Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2013-03-04T19:19:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 305017.pdf: 1234167 bytes, checksum: 2818a0c83b8dc9366e881cc4f0adaab6 (MD5) / A agregação plaquetária ocorre fisiologicamente para ocluir lesões em vasos ou em condições anormais como na disfunção endotelial ou na sepse. Diversos estímulos fisiológicos podem ativar as plaquetas tanto in vivo quanto in vitro. Alguns destes agentes agregantes são colágeno, ADP, 5-HT, trombina, TxA2 entre outros. O óxido nítrico, assim como a prostaglandina I2 (prostaciclina), atua como inibidor fisiológico da agregação plaquetária. O NO atua de diversas maneiras sobre a agregação plaquetária, desde a mobilização de cálcio até a inibição de receptores plaquetários. Um dos mecanismos de ação do NO na inibição da agregação plaquetária é através da ativação da enzima guanilato ciclase solúvel, e conseqüente formação do GMPc. O aumento de GMPc intracelular diminui as concentrações de cálcio intracelular, contribuindo para a inibição plaquetária. Neste estudo, foi avaliado se o NO apresentaria efeito inibitório na agregação plaquetária em ratos mesmo após a sua remoção e se esta inibição seria duradoura. A agregação plaquetária foi induzida por ADP ou colágeno em plasma rico em plaquetas de ratos, e como ferramentas farmacológicas para estudar o efeito do NO, foram usados o GTN (trinitrato de glicerila) e o GSNO (S-nitrosoglutationa), ambos doadores de NO. O inibidor da enzima guanilato ciclase solúvel ODQ foi utilizado para verificar a participação desta enzima na inibição da agregação plaquetária. O presente estudo mostrou que distintos doadores de NO causam perfis diferentes de inibição da agregação plaquetária e que este efeito agudo parece envolver ativação da guanilato ciclase. Outro achado importante e inédito foi que este efeito anti-agregante do NO é duradouro e que, talvez, possa ser explicado por S-nitrosilação de proteínas presentes em plaquetas. Por fim, um choque endotoxêmico induzido por endotoxina bacteriana (LPS) diminuiu o número de plaquetas circulantes e a agregação plaquetária. / Platelet aggregation occurs physiologically to occlude vessels lesions or abnormal conditions as endothelial dysfunction or sepsis. Several physiological stimuli can activate platelets in vivo and in vitro. Some of these aggregating agents are collagen, ADP, 5-HT, thrombin, TxA2 and others. Nitric oxide (NO) and prostaglandin I2 (prostacyclin) work as physiological platelet aggregation inhibitors. NO acts on platelet aggregation in several manners from mobilization of calcium to platelet receptors inhibition. One NO mechanism of action in inhibiting platelet aggregation is through the soluble guanylate cyclase enzyme activation and subsequent cGMP formation. Increased cGMP reduces intracellular calcium concentrations contributing to platelet inhibition. In this study, it was evaluated whether NO would present inhibitory effect in platelet aggregation even after its removal and whether that effect would last. Platelet aggregation was induced by ADP or collagen in platelet rich plasma from rats and as pharmacological tools to study the NO effect, we used the GTN (glyceryl trinitrate) and GSNO (S-nitrosoglutathione), both NO donors. The inhibitor of soluble guanylate cyclase enzyme (ODQ) was used to verify the involvement of this enzyme in the platelet aggregation inhibition. The present study showed that NO donors cause different profiles of platelet aggregation inhibition and this effect seems to involve acute activation of guanylate cyclase. Another important finding was that this unprecedented and anti-aggregating effect of NO is sustained and perhaps can be explained by S-nitrosylation of proteins present in platelets. Finally, the endotoxemic shock induced by bacterial endotoxin (LPS) decreased the number of circulating platelets and platelet aggregation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. / Made available in DSpace on 2012-10-22T00:06:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 204203.pdf: 259703 bytes, checksum: b99946da0b60552661630267cbaa1f75 (MD5) / Este trabalho avalia a ação de diferentes concentrações de PRP aplicadas em cultura celular da linhagem de osteoblasto humanos hFOB1.19 (American Tissue Culture Collection). A metodologia envolveu o teste proliferativo do ensaio do brometo de 3-[4,4-dimetiltiazol-2-4l]-2,5-difeniltetrazolio (MTT). O plasma rico em plaquetas (PRP) obtido foi processado e diluído em meio de cultura a 50%, 25%, 12,5% e 6,125%. As concentrações de soro fetal bovino (SFB) foram de 0% e 10% em meio de cultura. A proliferação foi lida por densidade óptica após um intervalo de tempo de 96 h em leitor de Elisa. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que 50% de PRP adicionado ao meio de cultura para osteoblastos humanos da linhagem hFOB1.19, induziu a melhor resposta proliferativa. As concentrações de 12,5% e 6,125% de PRP não mostraram diferença estatisticamente significativa. Verificou-se que a proliferação celular obtida pelo PRP a 50% foi mais significativa, em cultura com e sem SFB, comparada com as outras diluições realizadas. Conclui-se que o PRP promove proliferação de osteoblastos e indica que não é necessário soro para indução da proliferação de osteoblastos mediada pelo PRP, sugerindo o seu uso clinicamente para otimizar procedimentos de enxertia óssea na implantodontia.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. / Made available in DSpace on 2012-10-19T16:03:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:01:47Z : No. of bitstreams: 1 188702.pdf: 2472049 bytes, checksum: a7b577ad2fbf872ceb60b007507037c3 (MD5) / Pesquisa que objetiva analisar a formação de uma rede de fibrina do plasma rico em plaquetas (PRP) usando-se para a sua ativação apenas uma solução estéril de cloreto de cálcio a 10% e verificar se a temperatura constante de 37°C pode fornecer à técnica uma maior previsibilidade quanto ao tempo necessário para a coagulação. Os resultados mostraram que o tempo necessário para se promover a formação do coágulo variou aproximadamente de 2 a 10 min nos pacientes estudados após a mistura do (PRP) ao cloreto de cálcio a 10%, quanto se utiliza um aquecimento em banho-maria a 37°C. Concluiu-se que apesar de se obter um tempo maior para a formação da rede de fibrina com a mistura do cloreto de cálcio em relação à trombina, este tempo pode ser administrado pelo cirurgião.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T02:54:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 188845.pdf: 1608971 bytes, checksum: 13b2314a8641601163a13b498b027ac1 (MD5) / Este trabalho avalia a ação de três tipos de Plasma rico em plaquetas (PRP): o puro que se encontra dentro da bolsa do concentrado plaquetário; o ativado que corresponde ao puro misturado com cloreto de cálcio a 10%; e o geleificado que corresponde a mistura ativada incorporada de osso particulado após a espera do tempo de geleificação. Estes tipos de PRP foram aplicados sobre a proliferação de células "in vitro" de linhagem fibroblástica NIH/3T3. Para o desenvolvimento desta metodologia foi realizado a partir de uma garrafa de cultura de células o plaqueamento, sobre estas subculturas foi realizado o teste de citotoxicidade que estabeleceu a concentração de 10 ng, e por fim o teste de proliferação, nesta concentração, comparado com SFB a 2% e 5% foi significativo para o grupo do PRP ativado.

As anormalidades hemostáticas são comumente encontradas em pacientes com doença renal. Ambos, sangramento e estados pró-trombóticos, podem ser observados em pacientes com doença renal crônica (DRC). O principal papel das plaquetas é assegurar a hemostasia primária, a manutenção da integridade do vaso e cessar o sangramento após uma injúria. As plaquetas também estão envolvidas na trombose arterial aguda, na inflamação, na aterosclerose, e na angiogênese. Quando as plaquetas são ativadas elas se aderem à matrix endotelial onde ocorre a ativação e a liberação de agonistas secundários tais como o ATP, ADP, tromboxano A2, serotonina e outras substâncias biologicamente ativas. O ADP possui um papel crucial na ativação plaquetária, atuando em receptores P2. Está liberação pode ser responsável pela ativação, recrutamento e indução da agregação adicional de plaquetas no microambiente de lesão no vaso. Assim, o metabolismo do ADP no sangue é um importante mecanismo de regulação da função plaquetária. A NTPDase (ecto-CD39) hidrolisa o ATP e ADP extracelulares formando monofosfato de adenosina (AMP), que é subseqüentemente convertido para adenosina pela ação da enzima 5’- nucleotidase (CD73). O objetivo deste estudo foi explorar a relação entre a disfunção plaquetária na uremia com