In the experiments presented in this work, linear and non-linear femtosecond time-resolved spectrsocopy were applied to investigate the structure-function and functiondynamics relationship in biological and artificially designed systems. The experiments presented in this work utilize femtosecond time-resolved transient absorption and transient grating as well as picosecond time-resolved fluorescence spectroscopy to investigate the photophysics and photochemistry of biological photoreceptors and address the light-induced excited-state processes in a particular molecular device that serves as a - structurally - very simple light-harvesting antenna and potentially as a catalysis-switch for the production of hydrogen in solution. The combination of white-light probe transient absorption and coherent transient grating spectroscopies yields spectral information about the excited state absorption in concert with high quality, high signal-to-noise kinetic transients, which allow for precise fitting and therefore very accurate time-constants to be extracted from the data. The use of femtosecond time-resolved transient grating spectroscopy is relatively uncommon in addressing questions concerning the excited-state reaction pathways of complex (biological) systems, and therefore the experiments presented in this work constitute according to the literature the first studies applying this technique to a a metalloporphyrin and an artificial light-harvesting antenna. / In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Struktur- Funktions- und Funktions- Dynamik- Beziehungen in biologischen und künstlich synthetisierten Systemen untersucht. Hierfür wurden Femtosekunden zeitaufgelöste lineare und nicht-lineare spektroskopische Techniken verwendet. Mittels transienter Absorptions- und transienter Gitterspektroskopie sowie Pikosenkunden zeitaufgelöster Fluoresezenzmessungen wurden ausgewählte pflanzliche Photorezeptoren untersucht und die Relaxationsprozesse im angeregten Zustand einer artifiziellen Lichtsammelantenne charakterisiert. Die Kombination aus Femtosekundenzeitaufgelöster transienter Absorption unter Verwendung eines Weisslichtsuperkontinuums als Probepuls und kohärenter Vier-Wellen-Mischungs-Spektroskopie erlaubt es, breitbandige spektrale Informationen über einen photo-angeregten Zustand zu gewinnen und gleichzeitig Kinetiken mit einem sehr hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu messen. Letztere erlauben einen präzisen Fit, und somit können sehr präzise charakteristische Zerfallskonstanten aus den zeitaufgelösten Daten rekonstruiert werden. Durch den komplexeren Versuchsaufbau eines Vier-Wellen-Mischungs-Experiments verglichen mit dem transienter Absorptionsspektroskopie ist die Verwendung von zeitaufgelöster transienter Gitterspektroskopie zur Untersuchung licht-induzierter Prozesse in komplexen biologischen Systemen noch immer relativ unüblich. Daher stellen die hier präsentierten Ergebnisse die ersten Experimente dar, in denen diese Technik zur Untersuchung von angeregter Zustandsrelaxation in einem Metalloporphyrin und einem künstlichen photosynthetischen Reaktionszentrum eingesetzt wurde.

Regensburg, Univ., Diss., 2005.

University, Diss., 2004--Freiburg (Breisgau). / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.

Univ., Diss.--Regensburg, 1998.

Regensburg, Univ., Diss., 2008.

