O colesterol é um importante componente das membranas celulares em eucariotos superiores, desempenhando papéis estruturais e funcionais. O colesterol possui uma insaturação em sua estrutura sendo, portanto, alvo de oxidação mediada por espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio. A oxidação não enzimática do colesterol gera, como produtos primários, os hidroperóxidos de colesterol. Tais moléculas, por sua vez, são altamente reativas e podem reagir com metais livres e/ou metaloproteínas, trazendo consequências à celula. Neste sentido, o primeiro capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação dos hidroperóxidos de colesterol (ChOOH) com o citocromo c (citc), uma heme proteína envolvida no transporte de elétrons na mitocôndria. Análises de espectroscopia no UV-Vis mostraram que o ChOOH promove o bleaching da banda Soret do citc de uma maneira dose-dependente. Mais ainda, esta reação leva à formação de radicais centrados em carbono tanto na proteína como no lipídeo, sugerindo uma redução homolítica do ChOOH. Como consequências, pode-se observar a oligomerização do citc, um processo que pode influenciar no transporte de elétrons bem como na sinalização para a apoptose. A partir da reação do citc com ChOOH podem surgir, direta ou indiretamente, outras espécies reativas, como aldeídos, cetonas e epóxidos. Dentre estas, destacam-se os aldeídos de colesterol, em particular o colesterol secoaldeído (CSec) e o carboxialdeído (ChAld), uma vez que foram encontrados elevados em placas ateroscleróticas e em tecidos cerebrais de pacientes com doenças neurodegenerativas. Tais espécies podem reagir com resíduos de aminoácidos provocando alterações estruturais e funcionais em proteínas. Neste sentido, o segundo capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação do ChAld com citc. Usando modelos mimétivos de membrana e espectrometria de massas, foi mostrado que o ChAld modifica covalentemente o citc por um mecanismo consistente com a formação de bases de Schiff. Tal modificação ocorre preferencialmente em resíduos de lisina que interagem com a membrana. Estas modificações influenciam na afinidade do citc pela membrana, aumentando sua aderência, o que pode ter influência no transporte de elétrons e sinalização para a apoptose. No terceiro e último capítulo deste trabalho nós buscamos uma ferramente analítica que permitisse analisar modificação de proteínas promovidas por produtos de oxidação de colesterol e outros esteróis. Em um estudo realizado em colaboração com o grupo do professor Porter na Universidade de Vanderbilt, utilizamos ensaios baseados em click chemistry para buscar proteínas modificadas. Para isso, foram sintetizados derivados de colesterol e 7-deidrocolesterol (7-DHC, precursor imediato do colesterol) contendo um grupo alquinil na sua cadeia lateral. Este grupo pode ser ligado a um grupo azida por meio de uma reação de cicloadição, em um processo conhecido como click chemistry. Após a síntese e caracterização dos derivados lipídicos contendo o grupo alquinil na cadeia lateral, células Neuro2a foram tratadas com o alquinil-7-DHC e o alquinil-colesterol para averiguar seu metabolismo. Análises por HPLC-MS/MS mostraram que ambos derivados contendo o grupo alquinil foram metabolisados e convertdos nos respectivos ésteres. Usando um modelo celular para a doença conhecida como Sindrome de Smith-Lemli-Opitz (SLOS), doença caracterizada pela deficiência na enzima 7-deidrocolesterol redutase, foi mostrado que o acúmulo característico de 7-DHC nos pacientes pode levar a uma maior modificação de proteínas promovidas por seus derivados, o que pode contribuir para o desenvolvimento da doença. / Cholesterol is an important component of eukaryotic cellular membranes, where it has an influence in the fluidity and stability. Due to the presence of a double bond in its structure, cholesterol can be oxidized by reactive oxygen and nitrogen species. This non-enzymatic oxidation generates, as primary products, cholesterol hydroperoxides. Such molecules, in turn, are highly reactive and can react with free metal ions and/or metalloproteins, affecting cell metabolism. Therefore, the first chapter of the present study aims to investigate the reaction of cholesterol hydroperoxides (ChOOH) with cytochrome c (cytc), a heme protein involved in the mitochondrial electron transport. Spectroscopic analyses in the UV-Vis region showed that ChOOH induces a dose-dependent bleaching of cytc\'s Soret band. In addition, this reaction leads to the formation of carbon-centered radicals on both protein and lipid, suggesting a homolytic reduction of ChOOH. As consequences, cytc undergoes oligomerization, a process that can influence electron transport and apoptosis signaling. The reaction of cytc and ChOOH can produce, directly or indirectly, reactive species such as epoxides, aldehydes and ketones. Among them, cholesterol aldehydes, such as cholesterol secoaldehyde (CSec) and cholesterol carboxyaldehyde (ChAld), are of particular interest, since they were previously found elevated in atherosclerotic plaques and brain tissue of patients bearing neurodegenerative diseases. These species can also react with amino acid residues leading to protein denaturation and malfunction. With that in mind, the second chapter of this study aims to investigate the reaction of ChAld and cytc. Using mimetic membrane models and mass spectrometry analyses, we showed that ChAld covalently modifies cytc through a mechanism consistent with the formation of Schiff base adducts. Such modification occurs mostly at lysine residues that are known to interact with the membrane. The modifications have an influence in the affinity of cytc to the membrane, where they increase its binding to the membrane, a process that could affect the electron transport and apoptosis signaling. In the last and third chapter of this study we wanted an analytical tool that allowed the investigation of protein adduction promoted by cholesterol and other sterols-derived oxidation products. In a study performed in collaboration with the Porter group from Vanderbilt University, we used analyses based on click chemistry to search for protein adduction. To address that, we first synthesized derivatives of cholesterol and 7-dehydrocholesterol (7-DHC, the immediate precursor of cholesterol) containing an alkynyl group in the side chain. The alkynyl group can be ligated to an azide group through a cycloaddition reaction, in a process known as click chemistry. After the synthesis and characterization of alkynyl derivatives, Neuro2a cells were treated with alkynyl-7-DHC and alkynyl-cholesterol to check their metabolism. HPLC-MS/MS analyses showed that both alkynyl derivatives are metabolized and converted into their respective esters. In addition, using a cell model for Smith-Lemli-Optiz Syndrome (SLOS), a disease characterized by the deficiency in the dehydrocholesterol reductase 7, we showed that the characteristic accumulation of 7-DHC in SLOS patients might be associated with protein adduction promoted by its oxidation products, which might contribute to the development of the disease.

