Introduction Le cancer bronchique est un problème de santé publique en étant la première cause de décès par cancer dans le monde. Il reste de mauvais pronostic avec une résistance au Cisplatine qui est inéluctable dans l’histoire naturelle de la maladie. Nous nous sommes intéressés à l’association du CDDP aux inhibiteurs de la Poly(ADP-ribose) polymérase. Les inhibiteurs pharmacologiques de PARP sont source d’optimisme en oncologie clinique en monothérapie pour des tumeurs déficientes pour une voie de réparation de l’ADN et en association aux cytotoxiques classiques.Matériel et méthodes Nous avons généré 9 clones résistants au CDDP après culture de la lignée A549 dans des faibles doses de CDDP. Deux inhibiteurs pharmacologiques de PARP, CEP8983 (CEP) et PJ34 (PJ), ainsi que des siRNA spécifiques de PARP1 sont utilisés pour l’inhibition de PARP. L’apoptose est mesurée en cytométrie de flux par l’intermédiaire du potentiel membranaire de la mitochondrie DiOC6(3) et la perméabilisation de la membrane plasmique est évaluée par l’iodide de propidium. Le test de clonogénicité permet d’évaluer la capacité des cellules à échapper à la mort et à former une colonie. L’activité métabolique des cellules est mesurée par la mesure de clivage du sel de tetrazolium WST-1. L’immunofluorescence sur cellules fixées a permis d’étudier les dommages de l’ADN (γH2AX), la voie intrinsèque de l’apoptose (l’activation de la caspase 3 et la libération du cytochrome c) et la recombinaison homologue (BRCA1, RAD51). En Western Blot nous avons mesuré l’expression et l’activité de PARP (PAR) ainsi que l’expression d’acteurs de la réparation par excision de base (BER) (XRCC1 and polymérase β). Nous avons développé une méthode de détection de PAR en immunohistochimie sur des tissus inclus en paraffine. Résultats Nous avons trouvé un effet synergique pour l’association du CDDP aux inhibiteurs de PARP in vitro. De façon inattendue nous avons observé que les clones résistants au CDDP développent une addiction à PARP et sont spécifiquement tués par l’inhibition de PARP contrairement à la lignée parentale. Ces clones exhibent une hyperexpression et une hyperactivité de PARP. La réponse aux inhibiteurs de PARP corrèle plus précisément avec l’activation plutôt qu’avec l’expression de PARP, pointant que PAR est un biomarqueur plus précis que PARP. Nous avons observé que l’hyperactivation de PARP accompagne une résistance induite au CDDP et prédispose à une sensibilité aux inhibiteurs de PARP dans d’autres lignées de cancer bronchique (H460 et H1650), de mésothéliome (P31), de cancer de l’ovaire (TOV112D) et de col (HeLa). Dans des expériences in vivo nous avons noté que dans les xénogreffes obtenues à partir de clones résistants au CDDP, l’expression de PAR est stablement retrouvée en immunohistochimie. Ces tumeurs répondaient à l’inhibition de PARP par le PJ en diminuant l’expression de PAR. Les clones résistants au CDDP sensibilisés aux I PARP ont une recombinaison homologue conservée, cependant ont un déficit dans les étapes terminales du BER.Conclusion Nous avons identifié un effet synergique pour l’association des inhibiteurs de PARP au CDDP de des lignées de cancer bronchique. Nous avons observé une dépendance à PARP dans des lignées de cancer bronchique résistantes au CDDP et déficientes pour l’élongation du BER. Nous postulant que PAR est un biomarqueur spécifique de la réponse aux inhibiteurs de PARP. / Introduction Driven by the facts that non small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer-related morbidity and mortality worldwide and that NSCLC patients often develop resistance against Cisplatin (CDDP)-based therapies, we addressed the question of the combination therapy of CDDP with poly(ADP-ribose) polymerases (PARP) inhibitors. Inhibitors of PARP have raised great expectations for the treatment of a variety of cancers, either as monotherapeutic agent against DNA repair-deficient tumours or combined to DNA-damaging compounds.Material and methods We generated nine CDDP-resistant clones by prolonged exposure to low dose CDDP of the A549 NSCLC parental cell line. Two distinct PARP inhibitors, CEP8983 (CEP) and PJ34 (PJ) as well as PARP1 knockdown with small interfering RNAs (siRNAs) were used for PARP inhibition. Apoptosis was measured by the simultaneous assessment for the loss of the mitochondrial transmembrane potential (m) and the breakdown of the plasma membrane using the m-sensitive fluorochrome DiOC6(3) and the vital dye propidium iodide, respectively. Moreover clonogenic survival was assessed. In vitro assessments of the enzymatic activity of cells were based on the reduction of the colorless tetrazolium salt. Immunofluorescence microscopy determinations were performed with antibodies specific for DNA damage (γH2AX), intrinsic apoptosis (cleaved Caspase-3 and cytochrome c), and homologous recombination (RAD51 and BRCA1). Immunoblotting was assed for PARP1 expression and activity (PAR) and base excision repair (BER) effectors (XRCC1 and polymerase β). We developed an immunohistochemical staining method that specifically detects PAR on paraffin-embedded cell pellets and tissue sections.Results We found that PARP inhibitors and PARP1 siRNAs synergized with CDDP in the killing of NSCLC cells in vitro. Unexpectedly, CDDP-resistant NSCLC cell clones developed addiction to PARP hyperactivation, thereby becoming susceptible to apoptosis induction by PARP inhibition. We showed that these cisplatin-resistant clones, exhibited high PARP protein levels and increased PARP activity, leading to an increased poly-ADP ribosylation of cellular proteins, as compared to their parental, cisplatin-sensitive counterparts. These cisplatin-resistant cells become susceptible to cell death as induced by PARP inhibition, correlating with the hyperactivity of PARP (elevated PAR levels) more accuratly than with the overexpression of PARP. Suggesting that PAR levels may constitute a more accurate biomarker than PARP to predict the sensitivity of cells to PARP inhibition. We expanded the observation that cisplatin resistance causes PARP upregulation and hyperactivation and subsequent sensitization to PARP inhibition to additional five human cancer cell lines including two NSCLC (H1650 and H460), one mesothelioma (P31), one ovarian (TOV112D) and one cervical cancer (HeLa) cell line. To get further insight into this issue, we generated in vivo experiments. Tumors derived from CDDP-resistant cells were characterized by elevated levels of PAR suggesting that PAR levels are preserved during tumor formation. Those PAR-overexpressing tumors responded to the administration of PJ in vivo with a consistent reduction in PAR immunoreactivity. CDDP resistant clones that are specifically killed by PARP inhibitors assessed efficient homologous recombination repair however deficient BER elongation.Conclusion We showed a beneficial effect for the association therapy of PARP inhibitors with CDDP in several NSCLC cell lines. We have identified an addiction to PARP in CDDP resistant cell lines with deficient BER elongation. We postulate that PAR is a specific predictive biomarker for the response to PARP inhibitors.