Zebrafish have been used as a model to study the vertebrate retina due to its functional and structural similarities to the human retina. Photoreceptor cells (PRCs) are highly specialised type of neurons present in the retina. In zebrafish, PRCs can be divided into 5 different subtypes, rods and green, red, blue and UV sensitive cones. Mature PRCs are composed of different morphological compartments (basal domain, inner segment and outer segment), which are essential for their phototransduction ability. During development, these cells are known to arise from columnar neuroepithelium precursor cells and undergo a maturation process to become compartmentalised10. However, a detailed characterisation of this process is lacking in zebrafish. In this project, I aimed to establish and characterise in detail the stages of PRC maturation in zebrafish. Next, I aimed to investigate the role of candidate genes in this PRC maturation process. To label the plasma membrane of all cells, a zebrafish transgenic line was utilised. Furthermore, a novel zebrafish transgenic line that labels the outer segments of red sensitive PRCs was generated. This transgenic line enabled visualisation and volume quantification of outer segments of red sensitive cones. The use of both transgenic lines in combination with antibody stainings indicated that, from 72 hours post fertilisation (hpf) onwards, subtypes of PRCs exhibit differences in growth rate and morphology of their cell compartments. Additionally, differences in mitochondrial clusters and nuclei positioning were observed during the maturation process. From 72 hpf to 120 hpf, rough endoplasmic reticulum accumulation emerged specifically in rod like PRCs. Changes in chromatin organisation were observed in UV sensitive cones like PRCs from 120 hpf onwards. This showed that a high degree of complexity was observed even within the cone PRC subtypes. Lastly, the role of a candidate gene, crb2b, was examined by comparing PRC maturation process in WT and crb2b mutants. My results indicate that loss of Crb2b does not show obvious defects in PRC maturation. Results obtained in this dissertation provided a comprehensive characterisation of six independent PRC maturation stages using the criteria of cell compartmentalisation and growth, organellar distribution and localisation of cell polarity related protein complexes. This defined developmental timeline provides a platform to further study PRC maturation and function.

Femtosekundenaufgelöste Ramanspektroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Schwingungsentwicklung eines angeregten Chromophors in Echtzeit zu studieren. In dieser Arbeit wurde ein durchstimmbares Ramanspektrometer mit 10 cm-1 spektraler und 50--100 fs zeitlicher Auflösung entwickelt und für eine Anwendung auf flavinbasierte Photorezeptoren optimiert. Es wird der Einfluß der Resonanzbedingungen auf das transientes Ramanspektrum charakterisiert. Die Dynamik des angeregten Zustandes wird zuerst für den Modellphotoschalter Stilben untersucht, ausgehend sowohl vom cis-, als auch vom trans-Isomer. Intensitätsabnahme, spektrale Verschiebung und Bandenverschmälerung liefern Einblicke in die Schwingungsrelaxation des angeregten Chromophors. Wellenpaketbewegung und anharmonische Kopplung werden als Oszillationen beobachtet. Für das "Mutter"-Cyanin 1,1''-Diethyl-2,2''-pyridocyaniniodid wird die Isomerisierung bis in den Grundzustand verfolgt. Ramanspektren des Franck-Condon-Zustandes, des intermediär gebildeten heissen Grundzustandes und der Isomerisierungsprodukte werden erhalten. Als Grundlage für Experimente an Flavoproteinen werden die Eigenschaften des angeregten Flavinchromophors in Lösung untersucht. Transiente Absorptions- und Fluoreszenzexperimente weisen auf den Einfluss dynamischer polarer Solvatation hin. Es werden Ramanspektren des angeregten Zustandes von Flavin aufgenommen und die Schwingungsbanden zugeordnet. Populationsverminderung durch den Ramanimpuls wird als potentielles Artefakt in zeitaufgelösten Messungen identifiziert; der Effekt wird aber auch genutzt, um Wellenpaketbewegung im angeregten Zustand zu markieren. Die Photorezeptormutanten BlrB-L66F und Slr1694-Y8F werden mit transienter Absorption studiert. Dabei wird die Bildung des Signalzustandes und Flavinreduktion durch ein Tryptophan beobachtet. Die Anwendung des entwickelten Ramanspektrometers auf biologische Proben wird in einem ersten Experiment an Glucose Oxidase demonstriert. / Femtosecond stimulated Raman spectroscopy is a powerful tool that allows to study the structural relaxation of an excited chromophore directly in time. In this work a tunable Raman spectrometer with 10 cm-1 spectral and 50-100 fs temporal resolution was developed, and the technique was advanced towards applications to flavin-based proteins. With this device the influence of resonance conditions on the transient Raman spectrum is characterized. Excited-state dynamics is first investigated for the model photoswitch stilbene, starting from both the cis and the trans isomers. Decay, spectral shift, and narrowing of individual bands provide insight into the vibrational relaxation of the excited chromophore. Wavepacket motion and anharmonic coupling is seen as oscillations. Isomerization is followed to the ground state for the "parent" cyanine 1,1''-diethyl-2,2''-pyrido cyanine iodide. From a global analysis, Raman spectra for the Franck-Condon region, the intermediately populated hot ground state, and the isomerization products are obtained. As a basis for experiments on flavoproteins, the excited-state properties of the pure flavin chromophore are studied in solution. Transient absorption and fluorescence experiments suggest an influence of dynamic polar solvation on the electronic properties of the excited state. Raman spectra from the flavin excited state are recorded and the vibrational bands assigned. Population depletion by the Raman pulse is identified as a potential artefact, but the effect is also used to mark wavepacket motion in the excited state. The photoreceptor mutants BlrB-L66F and Slr1694-Y8F are studied by transient absorption; signaling state formation and flavin reduction by a semiconserved tryptophan are seen, respectively. The application of femtosecond Raman spectroscopy to biological samples is demonstrated in a first experiment on glucose oxidase.