Submitted by DANIEL JOSÉ HOFFMANN null (danielhoffmann@veterinario.med.br) on 2017-08-09T20:35:31Z No. of bitstreams: 1 ASSOCIAÇÃO ENTRE A HIPERLEPTINEMIA E O ESTRESSE OXIDATIVO SISTÊMICO EM CÃES OBESOS (Daniel José Hoffmann).pdf: 1191810 bytes, checksum: f7623146140f3767e6c70e577034698d (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-08-11T19:09:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 hoffmann_dj_me_araca.pdf: 1191810 bytes, checksum: f7623146140f3767e6c70e577034698d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-11T19:09:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 hoffmann_dj_me_araca.pdf: 1191810 bytes, checksum: f7623146140f3767e6c70e577034698d (MD5) Previous issue date: 2017-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A obesidade é um distúrbio nutricional frequente em cães, com prevalência de 30 a 50%, e representa um grande fator de risco para o desenvolvimento de uma série de doenças. A relação entre estresse oxidativo e obesidade em humanos é bem definida, entretanto em cães não está bem estabelecida. Foi realizada uma revisão bibliográfica sobre estresse oxidativo na obesidade canina, utilizando dois bancos de dados (Portal CAPES e PubMed), com fim de investigar a interferência do grau de obesidade no desenvolvimento do estresse oxidativo. Foi realizado um estudo observacional transversal com controle para confirmar a hipótese de que o grau de obesidade está correlacionado ao estresse oxidativo sistêmico. Para tal foram selecionados 121 cães, os quais foram distribuídos em grupos conforme o escore de condição corporal (ECC), controle (n=39), sobrepeso (n=38) e obeso (n=44). De todos os cães foram mensurados marcadores de obesidade (ECC e leptina) e marcadores de estresse oxidativo (Capacidade antioxidante total (TAC), Concentração oxidante total (TOC), Peroxidação lipídica (TBARS), Ácido úrico, Albumina, Gama Glutamil Transferase (GGT) e Índice de estresse oxidativo (IEO)). Os cães obesos apresentaram concentrações de leptina plasmática e indicadores de estresse oxidativo superiores aos demais grupos. Os valores intermediários de leptinemia e dos marcadores plasmáticos de estresse oxidativo sistêmico caracterizaram os cães com sobrepeso. Foi possível comprovar que a hiperleptinemia da obesidade está correlacionada com o estresse oxidativo sistêmico. / Obesity is a common nutritional disorder in dogs, with prevalence of 30 to 50%, and represents a major risk factor for the development of a number of diseases. The relationship between oxidative stress and obesity in humans is well defined, however in dogs is not well established. A literature review was performed on oxidative stress in canine obesity, using two databases (Portal CAPES and PubMed), to Investigate the interference of obesity degree in the development of oxidative stress. A crosssectional study was carried out with control to confirm the hypothesis that the degree of obesity is correlated to the oxidative stress. For such 121 dogs were selected, which were distributed in groups according to body condition score (ECC), control (n = 39), overweight (n = 38) and obese (n = 44). All the dogs were measured obesity markers (ECC and leptin) and markers of oxidative stress (Total Antioxidant Capacity (TAC), Total Oxidant Concentration (TOC), lipid peroxidation (TBARS), uric Acid, albumin, Gamma Glutamyl Transferase (GGT) and Oxidative Stress Index (IEO)). Obese dogs showed plasma leptin concentrations and oxidative stress indicators higher than the other groups. The intermediary values of leptin and the systemic oxidative stress plasmatic markers characterized the overweight dogs It was possible to prove that obesity hyperleptinemia is correlated with systemic oxidative stress. / FAPESP: 2014/20662-0

Orientador: Silvana Regina Perez Orrico / Coorientador: Carlos Rossa Junior / Banca: Margartete Aparecida Meneses de Almeida / Banca: José Roberto Cortelli / Banca: Maria Teresa Pepato / Banca: Luís Carlos Spolidório / Resumo: O presente estudo teve por objetivo avaliar os níveis locais e sistêmicos de peroxidação lipídica (LPO) e sua correlação com o perfil de marcadores inflamatórios, locais e sistêmicos em com Diabetes mellitus (DM) tipo 2, dislipidemia e periodontite crônica, comparando-os a indivíduos sem diabetes. Além disso, buscou-se propor um método validado para avaliar o malondiadeído (MDA) no fluido sulcular gengival de sítios saudáveis e doentes. A amostra foi constituída de 120 pacientes com doença periodontal crônica divididos em 4 grupos: Grupo1 (DM descompensado); Grupo2 (DM compensado); Grupo3 (sem diabetes com dislipidemia); Grupo 4 (sistemicamente saudável). Toda a amostra foi submetida a exame periodontal completo, exame físico e avaliação laboratorial para verificação da glicemia de jejum, hemoglobina glicada (HbA1c), insulina, proteína C-reativa e perfil lipídico. O exame periodontal consistiu na avaliação do índice de placa visível, do índice de sangramento marginal, da posição da margem gengival, da profundidade de sondagem, do sangramento à sondagem e do nível clínico de inserção. Para todos os grupos foram coletadas amostras de fluido sulcular gengival (FSG) (4 sítios sem periodontite e 4 sítios com periodontite) e de sangue para obtenção do plasma sanguíneo. Os níveis de peroxidação lipídica representados pelo MDA, avaliado por HPLC, e pelo LDL oxidado (LDLox), avaliado por ELISA, foram quantificados no fluido sulcular gengival e no plasma. Foram avaliadas ainda as citocinas (IL)-1, -2, - 4, -5, -6, -7, -8, -10, -12, -13 e fator de necrose tumoral α (TNF-α) no FSG e no plasma. Foi possível determinar e validar o método de avaliação no fluido sulcular gengival, com alta precisão, sendo que os coeficientes... (Resumo completo, clicar aesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study is to evaluate the levels of the lipid peroxidation and its correlation with systemic and local inflammatory markers profile in patients with type 2 diabetes mellitus (DM2) dyslipidemia and chronic periodontitis compared to systemically healthy patients. We also aimed to quantify a specific product of the lipid peroxidation process, malondialdehyde (MDA), in gingival crevicular fluid and to describe the validation of this method in this matrix using HPLC. The study sample comprised 120 patients divided into four groups with 30 patients in each group: group 1- diabetes with poor metabolic control with dyslipidemia, group 2- diabetes