A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva que causa comprometimento cognitivo em idosos. O diagnóstico clínico da DA é complexo. Existe uma grande necessidade de técnicas capazes de detectar a doença nos estágios iniciais, tanto para auxiliar o diagnóstico quanto para monitorar a efetividade dos tratamentos disponíveis. As alterações bioquímicas da DA são resultado de processos celulares como o metabolismo da proteína precursora do amilóide (APP), fosforilação da tau, stress oxidativo, inflamação e desregulação lipídica. Até o momento não existem marcadores bioquímicos para auxiliar o diagnóstico da DA. Este trabalho avaliou três possíveis candidatos a marcadores bioquímicos para a DA. Foram investigados a razão da APP (rAPP) de 130/110 kDa, fluidez de membrana e atividade da fosfolipase A2 em plaquetas de pacientes com DA e Comprometimento Cognitivo Leve (CCL), comparando-se seus resultados com controles idosos saudáveis. A fluidez das membranas das plaquetas foi avaliada por meio da anisotropia com a sonda fluorescente DPH (Difenilhexatrieno); a comparação das razões da APP foi realizada por Western Blotting empregando o anticorpo 22C11 e a da atividade da PLA2 foi determinada por ensaio radioenzimático com substratos e concentrações de cálcio específicas para cada um dos três principais grupos da enzima. A rAPP, as atividades da sPLA2 e iPLA2 estavam significantemente reduzidas na DA quando comparadas com controles, enquanto que a cPLA2 e a fluidez de membrana não apresentaram diferenças entre os grupos. A rAPP e a iPLA2 também apresentaram diferenças significativas entre CCL e DA, além de estarem correlacionadas com os parâmetros cognitivos MEEM e CAMCOG. A rAPP também estava correlacionada com a anistropia do DPH. / Alzheimer disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder that causes cognitive impairment in the elderly. The clinical diagnosis of AD is complex. Thus, there is a great need for sensitive techniques to detect neurodegeneration in the early stages to asset in the diagnosis and to follow the effectiveness of therapy. The biochemical alterations in the AD brain result from cellular processes such as amyloid precursor protein (APP) metabolism, tau phosphorylation, oxidative stress, inflammation and lipid dysregulation. So far there are no biochemical markers to help the AD diagnosis. The purpose of this study was to evaluate three possible candidates to biochemical marker of AD. The APP 130/110 kDa ratio, membrane fluidity and phospholipase A2 activity in platelets of patients with AD and mild cognitive impairment (MCI) were investigated compared to their results with healthy elderly controls. The membrane fluidity of platelets was assessed by the fluorescence anisotropy of DPH (diphenyl-hexatriene); the levels of APP isoforms were evaluated by Western Blot analysis using 22C11 antibody and the PLA2 activity was measured by radio-enzymatic assay with enzyme specific substrate and calcium concentrations for each one of the three main groups of the enzyme. The APP ratio (APPr), the sPLA2 and iPLA2 activity were markedly decreased in AD in comparing with controls, whereas a cPLA2 and membrane fluidity didn\'t show any alteration between the groups evaluated. The APPr and iPLA2 also showed significant differences between MCI e AD, and were correlated with cognitive parameters MMSE and CAMCOG. The APPr was also correlated with DPH anisotropy.