Die Hauptursache für die Erblindung von Erwachsenen in Industrieländern ist die fortschreitende Degeneration von Photorezeptoren (PR). Die PR-Degeneration tritt in Krankheiten, wie Retinitis Pigmentosa (RP) und Altersabhängiger Makuladegeneration (AMD), auf. Photobiomodulation (PBM) ist ein vielversprechender Ansatz, um die Degeneration der PR zu verzögern. Bestrahlung mit Licht, im roten bis nahinfraroten Bereich (600-1000 nm) und geringen Intensitäten (1-500 mW), induzierte antiinflammatorische, antiapoptotische Effekte und verbesserte Mitochondrienfunktion in retinalen Schädigungsmodellen. Klinische Studien belegten übereinstimmend ein erhöhtes Sehvermögen von Patienten mit AMD, RP oder diabetischer Retinopathie durch PBM-Therapie. Die basierenden zellulären Auswirkungen, die die Degeneration der PR verzögern, sind nur unzureichend beschrieben. Retinale Studien konzentrieren sich nahezu ausschließlich auf die Effekte von 670-nm-Rotlicht. Die aktuelle Leithypothese fokussiert sich auf den mitochondrialen Atmungskettenkomplex IV, die Cytochrom-c-Oxidase (CCO). CCO wirkt als primärer Photoakzeptor und Effektor von PBM, dessen Aktivierung zu erhöhter ATP-Synthese, d.h. einem erhöhten mitochondrialen Energiemetabolismus führt. Aktuelle Erkenntnisse lassen zusätzliche Photoakzeptoren vermuten. Allerdings wurde die direkte Wirkung auf andere Atmungskettenkomplexe bislang kaum untersucht. Eine Genregulation und molekularbiologische Mechanismen, die die zellulären Veränderungen erklären, sind weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die neuroprotektive Wirkungsweise von PBM auf geschädigte PR untersucht, die dessen Degeneration verzögert. Es erfolgte eine Charakterisierung der zellulären sekundären Effekte und regulatorischer Mechanismen von RL (670 nm) und NIRL (810 nm). Die Analysen wurden in einem organotypischen ex-vivo-PR-Schädigungsmodell durchgeführt. Mithilfe von Blaulicht (BL) -Bestrahlung (405 nm) über 9 h wurde oxidativer Stress in PR induziert, wodurch diese degenerieren und teilweise absterben. Im Anschluss der Schädigung wurde RL oder NIRL für 10 min appliziert. Nach dieser RL/NIRL-Therapie konnte mittels TUNEL-Assay eine 40-50 %ige Reduktion der Apoptoserate der PR gegenüber BL-geschädigten PR nachgewiesen werden. Dies bestätigt, in Übereinstimmung mit bisherigen PR-spezifischen PBM-Studien, eine PBM-induzierte Neuroprotektion der PR. Zusätzliche positive zelluläre Auswirkungen durch PBM zeigten sich anhand von geringerem oxidativen Zellstress und verbesserter Mitochondrienfunktion. Der oxidative Stress wurde folgendermaßen detektiert: Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in den Innen- (IS) und Außensegmenten (OS) der PR wurden mittels Vitalfärbung nachgewiesen. PBM-Behandlung reduzierte die durch BL-Exposition massiv erhöhte ROS-Bildung. Die relativen