with good metabolic control, group 3- without diabetes with dyslipidemia and group 4- systemically healthy. All the subjects will go through a complete periodontal examination and physical and laboratory evaluation in order to verify fasting plasma glucose, glycated hemoglobin (HbA1c), lipid profile, insulin and high sensitivity C-reactive protein. Periodontal examination will consist of visible plaque index, gingival bleeding index, bleeding on probing, probing depth (PD) and clinical attachment levels (CAL). Plasma and samples of gingival crevicular fluid (GCF) will be collected in 4 sites without periodontal disease and 4 sites with periodontal disease. The lipid peroxidation levels, evaluated by oxidized LDL (ox LDL) and MDA were measured in GCF and in plasma. Inflammatory cytokines, (IL)-1, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -10, -12, -13 and tumor necrosis factor-alpha α (TNF-α) were also evaluated in plasma and GCF. It was possible to validate a HPLC-based method to identify and quantify the MDA in GCF with sensitivity, precision, and accuracy even in small concentrations as observed in healthy... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Cláudio Cavariani / Banca: Edivaldo Aparecido Amaral da Silva / Banca: Elza Alves / Resumo: A retenção de clorofila tem afetado a produção de sementes de soja no Brasil, principalmente na região dos cerrados. Como conseqüência, tem-se a redução da qualidade dos lotes, constatada por queda na germinação e vigor, com prejuízos no estabelecimento de população adequada de plantas, no momento da semeadura. A degradação da clorofila pode ser afetada pelo estádio de maturação, por condições de secagem, aplicação de produtos químicos dessecantes e pelas condições climáticas, especialmente durante as fases de acúmulo de reservas e maturação das sementes. O processo de maturação, além de ter grande efeito na degradação da clorofila, influencia a produção de enzimas específicas da germinação. A presença do pigmento verde pode estar relacionada à produção de radicais livres que causam danos oxidativos, os quais afetam a longevidade das sementes. Este estudo teve como objetivo averiguar a relação entre a clorofila, a qualidade fisiológica e os danos oxidativos que afetam o potencial de conservação das sementes de soja. A pesquisa foi conduzida no Departamento de Produção Vegetal - Agricultura, da Faculdade de Ciências Agronômicas, UNESP, Campus de Botucatu. Os tratamentos constaram de 67 lotes de soja, de diferentes cultivares, provenientes de áreas dos Estados do Mato Grosso, de São Paulo e do Paraná, com variações nos graus de retenção... (resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The retention of chlorophyll has affected the production of soybeans in Brazil, mainly in the cerrado biome. As a result there has been a reduction in the quality of the lots, evidenced by a decrease in germination and vigor, with losses in the establishment of appropriate plants population at sowing time. The degradation of chlorophyll can be affected by ripening stage, by drying conditions, application of chemical desiccants, and climatic conditions, especially during periods of reserve accumulation and seed maturation. The maturation process, besides having great effect on the degradation of chlorophyll, has importance in the production of specific enzymes of germination. The presence of green pigment may be related to the production of free radicals that cause oxidative damage, which affects seed longevity. This study aimed to investigate the relationship between chlorophyll, the physiological quality and oxidative damage affecting the conservation potential of soybean seeds. The research was conducted at the Department of Crop Production - Agriculture, Faculty of Agronomic Sciences, UNESP, Botucatu. The treatments consisted of 67 soybean lots of different cultivars from areas in Mato Grosso, Sao Paulo and Parana, with variable degrees of chlorophyll retention. For each batch was determined the percentage of green seeds using a visual method of classification with the aid of the Munsell color card, and the chlorophyll content by chemical extraction, using the method of Arnon (1949) adapted in this study. The fluorometer was used to evaluate the photosynthetic activity of the seeds with chlorophyll retention. We evaluated also the oxidative damage suffered by each lot by determining lipoperoxide. All parameters were related to the quality of seeds valued at three times; initial date, soon after receiving the seed and after 3 and 6 months of storage. The data were analyzed by correlation... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Marileda Bonafim Carvalho / Coorientador: Luciane Helena Gargaglioni Batalhão / Banca: Paola Castro Moraes / Banca: Márcia Ferreira da Rosa Sobreira / Banca: Juliana Corrêa Borges Silva / Banca: Evelin Capellari Cárnio / Resumo: A instalação do estresse oxidativo decorre da existência de um desequilíbrio entre compostos oxidantes e antioxidantes, ocasionando a geração e acúmulo de espécies reativas do oxigênio (ERO). Estudos realizados nos estágios terminais da doença renal crônica (DRC) no homem e em ratos demonstraram que ocorre aumento na produção de ERO. O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se o mesmo ocorre em cães clinicamente estáveis nos diferentes estágios da DRC naturalmente adquirida. O protocolo experimental do presente trabalho foi previamente aprovado, pela Comissão de Ética no uso de Animais conforme processo n.