Contexte. Le cancer bronchopulmonaire (CBP) demeure la première cause de mortalité par cancer dans le monde. Malgré l’espoir suscité par le développement des thérapies ciblées, son pronostic demeure sombre, particulièrement dans les cas de CBP à petites cellules (CBP-PC) et de CBP non à petites cellules (CBP-NPC) présentant une activation de l’oncogène KRAS. Matériel et Méthodes. Nous avons mené 3 études successives, visant à (i) radiosensibiliser des modèles de CBP-PC par l’ajout d’un inhibiteur de BCL2, (ii) cibler des modèles de CBP-NPC mutés KRAS par l’association d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de RAF, et (iii) créer un modèle préclinique orthotopique murin de CBP reproduisant la progression tumorale observée en clinique. Résultats. Dans la première étude, l’inhibiteur de BCL2 oblimersen a présenté un effet radiosensibilisant sur des modèles de CBP-PC, in vitro et in vivo. Dans la seconde étude, l’association de l’inhibiteur de mTOR everolimus et de l’inhibiteur de RAF/VEGFR RAF265 a présenté un effet synergique sur des lignées cellulaires de cancers présentant la double mutation de KRAS et de PIK3CA, in vitro et in vivo. Dans la troisième étude, l’injection orthotopique d’une lignée bioluminescente de CBP-NPC chez des souris nude a permis d’établir des tumeurs intra pulmonaires évoluant vers une extension métastatique ganglionnaire et hématogène, et de détecter la présence de cellules tumorales circulantes. Conclusion. L’association d’un inhibiteur de BCL2 à la radiothérapie est une stratégie intéressante dans le CBP-PC, l’association d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de RAF/VEGFR est une stratégie intéressante dans le CBP-NPC présentant une double mutation KRAS-PIK3CA, mais ces données doivent être confirmées sur des modèles orthotopiques afin de gagner en pertinence avant d’envisager un transfert en clinique. / Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer-related mortality worldwide. Activation of phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-AKT and Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue (KRAS) can induce cellular immortalization, proliferation, and resistance to anticancer therapeutics such as epidermal growth factor receptor inhibitors or chemotherapy. This study assessed the conséquences of inhibiting these two pathways in tumor cells with activation of KRAS, PI3K-AKT, or both. We investigated whether the combination of a novel RAF/vascular endothelial growth factor receptor inhibitor, RAF265, with a mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor, RAD001 (everolimus), could lead to enhanced antitumoral effects in vitro and in vivo. To address this question, we used cell lines with different status regarding KRAS, PIK3CA, and BRAF mutations, using immunoblotting to evaluate the inhibitors, and MTT and clonogenic assays for effects on cell viability and proliferation. Subcutaneous xenografts were used to assess the activity of the combination in vivo. RAD001 inhibited mTOR downstream signaling in all cell lines, whereas RAF265 inhibited RAF downstream signaling only in BRAF mutant cells. In vitro, addition of RAF265 to RAD001 led to decreased AKT, S6, and Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 phosphorylation in HCT116 cells. In vitro and in vivo, RAD001 addition enhanced the antitumoral effect of RAF265 in HCT116 and H460 cells (both KRAS mut, PIK3CA mut); in contrast, the combination of RAF265 and RAD001 yielded no additional activity in A549 and MDAMB231 cells. The combination of RAF and mTOR inhibitors is effective for enhancing antitumoral effects in cells with deregulation of both RAS-RAF and PI3K, possibly through the cross-inhibition of 4E binding protein 1 and S6 protein. We then focus on animal models. Preclinical models of NSCLC require better clinical relevance to study disease mechanisms and innovative therapeutics. We sought to compare and refine bioluminescent orthotopic mouse models of human localized NSCLC. Athymic nude mice underwent subcutaneous injection (group 1-SC, n = 15, control), percutaneous orthotopic injection (group 2-POI, n = 30), surgical orthotopic implantation of subcutaneously grown tumours (group 3-SOI, n = 25), or transpleural orthotopic injection (group 4-TOI, n = 30) of A549-luciferase cells. Bioluminescent in vivo imaging was then performed weekly. Circulating tumour cells (CTCs) were searched using Cellsearch® system in SC and TOI models Group 2-POI was associated with unexpected direct pleural spreading of the cellular solution in 53% of the cases, forbidding further evaluation of any localized lung tumour. Group 3-SOI was characterized by high perioperative mortality, initially localized lung tumours, and local evolution. Group 4-TOI was associated with low perioperative mortality, initially localized lung tumours, loco regional extension, and distant metastasis. CTCs were detected in 83% of nude mice bearing subcutaneous or orthotopic NSCLC tumours. Transpleural orthotopic injection of A549-luc cells in nude mouse lung induces localized tumour, followed by lymphatic extension and specific mortality, and allowed the first time identification of CTCs in a NSCLC mice model.