as anormalidades hemostáticas e a severidade na doença renal em pacientes com insuficiência renal crônica sob tratamento conservador ND (pacientes que não realizam hemodiálise) e HD (pacientes que realizam hemodiálise) comparando com indivíduos normais de mesma faixa etária. Os resultados demonstraram um aumento na atividade da NTPDase em plaquetas de pacientes HD (52,88%) com o substrato ATP. A hidrólise do ADP apresentou-se diminuída (33,68% e 39,75%) em HD e ND pacientes, respectivamente. Além disso, a atividade da 5’-nucleotidase mostrou-se elevada em HD (160%) e ND (81,49%) quando comparado com o grupo controle. Correlações significativas foram encontradas entre a hidrólise do ATP, ADP e AMP e os níveis plasmáticos de creatinina e uréia. Foram realizadas comparações entre o tempo de hemodiálise a que os pacientes estavam submetido e a alterações na hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Encontrou-se aumento na atividade da NTPDase com substrato ATP, diminuição com o substrato ADP e aumento da atividade da 5´-nucleotídase entre 49 e 72 meses em paciente HD. Os resultados sugeriram que as alterações na hidrólise dos nucleotídeos em plaquetas podem contribuir para anormalidades hemostáticas em pacientes com DRC, podendo realçar o risco de complicações tromboembólicas e aterosclerose acelerada em pacientes com DRC. Podemos inferir que tanto a uremia como a hemodiálise têm influência nas desordens hemostáticas apresentadas nesses pacientes, e descritas nesse trabalho. Os conhecimentos sobre estresse oxidativo e seu papel como importante cofator contribuindo para disfunção endotelial, inflamação, aterosclerose e glomeruloesclerose têm substancialmente aumentado nos últimos anos. A doença cardiovascular (DCV) é a maior causa de morte em pacientes com insuficiência renal, sendo que cerca de 50% de todas as mortes em pacientes com terapia substitutiva e que receberam transplante renal estão relacionadas a DCV. A mortalidade por DCV em pacientes com insuficiência renal é aproximadamente 9% por ano, o que chega a ser 30 vezes maior do que da população em geral. O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e os mecanismos de defesa antioxidante. Nos últimos anos, foi estudado o efeito biológico das ROS, e, em estudos clínicos e experimentais recentes, foram notados sinais de estresse oxidativo em pacientes renais. No entanto, a influência da uremia e do procedimento de hemodiálise não foi elucidada. Nesse estudo, avaliou-se a influência da uremia e da hemodiálise sobre o estresse oxidativo e a atividade da enzima delta aminolevulinato deidratase (δ- ALA-D) em pacientes com DRC em HD e ND comparando com o grupo controle. Observou-se um aumento na peroxidação lipídica em soro de pacientes HD e ND. O nível de TBARS em hemácias foi elevado somente em pacientes HD. A atividade da catalase mostrou-se aumentada (83,56% e 61,23%) em pacientes HD e ND, respectivamente. Neste estudo, demonstrou-se a inibição da atividade da δ- ALA-D em pacientes HD e ND quando comparado ao grupo controle. Observouse, uma correlação positiva entre δ-ALA-D e δ-ALA-D/DTT com a quantidade de hemoglobina (r= 0.55, r= 0.42), respectivamente, e também observou-se uma correlação entre δ-ALA-D e δ-ALA-D/DTT e o nível de TBARS em eritrócitos (r= - 0.54, r= -0.51), respectivamente. Além disso, uma correlação negativa foi encontrada entre δ-ALA-D ou δ-ALA-D/DTT e a atividade da enzima CAT (r= - 0.63, r= -0.5), respectivamente. Nesse trabalho, demonstrou-se que a uréia pode ser o principal fator na geração de estresse oxidativo em pacientes com DRC. Além disso, a inibição da atividade d-ALA-D foi positivamente correlacionada com níveis de hemoglobina, demonstrando o papel fundamental da enzima d-ALA-D na biossíntese do heme e no desenvolvimento de anemia em pacientes com CRF. Estudos descreveram que o acúmulo de d-ALA pode levar ao aumento do estresse oxidativo, e a diminuição da eficiência nos mecanismos de defesa celular contra as espécies reativas de oxigênio pode levar a peroxidação lipídica e também a inibição da atividade da d- ALA-D, com concomitante alteração na síntese do heme, formando assim um ciclo de destruição. Esse estudo demonstrou várias alterações em pacientes com insuficiência renal crônica, sendo que muitas delas ajudam a explicar a tendência a desenvolver doença cardiovascular precoce nesses pacientes. / Hemostatic