° 013690/11. Foram estudados cinco grupos de cães, com idade variando entre quatro a 18 anos, compreendendo o grupo controle, composto por animais sadios (controle, n=17), grupo com DRC estágio 1 (DRC-1, n=12), grupo com DRC estágio 2 (DRC-2, n=10), grupo com DRC estágio 3 (DRC-3, n=13) e grupo com DRC estágio 4 (DRC-4, n=10). Os cães com DRC estavam com o quadro clínico estável e sem receber qualquer tipo de tratamento. Os animais sadios ou com DRC foram submetidos a duas coletas de sangue, com intervalo de 24 horas (amostras repetidas), para obtenção de soro e plasma. O estresse oxidativo foi avaliado pelo poder antioxidante, estimado pelo delta, e pela determinação plasmática indireta de óxido nítrico (NO) por meio da dosagem de nitrato/nitrito. O ensaio foi realizado em duplicatas das amostras de cada avaliação. Os dados obtidos (médias das duplicatas) foram submetidos à análise de variância (One-way ANOVA) não paramétrica (Kruskal-Wallis) (α=0,05). Os resultados estão expressos como média±erro padrão da média. Os valores de creatinina sérica, que definiram a classificação dos pacientes do grupo controle, DRC-1, DRC-2, DRC-3 e DRC-4 foram 1,02±0,02mg/dL; 1,06±0,05mg/dL; 1,80±0,03mg/dL; 3,39±0,21mg/dL e 6,00±0,28mg/dL, respectivamente. Os resultados relativos ... / Abstract: The establishment of oxidative stress results from an imbalance between oxidants and antioxidants compounds, which generates accumulation of reactive oxygen species (ROS). Studies conducted in terminal stages of chronic kidney disease (CKD) in humans and mice demonstrated an increase in ROS generation. The aim of this study was to determine if the same pattern of response occurs in dogs clinically stable at different stages of naturally occurring CKD. The experimental protocol of this study was previously approved by the Ethics Committee on the use of Animals n.° 013690/11. Five groups of dogs, all aged between four to 18 years old. Were studied the control group was composed of healthy animals (CG, n = 17), CKD stage 1 group (CKD-1, n = 12), CKD stage 2 group (CKD-2, n = 10), CKD stage 3 group (CKD-3, n = 13) and CKD stage 4 group (CKD-4, n = 10). CKD dogs were clinically stable with no treatment. Two blood samples were collected at intervals of 24 hours (repeated measures) to obtain serum and plasma. Oxidative stress was measured by antioxidant power and indirectly by determination of nitric oxide (NO) by nitrate/nitrite. Data (means of duplicates) were submitted to analysis of variance (One-way ANOVA) nonparametric (Kruskal-Wallis) (α = .05). The results were expressed as mean±standard error of the mean. The serum creatinine values guided the classification of patients as CG, CKD-1, CKD-2, CKD-3 and CKD-4 and were 1.02±0.02mg/dL, 1.06±0.05 mg/dL, 1.80±0.03 mg/dL, 3.39±0.21 mg/dL and 6.00±0.28 mg/dL, respectively. The results related to antioxidant power (GC) 0.032 ± 0.002 mmol/μL, (CKD-1) 0.030±0.002nmol/μL, (CKD-2) 0.028±0.003nmol/μL, (CKD- 3) 0.027±0.003 nmol/μL and (CKD-4) 0.025 ± 0.002 nmol/μL were different between the healthy dogs and dogs with CKD, but not differ significantly among groups. The results of the NO plasma concentrations did not differ significantly when comparing the GC data (10.81±0.51μM) ... / Doutor

Doenças desencadeadas ou agravadas pela contaminação ambiental resultante dos poluentes atmosféricos vêm se tornando cada vez mais preocupantes, entre as quais se destacam as doenças respiratórias e cardiovasculares. Vários estudos têm mostrado uma associação entre poluição atmosférica e o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, especialmente devido ao material particulado no ar. Este material, por sua vez, possui diversas substâncias em sua composição química, dentre eles os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), os quais têm sido fortemente associados com o processo inflamatório em estudos in vitro. O benzo[a]pireno (BaP) é um dos HPAs mais importantes, sendo que seu metabólito mais utilizado como biomarcador de exposição é o 1-hidroxipireno (1-HP) urinário. Considerando as doenças cardiovasculares, o infarto agudo do miocárdio (IAM) é um dos desfechos clínicos mais relevantes pela sua alta morbidade e mortalidade. Sabe-se que, além dos efeitos da poluição atmosférica, outros fatores são considerados determinantes no desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como o tabagismo, sedentarismo, dislipidemias, histórico familiar, entre outros. Neste contexto, o presente trabalho avaliou a possível associação entre exposição ambiental ao benzo[a]pireno, inflamação e biomarcadores do estresse oxidativo em pacientes com IAM. Fizeram parte deste estudo indivíduos diagnosticados com IAM (N=58) e indivíduos não infartados controles (N=41), sendo cada grupo dividido em fumantes e não fumantes. A concentração urinária de 1-HP foi quantificada por CLAE e os resultados corrigidos pela excreção urinária de creatinina. Análises laboratoriais de rotina como exames hematológicos, bioquímicos, bem como biomarcadores inflamatórios (PCRus) foram quantificados, além de biomarcadores do estresse oxidativo (MDA, SOD, δ-ALA-D, CAT, GPx), antioxidantes não-enzimáticos exógenos (β-caroteno, licopeno, vitamina E e retinol) e carboxihemoglobina (COHb), todos em amostras sangüíneas. Os resultados demonstram aumentos significativos dos níveis de 1-HP urinário, PCRus, MDA e das atividades das enzimas CAT e GPx em pacientes pós-infarto (fumantes e não fumantes) e ainda uma inibição da δ-ALA-D somente no grupo pós-infarto não fumantes, comparados aos grupos controles. Além disso, uma diminuição na atividade enzimática de SOD e dos níveis de β-caroteno foram encontrados nos dois grupos pós-infarto comparados aos grupos controles. Os níveis de COHb não apresentaram alterações significativas nos grupos estudados, exceto para os fumantes, independente do infarto. Correlações positivas de MDA (r=0,326, p=0,01) e CAT (r=0,474, p=0,001) com os níveis urinários de 1-HP foram encontradas. Por outro lado, δ-ALA-D (r=-0,353, p=0,01) e β-caroteno (r=-0,309, p=0,05) foram negativamente correlacionados com a excreção urinária de 1-HP; as correlações foram obtidas somente para os grupos não-fumantes. Os resultados indicam que os indivíduos com IAM apresentam maiores níveis do biomarcador inflamatório PCRus, além de alterações em vários biomarcadores de dano oxidativo em conjunto com um aumento da excreção urinária de 1-HP. Desta forma, estes resultados sugerem que, para uma melhor compreensão da exposição ao benzo[a]pireno e eventos cardiovasculares, o tabagismo deve ser excluído. Ainda, os resultados demonstram que o BaP tende a aumentar a peroxidação lipídica, apesar de aumentar a atividade da catalase. Além disso, o BaP demonstrou inibir a enzima δ-ALA-D e atuar na depleção de β-caroteno. Desta forma, sugere-se que o BaP induz o estresse oxidativo e que este aumento, isoladamente e/ou em conjunto com o metabólitos ativos do benzo[a]pireno, podem contribuir para o desfecho clínico do infarto agudo do miocárdio em indivíduos não-fumantes. / Diseases caused or aggravated by environmental pollutants are becoming increasingly worrisome, especially respiratory and cardiovascular diseases. Several studies have shown an association between air pollution and the development of cardiovascular diseases, considering the existence of particulate matter in the air pollution. Particulate