Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-20T18:26:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 899599 bytes, checksum: 6cb5d0eb2fc69c24761a203f60e8006c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-20T18:26:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 899599 bytes, checksum: 6cb5d0eb2fc69c24761a203f60e8006c (MD5) Previous issue date: 2012-07-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Foram isoladas bactérias da rizosfera de plantas-escape ou apresentando baixa seve- ridade de doenças em cultivo de tomateiro convencional e orgânico, de floresta de eucalipto e de floresta nativa. Utilizando metodologias para o isolamento de actino- micetos e de rizobactérias totais e endosporogênicas foram obtidos um total de 635 isolados bacterianos, sendo 590 obtidos no presente trabalho e 45 selecionados em outros trabalhos. Sementes de tomate foram microbiolizadas com suspensão bacte- riana de cada um dos isolados. Vinte e nove isolados (4,56%) foram capazes de reduzir as doenças do tomateiro causadas por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) e Xanthomonas gardneri (Xg) em 50% ou mais e em 60% ou mais, respectiva- mente em substrato esterilizado. No ensaio realizado em substrato não esterilizado, as plantas tratadas com os antagonistas foram novamente desafiadas contra Xg e Fol e também foi testado se os isolados seriam eficientes no biocontrole do fungo Alternaria solani (As). No ensaio realizado em solo não esterilizado, os antagonista foram dispensados no tomateiro por microbiolização de sementes e encharcamento de solo cinco dias antes da inoculação com o patógeno desafiante. Alguns isolados não foram eficientes em promover o biocontrole da mancha-bacteriana e da murcha- de-fusário em solo não esterilizado. Quinze dos isolados selecionados contra Xg e Fol também foram eficientes no biocontrole da pinta-preta. Todos os 29 isolados foram capazes de colonizarar o sistema radicular das plântulas de tomateiro. Os três isolados que mais reduziram as severidades de Fol, Xg e As, em percentagem média, foram os isolados UFV252 (não identificado), UFV618 (Streptomyces setonii) e UFV592 (Bacillus cereus) em 47,91, 46,32 e 42,02%, respectivamente. Esses três isolados e o ácido jasmônico (AJ) foram testados contra Xg, Fol e As e na atividade de enzimas de defesa: β-1,3-glucanases (GLU), quitinases (QUI), peroxidases (POX), polifenoloxidases (PFO), lipoxigenases (LOX) e fenilalanina amônia-liases (FAL), além da concentração de aldeído malônico (MDA). Os isolados foram aplicados nas plantas por microbiolização de sementes e também por encharcamento de solo cinco dias antes da inoculação dos patógenos desafiantes e o AJ foi pulverizado nas plantas 48 horas antes da inoculação. Mesmo nas plantas não inoculadas, os tratamentos tiveram maior atividade de algumas enzimas em relação ao tratamento-controle não inoculado. Esses resultados sugerem que as rizobactérias podem estar induzindo resistência sistêmica no tomateiro, uma vez que mesmo na ausência do patógeno ocorreu aumento na atividade enzimática. No patossistema tomateiro-Xg as maiores atividades das enzimas de defesa nas plantas inoculadas com Xg em comparação ao controle que resultaram em menor severidade da mancha-bacteriana foram: QUI e LOX, para o tratamento UFV618; PPO, QUI e LOX, para os tratamentos UFV592 e UFV252; e GLU, QUI, POX, PPO e FAL, para o tratamento AJ. Para o patossistema tomateiro-Fol, as maiores atividades das enzimas de defesa nas plantas inoculadas com Fol em comparação ao controle, que resultaram em menor severidade da murcha-de-fusário foram as enzimas QUI e LOX, para os tratamentos UFV618; e UFV592, para o tratamento AJ. Além dessas enzimas houve aumento na atividade da POX e PAL. No tratamento UFV252 houve aumento na atividade das enzimas PFO, FAL e QUI. Já no patossistema tomateiro-As foi observado que não houve aumento da atividade de nenhuma enzima para o tratamento UFV618, entre as plantas inocu- ladas com As e o tratamento-controle; também não ocorreu redução da severidade da pinta-preta. Entretanto, no tratamento UFV592 houve aumento na atividade das enzi- mas QUI e FAL e no tratamento UFV252 ocorreu aumento na atividade da PFO e FAL. Além da PFO, QUI e FAL houve aumento na atividade LOX no tratamento AJ. A maior atividade dessas enzimas parece ter contribuído para a redução da severi- dade da pinta-preta pelos tratamentos UFV592, UFV252 e AJ. Em todos os patossis- temas em pelo menos uma época de coleta a concentração de MDA foi maior no tratamento-controle, inoculado em comparação com os tratamentos UFV618, UFV592, UFV252 e AJ, indicando maior dano nas membranas no tratamento- controle, o que corrobora com os maiores valores de severidade observados nesse tratamento. / Bacteria were isolated from the rhizosphere of plants escape or showing low disease severity in tomato cultivation of conventional and organic eucalyptus forest and native forest. Using methodologies for isolating actinomycetes, rhizobacterias, and endosporogenic bacterias. This gave a total of 635 bacterial isolates, 590 isolates were obtained in this study and 45 isolates were selected for further work. Tomato seeds were microbiolized with bacterial suspension of each isolate. Twenty-nine isolates (4.56%), were able to reduce the tomato diseases caused by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) and Xanthomonas gardneri (Xg) in 50% or more and 60% or more, respectively, in sterile substrates. In the assay accomplished in substrate unsterile, plants treated with the antagonists were again challenged against Xg and Fol and also tested whether these isolates would be effective in the biocontrol fungus Alternaria solani (As). In the test carried out in non-sterile soil, the antagonist were dispensed by microbiolization in tomato seeds and soil drenching, five days before inoculation with the pathogen challenging. Some isolates were effective in promoting the biocontrol of bacterial spot and fusarium wilt in unsterilized soil. Fifteen of selected isolates against Xg and Fol were also effective in biocontrol of early blight. All 29 isolates were able to colonizarar the root system of tomato seedlings. The three isolates that most reduced the severities of Fol, Xg, and As, average percentage, the isolates were UFV252 (unidentified), UFV618 (Streptomyces setonii) e UFV592 (Bacillus cereus) at 47.91, 46.32, and 42.02%, respectively. These three isolates and jasmonic acid (JA) were tested agains Xg, Fol, and As and activity of defense enzymes: β-1,3-glucanases (GLU), chitinases (CHI), peroxidases (POX), polyphenoloxidases (PPO), lipoxygenases (LOX), and phenylalanine ammonia lyase (PAL), in addition the concentration of malondialdehyde (MDA). The strains were applied in plants by seed microbiolization and also by soil drenching, five days before inoculation of challenging pathogens and the JA was sprayed on plants 48 h before inoculation. Even in non-inoculated plants treatments had higher activity of some enzymes in relation to the control uninoculated. These results suggest that rhizobacteria may be inducing systemic resistance in tomato, since even in the absence of the pathogen caused an increase in enzyme activity. In pathosystem tomato-Xg the highest