As fosfolipases A2 (PLA2s, E.C. 3.1.1.4) pertencem a uma superfamília de enzimas que realizam a clivagem de fosfolipídios da membrana celular em ácidos graxos e lisofosfolipídios, numa reação dependente de cálcio. As PLA2s apresentam um importante papel em várias funções celulares, incluindo manutenção dos fosfolipídios celulares, geração de prostaglandinas e leucotrienos, tradução de sinais, proliferação celular e contração muscular. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de uma fosfolipase A2 ácida tóxica(BmooTX-I) isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. A BmooTX-I foi purificada por uma combinação de cromatografias em resinas de troca iônica (DEAE-Sephacel), exclusão molecular (Sephadex G-75) e interação hidrofóbica (Phenyl-Sepharose CL-4B). A confirmação do grau de pureza foi realizada através de análise por espectrometria de massa MALDI TOF da BmooTX-I reduzida (monômero, 13.802,66 Da) e não reduzida (dímero, 27.506,38 Da), da focalização isoelétrica (pI 4,2) e de SDS-PAGE. A região N-terminal da enzima apresentou alta homologia com outras PLA2s Asp49 de peçonhas de serpentes. A BmooTX-I apresentou também elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, induzir a liberação de PGI2 por HUVECs e apresentar efeito citotóxico sobre células tumorais, bactérias e fungos. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila (BPB) neutralizou a atividade enzimática e de inibição da agregação plaquetária. A determinação da miotoxicidade foi realizada através da dosagem dos níveis de CK no plasma de camundongos previamente injetados com a toxina. A análise histopatológica das fibras musculares demonstrou a presença de infiltrado inflamatório e líquido intercelular, ambos confirmados pela análise ultra-estrutural. O presente trabalho deverá contribuir para a elucidação e determinação da composição bioquímica dos venenos animais, já que as fosfolipases A2 ácidas tóxicas possuem mecanismos de ação ainda não totalmente esclarecidos. / Phospholipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) belong to a superfamily of enzymes that perform the cleavage of phospholipids of cell membranes in fatty acids and lysophospholipids in a calcium dependent reaction. PLA2s have an important role in several cellular functions, including maintenance of cellular phospholipids, the generation of prostaglandins and leukotrienes, translation signals, cell proliferation and muscle contraction. This study aimed at the structural and functional characterization of an acidic and toxic phospholipase A¬2 (BmooTX-I) isolated from Bothrops moojeni snake venom. BmooTX-I was purified by a combination of chromatographic steps on resins of ion exchange (DEAE Sephacel), molecular exclusion (Sephadex G-75) and hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose CL-4B). The confirmation of the purity degree was analyzed by MALDI TOF mass spectrometry of reduced BmooTX-I (monomer, 13,802.66 Da) and not reduced (dimer, 27,506.38 Da), by isoelectric focusing (pI 4.2) and by SDS-PAGE. The N-terminal region of the enzyme showed high homology with other Asp49 PLA2s of snake venoms. BmooTX-I also presented high phospholipase activity and induced moderate edema in vivo. Furthermore, this enzyme was capable of inhibiting platelet aggregation and plasma coagulation, inducing the release of PGI2 by HUVECs, also showing cytotoxic effects on tumor cells, bacteria and fungi. Treatment of the enzyme with the p-bromophenacyl bromide (BPB) neutralized the enzymatic activity and the inhibition of platelet aggregation. The determination of myotoxicity was accomplished through the determination of the CK levels in plasma of mice previously injected with the toxin. The histopathological analysis of muscle fibers showed the presence of inflammatory infiltration and intercellular fluid, both confirmed by ultrastructural analysis. This work contributes to the elucidation and determination of the biochemical composition of animal venoms, since the mechanisms of action of toxic acidic phospholipases A2 are not yet fully understood.

