motion characteristics (CASA), morphology (DIC), plasma and acrosomal membranes integrity (PI/FITC-PSA), mitochondrial membrane potential (JC-1) and membrane lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591), the last three analyses were assessed in flow citometry. The analyses were performed in time 0 and 24, 48 and 72 hours after cooling. The experimental design was random blocks with repeated-measures. The data were analyzed by the SAS program, submitted to analysis of variance and the interactions by the test of Greenhouse-Geisser at the level of 5% of significance. The values were larger in W semen for total and progressive motility, ALH, STR and LIN (P<0,05), however the values of the three types of speed and BCF were smaller (P<0,05). There was effect of time in the motion characteristics of sperm (P<0,05), except for STR. There was not any effect of centrifugation and time for the morphologic characteristics of cooled spermatozoa, that only differed among stallions (P<0,05). On the other hand, the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane were larger in W semen (P<0,05) and their percentages decreased within time (P<0,05). The membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm only increased in the first 24 hours (P<0,05) and it was not influenced by centrifugation. In conclusion, the centrifugation and withdrawal of the seminal plasma improve semen quality of the cooled equine sperm, mainly in stallions with low longevity, which is influenced by the initials characteristics of sperm morphology. Moreover, time of cooling induces a decline of seminal quality. Finally, the membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm seems not to be the main cause of alterations in the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane during the cooling of equine semen.

Os fungos de decomposição branca são organismos capazes de degradar os materiais lignocelulósicos de maneira eficiente através de reações catalisadas por enzimas hidrolíticas e oxidativas ou ainda por meio de metabólitos de baixa massa molar que iniciam o processo degradativo. Ceriporiopsis subvermispora é um fungo de decomposição branca que se destaca como um dos mais seletivos na degradação da lignina, possuindo grande potencial de aplicação tecnológica. Este fungo é capaz de iniciar reações de peroxidação de lipídeos a partir da formação de íons Mn3+ oriundos da ação da enzima manganês peroxidase (MnP) sobre Mn2+. No presente estudo avaliou-se a secreção de enzimas oxidativas por C. subvermispora agindo sobre madeira de Eucalyptus grandis em cultivos suplementados ou não com milhocina e milhocina e glicose. Os extratos enzimáticos obtidos a partir desses cultivos apresentaram elevada atividade de MnP, principalmente quando o meio foi suplementado com milhocina. Os mesmos extratos foram capazes de peroxidar ácido linoleico in vitro. Nessas reações ocorreu um acúmulo de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS) que foi proporcional ao nível de MnP existente nos extratos. A taxa de consumo de oxigênio nessas reações também foi proporcional aos teores de MnP presente nos extratos. A caracterização da madeira biotratada indicou que as maiores perdas de massa e de lignina ocorreram nos cultivos suplementados, sendo que aparentemente há uma correlação entre a extensão da degradação de madeira e lignina com a atividade peroxidativa dos extratos. Lacases foram detectadas somente em baixos níveis nos extratos enzimáticos oriundos da madeira. Por outro lado, cultivos em meio líquido composto de 2% de extrato de malte e 0,2% de extrato de levedura induziram a produção de lacases e nenhuma secreção de MnP. Também as lacases foram capazes de peroxidar ácido linoleico, desde que na presença de um mediador, o ácido _-hidróxi-benzóico. De qualquer forma, durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora, lacase foi detectada somente no início dos cultivos e mesmo assim em níveis bastante baixos o que significa que a participação de lacase na peroxidação de lipídeos durante a biodegradação de E. grandis por C. subvermispora deve ser pouco significante. / The white-rot fungi are able to degrade lignocellulosic materials in an efficient way through reactions catalyzed by hydrolytic and oxidative enzymes or still by means of low molar mass metabolites that begin the degradative process. Ceriporiopsis subvermispora is a white-rot fungus that stands out as one of the most selective in lignin degradation, possessing great potential for technological applications. This fungus is able to initiate lipid peroxidation reactions based on the Mn3+ produced by the catalytic action of the enzyme manganese peroxidase (MnP) on Mn2+ ions. In the present study, the secretion of oxidative enzymes by C. subvermispora was evaluated in cultures containing Eucalyptus grandis wood chips and some supplements such as corn steep liquor and corn steep liquor plus glucose. The enzymatic extracts obtained from these cultures contained high MnP activity, mainly when corn steep liquor was used as a culture supplement. The same extracts were able to peroxidize linoleic acid in vitro. In these reactions, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) accumulated over reaction time and the TBARS levels were proportional to the MnP present in the extracts. The rate of oxygen consumption in these reactions was also proportional to the level of MnP present in the extracts. The characterization of the biotreated wood indicated that the largest lignin and wood mass losses were observed in supplemented cultures, with an apparent correlation between the peroxidative activity in the extracts and the extension of the wood and lignin degradation. Laccase was detected only in low levels in the enzymatic extracts originating from the wood-containing cultures. On the other hand, submerged cultures in which the liquid medium was composed of 2% malt-extract and 0,2% yeast extract induced laccase production without simultaneous secretion of MnP. The laccase active extract was also able to peroxidize linoleic acid, since in the presence of a mediator (_-hydroxy-benzoic acid). Anyway, during E. grandis biodegradation by C. subvermispora, laccase was only detected in the beginning of the cultivations and even so at low levels suggesting that laccase were not involved in lipid peroxidation during the E. grandis wood biodegradation by C. subvermispora.