Les phénomènes cicatriciels et de carcinogenèse partagent des points communs et peuvent être définis comme des processus complexes et adaptatif régulés par les interactions entre l'hôte et le microenvironnement tissulaire. Après la chirurgie, la radiothérapie est la seconde modalité la plus efficace dans le traitement du cancer et une approche thérapeutique multimodale impliquant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie est aujourd’hui classiquement utilisée. Des résultats récents suggèrent que, en plus des effets létaux sur les cellules tumorales, la radiothérapie modifie le microenvironnement tissulaire. Ces modifications affectent le phénotype cellulaire, le métabolisme des tissus, et les événements de signalisation entre les cellules.Les interactions complexes entre les cellules stromales et les cellules cancéreuses suscitent beaucoup d’intérêt et dans la première partie de ma thèse, j’ai exploré les interactions entre stroma et cellules de carcinome en réponse à la radiothérapie par modulation génétique du stroma après irradiation. J’ai constaté que les fibroblastes, indépendamment de leur statut RhoB, ne modulaient pas la radiosensibilité intrinsèque des TC- 1, mais produisaient des facteurs diffusibles capables de modifier le devenir des cellules tumorales. Ensuite, j’ai constaté que fibroblastes sauvages et RhoB déficients stimulaient la migration des TC-1 par des mécanismes distincts, impliquant respectivement TGF- β1 et MMP. J’ai également constaté que la co-irradiation, des fibroblastes et des TC- 1, abrogait le phénotype pro-migratoire des TC-1 par répression de la sécrétion du TGF- β et des MMP. Alors que le protocole de co-irradiation utilisé mime la situation clinique, mes résultats sont en désaccord avec les publications récentes et suggèrent que le stroma irradié ne renforce pas la migration des cellules tumorales mais au contraire pourrait être manipulé pour promouvoir une réponse immunitaire anti-tumorale.Deuxièmement, mes expériences in vivo, semblent confirmer les données obtenues in vitro et montrent que l’irradiation préalable du lit tumoral ne stimule ni croissance de la tumeur et ni sa dissemination. Nos résultats semblent montrer que l’irradiation du stroma ne favorise pas la migration des cellules de carcinome et ceci indépendamment de leur génotype. La Troisième Partie De Mon Projet, a été consacrée à l’étude des cellules tumorale circulantes (CTC) après la radiothérapie. En accord avec les résultats rapportés après la chirurgie, le nombre de CTC augmente dans la circulation sanguine après radiothérapie probablement à cause des lésions vasculaires radio-induites ou/et par induction d’EMT dans les cellules tumorales. Néanmoins ces CTC semblent être piégées dans la cavité cardiaque. La signification de la présence de ces CTC pour le développement métastatique n’est pas élucidée mais on peut suspecter un effet promoteur de métastase. Ainsi le microenvironnement pourrait avoir des effets antagonistes promoteurs ou inhibiteurs de malignité. / Wound healing and carcinogenesis are defined as complex, adaptive processes which are controlled by intricate communications between the host and the tissue microenvironment. A number of phenotypic similarities are shared by wounds and cancers in cellular signaling and gene expression. Radiotherapy is the second most effective modality of cancer treatment after surgery and can be used, either alone or in combination with chemotherapy. Recent findings suggest that radiotherapy apart from tumor cell death also rapidly and persistently modifies the tissue microenvironment. These modifications affect cell phenotype, tissue metabolism, bidirectional exchanges and signaling events between cells. The complex interactions between stromal cells and cancer cells are of immense interest and in The First Part of My Thesis, I tried to explore the crosstalk between stromal and carcinoma cells in response to radiotherapy by genetic modulation of the stroma and irradiation. We found that fibroblasts, irrespective of their RhoB status, do not modulate intrinsic radiosensitivity of TC-1 but produce diffusible factors able to modify tumor cell fate. Then we found that Wt and RhoB deficient fibroblasts stimulated TC-1 migration through distinct mechanisms respectively, TGF-β1 and MMP-mediated. We also found that co-irradiation of fibroblasts and TC-1 abrogated the pro-migratory phenotype by repression of TGF-β and MMP secretion. This result is highly relevant to the clinical situation and suggests that conversely to, the current view; irradiated stroma would not enhance carcinoma migration and could be manipulated to promote anti-tumor immune response. Secondly, our in vivo experiments, tends to confirm the in vitro data showing that irradiated tumor bed does not stimulate tumor growth and escape. Our results also challenges the view that irradiated stroma would promote migration of carcinoma cells as we show that independently from their genotype co-irradiation of fibroblasts and carcinoma cells repressed carcinoma cell migration and confirmations studies are currently performed in vivo. The Third Part of My Project, was dedicated to investigate the effect on CTC release after radiotherapy. Consistently with the results reported after surgery , the number of CTC increases in the blood stream after radiotherapy probably due to radiation-induced vascular injury induced or/and by EMT induction in tumor cells but these cells seemed to be entrapped into the cardiac cavity. The significance of these CTC to metastatic development is still under investigation but there is evidence for a metastasis-promoting effect of RT from animal studies.Thus the microenvironment can exert antagonist stimulatory or inhibitory effects on malignant cells.