matter presents various substances in its chemical composition, e.g. polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), which have been strongly associated with the inflammatory process in in vitro studies. Benzo[a]pyrene (BaP) is one of the most important PAHs, whose most commonly utilized biomarker of exposure is the urinary metabolite 1-hydroxypyrene (1-HP). Regarding cardiovascular diseases, acute myocardial infarction (AMI) is clinically relevant due to its high morbidity and mortality. In addition to air pollution effects, several other factors are determinant in the development of cardiovascular diseases, for instance, smoking, sedentary lifestyle, dyslipidemia, family history, etc. In this context, the present study evaluated the possible association of environmental exposure to BaP, inflammation and oxidative stress biomarkers in AMI patients. Patients diagnosed with AMI (N=58) and controls (N=41) were enrolled in this study and divided into smokers and non smokers. The urinary excretion of 1-hydroxypyrene (1-HP) was analyzed by HPLC and results were corrected by urinary creatinine values. Hematological and biochemical parameters, inflammatory (hsCRP) and oxidative stress (MDA, SOD, δ-ALA-D, CAT, GPx) biomarkers, exogenous non-enzymatic antioxidants (β-carotene, lycopene, vitamin E e retinol) and carboxyhemoglobin (COHb) were determined in blood samples. We report increases in 1-HP urinary excretion, hsCRP and MDA levels, in CAT and GPx enzymatic activities in post-infarction patients (smokers and non smokers) and also an inhibition of δ-ALA-D activity only in the post-infarction non smoker group, compared to the control groups (p<0.05). Furthermore, decreases in SOD enzymatic activity and β-carotene levels have been found in the post-infarction groups compared to controls. COHb levels did not change significantly in both groups, except for smokers which increased independently from the infarction. MDA (r=0.326, p=0.01) and CAT (r=0.474, p=0.001) were positively correlated with the levels of urinary 1-HP. On the other hand, δ-ALA-D (r=-0.353, p=0.01) and β-carotene (r=-0.309, p=0.05) were negatively correlated with 1-HP urinary excretion; correlations were obtained only with non smoker groups. Thus these results suggest that in order to better understand the exposure to BaP and cardiovascular events, smoking must be excluded. Moreover, BaP was shown to increase lipid peroxidation despite the increase in catalase activity; BaP was also able to inhibit δ-ALA-D enzymatic activity and deplete β-carotene levels. Therefore, our findings suggest that BaP increases oxidative stress by itself or in conjunction with its active metabolites, which may contribute to the clinical outcome of the AMI in non smokers.

Introdução: A Insuficiência Hepática Aguda Grave (IHAG) é uma síndrome clínica rara, caracterizada por uma disfunção grave e súbita das células do fígado. A tioacetamida (TAA) é uma hepatotoxina, cuja administração em ratos causa a morte de células hepáticas por necrose centro lobular e promove o aumento da formação de espécies reativas de oxigênio (ERO). A glutamina é um aminoácido precursor para a síntese de glutationa. Objetivo: Avaliar o efeito antioxidante da glutamina em modelo experimental IHAG induzida por TAA em ratos. Métodos: Foram utilizados ratos machos Wistar, divididos em 4 grupos por tempo de avaliação: controle, glutamina (25 mg/kg), tioacetamida (400 mg/kg) e animais que receberam tioacetamida e glutamina. Os animais foram avaliados em 24, 36 e 48 horas. Foi coletado sangue para análises de AST, ALT, FA, BT e CRE e amostras de fígado para avaliar a lipoperoxidação (TBARS), a atividade das enzimas antioxidantes (SOD, GPx, CAT e GST), avaliação histológica e análise imuno-histoquímica de NF-kB, TNF-a e iNOS. Resultados: Os níveis de TBARS e a atividade das enzimas antioxidantes SOD e GST mostraram-se significativamente diminuídos nos animais dos grupos tratados com glutamina quando comparados com os animais dos grupos TAA. A atividade da CAT mostrou-se aumentada nos animais que receberam a glutamina em comparação aos animais dos grupos TAA. A atividade da GPx diminuiu significativamente nos grupos tratados com glutamina quando avaliada em 36 e 48 horas quando comparada com os animais dos grupos TAA, nestes tempos. O dano tecidual e a expressão de NF-kB, TNF-a e iNOS foram significativamente menores nos animais tratados com glutamina. Conclusão: A tioacetamida causa alterações em alguns parâmetros bioquímicos, histológicos e no processo inflamatório, por sua vez a glutamina exerce ação protetora ao fígado dos danos gerados pela tioacetamida no modelo de IHAG. / Introduction: Severe acute liver failure (SALF) is a rare clinical syndrome characterized by severe and sudden dysfunction of liver cells. The administration of the hepatotoxin thioacetamide (TAA) in rats causes the death of liver cells by necrosis and lobular center promotes increased formation of reactive oxygen species (ROS). Glutamine is a precursor for the synthesis of glutathione amino acid. Objective: To evaluate the antioxidant effect of glutamine in IHAG experimental model in rats induced by TAA. Methods: Male Wistar rats were divided into 4 groups by evaluation period: control, glutamine (25 mg / kg), thioacetamide (400 mg / kg) and animals that received thioacetamide and glutamine. Animals were evaluated at 24, 36 and 48 hours. Blood was collected for analysis of AST, ALT, ALP, BT and CRE and liver samples to assess lipid peroxidation (TBARS), the activity of antioxidant enzymes (SOD, GPx, CAT and GST), histological and immunohistochemical analysis NF-kB, iNOS and TNF-a. Results: The levels of TBARS and the activity of antioxidant enzymes SOD and GST were significantly decreased in animals in groups treated with glutamine compared with those for groups TAA. CAT activity was shown to be increased in animals receiving glutamine compared to groups TAA. The GPx activity decreased significantly in the groups treated with glutamine when evaluated at 36 and 48 hours compared with those for groups TAA in these times. The tissue damage and the expression of NF-kB, iNOS and TNF-a were significantly lower in animals treated with glutamine. Conclusion: The thioacetamide causes changes in some biochemical, and histological parameters in the inflammatory process, in turn glutamine exerts protective of the liver damage caused by thioacetamide in IHAG model action.