activities of defense enzymes in plants inoculated with Xg compared to the control that resulted in lower bacterial spot severity were: CHI and LOX for the treatment UFV618; PPO, CHI, and LOX for the treatments UFV592 and UFV252, and GLU, CHI, POX, PPO e PAL for the treatment JA. In pathosystem tomato - Fol the highest activities of defense enzymes in plants inoculated with Fol compared to the control, that resulted in lower fusarium wilt severity were the enzymes CHI and LOX for the treatments UFV618 and UFV592, for the treatment JA beyond these enzymes increased in activity of POX and PAL. In UFV252 treatment increased the activity of enzymes PPO, PAL e CHI. Already in the pathosystem tomato- As was noted that there was no increase in the activity of the enzyme for the UFV618 treatment, between inoculated plants with As and control treatment, there was also no reduction in severity of early blight. However, the UFV592 treatment was no increase in enzyme activity CHI and FAL, and UFV252 treatment occurred increase in PPO activity and FAL. Besides the PPO, CHI, and PAL there was an increase in LOX activity in JA treatment. The increased activity of these enzymes appears to have contributed to reducing the severity of early blight by UFV592, AJ, and UFV252 treatments. In all pathosystems at least one collection time the concentration of MDA in control treatment was higher in comparison to UFV618, UFV592, AJ, and UFV252 inoculated treatments. Indicating greater damage membranes in control treatment which corroborates with the highest severity observed in these treatments. / Tese liberada do sigilo pelo Orientador em 06 de junho de 2017. Documento anexado ao Termo de Autorização.

A citricultura brasileira concentra-se principalmente no Estado de São Paulo que contribui com 80,4 % da produção nacional, sendo o Brasil um dos maiores produtores mundiais de citros. Um dos problemas enfrentados pela citricultura é a sua vulnerabilidade a pragas e doenças, devido principalmente a baixa diversidade genética nas variedades comerciais utilizadas, associada ao sistema de plantio em áreas extensas. Uma das doenças que vem causando crescentes prejuízos para a citricultura brasileira é a pinta preta ou mancha preta dos citros causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely. O uso de conhecimentos de biologia molecular e métodos biotecnológicos devem ser considerados como importante alternativa para a produção de plantas geneticamente modificadas expressando genes de resistência. Para se obter plantas de citros resistentes a doenças, se faz necessário identificar genes que estejam relacionados com os mecanismos de defesa da planta. Na tentativa de identificar estes genes, o objetivo geral deste trabalho foi a identificação de genes in silico no banco de dados do Projeto Millenium CitEST e a análise de expressão diferencial de genes envolvidos na defesa. Mais de 7600 sequencias foram identificadas nas buscas no CitEST com similaridade aos genes R e genes envolvidos na HR e defesa, MAPKs e SNF1. Destes, foram selecionados 273 sequencias para experimentos de macroarranjo para análise da interação Citrus sinensis-Guignardia citricarpa. A análise estatística revelou que 171 genes (62,63%) apresentaram expressão diferencial significativa ao nível de 5% de probabilidade. Destes, 80 apresentaram expressão diferencial significativa maior do que duas vezes, dos quais 38 genes foram induzidos e 42 foram reprimidos no tecido infectado. Entre os genes induzidos estão MAPKs, genes de resistência (R), genes envolvidos na resposta de hipersensibilidade (HR) e na defesa da planta. Entre os transcritos reprimidos, há quatro similares a peroxidases e cinco similares a catalases, o que era esperado já que catalases e algumas peroxidases são capazes de remover H2O2, e assim a planta produz espécies reativa de oxigênio capaz de desencadear a ativação de genes de defesa. Os dados do macroarranjo foram validados via transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-PCRq) de 9 genes. As análises confirmaram a expressão diferencial de 8 deles sendo que somente um apresentou resultado contrastante ao macroarranjo, o que demonstra a eficiência da metodologia de macroarranjos para estudo de muitos genes simultaneamente. Os genes diferencialmente expressos identificados na interação C. sinensis-G. citricarpa são de grande importância, pois são fortes candidatos para serem utilizados na transformação genética de plantas com o objetivo de obter novas variedades de plantas com resistência a patógenos. / The Brazilian citrus industry is concentrated mainly in the State of Sao Paulo which contributes with 80.4% of national production, with Brazil being a leading world producer of citrus. One of the problems facing the citrus industry is its vulnerability to pests and diseases, mainly due to low genetic diversity of the commercial varieties used, linked to the system of planting in extensive areas. A disease that is causing increasing damage to the brazilian citrus industry is the black spot of citrus caused by the fungus Guignardia citricarpa Kiely. The use of knowledge of molecular biology and biotechnological methods should be considered as an important alternative for the production of genetically modified plants expressing genes for resistance. In order to obtain citrus plants resistant to diseases it is necessary to identify genes that are related to the defense mechanisms of the plant. In an attempt to identify these genes, the general aim of this study was to identify genes in silico in the database of the Millennium CitEST Project and to perform differential expression analysis of genes involved in the defense mechanisms. More than 7600 reads were identified in the CitEST search with similarity to R genes, genes involved in HR and defense, MAPKs and SNF1. It was selected 273 reads for macroarray experiments to analysis of Citrus sinensis-Guignardia citricarpa interaction. Statistical analysis revealed that 171 genes (62.63%) showed significant differential expression at the level of 5% probability. From these, 80 showed significant differential expression higher than two fold, in which 38 genes were induced and 42 were repressed in infected tissue. Among the induced genes are MAPKs, resistance (R) genes, genes involved in hypersensitivity response (HR) and plant defense. Among the suppressed transcripts, there are four similar to peroxidases and five similar to catalases, which is expected because catalases and some peroxidases are able to remove H2O2, and so the plant produces reactive oxygen species capable of triggering the activation of defense genes. The macroarray data were validated by reverse transcription followed by quantitative real-time PCR (RT-PCRq) of 9 genes. The analysis confirmed the differential expression of 8 of them, and only one presented different result of macroarray which demonstrate the efficiency of the macroarray methodology to analyze several genes simultaneously. The genes differentially expressed in the interaction of C. sinensis x Guignardia citricarpa identified are of great importance because they are strong candidates for use in genetic transformation of plants with the objective of obtaining new varieties of plants resistant to pathogens.