abnormalities are commonly found in patients with renal failure. Both a bleeding diathesis and the uremic prothrombotic state may be caused by renal disease. The main role of blood platelets is to ensure primary hemostasis, which is the maintenance of vessel integrity and cessation of bleeding upon injury. While playing a major part in acute arterial thrombosis, platelets are also involved in inflammation, atherosclerosis, and angiogenesis. When platelets are undergo activation first adhere to the subendothelial matrix where they become activated and release secondary agonists such as ATP, ADP, thromboxane A2, serotonin and several other biologically active substances. ADP and ATP play a crucial role in platelet activation, acting through P2 receptors. This release may be responsible for the activation, recruitment, and induction of aggregation of additional platelets in the microenvironment. Thus, the metabolism of ADP in the blood is important for the regulation of platelet functions. NTPDase (ecto-CD39) is that hydrolyzes extracellular adenosine tri- and diphosphate (ATP, ADP) to adenosine monophosphate (AMP), which is subsequently converted into adenosine by 5’- nucleotidase (CD73). The objectives of this study were to explore the relations between platelet dysfunction in uremia with hemostatic abnormalities and the severity of kidney disease in patients with CRF under conservative treatment (nondialysed - ND) and hemodialysis (HD) treatment companing to heathy subjects with the same age. The activities of the enzymes NTPDase and 5´-nucleotidase were analyzed in platelets from patients with chronic renal failure (CRF), both undergoing hemodialysis treatment (HD) and not undergoing hemodialysis (ND), as well as from a control group. The results showed an increase in platelet NTPDase activity in CRF patients on HD treatment (52.88%) with ATP as substrate. ADP hydrolysis was decreased (33.68% and 39.75%) in HD and ND patients, respectively. In addition, 5’-nucleotidase activity was elevated in the HD (160%) and ND (81.49%) groups when compared to the control group. Significant correlation was found among ATP, ADP and AMP hydrolysis and plasma creatinine and urea levels. Patients were compared statistically according the time of hemodialysis treatment. We found enhanced NTPDase with ATP substrate and decrease with ADP substrate, and increase in 5’-nucleotidase activity between 49 and 72 months on HD patients. Our results suggest the existence of alterations in nucleotide hydrolysis in platelets, which might contribute to abnormal homeostasis in renal failure patients, thus and the enhanced risk of thromboembolic complication and accelerated atherosclerosis in patients with renal failure. Our knowledge about stimuli and sources of oxidative stress, and about its role as an important cofactor contributing to endothelial dysfunction, inflammation, atherosclerosis and glomerulosclerosis has substantially increase over the last years. Cardiovascular disease (CVD) is the major cause of death in patients with renal insufficiency, accounting for 50% of all deaths in renal replacement therapy patients and in recipients of renal transplants. Mortality from CVD in patients with renal insufficiency is approximately 9% per year, which is about 30 times the risk in the general population. Oxidative stress defines an imbalance between formation of reactive oxygen species (ROS) and antioxidative defense mechanisms. In view of the profound biological effects of ROS, in recent years numerous clinical and experimental studies focused on detection of signs of oxidative stress in renal patients. However, the influence of uremia and the hemodialysis procedure, respectively, has not been elucidated. Oxidative stress has been implicated in long-term complications including anemia, amyloidosis, accelerated atherosclerosis, and malnutrition. In this study, we studied the influence of uremia and hemodialysis on oxidative stress and δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) activity in patients with CRF on HD treatment, in patients ND and in a control group. An increased lipid peroxidation was observed in the serum of HD and ND patients, as measured by TBARS serum levels. However, erythrocytic TBARS was only elevated in HD patients. The activity of catalase was increased (83.56%, 61.23%) in HD and ND