Os envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothrops são os mais importantes do ponto de vista médico e econômico na América Central. Dentre estas, a serpente Bothrops asper é responsável por 90% dos envenenamentos ofídicos registrados no Panamá anualmente. Apesar da relevância médica e econômica, só a peçonha de populações de B. asper da Costa Rica e Guatemala tem sido estudadas em detalhes. Neste trabalho apresentamos a caracterização da peçonha da B. asper do Panamá e o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de quatro fosfolipases A2 básicas denominadas MTX-I, MXT-II, MTX-III e MXT-IV e de uma fosfolipase A2acídica denominada Basp-I-PLA2. As fosfolipases A2 foram isoladas da peçonha em duas etapas usando cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose (0,05 M NH4HCO3 pH 8,1), e cromatografia hidrofóbica em Fenil-Sepharose (0,05 M Tris-HCl pH 7,4) seguida de gradiente de concentração de 4 a 0 M NaCl no mesmo tampão a temperatura ambiente (25°C). A isoforma acídica demonstrou maior atividade catalítica que as isoformas básicas, quando atuou sobre fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol. A focalização isoelétrica evidencia pIs de 8,1 a 8,3 para as MTXs e 4,6 para isoforma Basp-I-PLA2. A determinação da massa molecular por espectrometria de massa mostrou que MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 e MTX-3 14,253.0 e Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. As PLA2s (MTX-I, II, III e IV) induziram atividade miotóxica, reação inflamatória com migração de leucócitos ao músculo e ativação de macrófagos para exercer fagocitose e produção de superóxido. MTX-II exerceu um forte efeito citotóxico contra células tumorais JURKAT, C. albicans e E. coli. A fosfolipase A2 acídica, testada no plasma enriquecido com plaquetas, mostrou potente efeito inibitório na agregação plaquetária induzida pela ADP e colágeno. A análise de seqüência N- terminal demonstrou que as proteínas MTX-I, MTX-III e Basp-I-PLA2 pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Asp49 cataliticamente ativas, enquanto que, MTX-II e MTX-IV pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Lys49-homólogas cataliticamente inativas. Além disso, a sequência N-terminal das fosfolipases A2 básicas isoladas, demonstrou claramente que as miotoxinas isoladas neste trabalho são similares às miotoxinas previamente isoladas da peçonha da B. asper da Costa Rica. A Basp-I-PLA2 é uma nova fosfolipase A2 acídica isolada da peçonha de B. asper do Panamá e sua seqüência N-terminal revelou uma alta homologia com outras PLA2s acídicas Asp49 isoladas de peçonhas de serpentes. / Envenoming by Bothrops snakes is the most serious kind of envenoming from the medical and economical point of view in Central America. Bothrops asper snake is responsible for 90% of the snakebites registered in Panama every year. Despite its medical and economical relevance, only the venom of Costa Rica and Guatemala populations of this species has been studied to some detail, and there is very little information on intraspecies variability in venom composition and toxicity. In this study the crude venom of B. asper from Panama was characterized and its pharmacological and biochemistry activities were investigated with standard laboratory assays. Furthermore, we describe the isolation, functional and structural characterization of four basic phospholipases A2, named MTX-I, MTX-II, MTX-III, MTX-IV and a new acid phospholipase A2 named Basp-I-PLA2. The proteins were isolated from the crude venom by a combination of two chromatographic steps, using ion-exchange chromatography on CM-Sepharose (0.05 M NH4HCO3 pH 8.1 buffer), and hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose (0.05 M Tris-HCl pH 7.4), followed by concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. Analyses of phospholipids hydrolyzed by these enzymes have shown that all phospholipases belong to type A2. The acidic isoform demostraded more catalytic activity than the basic PLA2s. This enzyme was more active on substrates as phosphotidylcholine and phosphatidylglycerol. The isoelectric focusing evidenced pIs beetwen 8.1 to 8.3 for the MTXs and 4.6 for the isoform Basp-I-PLA2. Its mol. Wt was estimated by Mass spectrometry to be MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 and MTX-3 14,253.0 and Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. The PLA2s (MTX-I, II, III and IV) induced myotoxic activity, inflammatory reaction mainly leukocyte migration to the muscle and activation of macrophages to exert phagocytic activity and production of superoxide. MTX-II, the most abundant one showed to be cytotoxic against JURKAT tumor cell line, C. albicans and E. coli. The acidic phospholipases A2 when tested in platelet rich plasma, showed a potent inhibitory effect on aggregation induced by ADP and collagen. The analysis of the sequence N-terminal demonstrated that the MTX-I, MTX-III and BASP-I-PLA2 belong to the subclass of Asp49 phospholipases A2 catalytically active, whereas, MTX-II and MTX-IV belong to proteins of the subclass of the enzymatically inactive Lys49 PLA2 s-like. In addition, a sequence of the region N-terminal of the PLA2s basic isolated, demonstrated clearly, that the isolated myotoxins in this work are similar of the previously isolated myotoxins of the snake venom Bothrops asper from Costa Rica. The Basp-I-PLA2 is a new acidic PLA2 and his sequence N-terminal revealed a high homology with other Asp49 acidic PLA2 s from snake venoms.