L’efficacité de la chimiothérapie contre la croissance tumourale repose sur l'induction d'une mort des cellules tumourales dite immunogène. Les cellules tumourales mourantes agissent alors comme un vaccin thérapeutique en stimulant une réponse immunitaire anti-tumourale capable de contrôler, voire d'éliminer, les cellules cancéreuses résiduel. Les trois marqueurs principales de la mort cellulaire immunogène (MCI), sont (i) l'exposition pré-apoptotique de la calréticuline (CRT) à la surface des cellules, (ii) la sécrétion de l'ATP pendant l'apoptose qui dépend du processus d'autophagie, et (iii) le relargage post-apoptotique de la protéine non-histone de fixation à la chromatine HMGB1 (High Mobility Group B1). CRT, ATP et HMGB1 se lient respectivement à CD91, au récepteur purinergique P2RX7 (Purinergic Receptor P2X, ligand-gated ion channel 7) et au récepteur TLR4 (Toll-like Receptor 4) situés à la surface des cellules dendritiques. En retour, ces interactions initient respectivement la phagocytose des cellules mourantes, la production de l'interleukine-1β et la cross-présentation des antigènes tumouraux aux lymphocytes T.Notre laboratoire a précédemment démontré que la chimiothérapie adjuvante présente une efficacité réduite chez des patients atteints de cancers colorectaux et du sein portant un polymorphisme d'un seul nucléotide ou SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) compromettent la fonction des gènes P2RX7 et TLR4, notamment rs3751143 (496Glu>Ala) pour le gène P2RX7 et rs4986790 (299Asp>Gly) pour le gène TLR4.Compte tenu des ces résultats que mettent en évidence la relation étroite entre l’efficacité de la chimiothérapie anticancéreuse et un système immunitaire opérationnel, nous avons décidé d'étudier l'effet de ces SNPs, soit sur la survie globale soit sur la survie sans événement, chez des patients atteints de cancer pulmonaire non à petites cellules ou NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) et de cancers de la tête et du cou ou HNSCC (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma). De plus, nous avons porté notre attention sur un autre SNP affectant le gène ATG16L1 (Autophagy-related 16-Like 1), notamment rs2241880 (300Thr>Ala) qui compromet l’activité d’un gène fondamental dans le processus d’autophagie.Dans les cancers NSCLC, les allèles mutants "perte de fonction" des gènes ATG16L1, P2RX7 et TLR4 n'affectent pas la survie globale, indépendamment du type de chimiothérapie administrée. Au contraire, les patientes atteintes de HNSCC, portant au moins un allèle "perte de fonction" d’ATG16L1 et TLR4, présentent un taux de survie sans récidive inferieure par rapport aux patients qui présentent un genotype sauvage. Ce travail décrit pour la première fois un biomarqueur prognostique pour ce type de cancer.De plus, nous avons pu définir, par génotypage à haut débit, une signature de SNPs prédictive de la réponse à la chimiothérapie neoadjuvantes à base d'anthracyclines et des taxanes chez les patients atteints de cancer du sein. En particulier, la combinaison des deux paramètres clinicopathologiques classiques (âge lors du diagnostic et récepteur aux œstrogènes) avec les génotypes rs1076669 du gène ECE1 (Endothelin Converting Enzyme 1; 341Thr>Ile) et rs2277413 du gène PZP (Pregnancy-Zone Protein; 813Val>Ala) a permis de définir trois grandes catégories des patients et leur probabilité respective d'atteindre la réponse complète pathologique après traitement.L'identification de nouveaux biomarqueurs associés à une absence/diminution de réponse à la chimiothérapie apparaît critique pour choisir des alternatives thérapeutiques appropriées et éviter les effets secondaires indésirables chez les non-répondeurs. / Successful chemotherapeutics can induce a type of tumour cell death that is immunogenic, implying that patient’s dying cancer cells function as a therapeutic vaccine and elicit an anti-tumour immune response that controls the residual disease. The three main hallmarks of immunogenic cell death (ICD) are the pre-apoptotic exposure of calreticulin (CRT) on the cell surface, the autophagy-dependent secretion of ATP during the blebbing phase of apoptosis and the post-apoptotic release of the chromatin-binding non-histone protein high mobility group B1 (HMGB1). CRT, ATP and HMGB1 interact with CD91, purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel, 7 (P2RX7) and Toll-like receptor 4 (TLR4), respectively, on the surface of dendritic cells (DCs), thus promoting the engulfment of dying cells, the production of IL-1β and the cross-presentation of tumour-associated antigens to T cells, respectively.Our laboratory has demonstrated that adjuvant chemotherapy exhibits a reduced efficacy in breast and colorectal cancer patients bearing single-nucleotide polymorphisms (SNPs) that compromise the function of P2RX7 or TLR4, such as rs3751143 in P2RX7 (Glu496Ala) and rs4986790 in TLR4 (Asp299Gly).Driven by these results, underpinning the intimate relationship between the success of anti-cancer chemotherapy and an operational immune system, we decided to investigate the effect of these SNPs on disease outcome among non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients. Additionally, we focused our attention on a SNP in autophagy related 16-like 1 (ATG16L1), namely rs2241880 (Thr300Ala), which compromises the activity of one pivotal autophagic gene. In NSCLC patients, loss-of-function ATG16L1, P2RX7 and TLR4 alleles do not affect overall survival, irrespective of the administration and type of chemotherapy. Conversely, HNSCC patients bearing at least one loss-of-function ATG16L1 or TLR4 allele exhibit a reduced disease-free survival when compared to their wild-type counterparts. This is the first report highlighting a putative prognostic biomarker for this malignancy. Furthermore, taking advantage of a high throughput genotyping study, we delineated a SNP-based signature that predicts the response of breast cancer patients to anthracycline- and taxane-based neoadjuvant chemotherapy. Particularly, the combination of two classical clinicophatological parameters (age at diagnosis and estrogen receptor) and genotype at the ECE1 (rs1076669 Thr341Ile) and PZP (rs2277413 Val813Ala) loci allowed us to define three broad categories with a correspondent probability of achieving pathological complete response. The identification of new biomarkers associated with a reduced/absent response to chemotherapy appears critical for selecting appropriate therapeutic alternatives, and avoiding undesired side effects among non-responders.