A mancha preta dos citros (MPC), causada por Phyllosticta citricarpa, é uma doença de importância econômica devido à redução na produtividade ocasionada pela queda prematura dos frutos e ao aumento dos custos da produção devido ao uso intensivo de fungicidas. As lesões restringem-se praticamente ao flavedo dos frutos, depreciando-os para a comercialização e restringindo a exportação de frutas in natura. A MPC causa danos em todas as espécies cítricas de valor comercial, com exceção da Citrus aurantium (laranja azeda) e do Citrus latifólia (lima ácida Tahiti). Phyllosticta citricarpa causa infecções latentes e diferentes tipos de sintomas nos frutos. Essas características podem estar relacionadas com o estádio fenológico do fruto no momento da infecção. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a influência da idade dos frutos de laranja doce na germinação dos conídios e no período de incubação de P. citricarpa e identificar compostos fenólicos pré ou pós-formados no flavedo de frutos de laranja doce inoculados com P. citricarpa. Frutos de laranjeira das variedades Hamlin, Valência e Pêra com 1,5, 3,0, 5,0 e 7,0 cm de diâmetros foram inoculados com suspensão de conídios de P. citricarpa na concentração de 103 e 105 conídios.mL-1 e avaliados mensalmente. O primeiro sintoma observado foi o da falsa melanose e não foram observadas diferenças no período de incubação entre as variedades. O período de incubação da falsa melanose foi afetado pela concentração de inóculo e pelo diâmetro dos frutos. Frutos de 1,5 e 3,0 cm de diâmetro inoculados com suspensão de conídios de P. citricarpa, na concentração de 103 conídios.mL-1, apresentaram sintomas entre 70 e 116 dias respectivamente, enquanto que os frutos de 1,5, 3,0 e 5,0 cm de diâmetro, inoculados com suspensão de 105 conídios.mL-1, expressaram sintomas entre 40, 65 e 156 dias respectivamente. A expressão dos sintomas de mancha dura não diferiu entre as concentrações de inóculo, mas diferiu entre os diâmetros e entre as variedades avaliadas. A variedade Valência apresentou os menores tempos para o aparecimento dos sintomas quando comparado com as variedades Hamlin e Pêra. Os tempos médios para a expressão da mancha dura nos frutos (todas as variedades) inoculados com 1,5, 3,0, 5,0 e 7,0 cm de diâmetro foram 240, 217, 176 e 197 dias respectivamente. Sintomas de falsa melanose e mancha dura se expressaram independente um do outro. Não foi observado diferenças nas quantidades dos compostos fenólicos entre os frutos inoculados e não inoculados após 48 h de câmara úmida. As maiores quantidades de compostos fenólicos foram encontradas nos frutos menores e à medida que estes aumentaram de tamanho, observou-se a diminuição nas quantidades destes compostos. Não foram observadas diferenças no padrão de germinação do fungo em relação aos diferentes diâmetros inoculados, porém foram observadas placas de cera na superfície dos frutos de 7,0 cm de diâmetro. Os sintomas de falsa melanose parecem estar relacionados com a defesa da planta, e os sintomas de mancha dura estão relacionados com o estádio fenológico dos frutos. / Citrus black spot (CBS), caused by Phyllosticta citricarpa, is a disease of economic importance due to the reduction in yield, caused by premature fruit drop, and high production costs, due to the intensive fungicide spraying. The lesions are restricted to the fruit flavedo, decreasing market prices and restricting exports of fresh fruits. CBS causes damage in all commercial citrus species with exception of Citrus aurantium (sour orange) and Citrus latifolia (Tahiti acid lime). Phyllosticta citricarpa causes latent infections and different types of symptoms on fruit. These characteristics may be related to the phenological stage of the fruit at the time of infection. The objectives of this study were to evaluate the influence of fruit age of sweet orange on conidia germination and on the incubation period of P. citricarpa and identify phenolics pre or post-formed in the flavedo of sweet orange inoculated with P. citricarpa. Orange fruits of varieties Hamlin, Valencia and Pera with 1.5, 3.0, 5.0 and 7.0 cm of diameters were inoculated with a conidia suspension of P. citricarpa at the concentration of 103 and 105 conidia.mL-1 and were evaluated monthly. The first symptom observed was false melanose and no differences were found in the incubation period among the varieties. The incubation period of false melanose was affected by the inoculum concentration and fruit diameters. Fruits with 1.5 and 3.0 cm of diameter inoculated with a conidia suspension of P. citricarpa, at a concentration of 103 conidia.mL-1, showed symptoms between 70 and 116 days, respectively. On the other hand, fruits with 1.5, 3.0 and 5.0 cm in diameter, inoculated with suspension of 105 conidia.mL-1, expressed symptoms between 40, 65 and 156 days, respectively. The period for symptom expression of hard spot did not differ between inoculum concentrations. The incubation period differed between the diameters and varieties evaluated. The Valencia variety presented symptoms in a shorter time than Hamlin and Pera. The average times for hard spot expression in fruits (all varieties together) inoculated with 1.5, 3.0, 5.0 and 7.0 cm of diameter were 240, 217, 176 and 197 days, respectively. Symptoms of false melanose and hard spot were expressed independently from each other. No differences were observed in the amounts of phenolic compounds between inoculated and non-inoculated fruits after 48 h of incubation in a humid chamber. The highest amounts of phenolic compounds were found in smaller fruits and, as fruits increased size, there was a decrease in the amounts of these compounds. No differences were found in the germination pattern of fungus on the inoculated fruits, but wax plates were observed on the surface of fruits with 7.0 cm in diameter. Symptoms of false melanose seem to be related to the plant defense mechanism, and symptoms of hard spot appeared to be related with phenological stages of the fruits.