ROS-Level sanken von 2,7 (BL) auf 1,2 (RL/NIRL) im OS und von 1,9 (BL) auf 1,3 (RL/NIRL) im IS und näherten sich der normalisierten Kontrolle ungeschädigter Zellen an. PBM inhibierte die Bildung der Lipidperoxidationsprodukte 4-HNE und HEL in den IS und OS. Weiterhin reduzierte sich durch PBM die mtDNA-Schädigung und PBM initiierte mtDNA-Reparaturmechanismen in den IS. Neben dem bereits beschriebenen CCO als Photoakzeptor von PBM, stehen weitere Atmungskettenkomplexe als primäre Photoakzeptoren zur Diskussion. In in-situ-Aktivitätsassays konnten die Atmungskettenkomplexe I und II als direkte Photoakzeptoren von RL und NIRL identifiziert werden. Die, durch BL-Bestrahlung bedingte, 40-50%ige Inhibierungen ihrer Aktivitäten wurde durch RL- bzw. NIRL-Behandlung nahezu komplett wiederhergestellt. Zudem wurde erstmalig belegt, dass PBM, neben den Atmungskettenkomplexen der Mitochondrien in den IS, auch die Aktivität der funktionellen ektopischen Atmungskettenkomplexe in den OS gleichermaßen stimuliert. Als Konsequenz konnte, in Übereinstimmung mit früheren Studien, ein gesteigerter retinaler ATP-Gehalt nachgewiesen werden. Vermutlich sind die Mitochondrien mit ihren Atmungskettenkomplexen die Hauptakzeptoren der PBM. Der gesteigerte Energiemetabolismus bewirkt im Allgemeinen zelluläre Verbesserungen. Wahrscheinlich wird durch PBM der Kreislauf zwischen ROS-Bildung und Schädigung der Atmungskettenkomplexe unterbrochen. Die funktionelle Verbesserung der ektopischen Komplexe kann ebenso zu dem verringerten oxidativem Stress der PR beitragen. Neben der verbesserten Mitochondrienfunktion durch PBM, belegten die Bax-, Bcl-2- und Caspase-9-Proteinlevel eine reduzierte mitochondrieninduzierte Apoptose. Um molekularbiologisch regulatorische Vorgänge aufzuklären, die den veränderten zellulären Phänotyp bewirken, erfolgte eine umfassende Genexpressionsanalyse an isolierten PR, sowie Validierung ausgewählter verändert exprimierter Gene mittels in-situ-Hybridisierung und immunohistochemischer Analyse der kodierten Proteine. Die Ergebnisse der Genregulation durch PBM identifizierten besonders die Gene cryaa und cryab, aus der Klasse der α-Crystalline, die nach RL- und NIRL-Behandlung überexprimiert vorlagen. Als Negativregulatoren der mitochondrieninduzierten Apoptose und der ROS-Produktion können cryaa und cryab eine Reduktion des oxidativen Zellstresses in PR initiieren. Insgesamt demonstriert die vorliegende Arbeit die neuroprotektive Wirkungsweise von PBM auf BL-geschädigte PR. Sie zeigt einen PBM-Wirkmechanismus, der auf Atmungskettenkomplexe und die Genregulation von cryaa und cryab abzielt. Dies führt sekundär zu zellulären Effekten mit reduziertem oxidativen Zellstress. Diese grundlegenden Ergebnisse können helfen, PBM umfassend in klinische Anwendungen von Patienten mit PR-Schädigung zu transferieren.