groups, respectively. This study also showed an inhibition Blood δ--ALA-D activity of HD and ND patients was significantly lower when compared with the control group. A positive correlation was also observed between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT with hemoglobin (r=0.55, r=0.42), respectively, and a negative correlated were observed between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT with TBARS level in erythrocytes (r= - 0.54, r=-0.51), respectively. Furthermore, a negative correlation was found between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT and CAT activity (r= -0.63, r= -0.5), respectively. In this study, it was shown that uremia itself could be the principal factor in generating oxidative stress in CRF patients. Furthermore, the inhibition of d-ALA-D activity was positively correlated with hemoglobin levels, showing the fundamental role of this enzyme in heme biosynthesis and the development of anemia in patients with CRF. Studies reported that the accumulation of d-ALA may lead to increased oxidative stress. In addition an existence of a decreased efficiency in the mechanisms of cellular defense against reactive oxygen species can lead to lipid peroxidation and inhibition of the activity of d-ALA-D with concomitant change in the synthesis of heme, thus forming a cycle of destruction. This study showed several changes in patients with chronic renal failure, which may to explain the tendency to develop cardiovascular disease in these patients early.

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose. / Platelets are cytoplasmic fragments derived from bone marrow megakaryocytes rupture, whose major role is related to the vascular integrity maintenance. The extracellular nucleotides ATP and ADP as well as adenosine have been implicated in a great number of physiological functions: ADP is the major factor recruiting platelet, whereas ATP has been considered as a competitive inhibitor of ADP-induced platelet aggregation. Adenosine is a molecule able to induce vasodilatation and to inhibit platelet aggregation. Thus, the maintenance of normal purinergic signalling has been showed as an important issue for the treatment of cardiovascular diseases. The nucleoside di and triphosphate can be hydrolyzed by members of several families of membrane-bound or soluble ectonucleotidases, including ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterases (E-NPPs), that together with an ecto-5’-nucleotidase lead to adenosine formation. On the platelets ecto-surface, both E-NTPDase and ecto-5’-nucleotidase are already described. The renin-angiotensin system is the most important regulator of renal and cardiovascular function developing a fundamental role in the arterial blood pressure homeostasis and in the electrolytic balance. Angiotensin II (ANGII) induces physiologically the platelet activation, probably due to its vasoconstrictors properties. The aims of this study were: 1) to kinetically characterize the enzyme E-NPP from rat blood platelet, using the artificial marker substrate p-Nph-5’TMP and 2) to clarify, even though in part, the effects of ANGII upon extracellular nucleotide hydrolysis by rat platelets ectoenzymes. In the first chapter, we describe an enzymatic activity that shares the major characteristics already described for E-NPPs: optimum alkaline pH; KM and Vmax calculated values of approximately 106.22 ± 17.83 μM and 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively; and divalent cation dependence. Besides, AMP inhibited only p-Nph-5’TMP hydrolysis. On the other hand, sodium azide, in high concentrations, ANGII and gadolinium chloride just changed ATP or ADP or both hydrolysis. In the second chapter, we show that ANGII was able to increase ATP, ADP and AMP hydrolysis in platelets from rats in all tested dosis (5, 50, 500 e 5000 picomoles). However, no modification was observed regarding p-Nph-5'TMP hydrolysis. Additionally, we verified an increase on AMP hydrolysis and a reduction on p-Nph-5'TMP hydrolysis in platelets from spontaneously hypertensive rats (SHR) when compared to Wistar normotensive rats. Finally, this work shows the kinetic and biochemistry characterization of an E-NPP enzyme on the intact platelet surface as being part of a complex system for nucleotide hydrolysis that could contribute for the antiplatelet therapies and