Alternaria dauci e A. solani são duas espécies de fungos fitopatogênicos reconhecidamente difíceis de esporular em meio de cultura. Isto dificulta as inoculações artificiais e, conseqüentemente, prejudica o processo de seleção de genótipos de cenoura e tomate resistentes às doenças causadas por estes fungos. Este trabalho teve o objetivo de verificar a influência de alguns fatores, aplicados na incubação, sobre o crescimento micelial e esporulação das duas espécies fúngicas. Diferentes meios de cultura (BDA, aveia e V8), temperatura (15, 20, 25, 30 e 35 °C), comprimentos de onda da luz usada na incubação (amarela, azul, branca, NUV, verde e vermelha), tipos de estresse aplicado à colônia (raspagem, UV, irradiação de microondas e temperatura de 100 °C) e fotoperíodos (luz / escuro, respectivamente, de 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 e 0 h / 24 h) foram testados. Após a determinação dos melhores fatores, o método desenvolvido neste trabalho foi comparado ao método tradicionalmente utilizado (BDA, 25 °C, 12 h luz branca / 12 h escuro e raspagem da colônia), utilizando diversos isolados de ambas as espécies. Os resultados indicaram o meio V8-ágar e a temperatura de 25 °C como os mais favoráveis ao crescimento e esporulação. Os diferentes comprimentos de onda utilizados tiveram influência marcante na esporulação, sendo o NUV o mais estimulante. Todos os tipos de estresse aplicados induziram esporulação, porém, a raspagem das colônias proporcionou os melhores resultados. O fotoperíodo 12 h luz NUV / 12 h escuro foi o que mais estimulou a esporulação. Observou-se que, de modo geral, períodos de escuro maiores que os períodos de luz aplicados após o estresse da colônia, favoreceram a esporulação. Dessa forma, o processo desenvolvido neste trabalho consistiu de incubação em meio V8-ágar, temperatura de 25 °C, raspagem da colônia e fotoperíodo de 12 h luz NUV / 12 h escuro. Este procedimento mostrou-se nitidamente superior ao tradicionalmente utilizado para crescimento e esporulação de ambas as espécies. / Alternaria dauci e Alternaria solani are two phytopathogenic fungus species known for difficult sporulation in culture media. This hampers artificial inoculations and, consequently, affects the selection process of carrot and tomato genotypes resistant to the diseases caused by these fungi. This study had the objective of verifying the influence of some factors applied during incubation on mycelia growth and sporulation of the two fungus species. Different culture media (BDA, oat and V8), temperature (15, 20, 25, 30 and 35 °C), light wavelengths during incubation (yellow, blue, white, NUV, green, and red), stress types applied to the colony (scratching, UV, microwave irradiation, and temperature of 100 °C) and photoperiods (light / dark, respectively, of 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 h and 0 h / 24 h) were tested. Upon determination of the best factors, the method developed in this study was compared to the traditional procedure (BDA, 25 °C, 12 h white / 12 h dark light and scratching of the colony), with different isolates of both species. Results indicated the V8-agar media and a temperature of 25 °C as most favorable for growth and sporulation. The different wavelengths had a marked influence on sporulation and NUV was the most stimulating. All applied stress types induced sporulation, but best results were obtained with scratching of the colonies. The 12 h light / 12 h dark photoperiod stimulated sporulation most. In general, longer dark than light periods after the stress of the colony favored sporulation. The procedure developed in this study consisted of incubation in V8-agar media, a temperature of 25 °C, scratching of the colony and a 12 h light / 12 h dark photoperiod. This process is clearly superior to the traditional method for growth and sporulation of both species.

Abstract Water resources management calls for methods to simultaneously manage groundwater (GW) and surface water (SW) systems. These have traditionally been considered separate units of the hydrological cycle, which has led to oversimplification of exchange processes at the GW-SW interface. This thesis studied GW hydrology and the previously unrecognised connection of the Rokua esker aquifer with lakes and streams in the area, with the aim of identifying reasons for lake water level variability and eutrophication in the Rokua esker. GW-SW interactions in the aquifer were first studied with field methods. Seepage meter measurements showed substantial spatial variability in GW-lake interaction, whereas transient variability was more modest, although present and related to the surrounding aquifer. Environmental tracers suggested that water exchange occurs in all lakes in the area, but is of varying magnitude in different lakes. Finally, GW-SW interaction was studied in peatland catchments, where drainage channels in the peat soil presumably increased groundwater outflow from the aquifer. Amount and rate of GW recharge were then estimated with a simulation approach developed explicitly to account for the physical characteristics of the Rokua esker aquifer. This produced a spatially and temporally distributed recharge estimate, which was validated by independent field techniques. The results highlighted the impact of canopy characteristics, and thereby forestry management, on GW recharge. The data collected and the new understanding of site hydrology obtained were refined into a fully integrated surface-subsurface flow model of the Rokua aquifer. Simulation results compared favourably to field observations of GW, lake levels and stream discharge. A major finding was of good agreement between simulated and observed GW inflow to lakes in terms of discharge locations and total influx. This thesis demonstrates the importance of using multiple methods to gain a comprehensive understanding of esker aquifer hydrology with interconnected lakes and streams. Importantly, site-specific information on the reasons for water table variability and the trophic status of Rokua lakes, which is causing local concern, is provided. As the main outcome, various field and modelling methods were tested, refined and shown to be suitable for integrated GW and SW resource management in esker