Rhodopsin-Guanylylzyklasen (RhGC) sind einzigartige Photorezeptoren, die kürzlich in Pilzen der Abteilung Blastocladiomycota entdeckt wurden [1]. RhGCs gehören zu den Enzym-Rhodopsinen und die Licht-sensitive mikrobielle Rhodopsin Domäne ist kovalent mit einer Typ III Guanylylzyklase verbunden. Guanylylzyklasen bilden den sekundären Botenstoff cGMP, der zusammen mit cAMP eine Vielzahl biologischer Prozesse reguliert [2–12]. In der vorliegenden Arbeit wurden die fünf neu-entdeckten RhGCs mithilfe unterschiedlicher biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert. Elektrophysiologische Messungen erbrachten einen indirekten Nachweis für eine Grünlicht-aktivierte cGMP Synthese bei den RhGCs aus Blastocladiella emersonii (Be) und Catenaria anguillulae (Ca). Die Licht-aktivierte Guanylylzyklasen Funktion dieser RhGCs konnte durch ELISA Experimente und nach Aufreinigung der Photorezeptoren bestätigt werden. Belichtung führte zu einer 100-fachen oder 200-fachen Erhöhung von cGMP mit einem vmax von 1.8 oder 11.6 µmol/min/mg(Protein) bei BeRhGC oder CaRhGC. Im Dunkeln verblieb bei beiden Photorezeptoren die cGMP-Konzentration auf dem Niveau von Kontrollzellen. Durch eine enzymkinetische Analyse der isolierten Guanylylzyklase Domänen (Be/CaGC) konnte die konstitutive Aktivität der enzymatischen Einheit gezeigt werden, die im Vergleich zu den Volllängen Photorezeptoren 3-6x reduziert war. Weiterhin wurden die Photozyklen der isolierten Rhodopsin Domänen mithilfe spektroskopischer Methoden untersucht und Photointermediate identifiziert, die typisch für mikrobielle Rhodopsine sind. Die M-Intermediate zerfielen langsam mit τ ~ 100 ms bei BeRh und τ ~ 500 ms bei CaRh. Um die kinetischen und spektroskopischen Parameter der Photorezeptoren zu verändern, wurden die Be/Ca Rhodopsin Domänen mutiert. Zusätzlich wurde die Substratspezifität der RhGCs geändert und eine Doppelmutation (E497K/C566D) in der katalytischen Domäne erzeugte Rhodopsin-Adenylylzyklasen (RhACs). Die Licht-induzierte cAMP Synthese der RhACs wurde in Xenopus Oocyten getestet und im Vergleich zu BeRhAC zeigte CaRhAC eine erhöhte Licht-zu-Dunkel-Aktivität (6x) einhergehend mit einer verringerten Dunkelaktivität (5.5x). Um weitere Einblicke in die kürzlich entdeckten RhGCs zu erhalten, wurden die isolierten Zyklase Domänen, Be/CaGC und CaAC, in Gegenwart von NTP Analoga kristallisiert. Neben hochauflösenden monomeren GC Strukturen ohne Ligand wurde eine 2.25 Å Struktur der mutierten Zyklase, CaAC, mit dem ATP Analogon ATPαS gelöst. Die CaAC Struktur zeigt ein antiparalleles Arrangement der Dimer-Untereinheiten und die Bindung der Nukleotidbase durch die zuvor mutierten Reste. Aufgrund der Ähnlichkeit zu anderen Typ III Zyklasen kann auf einen klassischen Reaktionsablauf bei RhGCs rückgeschlossen werden. Abschließend wurde die Anwendbarkeit von Ca/BeRhGC sowie CaRhAC in hippokampalen Rattenneuronen und CHO Zellen getestet. Diese Experimente zeigen, dass sowohl RhGCs als auch YFP-CaRhAC als optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die Zellbotenstoffe cGMP bzw. cAMP präzise mit Licht zu regulieren. / Rhodopsin-guanylyl cyclases (RhGC) are unique photoreceptors recently discovered in Blastocladiomycota fungi [1]. In RhGCs the light-sensitive microbial rhodopsin domain is covalently linked to a type III guanylyl cyclase. Guanylyl cyclases form the second messenger cGMP, which together with cAMP regulates a variety of biological processes [2–12]. Due to their architecture, RhGCs are classified as microbial enzyme rhodopsins. In the present work, the five newly discovered RhGCs were characterized