A utilização de fatores hepatotróficos (FH) tem trazido importantes avanços no tratamento de algumas doenças hepáticas. A avaliação dos efeitos dessas substâncias pode ser feita com o uso de modelos in vivo, como a regeneração hepática após a hepatectomia parcial ou in vitro, como a cultura de hepatócitos, células estreladas ou outros tipos celulares do fígado. O modelo de cultura demonstra ser útil por possibilitar a análise individualizada de determinadas substâncias ou soluções diretamente nas células-alvo, facilitando o delineamento de seu mecanismo de ação. Dessa forma, o presente trabalho estudou in vitro os efeitos da administração de fatores hepatotróficos (FH) em hepatócitos isolados de fígados de ratos, avaliando seu metabolismo e proliferação celular. Trinta ratos Wistar fêmeas foram utilizados, o fígado retirado e, por digestão enzimática in situ, suas células foram dissociadas e os hepatócitos separados em gradiente de Percoll 45%; cultivados em meio DMEM/F12, tratadas com diferentes concentrações dos FH (1X, 5X e 10X) e analisadas em intervalos de 24, 48 e 72 horas. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pelo método colorimétrico MTT, a toxicidade pelo iodeto de propídeo, o potencial elétrico da membrana mitocondrial pela Rodamina 123 e a expressão da citoqueratina 8, 18 e desmina como marcadores do citoesqueleto. O metabolismo hepático foi avaliado pela depuração do verde de indocianina (VIC), pela quantificação de colágeno tipo I e pela formação de radicais lipídicos poliinsaturados peroxidados. A técnica utilizada para a obtenção de hepatócitos mostrou-se eficaz com viabilidade superior a 90%, sem apresentar toxicidade, com manutenção do potencial mitocondrial e com marcação positiva para citoqueratinas 8, 18 e desmina. A adição dos FH aumentou a proliferação dos hepatócitos nos três períodos analisados em relação ao grupo controle. Os FH não demonstraram toxicidade em cultura primária de hepatócitos em nenhuma das concentrações avaliadas ao longo de todos os períodos experimentais. A adição dos FH na concentração de 10X evitou a formação de radicais livres, protegendo os hepatócitos da lipoperoxidação. Por outro lado, a avaliação funcional das culturas primárias pelo teste VIC mostrou-se eficaz na determinação do metabolismo dos hepatócitos, como a manutenção dos níveis das transaminases e amilase. Os hepatócitos mantidos em cultura primária após a adição dos FH em todos os períodos analisados aumentaram a produção de colágeno, e também foram capazes de modificar a distribuição da população de células nas fases quiescentes, aumentando sua capacidade de síntese. A adição dos FH nas concentrações estudadas nas culturas de hepatócitos mostrou-se eficaz na manutenção dessas células, mantendo-se funcionalmente ativos, com a expressão dos marcadores de seu metabolismo e diferenciação. / The use of hepatrotophic hic factors (HF) has provided important advances in the treatment of several hepatic disorders. The evaluation of this treatment may be carried out by in vivo models, as experiments on hepatic regeneration after partial hepatectomy; or in vitro models as culture of hepatocytes, stellate cells or any other hepatic cell. This last model allows an individual analysis of the studied substances on their target cells, providing the possibility of further investigation on the mechanisms involved. Therefore, the present study evaluated the in vitro effects of the hepatotrophic factors administration on the metabolism and proliferation of cultured hepatocytes from normal rat liver. Liver from 30 Wistar rats were used, and after in situ enzimatic dissociation, hepatocytes were collected and separated by 45% Percoll density gradient, cultivated in DMEN/F12 media supplemented with different HF concentrations (1×, 5× and 10×) and finally analyzed at 24, 48 and 72hs intervals. Cell viability and proliferation were assessed by MTT colorimetric assay, cell toxicity by propidium iodide, mitochondrial membrane electrical potential by 123 rodamine test and cytokeratin 8, 18 and desmin as cytoskeleton markers. Hepatic metabolism was evaluated by infusion of indocianine green (ICG), by type I collagen quantification and by peroxided polyunsaturated lipid radicals production. The techniques used in order to collect hepatocytes proved to be efficient, with a viability higher than 90%, no toxicity, and the maintenance of the mitochondrial membrane potential and positive labeling for cytokeratins (CK) 8, 18 and desmin. The HF addition increased the proliferation of hepatocytes in the three periods analyzed, when compared to the control group. The HF did not show any toxicity in primary hepatocytes culture regardless of the concentration evaluated along the experimental periods. The HF addition impaired the production of free radicals, protecting the hepatocytes from the lipid peroxidation. On the other hand, the functional evaluation of primary hepatocytes cultures using the ICG test proved to be efficient in the determination of the hepatocytes metabolism, as the maintenance of the transaminase and amylase levels. The hepatocytes kept in primary culture after HF addition in all the analyzed periods increased the collagen production and were also able to shift the distribution of quiescent cells population of, thus increasing their synthesis capacity. The HF addition in the studied concentrations in hepatocytes cultures proved to be efficient in the maintenance of these cells, that remain functionally active and expressing their metabolism and differentiation characteristic markers.