aquifers. / Tiivistelmä Vesivarojen hallinnassa tarvitaan menetelmiä pohja- ja pintaveden kokonaisvaltaiseen huomioimiseen. Pohja- ja pintavesiä tarkastellaan usein erillisinä osina hydrologista kiertoa, mikä on johtanut niiden välisten virtausprosessien yksinkertaistamiseen. Tässä työssä selvitettiin Rokuan pohjavesiesiintymän hydrologiaa ja hydraulista yhteyttä alueella oleviin järviin ja puroihin. Tutkimuksessa pyrittiin osaltaan selvittämään syitä harjualueen järvien pinnanvaihteluun ja veden laatuongelmiin. Kenttätutkimuksissa todettiin voimakasta alueellista vaihtelua järven ja pohjaveden vuorovaikutuksessa. Pohjaveden suotautumisen ajallinen vaihtelu puolestaan oli vähäisempää, mutta havaittavissa, ja kytköksissä järveä ympäröivän pohjavesipinnan vaihteluihin. Merkkiaineet vesinäytteistä viittasivat vastaavan vuorovaikutuksen olevan läsnä myös muissa alueen järvissä, mutta suotautuvan pohjaveden määrän vaihtelevan järvittäin. Turvemailla tehdyt mittaukset osoittivat pohjaveden purkautuvan ojaverkostoon ja ojituksen mahdollisesti lisäävän ulosvirtaamaa pohjavesiesiintymästä. Pohjaveden muodostumismäärää ja -nopeutta tutkittiin numeerisella mallinnuksella, joka kehitettiin huomioimaan harjualueelle ominaiset fysikaaliset tekijät. Mallinnus tuotti arvion ajallisesti ja alueellisesti vaihtelevasta pohjaveden muodostumisesta, joka varmennettiin kenttämittauksilla. Tuloksissa korostui kasvillisuuden, ja sitä kautta metsähakkuiden, vaikutus pohjaveden muodostumismääriin. Hydrologiasta kerätyn aineiston ja kehittyneen prosessiymmärryksen avulla Rokuan harjualueesta muodostettiin täysin integroitu numeerinen pohjavesi-pintavesi virtausmalli. Mallinnustulokset vastasivat mittauksia pohjaveden ja järvien pinnantasoista sekä purovirtaamista. Työn merkittävin tulos oli, että mallinnetut pohjaveden purkautumiskohdat ja purkautumismäärät alueen järviin vastasivat kenttähavaintoja. Tämä työ havainnollisti, että ymmärtääkseen pohjaveden ja siitä riippuvaisten järvien ja purojen vuorovaikutusta harjualueella on käytettävä monipuolisia tutkimusmenetelmiä. Työ toi lisätietoa Rokuan harjualueen vesiongelmien syihin selittäen järvien vedenpinnan vaihtelua ja vedenlaatua pohjavesihydrologialla. Väitöstyön tärkein anti oli erilaisten kenttä- ja mallinnus-menetelmien soveltaminen, kehittäminen ja hyödylliseksi havaitseminen harjualueiden kokonaisvaltaisessa pinta- ja pohjavesien hallinnassa.

Alternaria dauci e A. solani são duas espécies de fungos fitopatogênicos reconhecidamente difíceis de esporular em meio de cultura. Isto dificulta as inoculações artificiais e, conseqüentemente, prejudica o processo de seleção de genótipos de cenoura e tomate resistentes às doenças causadas por estes fungos. Este trabalho teve o objetivo de verificar a influência de alguns fatores, aplicados na incubação, sobre o crescimento micelial e esporulação das duas espécies fúngicas. Diferentes meios de cultura (BDA, aveia e V8), temperatura (15, 20, 25, 30 e 35 °C), comprimentos de onda da luz usada na incubação (amarela, azul, branca, NUV, verde e vermelha), tipos de estresse aplicado à colônia (raspagem, UV, irradiação de microondas e temperatura de 100 °C) e fotoperíodos (luz / escuro, respectivamente, de 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 e 0 h / 24 h) foram testados. Após a determinação dos melhores fatores, o método desenvolvido neste trabalho foi comparado ao método tradicionalmente utilizado (BDA, 25 °C, 12 h luz branca / 12 h escuro e raspagem da colônia), utilizando diversos isolados de ambas as espécies. Os resultados indicaram o meio V8-ágar e a temperatura de 25 °C como os mais favoráveis ao crescimento e esporulação. Os diferentes comprimentos de onda utilizados tiveram influência marcante na esporulação, sendo o NUV o mais estimulante. Todos os tipos de estresse aplicados induziram esporulação, porém, a raspagem das colônias proporcionou os melhores resultados. O fotoperíodo 12 h luz NUV / 12 h escuro foi o que mais estimulou a esporulação. Observou-se que, de modo geral, períodos de escuro maiores que os períodos de luz aplicados após o estresse da colônia, favoreceram a esporulação. Dessa forma, o processo desenvolvido neste trabalho consistiu de incubação em meio V8-ágar, temperatura de 25 °C, raspagem da colônia e fotoperíodo de 12 h luz NUV / 12 h escuro. Este procedimento mostrou-se nitidamente superior ao tradicionalmente utilizado para crescimento e esporulação de ambas as espécies. / Alternaria dauci e Alternaria solani are two phytopathogenic fungus species known for difficult sporulation in culture media. This hampers artificial inoculations and, consequently, affects the selection process of carrot and tomato genotypes resistant to the diseases caused by these fungi. This study had the objective of verifying the influence of some factors applied during incubation on mycelia growth and sporulation of the two fungus species. Different culture media (BDA, oat and V8), temperature (15, 20, 25, 30 and 35 °C), light wavelengths during incubation (yellow, blue, white, NUV, green, and red), stress types applied to the colony (scratching, UV, microwave irradiation, and temperature of 100 °C) and photoperiods (light / dark, respectively, of 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 h and 0 h / 24 h) were tested. Upon determination of the best factors, the method developed in this study was compared to the traditional procedure (BDA, 25 °C, 12 h white / 12 h dark light and scratching of the colony), with different isolates of both species. Results indicated the V8-agar media and a temperature of 25 °C as most favorable for growth and sporulation. The different wavelengths had a marked influence on sporulation and NUV was the most stimulating. All applied stress types induced sporulation, but best results were obtained with scratching of the colonies. The 12 h light / 12 h dark photoperiod stimulated sporulation most. In general, longer dark than light periods after the stress of the colony favored sporulation. The procedure developed in this study consisted of incubation in V8-agar media, a temperature of 25 °C, scratching of the colony and a 12 h light / 12 h dark photoperiod. This process is clearly superior to the traditional method for growth and sporulation of both species.