using different biochemical and biophysical methods. Electrophysiological measurements provided indirect evidence for green light-activated cGMP synthesis of the RhGCs from Blastocladiella emersonii (Be) and Catenaria anguillulae (Ca). The light-activated guanylyl cyclase function could be confirmed by ELISA experiments and after purification of these photoreceptors. Green illumination led to a 100-fold or 200-fold increase in cGMP with a vmax of 1.8 or 11.6 µmol/min/mg(protein) for BeRhGC or CaRhGC. In the dark the cGMP concentration remained at the level of control cells for both photoreceptors. A kinetic analysis of the isolated guanylyl cyclase domains (Be/CaGC) revealed the constitutive activity of the enzymatic domain, which was 3-6x reduced compared to the full-length photoreceptors. A spectroscopic characterization of the Be/Ca rhodopsin domains allowed the identification of photocycle intermediates, which are typical for microbial rhodopsins. The M-intermediates decayed slowly with a τ ~ 100 ms for BeRh and τ ~ 500 ms for CaRh. The Be/Ca rhodopsin domains were mutated to change the kinetic and spectroscopic parameters of the photoreceptors. In addition, the substrate specificity of the RhGCs was switched to ATP by a double mutation (E497K/C566D) in the catalytic domain. The light-induced cAMP synthesis of the generated rhodopsin-adenylyl cyclases (Be/CaRhACs) was shown in Xenopus oocytes and after purification of the proteins. Compared to BeRhAC, CaRhAC showed an increased light-to-dark activity (6x) and a decreased activity in darkness (5.5x). To get further insight into the recently discovered RhGCs, the isolated cyclase domains, Be/CaGC and CaAC, were crystallized in the presence of NTP analogues. High-resolution monomeric GC structures without a bound ligand were produced. Additionally, a 2.25 Å structure of the mutated cyclase, CaAC, with the ATP analogue ATPαS was solved. The CaAC structure shows an antiparallel arrangement of the dimer subunits and the nucleotide base is bound by the previously mutated residues. Due to the similarity to other type III cyclases, a classical reaction sequence for RhGCs can be deduced. Finally, the applicability of Ca/BeRhGC and CaRhAC was tested in hippocampal rat neurons and CHO cells. These application-oriented approaches show that both RhGCs and YFP-CaRhAC can be used as optogenetic tools to precisely control cGMP and cAMP with light.

Photoreceptors are highly specialized neurons within the eye and the key retinal cells sensing light. They are indispensable for our visual perception and loss of photoreceptors consequently leads to loss of vision, a sense that alone is responsible for more than 30% of the input to our brain. Vision impairment and blindness is a leading cause of disability in the industrialized world and is in many cases ultimately due to a degeneration of the photoreceptors, which cannot be halted or reversed. Retinal degenerative diseases encompass a heterogeneous group of etiologies, mainly caused by various mutations in a plethora of proteins involved in the visual process. Currently, several therapeutic options are being explored, with so far one gene therapy for a rare inherited blinding condition being clinically approved. However, the gene therapy approach requires not only the presence of remaining photoreceptors but the tailoring of the therapy to each individual mutation. An alternative, more generally applicable approach is to restore vision through photoreceptor replacement therapy. As such, research on mouse-to-mouse photoreceptor transplantations has been carried out for