Introduction Le cancer bronchique est un problème de santé publique en étant la première cause de décès par cancer dans le monde. Il reste de mauvais pronostic avec une résistance au Cisplatine qui est inéluctable dans l'histoire naturelle de la maladie. Nous nous sommes intéressés à l'association du CDDP aux inhibiteurs de la Poly(ADP-ribose) polymérase. Les inhibiteurs pharmacologiques de PARP sont source d'optimisme en oncologie clinique en monothérapie pour des tumeurs déficientes pour une voie de réparation de l'ADN et en association aux cytotoxiques classiques.Matériel et méthodes Nous avons généré 9 clones résistants au CDDP après culture de la lignée A549 dans des faibles doses de CDDP. Deux inhibiteurs pharmacologiques de PARP, CEP8983 (CEP) et PJ34 (PJ), ainsi que des siRNA spécifiques de PARP1 sont utilisés pour l'inhibition de PARP. L'apoptose est mesurée en cytométrie de flux par l'intermédiaire du potentiel membranaire de la mitochondrie DiOC6(3) et la perméabilisation de la membrane plasmique est évaluée par l'iodide de propidium. Le test de clonogénicité permet d'évaluer la capacité des cellules à échapper à la mort et à former une colonie. L'activité métabolique des cellules est mesurée par la mesure de clivage du sel de tetrazolium WST-1. L'immunofluorescence sur cellules fixées a permis d'étudier les dommages de l'ADN (γH2AX), la voie intrinsèque de l'apoptose (l'activation de la caspase 3 et la libération du cytochrome c) et la recombinaison homologue (BRCA1, RAD51). En Western Blot nous avons mesuré l'expression et l'activité de PARP (PAR) ainsi que l'expression d'acteurs de la réparation par excision de base (BER) (XRCC1 and polymérase β). Nous avons développé une méthode de détection de PAR en immunohistochimie sur des tissus inclus en paraffine. Résultats Nous avons trouvé un effet synergique pour l'association du CDDP aux inhibiteurs de PARP in vitro. De façon inattendue nous avons observé que les clones résistants au CDDP développent une addiction à PARP et sont spécifiquement tués par l'inhibition de PARP contrairement à la lignée parentale. Ces clones exhibent une hyperexpression et une hyperactivité de PARP. La réponse aux inhibiteurs de PARP corrèle plus précisément avec l'activation plutôt qu'avec l'expression de PARP, pointant que PAR est un biomarqueur plus précis que PARP. Nous avons observé que l'hyperactivation de PARP accompagne une résistance induite au CDDP et prédispose à une sensibilité aux inhibiteurs de PARP dans d'autres lignées de cancer bronchique (H460 et H1650), de mésothéliome (P31), de cancer de l'ovaire (TOV112D) et de col (HeLa). Dans des expériences in vivo nous avons noté que dans les xénogreffes obtenues à partir de clones résistants au CDDP, l'expression de PAR est stablement retrouvée en immunohistochimie. Ces tumeurs répondaient à l'inhibition de PARP par le PJ en diminuant l'expression de PAR. Les clones résistants au CDDP sensibilisés aux I PARP ont une recombinaison homologue conservée, cependant ont un déficit dans les étapes terminales du BER.Conclusion Nous avons identifié un effet synergique pour l'association des inhibiteurs de PARP au CDDP de des lignées de cancer bronchique. Nous avons observé une dépendance à PARP dans des lignées de cancer bronchique résistantes au CDDP et déficientes pour l'élongation du BER. Nous postulant que PAR est un biomarqueur spécifique de la réponse aux inhibiteurs de PARP.

Les nouveaux services de télécommunication accessibles en mobilité entraînent une demande croissante de débit et amènent aux limites de capacités des réseaux actuels. Pour répondre à cette demande, les opérateurs cellulaires déploient de nouvelles technologies et densifient leurs réseaux en ajoutant des petites cellules, où les stations de base sont plus proches des utilisateurs. Compte tenu de la visibilité directe et de la faible hauteur des antennes, le canal de propagation des petites cellules est différent de celui des macro-cellules et les modèles stochastiques de canal existants ne sont plus adaptés. C’est dans ce contexte que se situe cette thèse, qui explore les problématiques de dynamique dans le canal de propagation et dans l’utilisation des ressources radio. Nous proposons dans une première partie de caractériser les dynamiques dans le canal de propagation de petite cellule en milieu extérieur. Cette caractérisation se base sur des prédictions déterministes, où une partie de l’environnement est généré de manière aléatoire afin de procéder à des études statistiques. Pour cela, nous mettons en place une plateforme de simulation, capable de générer des objets statiques, de les déplacer et de les prendre en compte dans des outils de prédiction de propagation adaptés aux petites cellules. Une phase de mesures de l’impact du trafic de véhicules sur la puissance du signal permet de valider les outils de propagation développés dans la plateforme. L’objectif de la deuxième partie de la thèse est d’évaluer l’impact de ces nouvelles topologies sur les performances des réseaux hétérogènes. Nous présentons un modèle hybride de propagation qui prend en compte les variations de signal dues au trafic de véhicules en combinant les approches déterministes et statistiques, pour avoir les avantages de résultats précis et d’un temps de calcul rapide. Ce modèle hybride est utilisé par la suite dans un processus de simulation de réseau cellulaire 3G LTE au niveau système, où nous évaluons l’impact du trafic de véhicules sur le débit maximal, la consommation d’énergie et le respect de la qualité de service. / New services available with modern mobile telecommunication networks lead to a growing demand for better bit rates up to reach the capacity limits of current networks. To face this demand, cellular network operators deploy new technologies and densify their radio access by adding small cells, where the distance between the mobile users and the base stations is decreased. Given the Line of Sight conditions and the low height of base station antennas, the small-cell propagation channel is different from the classical macro-cellular channel and existing stochastic channel models are not suited anymore. In this context, this Ph.D. work proposes to explore challenges on the dynamics of the channel and of radio resource usage. In a first part, we propose to characterize the dynamics of the propagation channel in small-cell outdoor environments. This characterization is based on deterministic predictions, where part of the environment is randomly generated in order to proceed to statistical analysis. We describe a simulation framework able to generate static objects, to move them and to take them into account in propagation prediction tools targeted for small-cell environments. Measurements of the impact of vehicular traffic on received power enable the validation of propagation tools developed in the framework. In the second part of this work, we propose to evaluate the impact of those new topologies on the performance of heterogeneous networks. We present a hybrid propagation model taking into account signal variations due to vehicular traffic by combining deterministic and statistic approaches in order to benefit from both advantages: accurate results and quick simulations. This hybrid model is finally used in a cellular 3G LTE network simulation process where we evaluate the impact of vehicular traffic on maximal throughputs, energy consumption and quality of service.