A pinta preta provocada pelo fungo Guignardia psidii Ullasa e Rawal (Phyllosticta psidiicola (Petrak) van der Aa) vem gerando perdas pós-colheita na produção de goiaba para consumo in natura. Este trabalho buscou maiores informações sobre esta doença por meio do estudo do efeito da temperatura, da duração do período de molhamento, do efeito dos gases dióxido de carbono e etileno, e da idade dos frutos de goiabeira na pré-penetração de conídios de G. psidii. Os estudos in vitro foram avaliados por meio de microscópio de luz e os in vivo por meio de microscópio eletrônico de varredura, registrando-se a porcentagem de conídios germinados, apressórios formados e apressórios melanizados (in vitro). O efeito da temperatura (10 a 40ºC) e da duração do período de molhamento (6 a 48 in vitro e 6 a 24 horas in vivo) na germinação, formação de apressórios e apressórios melanizados (in vitro) foram avaliados em superfície de poliestireno e de frutos de goiabeira. Em ambas as superfícies, à medida que a temperatura aumentou, observou-se o aumento gradual da germinação, formação de apressório e apressório melanizado atingindo o máximo a 25ºC e duração de período de molhamento de 24 horas in vivo e 48 horas in vitro. Nessas condições, os valores obtidos foram 38% de conídios germinados, 37,7% de apressórios formados e 32,7% de apressórios melanizados in vitro e 45,6% de conídios germinados e 11,2% de apressórios formados in vivo. As taxas de germinação e formação de apressório foram maiores no experimento in vivo. A germinação e formação de apressório de conídios de G. psidii foram avaliadas em cinco diferentes idades de frutos: 10 dias, 35 dias, 60 dias, 85 dias e 110 dias. Observou-se o aumento gradual das variáveis avaliadas com o aumento da idade do fruto, apresentando, em frutos com 10 dias, 8,4% de conídios germinados e 3,2% de apressórios formados, enquanto os frutos com 110 dias apresentaram 43,2% de conídios germinados e 26,4% de apressórios formados. O efeito das concentrações 0, 3, 6 e 12% de dióxido de carbono e 0, 1, 3 e 6 ppm de etileno na pré-penetração de conídios de G. psidii foram avaliadas in vitro e in vivo. No experimento in vitro, o aumento das concentrações de dióxido de carbono provocou queda na germinação dos conídios de G. psidii quando comparado ao controle. No entanto, entre as concentrações deste gás a taxa de germinação manteve-se estável. Portanto, no controle esta variável apresentou valor médio de 45,1% enquanto que nas concentrações 3, 6 e 12% do gás passou para, respectivamente, 24,6%, 22,6% e 25,8%. Entretanto, o aumento das concentrações deste gás provocou decréscimo progressivo da taxa de formação de apressórios e apressórios melanizados. Na concentração de 3% de dióxido de carbono houve 10,3% de apressórios formados e 5,4% de apressórios melanizados e na concentração de 12%, esses valores foram reduzidos para 4,1% e 0,5%, respectivamente. No entanto, no experimento in vivo, as taxas de germinação e formação de apressórios apresentaram redução gradativa entre as concentrações 3 e 6% de dióxido de carbono, elevando-se novamente a 12%, passando de 28,2% de conídios germinados e 20,5% de apressórios formados na concentração de 6% de dióxido de carbono para, respectivamente, 49,3% e 38,2% a 12% de concentração desse gás. Esse comportamento pode ser explicado devido à remoção dos conídios não germinados durante o preparo das amostras para visualização em microscópio eletrônico. O etileno, tanto nos experimento in vitro quanto in vivo não apresentou efeito sobre a germinação e formação de apressórios de G. psidii. Apresentando no controle in vitro 34,6% de conídios 9 germinados, 34,2% de apressórios formados e 29,9% de apressórios melanizados e na maior concentração de etileno estudada (6 ppm) 26,7% de conídios germinados, 26,3% de apressórios formados e 20,2% de apressórios melanizados. Nos ensaios in vivo, o controle apresentou 40% de conídios germinados e 32,7% de apressórios formados e na maior concentração de etileno estudada 49,3% de conídios germinados e 38,2% de apressórios formados. / The black spot caused by the fungus Guignardia psidii Ullasa and Rawal (Phyllosticta psidiicola (Petrak) van der Aa) has been causing post-harvest losses of guava fruit for consumption in natura. This work was designed to investigate the effects of temperature, wetness duration, carbon dioxide and ethylene concentration, and guava fruit age on the pre-penetration of G. psidii. The percentages of germinated conidia, formed appressoria and melanized appressoria were evaluated in both in vitro and in vivo experiments, using a light microscope in the former and a scanning electron microscope in the later. The effects of temperature (10 to 40ºC) and wetness duration (6 to 48 hours in vitro and 6 to 24 hours in vivo) on the germination, appressoria formation and melanized appressoria (in vitro) were evaluated on a polystyrene surface and on the fruit\'s surface. In both surfaces, as the temperature increased a gradual increase in conidia germination, appressoria formation and melanized appressoria was observed, reaching maximum at 25ºC with wetness duration being 24 hours in vivo and 48 hours in vitro. In these conditions, the values obtained were 38.0% germinated conidia, 37.7% formed appressoria and 32.7% melanized appressoria in vitro and 45.6% germinated conidia and 11.2% formed appressoria in vivo. Conidia germination and appressoria formation rates were higher in the in vivo experiment. G. psidii conidia germination and appressoria formation were evaluated at five different fruit ages: 10 days, 35 days, 60 days, 85 days and 110 days. A gradual increase of the evaluated variables was observed as the fruit\'s age increased, presenting in fruits with 10 days, 8.4% germinated conidia and 3.2% formed appressoria, while the fruits with 110 days presented 43.2% germinated conidia and 26.4% formed appressoria. The effects of carbon dioxide concentration at 0, 3, 6 and 12% and ethylene at 0, 1, 3 and 6 ppm on the pre-penetration of G. psidii were evaluated in vitro and in vivo. In the in vitro experiment an increase in the carbon dioxide concentration provoked a decrease in G. psidii conidia germination when compared to the control. However, between the gas concentrations tested, the germination rate was stable. Therefore, in the control this variable presented a mean value of 45.1% while in the gas concentration of 3, 6 and 12%, the mean values were, respectively, 24.6%, 22.6% and 25.8%. However, increasing carbon dioxide concentration caused a progressive decrease in appressoria formation and melanized appressoria rates. At a concentration of 3% carbon dioxide, there was 10.3% formed appressoria and 5.4% melanized appressoria and at 12% concentration