Este trabalho centrou-se no desenvolvimento tecnológico e na caracterização de nanopartículas poliméricas (nanocápsulas ou nanoesferas) contendo melatonina, empregando diferentes composições, métodos de preparação e concentrações de melatonina. De uma maneira geral, as diferentes suspensões nanoparticuladas foram caracterizadas segundo a determinação dos teores totais de melatonina, a determinação das taxas de associação da melatonina aos nanocarreadores, a análise morfológica, a determinação dos diâmetros médios de partículas e polidispersões, além da determinação dos valores de potenciais zeta. As suspensões de nanocápsulas ou de nanoesferas foram preparadas pelos métodos de deposição interfacial ou de nanoprecipitação, respectivamente. Foram avaliadas as influências do tipo de polímero [Eudragit® S100, Eudragit® RS100, poli(ε-caprolactona) ou poli(lactideo)], de óleo (triglicerídeos dos ácidos cáprico e caprílico, óleo mineral ou Eutanol G®) e de tensoativos (polissorbato 80, poloxamer 188, monooleato de sorbitano, monoestearato de sorbitano ou lecitina) sobre as características físico-químicas das suspensões. Os resultados demonstraram que as nanopartículas apresentaram diâmetros inferiores a 350 nm, encapsulação parcial da melatonina e morfologia esférica. As suspensões de nanoesferas apresentaram eficiências de encapsulação similares, mas diâmetros inferiores às respectivas nanocápsulas. O tipo de polímero empregado influenciou nas taxas de associação da melatonina. De acordo com a maior eficiência de encapsulação (56 %), nanocápsulas preparadas com Eudragit S100® foram selecionadas para secagem por aspersão, empregando dióxido de silício coloidal (3 % m/V). As micropartículas nanorrevestidas obtidas apresentaram eficiência de encapsulação de 93 % e foram capazes de controlar a velocidade de liberação da melatonina, comparativamente ao fármaco puro. O estudo de estabilidade das suspensões de nanocápsulas, comparativamente à nanoemulsão e à nanodispersão dos tensoativos, mostrou que a composição dos sistemas e as condições de armazenamento influenciaram a estabilidade físico-química das formulações. Um delineamento fatorial 23 foi também realizado objetivando-se a comparação das características físicoquímicas de nanocápsulas de Eudragit RS100® contendo melatonina obtidas através de deposição interfacial ou de emulsificação-difusão. As taxas de associação da melatonina não foram influenciadas pela composição das formulações e nem pelo método de preparação empregado. Por outro lado, os diâmetros, as polidispersões, os potenciais zeta, os valores de pH e a estabilidade físico-química foram influenciados pelo método de preparação e/ou pela composição dos sistemas. As propriedades antioxidantes da melatonina associada a nanopartículas foram também avaliadas. Desta forma, experimentos in vitro de lipoperoxidação de microssomas hepáticos e de lipossomas de fosfatidilcolina, induzida pelo radical ascorbil, foram realizados. Nanocápsulas ou nanoesferas preparadas com Eudragit S100® foram selecionadas para o estudo, com base na maior eficiência de associação do fármaco. Nanoemulsão também foi testada para verificar a influência da presença do polímero. A presença da melatonina foi capaz de proteger os lipídios em comparação aos controles, com influência da formulação, da dose de melatonina e do modelo de membrana empregado. Apenas os nanocarreadores poliméricos (nanocápsulas ou nanoesferas revestidas com polissorbato 80) contendo melatonina foram capazes de aumentar significativamente a atividade antioxidante deste fármaco nos dois modelos de membrana empregados. Finalmente, nanocápsulas de Eudragit S100® revestidas com polissorbato 80 foram administradas, intraperitonealmente em camundongos sadios, e os efeitos antioxidantes agudos da melatonina in vivo foram avaliados no cérebro (córtex frontal e hipocampo) e no fígado. Os resultados demonstraram que as nanocápsulas contendo melatonina foram capazes de reduzir significativamente a lipoperoxidação no córtex, no hipocampo e no fígado, ao passo que a solução do fármaco não exerceu efeito significativo. O conjunto dos resultados demonstrou a viabilidade tecnológica da preparação de sistemas poliméricos nanoparticulados e microparticulados contendo melatonina, na forma de suspensão ou de pós, com potencial aplicação tanto no aumento da atividade antioxidante quanto no controle da liberação deste fármaco. / This work has been based on the development and characterization of the melatoninloaded polymeric nanoparticles (nanocapsules or nanospheres) employing different system compositions, methods of preparation and melatonin concentrations. In general, the different nanoparticle suspensions were characterized in terms of melatonin content and its association within the particles, morphology, mean size and polydispersity of the particles, as well as the zeta potentials. The nanocapsule or nanosphere suspensions were prepared by interfacial deposition or nanoprecipitation methods, respectively. The influences of the type of the polymer [Eudragit® S100, Eudragit® RS100, poly(ε-caprolactone) or poly(lactide)], of the oil nature (caprylic/capric triglyceride, mineral oil or Eutanol G®) and of the type of surfactants (polysorbate 80, poloxamer 188, sorbitan monooleate, sorbitan monostearate or lecithin) on the physicochemical characteristics of suspensions were evaluated. The results demonstrated that the nanoparticles presented mean size lower than 350 nm, partial encapsulation of melatonin and they were spherically shape. The nanosphere suspensions presented similar encapsulation efficiencies to nanocapsules, however, the former presented a lower mean size of particles. The type of polymer used in the formulations influenced the encapsulation efficiencies. The nanocapsules prepared with Eudragit S100® were selected to be spray-dried, using colloidal silicon dioxide (3 % w/v), due to the highest encapsulation efficiency (56 %). The nanoparticle-coated microparticles presented the encapsulation efficiency of 93 % and they controlled the release rate of melatonin when compared to the pure drug. The physicochemical stability evaluation of the melatonin-loaded nanocapsule suspensions