vascular diseases treatment. In addition, we present some results showing interactions between rat platelet angiotensinergic and adenosinergic systems that could contribute to the understanding and treatment of cardiovascular diseases such as hypertension and atherosclerosis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-17Bitstream added on 2014-06-13T20:17:37Z : No. of bitstreams: 1 costa_ccmr_me_botfmvz.pdf: 292935 bytes, checksum: 632cc3655cad59e9e602b2040d94e522 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O concentrado de plaquetas é um hemocomponente importante para a transfusão de grandes quantidades de plaquetas. Durante a estocagem, as plaquetas sofrem lesões que devem ser analisadas por meio de testes laboratoriais. O objetivo do presente estudo foi avaliar as qualidades físicas, químicas, microbiológicas, estruturais e funcionais plaquetárias em concentrados de plaquetas caninos estocados durante 5 e 7 dias. Foram realizadas contagem de plaquetas, leucócitos e hemácias por unidade, mensuração do pH, glicose, avaliação do swirling, análise microbiológica, avaliação da agregação plaquetária e da expressão da GPIIbIIIa pela citometria de fluxo. As análises foram realizadas logo após a centrifugação, e no quinto (grupo I) e sétimo (grupo II) dias de estocagem dos concentrados de plaquetas obtidos de 22 cães hígidos. Todas as bolsas foram negativas para o isolamento de microorganismos. Houve diminuição significativa nas contagens de plaquetas e leucócitos, pH, glicose e swirling nos dois grupos. Ocorreu diminuição na resposta agregatória nos dois grupos, com o uso isolado e associado de ADP e epinefrina. Os anticorpos CD41 e CD61 apresentaram alta porcentagem de fluorescência em todos os momentos, e não houve variação significativa na média de intensidade de fluorescência das plaquetas durante a estocagem. Conclui-se que, mantida a esterilidade microbiológica, os concentrados de plaquetas caninas podem ser estocados por até 7 dias, no entanto, há uma maior perda da viabilidade plaquetária e qualidade dos concentrados quando comparados ao grupo armazenado durante 5 dias. Houve perda funcional das plaquetas durante a estocagem pela redução da agregação plaquetária. Os anticorpos CD41 e CD61 podem ser utilizados na avaliação da GPIIbIIIa de plaquetas caninas estocadas durante os períodos avaliados / Platelet concentrate is an important blood component for platelet transfusion. During storage, platelets undergo lesions that should be evaluated by laboratory assays. The aim of this study was to evaluate the physical, chemical, microbiological, structural and functional platelet qualities in canine platelet concentrate stored for 5 and 7 days. Platelet, leukocytes and erythrocytes concentrations per unit, pH and glucose measurements, swirling observation, microbiological analysis, assessment of platelet agregation and expression of GPIIbIIIa by flow cytometry were performed. Analyses were performed after centrifugation, and the fifth (group I) and seventh (group II) days of platelet concentrate storage obtained from 22 healthy dogs. All platelet concentrate bags were negative for microorganisms isolation. Platelet and leukocytes concentrations, pH, glucose, and swirling decreased significantly during storage, in both groups. A significant reduction in aggregatory response was detected in both groups, in the presence of ADP, epinephrine or both simultaneously. CD41 and CD61 antibodies showed high fluorescence at all times, and no significant variation in mean fluorescence intensity during storage. In conclusion, canine platelet concentrates should be stored for 5 days, however, can be stored for up to 7 days with greater loss of viability and quality of bags during this period. There was functional loss observed by the reduction of platelet aggregation during storage in both groups. CD41 and CD61 antibodies can be used to assess GPIIbIIIa in canine platelets stored during the evaluated period