these values were reduced to 4.1% and 0.5%, respectively. Nonetheless, in the in vivo experiment, the rates of germination and appressorium formation presented a gradual reduction between the 3 and 6% dioxide carbon concentrations, increasing again at 12%, increasing from 28.2% germinated conidia and 20.5% formed appressoria at 6% carbon dioxide concentration to, respectively, 49.3% and 38.2% at 12% concentration of this gas. This behavior could be due to the removal of the conidia that did not germinate, during the preparation of the sample for electron microscope observation. Ethylene, in both the in vitro and in the in vivo experiments, showed no effect on G. psidii germination and appressoria formation, presenting in the in vitro control, 34.6% germinated conidia, 34.2% formed appressoria and 29.9% melanized appressoria and in the highest ethylene concentration studied (6 ppm) 26.7% germinated conidia, 26.3% formed appressoria and 20.2% melanized appressoria. In the in vivo assays, the control presented 40.0% 11 germinated conidia and 32.7% formed appressoria and in the highest ethylene concentration studied 49.3% germinated conidia and 38.2% formed appressoria.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcia Vargas Toledo.pdf: 728769 bytes, checksum: 73f1b1501ca618c192074d64a04203ae (MD5) Previous issue date: 2009-06-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The tomato (Lycopersicon esculentum Mill) is the second most consumed vegetable in Brazil. The early blight disease, caused by the fungus Alternaria solani is one of the most important disease of this culture. The control is usually done with fungicides that can cause the production of fruits contaminated with pesticide. The use of homeopathy has been a practice for disease control, and an alternative to reduce these chemical drugs. The objective of this study was to evaluate the fungitoxic activity against A. solani, the disease control of early blight and the effect on plant growth of tomato.of homeopathic drugs Propolis, Isotherapic of A. solani and Isotherapic of ash in at dinamizations 6, 12, 30 and 60CH, and Sulphur, Silicea terra, Staphysagria, Phosphorus, Ferrum sulphuricum and Kali iodatum at dinamizations 6, 12, 30 and 100CH. In vitro assays was investigate the antimicrobial activity of the treatments on mycelial growth, sporulation and germination of spores of A. solani. The results indicated that Sulphur 100CH and Staphysagria 100CH reduced the mycelial growth compared with the control treatment wint distilled water and water-etanol solution. Propolis, 6, 30 and 60CH and Ferrum sulphuricum 6 and 30CH inhibited the sporulation, Isotherapic of A. solani in 6CH, Isotherapic of ash at 6CH, and Ferrum sulphuricum 6 and 30CH reduced the spores germination of A. solani. The data also indicated that the distilled water at 60 and 100CH reduced the mycelial growth. In the second phase, anassay was conducted in a greenhouse with Propolis, Sulphur and Ferrum sulphuricum. The work was carried out in pots, and at 19 days after transplanting of seedlings, the 6 ths. leaves were treated and 72 hours after the treatment, the 6ths. and 7ths. leaves were inoculated with A. solani. The severity were evaluated 7, 10, 14 and 16 days after inoculation and was calculated the area under the disease progress curve (AUDPC). Sulphur, 12 and 30 CH, Ferrum sulphuricum at 6, 12 and 30CH and Propolis in all dinamizations reduced the AUDPC of early blight. Sulphur 60CH and water-etanol solution 10% had systemic effect in the induction of resistance. Propolis at 30 and 60CH increased the amount of root, Ferrum sulphuricum 60CH and Sulphur in 30CH increased the root dry weight, while Propolis on 30 and 60CH, Ferrum sulphuricum in 6, 12, 30 and 60CH and Sulphur in all dinamizations increased the mass of the shoot. The results indicate that the homeopathic drugs tested have potential for control of early blight in the tomato, by direct actions on the pathogen and host. / O tomate (Lycopersicon esculentum Mill) é a segunda hortaliça mais consumida no Brasil. A doença pinta preta, causada pelo fungo Alternaria solani é uma das mais importantes. O tratamento normalmente é feito com fungicidas o que ocasiona a produção de frutos contaminados por resíduos de agrotóxicos. O uso da homeopatia tem sido uma prática relevante no controle de doenças, e uma alternativa para reduzir esses contaminantes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação dos medicamentos homeopáticos Propolis, Isoterapico de A. solani e Isoterapico de cinza, nas dinamizações 6, 12, 30 e 60CH, e Sulphur, Silicea terra, Staphysagria, Phosphorus, Ferrum sulphuricum e Kali iodatum nas dinamizações 6, 12, 30 e 100CH, na atividade fungitóxica sobre A. solani, no controle da doença pinta preta, e no crescimento das plantas de tomate. Foi realizado ensaio in vitro visando investigar a atividade antimicrobiana dos tratamentos no crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos de A. solani. Os resultados indicaram que Sulphur em 100CH e Staphysagria em 100CH reduziram o crescimento micelial comparando com os controles água destilada e solução hidroalcoólica. Na inibição da esporulação, Propolis em 6, 30 e 60CH e Ferrum sulphuricum em 6 e 30CH diferiram dos controles. Isoterapico de A. solani em 6CH, Isoterapico de cinza em 6CH e Ferrum sulphuricum em 6 e 30CH reduziram a germinação de esporos de A. solani. Os dados indicaram também que a água destilada, quando dinamizada em 60 e 100CH, reduziu o crescimento micelial. Na segunda fase, foi realizado ensaio em casa de vegetação com ambiente controlado com os medicamentos Propolis, Sulphur e Ferrum sulphuricum. O trabalho foi realizado em vasos e, aos 19 dias após o transplante das mudas, as 6ªs folhas foram tratadas e 72 horas após, as 6ªs e 7ªs folhas foram inoculadas com A. solani. Foram feitas avaliações da severidade com 7, 10, 14 e 16 dias após a inoculação e com os dados calculada a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD). Ao término foram avaliadas variáveis de crescimento. Sulphur em 12 e 30 CH, Ferrum sulphuricum em 6, 12 e 30CH e Propolis em todas as dinamizações reduziram a AACPD da pinta preta, Sulphur em 60CH e solução hidroalcóolica 10% apresentaram efeito sistêmico na indução de resistência. Propolis em 30 e 60CH incrementaram o volume de raiz, Ferrum sulphuricum em 60CH, Sulphur em 60CH e Propolis em 30CH incrementaram a massa seca da raiz, enquanto que Propolis em 30 e 60CH, Ferrum sulphuricum em 6, 12, 30 e 60CH e Sulphur em todas as dinamizações incrementaram a massa da parte aérea. Os resultados indicam que os medicamentos homeopáticos testados têm potencial para controle de pinta preta no tomateiro, por ação direta no patógeno e no hospedeiro.