Um aumento da atividade da PLA2 e alterações do sistema dopaminérgico tem sido descrito em esquizofrenia. No presente estudo, foram investigados os efeitos da atividade da PLA2 sobre os receptores D1 e D2 em cérebro post mortem de 10 sujeitos. Foi encontrado que a PLA2GVI é responsável por 85% do total de atividade da PLA2 no cérebro. A estimulação da PLA2GVI (por EDTA) aumentou a afinidade de D1 em estriado e em CPF e diminuiu a afinidade de D2 em estriado. A inibição da PLA2GVI (por BEL) diminuiu a afinidade de D1 em estriado, e em CPF e CT. A estimulação da PLA2GVI resultou em aumento na densidade de D1 em CPF e CT, e de D2 em estriado. Uma elevação da PLA2 em esquizofrenia poderia contribuir para a biologia da doença através de alterações na neurotransmissão dopaminérgica / Increased PLA2 activity and dopaminergic alterations have been described in schizophrenia. In the present study it was investigated the effects of PLA2 activity on D1 and D2 receptors in post mortem brain of 10 subjects. It was found that PLA2GVI corresponds to 85% of all PLA2 activity in the brain. The stimulation of PLA2GVI (by EDTA) increased D1 affinity in striatum and in PFC, and decreased D2 affinity in striatum. Conversely, the inhibition of PLA2GVI (using BEL) decreased D1 affinity in striatum, PFC and TC. The stimulation of PLA2GVI increased D1 density in PFC and TC, as well as the D2 density in striatum. The increased PLA2 activity in schizophrenia may contribute to the biology of the disease through alterations in dopaminergic neurotransmission

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:44:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DizFilho_EduardoBrittodosSantos_D.pdf: 56066109 bytes, checksum: 5145b0aec09dd84e8ea2af9763987d84 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os Anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) constituem uma classe de medicamentos com prescrição mundial, pois são fármacos que auxiliam na terapia de vários processos patológicos visto que oferecem ações farmacológicas: anti-inflamatória, analgésica e antipirética, como efeitos primários. A venda dos AINES no Brasil é de forma ''livre", porém, nos EUA é realizada somente sob prescrição médica. Apesar do grande número de informações acumuladas durante anos de pesquisa a respeito destas drogas sobre as atividades das Ciclooxigenases 1 e 2 (COX 1 e COX 2), respectivamente, do seu papel como ferramenta molecular para o estudo das vias biossintéticas das prostaglandinas e dos avanços em relação a sua síntese e síntese de novos AINES, não se tem conhecimento da atuação dessas drogas sobre a estrutura e função das Fosfolipases A2 secretórias (PLA2s), responsáveis pela produção do acido araquidônico precursor de vários tipos de derivados lipídicos biologicamente ativos e responsável pelo processo inflamatório. O objetivo deste trabalho é responder questões relacionadas à ação dos AINES sobre a ação de PLA2 de serpentes, responsáveis por eventos farmacológicos principalmente relacionados com edema. Esta atividade inflamatória pode ser desencadeada tanto por PLA2 enzimaticamente ativas, como não ativas, ambas induzindo o efeito de inflamação aguda por mecanismos ainda controversos. O trabalho utilizou PLA2 farmacologicamente ativa (destacadamente no processo inflamatório), isoladas do veneno de serpentes Bothrops leucurus, em ensaios de cinética enzimática, atividade farmacológicas relacionados ao edema, agregação plaquetária, mionecrose e neurotoxicidade conduzidos em presença das toxinas puras, das toxinas em presença dos AINES, em ensaios com prévio tratamento dos AINES e posterior aplicação das PLA2. Para uma avaliação mais precisa das alterações induzidas por estes AINES (princípios ativos puros ou drogas comerciais) foram empregadas técnicas de varredura em espectrômetro de UV-Vis (220-700mn) para averiguar possíveis modificações do espectro de absorbância da PLA2 e do AINES após a incubação o que poderia indicar modificações estruturais na PLA2, induzidas por estas drogas. Além de avaliar a ação específica dos AINES sobre as PLA2, secundariamente, o trabalho possibilitou conhecer alguns aspectos físico-químicos e estruturais de PLA2 isoladas do veneno de Bothrops leucuros. Os resultados determinaram que, embora não ocorram interações estruturais entre os AINES e as PLA2, foram evidenciadas alterações de atividade farmacológica / Abstract: Anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are a class of prescription drugs worldwide, as are drugs that