many years, though with mixed results. In the last decade, it has however also become possible to generate large quantities of human photoreceptors through retinal organoid technology, allowing to instead transplant human cells. While promising, this field is still in development and principal conditions for successful photoreceptor transplantation have yet to be defined. Here, human-to-mouse photoreceptor transplantations were performed and assessed with the aim to receive insights into retinal cell replacement technology with specific focus on photoreceptor maturation, polarization and functional integration. Using a cone-degeneration host line, large-scale incorporation of human photoreceptor grafts into the murine retina was shown for the first time. It was found that for human photoreceptors, the choice of developmental stage strongly affects incorporation and maturation capacity. Furthermore, the results demonstrate the necessity of adequate graft-host interaction for successful transplant maturation and function, suggesting that photoreceptor replacement strategies might benefit from transplantation in earlier rather than late stages of retinal degeneration. Taken together, this thesis lays important groundwork for the further development of human photoreceptor replacement strategies to treat retinal degenerative disease.:ACKNOWLEDGEMENTS I ABSTRACT III ZUSAMMENFASSUNG V PUBLICATIONS VII TABLE OF CONTENTS IX LIST OF FIGURES XIII LIST OF TABLES XIV GENERAL ABBREVIATIONS XV GENE AND PROTEIN ABBREVIATIONS XVII 1 INTRODUCTION 1 1.1 THE RETINA AND LIGHT PERCEPTION 1 1.1.1 General structure of the eye 1 1.1.2 General structure of the retina 1 1.1.3 General photoreceptor structure 3 1.1.4 Phototransduction 4 1.1.5 Signal transmission to the brain 6 1.1.6 Major differences between rods and cones 7 1.1.7 The role of Müller glia in photoreceptor support and light perception 9 1.2 RETINAL DEGENERATION DISEASES AND TREATMENT OPTIONS 11 1.2.1 Retinal degeneration diseases 11 1.2.2 Therapeutic approaches to treat retinal degeneration diseases 12 1.3 CELL REPLACEMENT AS TREATMENT APPROACH FOR RETINOPATHIES 14 1.3.1 Transplantations of rodent retinal tissue and cells 14 1.3.2 Transplantations of human retinal tissue and cells 17 1.4 AIM OF THIS THESIS 22 2 CHARACTERIZATION OF CRX-MCHERRY HUMAN RETINAL ORGANOIDS AS PHOTORECEPTOR CELL SOURCE 23 2.1 AIMS 23 2.2 CHARACTERIZATION OF CRX-MCHERRY REPORTER-EXPRESSING CELLS 23 2.2.1 Crx-mCherry expression overlaps with endogenous CRX expression and increases over time 23 2.2.2 Crx-mCherry organoids contain an outer and an inner nuclear layer 24 2.2.3 Crx-mCherry+ cells express early and mature rod and cone markers 25 2.2.4 Crx-mCherry+ cells do not express proliferation markers 27 2.3 ENRICHMENT AND CHARACTERIZATION OF CRX-MCHERRY+ DONOR CELLS 28 2.3.1 Enrichment of Crx-mCherry+ cells by FACS 28 2.3.2 Characterization of Crx-mCherry enriched cells by single cell sequencing 29 2.3.3 Characterization of D200 Crx-mCherry-enriched cells by immunocytochemistry 30 2.4 SUMMARY 31 3 TRANSPLANTATION OF HUMAN CRX-MCHERRY+ GRAFTS AGED D100, D200 AND D300 INTO CPFL1 MICE 33 3.1 AIMS 33 3.2 CRX-MCHERRY+ CELLS OF ALL AGES CAN BE TRANSPLANTED AND SURVIVE IN THE MURINE RETINA 33 3.2.1 Human grafts can be identified by RCVRN staining 34 3.2.2 D100 Crx-mCherry+ transplants are larger than D200 and D300 grafts 34 3.2.3 Graft volume increase over time is not due to in vivo proliferation 36 3.3 GRAFT MORPHOLOGY DIFFERS WITH DONOR AGES 37 3.3.1 Human grafts can adopt an intraretinal position 37 3.3.2 Graft positioning changes over time 37 3.3.3 