Abstract Fluoroscopically guided procedures are currently an area of special concern in relation to radiation protection, as they may produce a high radiation dose to patients and increase the risk of skin injury. ERCP is a gastrointestinal procedure used as a gold standard in the treatment of pancreatobiliary disorders. It is performed under endoscopic and fluoroscopic guidance. Recently, both the number and the complexity with associated increased technical difficulty of therapeutic ERCP procedures have significantly increased. The present study aimed to assess the medical use of radiation in ERCP, with special emphasis on optimisation of radiation protection of patients. For this purpose, the level of patient radiation exposure during ERCP was evaluated by registering the radiation dose indices in Finnish hospitals. The entrance surface dose was measured by thermoluminescent dosimeters and the effective dose was estimated using conversion coefficients. For dose optimisation and for quality assurance, the local diagnostic reference levels (DRL) for ERCP were established and reviewed after five years. A single centre prospective analysis was conducted to identify patient-, procedure- and operator-related factors affecting dose area product (DAP) and fluoroscopy time (FT). The results showed a large variation of dose indices in overall, as among participating hospitals due to differences in patient characteristics, operator, equipment and procedural complexity. The risk of radiation-induced skin injury and the lifetime cancer risk seems to be reasonably low, indicating ERCP to be a low-dose study. Local DRL is an effective tool in the optimisation process, as a certain degree of dose reduction was achieved during the years. Multiple factors were found to affect DAP and FT in ERCP. The awareness of these factors may help to predict possible prolonged procedures that cause a higher radiation dose to the patient and thus facilitate the use of appropriate precautions. / Tiivistelmä Säteilysuojelun näkökulmasta läpivalaisuohjauksessa tehtävät toimenpiteet ovat erityisen huolen aiheena, koska ne voivat aiheuttaa potilaille suuria säteilyannoksia ja siten lisätä ihovaurion riskiä. ERCP on ruoansulatuskanavan endoskopiatoimenpide, jota käytetään haima- ja sappitiesairauksien hoidossa kultaisena standardina. ERCP suoritetaan duodenoskoopilla läpivalaisukontrollissa. Viime vuosina ERCP toimenpiteiden määrät ja toimenpiteiden monimutkaisuus ovat kasvaneet merkittävästi lisääntyneen teknisen haastavuuden vuoksi. Tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida säteilyn lääketieteellistä käyttöä ERCP:ssa, kiinnittäen eritystä huomiota potilaan säteilysuojelun optimointiin. Potilaan säteilyaltistuksen tasoa ERCP:ssa arvioitiin keräämällä potilasannoksia suomalaisista sairaaloista, pinta-annokset mitattiin termoloistedosimetreilla ja efektiivinen annos laskettiin muuntokertoimilla. Säteilyaltistuksen optimointi- ja laadunvalvonnan työkaluksi ERCP:lle asetettiin paikalliset vertailutasot ja ne tarkistettiin 5 vuoden kuluttua. Potilaaseen, toimenpiteeseen ja toimenpiteen suorittajaan liittyvät tekijät, jotka vaikuttavat annoksen ja pinta-alan tuloon (DAP) sekä läpivalaisuaikaan, selvitettiin retrospektiivisesti yhdessä sairaalassa. Tutkimuksen tulokset osoittivat, että potilaan säteilyannoksissa oli suurta vaihtelua niin yleisesti, kuin osallistuvien sairaaloiden välillä. Vaihtelu johtui potilaan ominaisuuksista, erilaisista läpivalaisulaitteista, toimenpiteen suorittajista ja ERCP toimenpiteiden vaikeusasteesta. Säteilyn aiheuttaman ihovaurion riski ja elinikäinen syöpäriski näyttäisi tulosten perusteella olevan kohtuullisen alhainen, mikä osoittaa, että ERCP on matala-annostutkimus. Paikallinen vertailutaso osoittautui tehokkaaksi optimointityökaluksi, sillä annostason lasku ERCP:ssa saavutettiin vuosien kuluessa. Useiden tekijöiden todettiin vaikuttavan DAP:n ja läpivalaisuaikaan ERCP:ssa. Näiden tekijöiden tiedostaminen voi auttaa tunnistamaan etukäteen ne haastavat ERCP toimenpiteet, jotka voivat aiheuttaa suuria säteilyannoksia potilaille, ja siten mahdollistaa niihin varautumisen.

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Modifications of the “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpafrom symptomatic tissues with validation of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues (328.62 ng µL -1 and 322.79 ng µL -1 , respectively), with low concentration of proteinsin the DNA solution. The extractor of DNA in amount (>300 ng µL -1 ) and quality (structural integrity) was sufficient to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA (event MON 810 standard ERM®-BF413b), with the amplification of the specific region of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and partial reproducibility among the limits acceptablein the methodology with coefficient of variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method for the diagnosis of the fungus G. citricarpaby PCR conventional and real time PCR was validated with the specific evaluation of the limitof detection. Conventional and real time PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR presented detecting limit of 10 ng µL -1 of the fungus DNA, with repeatability. Real time PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24 external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying between 232 and 232 x 10 2 DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples; being an excellent option for the diagnosis of thispathogen in asymptomatic orchards. / A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpae o tempo para o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpaem tecidos de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação dapureza química, integridade estrutural e ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados (328,62 ng µL -1 e 322,79 ng µL -1 , respectivamente), com baixa concentração de proteínas na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µL -1 ) e qualidade (integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento MON 810 padrão ERM®-BF413b), com a amplificação da região específica desse evento em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005, foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real com a avaliação da especificidadee do limite de detecção. Os métodos de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de 10 ng µL -1 de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade, na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, apresença do fungo foi detectada em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional. Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas, constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares assintomáticos.