help in the therapy of various pathological processes as they offer pharmacological actions: anti-inflammatory, analgesic and antipyretic, such as primary effects. The sale of NSAIDs in Brazil are ''free", but the U.S. is preferred only by prescription. Despite the large amount of information accumulated through years of research on these drugs on the activities of the cyclooxygenases 1 and 2 (COX 1 and COX 2), respectively, of their role as a molecular tool for studying the biosynthetic pathways of prostaglandins and advances in respect of its synthesis and synthesis of new NSAIDs, there are no known performance of these drugs on the structure and function of secretory phospholipase A2 (PLA2s), responsible for the production of arachidonic acid precursor of various biologically active lipid derivatives and responsible for the inflammatory process. This paper aims to answer questions related to the action of NSAIDs on the action of PLA2 of snakes responsible for pharmacological events mainly related to edema. This inflammatory activity can be triggered by PLA2 enzymatically active and non active, inducing both the effect of acute inflammation by still controversial. The paper uses PLA2 pharmacologically active (highlighted in the inflammatory process), isolated from Bothrops leucurus snake venom and Bothrops jararacussu in kinetics assays, pharmacological activity related to edema, platelet aggregation, and neurotoxicity myonecrosis conducted in the presence of pure toxins, the toxins in the presence of NSAIDs, previous treatment trials with NSAIDs and the subsequent application of PLA2. For a more accurate assessment of changes induced by these NSAIDs (pure active ingredients or drugs trade) is employed techniques of scanning UV-Vis spectrophotometer (220-700nm) to ascertain possible modification of the absorbance spectrum of PLA2 and NSAIDs after incubation which could indicate structural changes in PLA2, induced by these drugs. In addition to assessing the specific action of NSAIDs on PLA2 secondarily work enables to know some physical-chemical aspects and structures of PLA2 isolated from the venom of Bothrops leucurus. The results determine that although there occur structural interactions between NSAIDs and PLA2 activity were observed pharmacological changes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:14:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vega_SalomonHuancahuire_D.pdf: 1506157 bytes, checksum: 874bfba78d521b4e037ba15f754d80b7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: No presente trabalho, a partir do veneno de Porthidium hyoprora, foram purificadas duas fosfolipases A2 (PLA2) miotóxicas, denominadas PhTX-I e PhTX-II, determinadas suas sequências primárias e caracterizadas bioquímica e farmacologicamente. Ambas as proteínas foram purificadas em uma única etapa cromatográfica (HPLC-FR), sendo obtida homogênea e com alto grau de pureza, confirmado por SDS-PAGE, análise de aminoácidos e espectrometria de massas. PhTX-I e PhTX-II estão constituídas de uma única cadeia polipeptídica e possuem massas moleculares de 14.249 e 14.149 Da, respectivamente. A sequência de aminoácidos foi determinada via espectrometria de massas ESI-MS/MS, pertencendo à família das PLA2 D49. A estrutura secundária predominante destas proteínas está constituída de ?-hélices. PhTX-I e PhTX-II induziram atividade paralisante neuromuscular ex vivo na preparação de biventer cervicis de pintainho e esta atividade foi similar ao efeito de outras PLA2 de veneno botrópico. In vivo, tanto PhTX-I quanto PhTX-II, induziram elevada miotoxicidade local e atividade edematogênica. Adicionalmente, PhTX-I induz liberação de IL-6 após injeção intramuscular em camundongos. In vitro, PhTX-I e PhTX-II foram citotóxicas de maneira dose-dependente para as linhagens celulares de fibroblastos NIH-3T3 e NG97 derivada de astrocitoma humano grau III. Adicionalmente PhTX-I foi citotóxica sobre cultura celular de miotubos C2C12, entretanto teve pouco efeito citolítico sobre mioblastos de músculo esquelético. Foram feitas modificações químicas em resíduos de aminoácidos específicos da PhTX-I e avaliadas suas atividades farmacológicas após as modificações. Foram modificados um resíduo de His e Trp, quatro de Tyr e sete de Lys. A análise destas proteínas por dicroísmo circular demonstrou que a estrutura secundária das proteínas modificadas não foi alterada significantemente. Avaliação das atividades biológicas indicam um papel crítico desempenhado pelos aminoácidos Lys e