Les tumeurs sont généralement constituées de différentes sous-populations de cellules cancéreuses génétiquement hétérogènes, responsables en grande partie de la capacité de la tumeur à évoluer rapidement et à s’adapter aux conditions environnementales. Cette diversité génétique a des conséquences majeures pour le patient, notamment au cours de la progression tumorale et pour l’acquisition d’une résistance aux traitements.Nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur la technologie CRISPR/Cas9 qui consiste à introduire, en plus d’une altération de séquence voulue d’un gène d’intérêt, une série de mutations silencieuses, constituant une sorte d’étiquette génétique qui peut être détectée par PCR quantitative ou séquençage de nouvelle génération. En parallèle, un code-barres constitué exclusivement de mutations silencieuses est utilisé comme contrôle interne pour les effets non spécifiques potentiels qui peuvent être engendrés suite au clivage hors-cible par le système CRISPR/Cas9. Cette approche, que nous avons appelée CRISPR-barcoding, permet de générer et de suivre l’émergence d’un petit groupe de cellules cancéreuses contenant une mutation voulue au sein d’une population de cellules non modifiées, représentant ainsi un nouveau modèle expérimental d’hétérogénéité génétique intratumorale. Grâce à une série de preuves de concept, nous avons montré que CRISPR-barcoding est une nouvelle approche qui permet d’étudier de façon simple et rapide les conséquences fonctionnelles de différents types de modifications génétiques apportées directement au niveau de la séquence génomique.Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé cette nouvelle approche pour l'étude de la résistance du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) à la thérapie ciblée. Les patients de CBNPC dont la tumeur présente une mutation activatrice de l'epidermal growth factor receptor (EGFR) sont généralement traités avec des inhibiteurs de ce récepteur. Malheureusement, malgré une réponse initiale, presque invariablement ces patients rechutent, suite au développement d’une résistance causée, dans la majorité des cas, par l’apparition de mutations secondaires ou tertiaire de l'EGFR. Grâce à un criblage réalisé en utilisant un modèle de CBNPC basé sur la stratégie CRISPR-barcoding, nous avons pu identifier l’inhibiteur multikinase sorafenib pour sa capacité à prévenir la résistance de ces cellules aux inhibiteurs d’EGFR. Ce composé présente un mécanisme d’action original, impliquant une diminution précoce du niveau de phosphorylation de STAT3, suivie par une baisse considérable de l’expression de l’EGFR, aboutissant à une inhibition des voies intracellulaires en aval de ce récepteur, telles que RAS-MAPK et PI3K-AKT-mTOR. Ces données ont été confirmées in vivo en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules de CBNPC modifiées par CRISPR-barcoding.En conclusion, l’ensemble de nos résultats montre que le sorafenib peut prévenir l’émergence de cellules de CBNPC résistantes aux inhibiteurs d’EGFR, indiquant que ce composé pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement de ce type de tumeur. / Individual tumors are composed of multiple and genetically distinct subpopulations of transformed cells that can adapt and evolve in a different way based on environmental conditions. This genetic diversity has major consequences for the patient, particularly during tumor progression and for cancer treatment.We devised a new strategy based on CRISPR/Cas9 technology in which a potentially functional modification in the sequence of a gene of interest is coupled with a series of silent point mutations, functioning as a genetic label for cell tracing. In parallel, a second barcode consisting of distinct silent mutations is inserted in the same cell population and used as a control for CRISPR/Cas9 off-target cleavage. This approach, that we named CRISPR barcoding, enables detection of cells containing the mutation of interest within a mass population of unmodified cells using real-time quantitative PCR or deep sequencing. Through a series of proof-of-concept studies, we demonstrated that CRISPR-barcoding is a fast and highly flexible strategy to investigate the functional consequences of a specific genetic modification in a broad range of assays.In the second part of my thesis, we used CRISPR-barcoding to investigate non-small cell lung cancer (NSCLC) resistance to targeted therapy. Some NSCLCs harbor activating mutations of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and are addicted to this signaling pathway. These tumors initially show a good response to EGFR inhibitors (EGFRi), but they almost invariably relapse, due to the acquisition of a resistance, as a result of additional genetic alterations, including secondary and tertiary EGFR mutations. Using a CRISPR-barcoding model, we identified the multikinase inhibitor sorafenib for its ability to prevent EGFRi resistance in NSCLC cells. This compound acts through an original mechanism that involves early reduction of STAT3 phosphorylation and late down-regulation of EGFR, resulting in the inhibition of different downstream pathways activated by this receptor, including, RAS-MAPK and PI3K-AKT-mTOR. These results were confirmed in vivo, using a CRISPR-barcoding xenograft model for NSCLC.Altogether, our data indicate that sorafenib can prevent NSCLC resistance to EGFRi through a novel mechanism, thus providing a new potential therapeutic strategy for the treatment of this type of cancer.

Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent une source de matériel tumoral accessible de manière non invasive, susceptible de fournir des informations cliniques et fondamentales. Ces cellules issues de tumeurs primitives ou métastatiques représentent une population hétérogène d’éléments très rares circulant dans le sang. La personnalisation des traitements en oncologie repose sur la caractérisation moléculaire de biopsies tumorales mais celles-ci peuvent être difficiles à réaliser ou peu informatives. De ce fait, la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des CTC présente un double intérêt, clinique pour identifier des biomarqueurs de sensibilité à des traitements, et fondamental pour étudier les mécanismes qui sous-tendent leur potentiel à initier des tumeurs.Les objectifs de ma thèse ont été d’une part de caractériser par séquençage de l’exome (WES) les CTC à l’échelle de cellule unique de patients atteints de cancers de la prostate (PCa) métastatiques et d’autre part d’établir puis caractériser des modèles de xénogreffes dérivés de CTC (CDX) chez des patients atteints de cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) ou de PCa.Pour répondre au premier objectif, nous avons développé une méthode expérimentale globale incluant trois approches technologiques permettant d’enrichir et d’isoler des CTC individuelles de différents phénotypes (épithélial, épithélio-mésenchymateux et mésenchymateux), d’amplifier la totalité du génome (WGA) et de le séquencer. Le WES a été réalisé pour 34 échantillons de CTC sélectionnés sur des critères de qualité du WGA, ainsi que pour les biopsies de métastases correspondantes chez sept patients. Deux patients présentant une hétérogénéité phénotypique de leurs CTC, ont été analysés en profondeur. Nous avons mis en évidence des mutations partagées entre les CTC et les biopsies tumorales correspondantes ainsi que des mutations uniquement retrouvées dans les CTC. Ces mutations spécifiques aux CTC sont présentes dans tous les phénotypes et affectent particulièrement les gènes impliqués dans le remodelage du cytosquelette, la réparation de l’ADN ou l’invasion. L’existence de mutations communes entre les CTC de différents phénotypes suggère une relation phylogénique entre ces cellules mais une évolution divergente pendant le processus métastatique. Ce travail est soumis pour publication.Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons implantés les CTC de 67 patients atteints de CBNPC et 24 patients atteints de PCa chez des souris immunodéprimées. Nous avons établis quatre CDX de CBNPC et un CDX de PCa. La caractérisation de ces modèles, des biopsies tumorales, des CTC collectées au moment de la xénogreffe, des CDX et des lignées cellulaires établies à partir du CDX, ont révélé que les CTC, le CDX et les lignées cellulaires « miment » le phénotype et le profil mutationnel des biopsies tumorales. La caractérisation plus approfondie de l’une des lignées cellulaires montre la présence d’un stress réplicatif et d’une instabilité génomique élevée. Ce résultat nous oriente sur l’hypothèse d’un rôle éventuel de l’instabilité génomique dans la tumorigénicité des CTC.Dans ce travail, nous avons montré que le profil mutationnel des CTC présente de fortes similitudes avec les biopsies tumorales des patients dans les patients atteints de PCa étudiés. De plus, nous avons observé l’existence de mutations spécifiques aux CTC, non détectées dans les biopsies tumorales. Également, nous montrons que des CTC issues de CBNPC et de PCa sont tumorigéniques in vivo et qu’elles reflètent le profil mutationnel des biopsies tumorales des patients. Ces modèles constituent des outils originaux et intéressants pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et stratégies anti-cancéreuses, et comprendre les mécanismes qui supportent le potentiel des CTC à initier des tumeurs. / Circulating tumor cells (CTCs) represents an non invasive source of tumor material which may provide clinical and basic information. These cells derived from primary or metastatic tumors represents an heterogeneous population of very rare events which circulates in the blood. Oncology personnalized medicine is based on biopsies molecular characterization but these are sometimes which difficult to realize and poorly informative. Thereby molecular and functional characterization of CTCs presents a double interest, clinical to identify treatments biomarkers sensitivity and basic to study mechanisms underlying their tumor inititiating cell (TIC) potential. The two goals of my thesis were on the one hand to characterize by whole-exome sequencing (WES) at the single level the CTCs from patients with metastatic prostate cancers (mPCa) and on the other hand to establish and characterize CTC-derived xenografts (CDX) from patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) or mPCa. For the first goal we developped a global workflow which include three technological approaches to enrich and isolate individual CTCs from different phenotype (epithelial, epithelial and mesenchymal, mesenchymal), to perform whole genome amplification (WGA) and to sequence them. WES was performed on 34 CTC samples selected according to WGA quality and on corresponding metastasis biopsies from seven patients. Two patients with phenotypic heterogeneity of CTCs were deeply analyzed. We highlighted shared mutations between CTCs and matched biopsies as well as mutations only detected in CTCs. These private CTC mutations are detected in all phenotype and particularly affect genes invlved in cytoskeleton remodeling, DNA repair or invasion. The existence of common mutations between CTCs from various phenotype suggests a phylogenic link between these cells but a divergent evolution during metastatic process. This work is submitted for publication. For the second goal, we implanted CTCs from 67 NSCLC patients and 28 mPCa patients in immunocompromised mice. We established four NSCLC CDX and one mPCa CDX. The characterization of tumor biopsies, CTCs collected at the time of xenograft, CDX and CDX-derived cell lines revealed that CTCs, CDX and cell lines miror the phenotype and mutational landscape of tumor biopsies. The more deeply characterization of one cell line show the presence of a high replicative stress and genomic instability. This result directs us to the hypothesis of a possible role of the genomic instability in CTC tumorigenicity.We demonstrated in this work that CTCs mutational landscape harbors high similairities with patients tumor biopsies in mPCa. Furthermore we observed CTC private mutations not detected in tumor biopsies. Also we showed that some CTCs from NSCLC and mPCa are tumorigenic in vivo and that these CTCs mirror mutational profile of patients tumor biopsies. These models are original and interesting tools to identify new therapeutic targets and anti-tumoral strategies and understand mechanisms underlying the TIC potential of CTCs.