Estudou-se a degradação dos fármacos acetaminofeno (ACT), atenolol (ATL), bezafibrato (BZF), diclofenaco (DIC) e ibuprofeno (IBU) em solução aquosa através de fotólise e peroxidação fotoassistida. As soluções foram caracterizadas antes e após os processos de fotólise e UV/H&#8322O&#8322 quanto à degradação dos fármacos e à remoção de carbono orgânico total. Também foi avaliada a degradação por fotólise dos fármacos em uma matriz real (efluente de estação de tratamento de esgoto, ETE). Os experimentos foram realizados em um reator anular com lâmpada de vapor de mercúrio de baixa pressão de 36 ou 75 W e concentrações iniciais de 5 ou 20 mg L&#8315&#185 de cada fármaco, em mistura e individualmente, no caso dos estudos de fotólise UV. Os resultados mostraram absorção de radiação UV (254 nm) pelo ACT superior à dos demais fármacos (&#8364=8990 L mol&#8315&#185 cm&#8315&#185), e comparativamente inferior para o ATL e IBU (&#8364=725 e 1080 L mol&#8315&#185 cm&#8315&#185, respectivamente). Não houve degradação por hidrólise após 24h em qualquer pH. O DIC e o BZF degradaram-se mais rapidamente, independentemente do processo fotoassistido. As concentrações de DIC nos experimentos realizados com [DIC]0=5 mg L&#8315&#185 ficaram abaixo do limite de detecção após 20 minutos de irradiação. Na presença de H H&#8322O&#8322 as concentrações dos contaminantes ficaram abaixo do limite de detecção após 50 minutes para concentrações iniciais de 20 mg L&#8315&#185. Os resultados dos ensaios de toxicidade nos experimentos realizados com a mistura de fármacos mostraram valores de CE50 inferiores aos valores obtidos nos experimentos com a solução dos fármacos individuais. Os valores de TOC apresentaram redução de até 13% ao final de 120 minutos, o que comprova a persistência dos produtos de degradação. A degradação por fotólise UV do ATL e do ACT ocorreu mesmo em efluente de ETE, sendo a eficiência desse processo semelhante à obtida usando-se água como matriz. Esses resultados são úteis para compreensão da remediação de águas e efluentes contendo esses contaminantes emergentes por meio de processos foto-oxidativos. / This work aimed at studying the degradation of the following pharmaceutical compounds in aqueous solution by means of photolysis and photoassisted peroxidation: acetaminophen (ACT), atenolol (ATL), bezafibrate (BZF), diclofenac (DIC), and ibuprofen (IBU). Solutions were characterized before and after photolysis and UV/H2O2 processes regarding drug degradation and total organic carbon removal. In addition, the photolysis of the pharmaceutical compounds was investigated in a real wastewater matrix (effluent from a sewage treatment plant, STP). The experiments were carried out in an annular photochemical reactor equipped with a low pressure mercury lamp (36 or 75 W) and initial solution concentrations of 5 and 20 mg L-1 of each drug, for the mixture and individual compounds, in the case of UV photolysis studies. The results revealed higher absorption of UV radiation (254 nm) by ACT than that shown by the other pharmaceutical compounds (=8990 L mol-1 cm-1), and comparatively lower for ATL and IBU (=725 and 1080 L mol-1 cm-1, respectively). No hydrolysis was observed after 24 hours at any pH. The degradation of DIC and BZF was faster, regardless the photoassisted process. DIC concentrations in the experiments carried out with [DIC]0=5 mg L-1 were below the detection limit after 20 minutes of irradiation. In the presence of H2O2, contaminant concentrations were below the detection limit after 50 minutes of irradiation for initial concentrations of 20 mg L-1. The results of the toxicity assays for the experiments carried out with the mixture of pharmaceutical compounds showed CE50 values lower than those obtained with the compounds individually. TOC removals up to 13% after 120 minutes were obtained, therefore confirming the formation of persistent degradation products. In the case of ATL and ACT, UV degradation occurred even in STP wastewater and the efficiency of the process was similar to that obtained with pure water. The results obtained in this study are useful to understand the treatment of water and wastewater contaminated with this class of emerging pollutants by means of photo-oxidative process.

Combination radiation and chemotherapy are commonly used to treat locoregionally advanced head and neck squamous cell carcinoma. Aggressive dosing of these therapies is significantly hampered by side effects due to normal tissue toxicity. Selenium represents an adjuvant that selectively sensitizes cancer cells to therapy, potentially by inducing lipid peroxidation (LPO). This study investigated whether one such selenium compound, methylseleninic acid (MSA), induces LPO and radiation sensitivity in HNSCC cells. Results from BODIPY C11 oxidation and ferric thiocyanate assay revealed that MSA induced LPO in HNSCC cells rapidly and persistently. Cell counts and propidium iodide viability assays showed that MSA was more toxic to HNSCC cells than other related selenium compounds, and this toxicity was abrogated by treatment with α-tocopherol, an LPO inhibitor. MSA was also found to sensitize HNSCC cells to radiation by clonogenic assay. The addition of MSA to a cell-free solution of glutathione (GSH) resulted in an increase in oxygen consumption as measured by Clark electrode, suggesting the formation of reactive oxygen species. Intracellular GSH in HNSCC was depleted following MSA treatment. Supplementation of the intracellular GSH pool with N-acetylcysteine (NAC) rendered the cells more sensitive to MSA. Results from this study identify MSA as an inducer of LPO, and reveal its capability to sensitize HNSCC to radiation. MSA may represent a potent adjuvant to combination therapy in HNSCC.