Tyr na miotoxicidade, efeito paralisante neuromuscular e principalmente na citotoxicidade induzida por PhTX-I. A atividade catalítica da PhTX-I é relevante para os efeitos edematogênico, paralisante neuromuscular e miotóxico, mas não para sua atividade citotóxica, pois este efeito foi completamente independente da atividade catalítica de PhTX-I, evidenciando a existência de regiões moleculares, diferentes a do sítio catalítico, as quais podem ser responsáveis por pelo menos algumas das propriedades farmacológicas da PhTX-I. Podemos concluir, que apesar de ser demonstrada uma dissociação parcial, tanto o sítio catalítico como os sítios farmacológicos hipotéticos são relevantes para o perfil farmacológico de PhTX-I / Abstract: In this work, were purified two myotoxics phospholipases A2 (PLA2), PhTX-I and PhTX-II, from P. hyoprora snake venom, determined their primary sequences and characterized their pharmacological and biochemical activities. These proteins were purified in a single chromatographic step (FR-HPLC) and obtained with homogeneous and high purity, which was confirmed by SDS-PAGE, amino acid analysis and mass spectrometry. PhTX-I and PhTX-II are constituted of a single polipetide chain and have molecular mass of 14.249 and 14.149 Da, respectively. The amino acid sequence was determined by ESI-MS/MS mass spectrometry; belong to PLA2 D49 family. The predominant secondary structure of these proteins consists of ?-helix. PhTX-I and PhTX-II induced neuromuscular paralyzing effect ex vivo in young chick biventer cervicis preparations, this activity was similar to other PLA2 of snake venom. In vivo, PhTX-I and PhTX -II induced local myotoxicity and edema-forming activity, in addition, PhTX-I induces release of IL-6 after intramuscular injection in mice. In vitro, PhTX-I and PhTX -II were cytotoxic to the fibroblast cell line NIH-3T3 and NG97 derived from grade III human astrocytoma. Additionally PhTX-I induced low cytotoxicity in skeletal muscle myoblasts, however was able to lyse myotubes. Were made modifications chemical in PhTX-I specific amino acid residues and evaluated the pharmacological activities after modifications. Was modified one His and Trp, four Tyr and seven Lys residues? Analysis by circular dichroism demonstrated that secondary structure of protein remains practically unchanged. Evaluation of biological activities indicate a critical role of Lys and Tyr amino acid at myotoxicity, neuromuscular paralyzing effect, and especially cytotoxicity induced by PhTX-I. The catalytic activity of PhTX-I is relevant to the edematogenic, neuromuscular paralyzing and myotoxic effects, but not for their cytotoxic activity, since this effect is completely independent of the catalytic activity of PhTX-I, demonstrating the existence of molecular regions, different from the catalytic site, which may be responsible for at least some of the pharmacological properties of PhTX-I. We conclude that both the catalytic site and the hypothetical pharmacological site(s) are apparently relevant for the pharmacological profile of PhTX-I, although a partial dissociation between these activities has been demonstrated / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Recently, they are examined various means for activating the endogenous signalling pathways leading to increased resistance of the myocardium from ischemic/reperfusion (I/R) injury. One of them is the adaptation to chronic hypoxia, which has been shown to reduce the incidence and severity of ventricular arrhythmias, improves the recovery of postischemic contractile function of the heart and particularly reduces the extent of myocardial infarction. Since the function of the heart depends on the maintenance of membrane integrity of cardiomyocytes there are very important phospholipase A2 (PLA2) which are involved in the repair of cellular membranes. Also they are an important component of the protective signalling pathways because they cleave membrane phospholipids to produce lipid signalling molecules. Elucidate the role of PLA2 and the precise mechanism of action of signalling pathways leading to cardioprotection could be important for the prevention and treatment of cardiovascular diseases. Therefore, in this thesis we examined the influence of continuous normobaric hypoxia (CNH) to the relative representation of cardiac PLA2 (secretory - sPLA2IIA, calcium-independent - iPLA2, cytosolic - cPLA2α and its phosphorylated form - p-cPLA2α), and proteins involved in the activation and phosphorylation of...