L’avènement des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICIs) ciblant l’axe PD-1/PD-L1 a révolutionné le traitement des patients avec un carcinome pulmonaire non à petites cellules (CPNPC). Ce mémoire consolide les conclusions de trois études distinctes visant à analyser et à améliorer l'efficacité des ICIs en monothérapie chez le CPNPC. La première section explore les bénéfices associés au durvalumab suivant une chimioradiothérapie chez les patients présentant un CPNPC localement avancé, confirmant le bénéfice de survie associé aux ICI et élargissant les perspectives émises depuis l'étude PACIFIC, y compris au niveau de la valeur prédictive du PD-L1. Dans l’optique de caractériser de nouveaux biomarqueurs d’efficacité, la deuxième section souligne le rôle crucial du microbiome intestinal dans la modulation de la réponse aux ICIs, spécifiquement au niveau de la dysbiose intestinale liée aux antibiotiques. La méta-analyse proposée confirme l’impact délétère des antibiotiques sur la survie des patients traités avec un ICI, tout particulièrement lorsque l’antibiothérapie précède l’inhibition du PD-1/PD-L1. Dans le domaine des stratégies immunomodulatrices émergentes, la troisième section explore l’impact de la cryoablation chez les patients présentant un CPNPC avec PD-L1≥50% et traités avec le pembrolizumab. Sans relever un signal d’efficacité supérieure, cette étude de phase I/II confirme la faisabilité et l’innocuité de la cryoablation, une technique permettant la libération d’antigènes tumoraux en circulation sans dénaturation thermique. Ultimement, ce mémoire propose un survol des bénéfices de survie, biomarqueurs prédictifs et stratégies immunomodulatrices liés à l’utilisation des ICIs chez les patients avec un CPNPC avec l’espoir d’optimiser les paradigmes thérapeutiques existants. / The advent of immune checkpoint inhibitors (ICIs) targeting the PD-1/PD-L1 axis has revolutionized the therapeutic landscape for patients diagnosed with non-small cell lung cancer (NSCLC). This thesis consolidates the findings of three distinct studies aiming to analyze and enhance the efficacy of ICI monotherapy in NSCLC. The first section delves into the real-world use of durvalumab following chemoradiotherapy in stage III NSCLC, confirming the survival benefit associated with ICI administration in this context and broadening the insights derived from the PACIFIC study, particularly regarding the predictive value of PD-L1. With the aim of characterizing new biomarkers of efficacy, the second section sheds light on the crucial role of the gut microbiome in modulating responses to ICIs, particularly intestinal dysbiosis related to antibiotics. The meta-analysis confirms the detrimental impact of antibiotics on the overall survival of patients with advanced cancer treated with ICI monotherapy, especially when antibiotic therapy precedes PD-1/PD-L1 inhibition. In the realm of emerging immunomodulatory strategies, the third section explores the impact of cryoablation in patients with NSCLC and PD-L1≥50% treated with pembrolizumab. Although the procedure did not translate into a signal of superior efficacy, the proposed phase I/II study confirms the feasibility and safety of cryoablation, a technique allowing the release of circulating tumor antigens without heat-related denaturation. Ultimately, this thesis presents a contemporary overview of survival benefits, predictive biomarkers, and immunomodulatory strategies associated with the use of ICIs in monotherapy in patients with NSCLC, with the hope of optimizing existing therapeutic paradigms.

Il est maintenant bien établi que le système immunitaire joue un rôle majeur dans le contrôle des tumeurs, y compris dans les carcinomes pulmonaires. Cependant, les interactions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral sont mal connues. Dans ce travail, nous avons étudié les caractéristiques morphologiques et moléculaires des cellules tumorales provenant d’adénocarcinomes pulmonaires et leur association avec la composition du microenvironnement immunitaire. Nous avons rapporté la valeur pronostique des paramètres morphologiques de ces tumeurs, comme le grade histologique des adénocarcinomes, et leur association avec le statut moléculaire EGFR et KRAS. Nous avons émis l’hypothèse que la diversité morphologique et moléculaire de ces tumeurs pouvait être associée à une signature immunitaire intra-tumorale spécifique et que cela pourrait avoir un impact pronostique. Nous avons mis en évidence que la densité des cellules dendritiques matures, situées au sein de structures lymphoïdes tertiaires, variait en fonction du statut moléculaire EGFR et KRAS des tumeurs. De même, l’impact pronostique des cellules dendritiques matures et des lymphocytes CD8+ variait en fonction du statut moléculaire des tumeurs. Nous avons également retrouvé la valeur pronostique de l’environnement immunitaire, représenté par la densité en cellules dendritiques matures et en lymphocytes CD8+, sur la survie à long terme des carcinomes pulmonaires de stade III-N2 opérés après chimiothérapie néoadjuvante. Enfin, nous avons démontré que la chimiothérapie n'est pas associée à de profondes modifications de l’infiltrat immunitaire, alors qu’elle entraîne des modifications des cellules tumorales. L’ensemble de ces résultats suggère que l’infiltrat immunitaire est intimement lié à la cellule tumorale et que la composition du microenvironnement immunitaire varie avec les caractéristiques de la tumeur. Cette interaction entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires contribue au pronostic de ces tumeurs. Ces données démontrent l’intérêt d’utiliser des traitements combinant des drogues cytotoxiques, telle la chimiothérapie conventionnelle, à des traitements immunomodulateurs permettant de favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale efficace. / The major role of the immune system against tumor development is now clearly established, including lung carcinoma. Nevertheless, interaction between tumoral cells and immune environment is less well-defined. In that study, we have studied morphological and molecular tumoral cells characteristics from lung adenocarcinoma and their role in the composition of immune environment. We reported the prognostic value of morphological parameters, as histological grade of adenocarcinoma, and their association with molecular EGFR and KRAS status. We hypothesized that morphological and molecular diversity of these tumors could be associated with a specific intratumoral immune signature, and could have an impact in prognosis. We showed that mature dendritic cells density, located in tertiary lymphoid structures, differed according to EGFR and KRAS status. Morever, molecular status of tumors modified the pronostic value of mature dendritics cells and CD8+ T cells. We found a prognostic value of immune environment, represented by dendritic cells and T CD8+ cells, in operated stage III-N2 lung carcinomas treated by neoadjuvant chemotherapy. At last, we demonstrated that chemotherapy is not associated with wide modifications in immune infiltrate, whereas it induced modifications in tumoral cells. All together, these data strongly argue for a close link between tumoral cells and immune environment, which seems to depend on tumoral cell characteristics. This interaction between tumoral cells and immune cells contribute to the prognosis of these tumors. These results show the evidence that combine cytotoxic treatment, like conventional chemotherapy, with immunomodulators, favour a protective anti-tumor immune response.