Qualitative differences in graft morphology between donor ages 38 3.4 GRAFT MATURATION 41 3.4.1 D200 but not D100 or D300 grafts develop large quantities of inner segments 41 3.4.2 Inner segment development is associated with close proximity to the host retina 42 3.5 HUMAN IDENTITY OF INTRARETINAL GRAFTS 43 3.5.1 Intraretinal Crx-mCherry+ grafts are largely a result of true morphological incorporation 43 3.5.2 Rare indications of potential human-to-mouse material transfer 45 3.6 SUMMARY 47 4 IN DEPTH CHARACTERIZATION OF TRANSPLANTED D200 CRX-MCHERRY+ CELLS 49 4.1 AIMS 49 4.2 EARLY POST TRANSPLANTATION DYNAMICS IN GRAFT POSITIONING AND GRAFT-HOST INTERACTIONS 49 4.2.1 Intraretinal and proximal D200 grafts interact with the host retina while isolated and distal clusters show only little interaction 49 4.2.2 Incorporation of D200 grafts is first evident at 8 weeks post transplantation 50 4.2.3 Host Müller glia extend processes into the graft before host bipolar cells 51 4.2.4 MG staining in D200 grafts originates from host MG 51 4.3 INCORPORATING D200 GRAFTS POLARIZE AND FORM STRUCTURES OF MATURE PHOTORECEPTORS 53 4.3.1 Grafts and host form an outer limiting membrane (OLM)-like structure 53 4.3.2 Inner segment formation occurs where an OLM is formed 54 4.3.3 Incorporating grafts form outer segment-like structures 55 4.3.4 Incorporating grafts form synaptic structures 57 4.3.5 Transplanted Crx-mCherry+ cells become enriched for cones 58 4.3.6 Higher levels of mature photoreceptor markers in ex vivo compared to in vitro cones 60 4.4 INCORPORATION AND MATURATION CAPACITY DEPEND ON THE HOST ENVIRONMENT 63 4.4.1 Graft morphology and maturation in C57BL/6JRj recipients resembles that in Cpfl1 hosts 63 4.4.2 Graft morphology and maturation in highly degenerated rd1 and tgCR host lines differs strongly from the outcome in models with an ONL 63 4.5 SUMMARY 67 5 FUNCTIONAL ASSESSMENT OF TRANSPLANTED CRX-MCHERRY+ CELLS 69 5.1 AIMS 69 5.2 HIGH-LEVEL FUNCTION 69 5.2.1 Light-Dark Box 69 5.3 TISSUE-LEVEL FUNCTION 71 5.3.1 Multi-electrode array assessment of D200+26w grafts in Cpfl1 mice 71 5.3.2 Isolation of cone-mediated RGC response through photopic light stimulation and L-AP4 addition 71 5.3.3 Graft-containing retinal portions exhibit cone-mediated light responses 72 5.4 SUMMARY 74 6 DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES 75 6.1 HUMAN GRAFTS CAN MORPHOLOGICALLY INCORPORATE INTO THE MODERATELY DEGENERATED MOUSE RETINA 75 6.2 INTRARETINAL GRAFTS MOSTLY REPRESENT TRUE INCORPORATION EVENTS, NOT MATERIAL TRANSFER 76 6.3 GRAFT MATURATION DEPENDS ON GRAFT-HOST INTERACTION 77 6.4 ESTABLISHMENT OF GRAFT-HOST INTERACTION AND GRAFT INCORPORATION 78 6.5 D200 CRX-MCHERRY+ CELLS ARE THE PREFERABLE DONOR POPULATION COMPARED TO D100 AND D300 80 6.6 CONES SHOW PREFERENTIAL SURVIVAL POST GRAFTING 81 6.7 FUNCTIONAL ANALYSES OF TRANSPLANTED ANIMALS 82 6.8 FUTURE CLINICAL TRANSLATION 85 6.9 MAJOR CONTRIBUTION TO OTHER WORK 88 7 FINAL CONCLUSION 89 8 MATERIALS AND METHODS 91 8.1 STUDY APPROVAL 91 8.2 MATERIALS 91 8.2.1 Materials and Chemicals 91 8.2.2 Cell Line 92 8.2.3 Mouse Lines 92 8.2.4 Antibodies 93 8.3 METHODS 95 8.3.1 Cell culture 95 8.3.2 Transplantations 96 8.3.3 Functional analyses 98 8.3.4 Immunohistochemistry and Immunocytochemistry 100 8.3.5 Imaging and image processing 103 8.3.6 Statistics 106 8.3.7 Single cell sequencing 107 8.3.8 Bioinformatic analysis 108 9 BIBLIOGRAPHY 111 10 APPENDIX 128 10.1 APPENDIX 1: ERKLÄRUNGEN ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 128 10.2 APPENDIX 2: BESTÄTIGUNG ÜBER EINHALTUNG DER AKTUELLEN GESETZLICHEN VORGABEN 129