compared to the nanoemulsion or the nanodispersion of surfactants showed that the composition of the melatonin-loaded system and the storage conditions influenced the physicochemical stability of the formulations. Melatonin-loaded Eudragit RS100®-nanocapsule suspensions prepared by interfacial deposition or by emulsification-diffusion techniques were also compared in terms of physicochemical characteristics using a 23 fatorial-design. The formulation composition or the preparation methods did not influence the encapsulation efficiencies. However, the mean size, polydispersity, zeta potential, pH and physicochemical stability were influenced by the formulation composition and/or by the preparation methods. The antioxidant properties of the melatonin-loaded nanoparticle suspensions were also evaluated. Hence, phosphatidylcoline liposomes or liver microsomes were used as model of the lipid membrane and in vitro lipid peroxidation was induced by free radical ascorbyl. The melatonin-loaded Eudragit S100® nanoparticles (nanocapsules and nanospheres) were selected to this study based on the highest encapsulation efficiencies. The nanoemulsion was also evaluated for studying the influence of the presence of the polymer The results demonstrated that the lipids were protected against peroxidation due to the presence of the melatonin, and this effect depended on the type of formulation, drug concentration and on the type of the membrane model. Only the melatonin-loaded polymeric nanocarriers (polysorbate 80-coated nanocapsules or nanospheres) were able to improve the antioxidant action of melatonin in both membrane model. Finally, the in vivo acute antioxidant capacities of melatonin-loaded polysorbate 80-coated Eudragit S100® nanocapsules in the brain (frontal cortex and hippocampus) and in the liver were compared to the effect of the drug solution, after 1 h of intraperitoneal administration in mice. It was verified that the melatonin-loaded nanocapsules significantly decreased the lipid peroxidation in the cortex, in the hippocampus and in the liver. On the other hand, the melatonin solution did not significantly decrease the lipid peroxidation. Briefly, the results demonstrated the technological viability of the preparation of melatonin-loaded polymeric nanoparticulated and microparticulated systems in the form of suspension or powder. These polymeric particulated systems presented potential applications in both to improve the antioxidant activity and to control the release profile of melatonin.

Introdução: A Insuficiência Hepática Aguda Grave (IHAG) é uma síndrome clínica rara, caracterizada por uma disfunção grave e súbita das células do fígado. A tioacetamida (TAA) é uma hepatotoxina, cuja administração em ratos causa a morte de células hepáticas por necrose centro lobular e promove o aumento da formação de espécies reativas de oxigênio (ERO). A glutamina é um aminoácido precursor para a síntese de glutationa. Objetivo: Avaliar o efeito antioxidante da glutamina em modelo experimental IHAG induzida por TAA em ratos. Métodos: Foram utilizados ratos machos Wistar, divididos em 4 grupos por tempo de avaliação: controle, glutamina (25 mg/kg), tioacetamida (400 mg/kg) e animais que receberam tioacetamida e glutamina. Os animais foram avaliados em 24, 36 e 48 horas. Foi coletado sangue para análises de AST, ALT, FA, BT e CRE e amostras de fígado para avaliar a lipoperoxidação (TBARS), a atividade das enzimas antioxidantes (SOD, GPx, CAT e GST), avaliação histológica e análise imuno-histoquímica de NF-kB, TNF-a e iNOS. Resultados: Os níveis de TBARS e a atividade das enzimas antioxidantes SOD e GST mostraram-se significativamente diminuídos nos animais dos grupos tratados com glutamina quando comparados com os animais dos grupos TAA. A atividade da CAT mostrou-se aumentada nos animais que receberam a glutamina em comparação aos animais dos grupos TAA. A atividade da GPx diminuiu significativamente nos grupos tratados com glutamina quando avaliada em 36 e 48 horas quando comparada com os animais dos grupos TAA, nestes tempos. O dano tecidual e a expressão de NF-kB, TNF-a e iNOS foram significativamente menores nos animais tratados com glutamina. Conclusão: A tioacetamida causa alterações em alguns parâmetros bioquímicos, histológicos e no processo inflamatório, por sua vez a glutamina exerce ação protetora ao fígado dos danos gerados pela tioacetamida no modelo de IHAG. / Introduction: Severe acute liver failure (SALF) is a rare clinical syndrome characterized by severe and sudden dysfunction of liver cells. The administration of the hepatotoxin thioacetamide (TAA) in rats causes the death of liver cells by necrosis and lobular center promotes increased formation of reactive oxygen species (ROS). Glutamine is a precursor for the synthesis of glutathione amino acid. Objective: To evaluate the antioxidant effect of glutamine in IHAG experimental model in rats induced by TAA. Methods: Male Wistar rats were divided into 4 groups by evaluation period: control, glutamine (25 mg / kg), thioacetamide (400 mg / kg) and animals that received thioacetamide and glutamine. Animals were evaluated at 24, 36 and 48 hours. Blood was collected for analysis of AST, ALT, ALP, BT and CRE and liver samples to assess lipid peroxidation (TBARS), the activity of antioxidant enzymes (SOD, GPx, CAT and GST), histological and immunohistochemical analysis NF-kB, iNOS and TNF-a. Results: The levels of TBARS and the activity of antioxidant enzymes SOD and GST were significantly decreased in animals in groups treated with glutamine compared with those for groups TAA. CAT activity was shown to be increased in animals receiving glutamine compared to groups TAA. The GPx activity decreased significantly in the groups treated with glutamine when evaluated at 36 and 48 hours compared with those for groups TAA in these times. The tissue damage and the expression of NF-kB, iNOS and TNF-a were significantly lower in animals treated with glutamine. Conclusion: The thioacetamide causes changes in some biochemical, and histological parameters in the inflammatory process, in turn glutamine exerts protective of the liver damage caused by thioacetamide in IHAG model action.