Cardiovascular diseases, particularly acute myocardial infarction, are the leading causes of death in developed countries including the Czech Republic. One of the ways to increase cardiac resistance against acute ischemia/reperfusion (I/R) injury is adaptation to chronic hypoxia. However, changes at the molecular level associated with this adaptation have still not been fully explored. It is obvious that the myocardial function depends on maintaining membrane integrity and cellular homeostasis of cardiomyocytes. From this perspective, phospholipases A2 (PLA2) are the key enzymes that take part in the remodeling and repairing of the cell membranes. Moreover, PLA2 are also involved in generation of lipid signaling molecules - free long chain fatty acids (FA) and 2-lysophopholipids. In myocardium, members of three major PLA2 classes are present: cytosolic PLA2 (cPLA2), calcium-independent PLA2 (iPLA2) and secretoric PLA2 (sPLA2). This thesis aimed to determine the following in the left ventricular myocardium of adult male Wistar rats: 1) The effect of intermittent hypobaric hypoxia (IHH; 8 hours/day, 5 days/week, 5 weeks, ~ 7000 m) on the expression of total cPLA2α and its phosphorylated form (p-cPLA2α, Ser505 ), and further iPLA2 and sPLA2IIA, as well as signaling proteins activating cPLA2α enzyme...

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Introduction: During glutamate excitotoxicity, overstimulation of glutamate receptors leads to sustained elevation in cytosolic Ca2+ ([Ca2+]c), or delayed Ca2+ dysregulation (DCD), which is causally linked to cell death. There are two major hypothetical mechanisms for DCD: the continuous activation of N-methyl-D-aspartate-subtype of the ionotropic glutamate receptors (NMDAR) and the reversal of the plasmalemmal Na+/Ca2+ exchanger. However, the contribution of each of these mechanisms in DCD is not completely established. Major results: Neurons exposed to excitotoxic glutamate produced DCD, an increase in cytosolic Na+ ([Na+]c), and plasma membrane depolarization. MK801 and memantine, noncompetitive NMDAR inhibitors, added after glutamate, completely prevented DCD; however AP-5, a competitive NMDAR inhibitor, failed to do so. The NMDAR inhibitors had no effect on lowering elevated [Na+]c or on restoring plasma membrane potential, which are conditions suggesting NCXrev could be involved. In experiments inducing NCXrev, MK801 and memantine completely inhibited Ca2+ dysregulation after glutamate while AP-5 did not. Inhibition of NCXrev, either with KB-R7943 or by preventing the increase in [Na+]c, failed to avert DCD. However, NCXrev inhibition combined with NMDAR blocked by AP-5 completely prevented DCD. Overall, these data suggested that both NMDAR and NCXrev are essential for glutamate-induced DCD, and inhibition of only one mechanism is insufficient to prevent collapse of calcium homeostasis. Based on the data above, we investigated a NMDA receptor antagonist currently in clinical trials for reducing the effects of glutamate excitotoxicity, ifenprodil. Ifenprodil is an activity-dependent, NMDAR inhibitor selective for the NR2B subunit. We found that ifenprodil not only inhibited the NR2B-specific NMDAR, but also inhibited NCXrev. If ifenprodil is combined with PEAQX, a NMDAR inhibitor selective for the NR2A subunit, low concentrations of both inhibitors completely prevent DCD. Conclusion: The inhibition of a single Ca2+ influx mechanism is insufficient in preventing DCD, which requires simultaneous inhibition of both the NMDAR and NCXrev. These findings are critical for the correct interpretation of the experimental results obtained with these inhibitors and for better understanding of their neuroprotective actions.

The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. Title from PDF of title page (University of Missouri--Columbia, viewed on April 29, 2010). Vita. Thesis advisor: Grace Y. Sun. "May 2008" Includes bibliographical references.