Orientador: Maria José Hitomi Nagata / Banca: Michel Reis Messora / Banca: Mário Taba Júnior / Banca: Álvaro Francisco Bosco / Banca: Valdir Gouveia Garcia / Resumo: Este estudo avaliou a influência do Plasma Rico em Plaquetas (PRP) e da Fibrina Rica em Plaquetas (FRP) no reparo ósseo de defeitos de tamanho crítico (DTC) criados cirurgicamente em calvárias de ratos. 90 ratos foram aleatoriamente divididos em 3 grupos: C (controle), PRP e FRP. Um DTC de 5 mm de diâmetro foi criado na calvária de cada animal. No Grupo C, o defeito foi preenchido com coágulo sanguíneo somente. Nos grupos PRP e FRP, os defeitos foram preenchidos com PRP e FRP, respectivamente. Os animais foram eutanasiados aos 7, 15 ou 30 dias pós-operatórios. Análises histomorfométrica e imunoistoquímica foram realizadas. A Área de Osso Neoformado (AON) foi calculada como uma porcentagem da área total do defeito original. Imunomarcações do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), fator de transcrição relacionado à Runt 2 (Runx2), proteína morfogenética óssea - 2 (BMP-2) e fosfatase alcalina específica do osso (BALP) foram realizadas. Células positivas para PCNA e Runx2 foram quantificadas e as imunomarcações para BMP-2 e BALP foram semi-quantificadas. Os dados foram estatisticamente analisados. Aos 7 dias, o Grupo PRP (10,74 ± 4,80%) apresentou AON significativamente maior do que os grupos C (0,86 ± 0,98%) e FRP (2,95 ± 2,37%). Aos 15 dias, os grupos C, PRP e FRP apresentaram AON similares (13,07 ± 4,48%; 14,19 ± 2,85%; 18,83 ± 6,71%, respectivamente). Aos 30 dias, os grupos PRP (32,75 ± 7,39%) e FRP (28,73 ± 10,67%) apresentaram AON significativamente maior do que o Grupo C(13,55 ± 4,62%). Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos PRP e FRP aos 30 dias. Aos 7 dias, os grupos PRP e FRP apresentaram número de células PCNA-positivas significativamente maior do que o Grupo C. Aos 15 dias, o Grupo FRP apresentou número de células... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study evaluated the influence of Platelet-Rich Plasma (PRP) and Platelet-Rich Fibrin (PRF) on bone healing in surgically created critical-size defects (CSD) in rat calvaria. 90 rats were randomly divided into 3 groups: C (control), PRP and PRF. A 5 mm diameter CSD was created in the calvarium of each animal. In Group C, the defect was filled by blood clot only. In groups PRP and PRF, the defects were filled with PRP and PRF, respectively. Animals were euthanized 7, 15 or 30 days postoperatively. Histomorphometric and immunohistochemical analyses were performed. Newly formed bone area (NFBA) was calculated as percentage of the total area of the original defect. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Runt-related transcription factor 2 (Runx2) Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and Bone Alkaline phosphatase (BALP) immunohistochemical staining were performed. PCNA-positive and Runx2-positive cells were quantified and BMP-2 and BALP immunostaining were semi-quantified. Data were statistically analyzed. At 7 days, Group PRP (10.74 ± 4.80) had significantly greater NFBA than groups C (0.86 ± 0.98) and PRF (2.95 ± 2.37). At 15 days, groups C, PRP and PRF presented similar amount of NFBA (13.07 ± 4.48; 14.19 ± 2.85; 18.83 ± 6.71, respectively). At 30 days, groups PRP (32.75 ± 7.39) and PRF (28.73 ± 10.67) presented significantly greater NFBA than Group C (13.55 ± 4.62) and no significant differences were observed between groups PRP and PRF. At 7 days, Groups PRP and PRF showed a significantly higher number of PCNA-positive cells than Group C. At 15 days, Group PRF had a significantly higher number of PCNA-positive cells than groups C and PRP; Group PRP had a significantly higher number of these cells than Group C... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Rosana Rossi Ferreira / Banca: Hamilton da Rosa Pereira / Banca: Ricardo de Paula Leite Curry / Resumo: Objetivos: Avaliar, através de um estudo clinico, randomizado, controlado e cego, a eficácia do plasma rico em plaquetas na cicatrização, dor e hemostasia após artroplastia total do joelho. Metodologia: Foram selecionados 40 pacientes que seriam submetidos a prótese total do joelho e randomizados. Em 20 destes pacientes foi aplicado o plasma rico em plaquetas antes do fechamento da cápsula articular. Foram realizadas dosagens de hemoglobina (mg/dL) e hematócrito (%) no pré-operatório, após 24 e 48 horas da cirurgia. Aplicado o questionário WOMAC, a escala verbal da dor e medidas as amplitudes de movimento do joelho até o 2o mês pós-operatório. A análise estatística comparou os resultados afim de comprovar haver diferença entre os grupos em cada um dos momentos da avaliação. Resultados: Medidas do valor da hemoglobina (mg/dL) e hematócrito (%) realizadas no pré-operatório, após 24 e 48 horas da cirurgia não mostraram diferenças significativas entre os grupos (p>0,05). O questionário WOMAC e a amplitude de movimento medidas no pré-operatorio e até os dois primeiros meses também não mostraram diferenças estatísticas entre os grupos (p>0,05). A avaliação da dor através da escala verbal, mostrou vantagem no grupo que utilizou o plasma rico em plaquetas após 24 e 48 horas, uma e três semanas e dois meses de pós-operatório (p<0,05). Conclusões: Da maneira que foi utilizado, o plasma rico em plaquetas não se mostrou efetivo para reduzir sangramento ou melhorar a função do joelho após a artroplastia em comparação aos controles. Houve vantagem na escala verbal de dor pós-operatória. Descritores: Artroplastia, joelho, transfusão, plasma rico em plaquetas, sangramento / Abstract: Purpose: To assess, through a clinical study, randomized, controlled ande singleblinded, the effectiveness of platelet-rich plasma in healing, pain and hemostasis after a total knee arthroplasty. Methods: 40 patients, that would be submitted to total knee arthroplasty, were selected and randomized. In 20 of these was applied platelet-rich plasma before the closure of the joint capsule. Hemoglobin and hematocrit levels were measured in the preoperative, after 24 and 48 hours of surgery. The WOMAC questionnaire and verbal pain scale were applied, measures of the range of motion of the knee were performed until the second postoperative month. Statistical analysis compared the results in order to prove if there is a difference between the groups at each time of evaluation times. Results: Hemoglobin and hematocrit levels performed preoperatively, after 24 and 48h of surgery showed no significant differences between groups (p>0,05). The WOMAC questionnaire and the measures of range of motion in the preoperative and even in the first two months also showed no statistic differences between groups (p>0,05). Pain assessement through verbal scale showed benefit in the group using platelet-rich plasma after 24 and 48 hours, one to three weeks and two months postoperative (p<0,05). Conclusions: The way it was used, the platelet-rich plasma was not effective for reducing bleeding or improve knee function after arthroplasty compared with controls. There was an advantage in the verbal scale of postoperative pain / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Programa de Pós Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-06-11T14:58:05Z No. of bitstreams: 1 2014_LuisaMayumiArakeTacca.pdf: 3171230 bytes, checksum: f2a279d3f6739aba7da24618336db559 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-09T11:45:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LuisaMayumiArakeTacca.pdf: 3171230 bytes, checksum: f2a279d3f6739aba7da24618336db559 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-09T11:45:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LuisaMayumiArakeTacca.pdf: 3171230 bytes, checksum: f2a279d3f6739aba7da24618336db559 (MD5) / Os anfíbios anuros são animais que vêm sendo estudados e utilizados como modelos para descoberta de novas moléculas há algum tempo. Sua pele secreta uma mistura de substâncias ativas em grande parte já isoladas e estruturalmente caracterizadas. Dentre tais compostos, podemos citar peptídeos antimicrobianos, hipotensores e opióides, aminas biogênicas, alcaloides e esteróis. O trabalho em questão analisou um peptídeo oriundo da secreção cutânea do anfíbio Hypsiboas punctatus. Tal peptídeo apresenta uma sequência de 15 resíduos de aminoácidos e um motivo ativo composto pelo tripeptídeo KGD característico das proteínas da família das desintegrinas, até o momento inédito em anfíbios. O peptídeo em questão foi modificado em mais cinco análogos e sintetizado por meio de síntese química sólida. As moléculas foram purificadas, caracterizadas e testadas e, ao final do processo, tiveram os modelos das suas estruturas tridimensionais determinados por meio de Ressonância Magnética Nuclear. A sequência peptídica original foi modificada para gerar cinco análogos sintéticos obtidos por meio de síntese química em fase sólida. Todos os análogos foram submetidos à oxidação do par de resíduos de cisteína para formação das respectivas pontes dissulfeto, purificados, caracterizados e testados. Ao final deste processo, tiveram suas respectivas estruturas tridimensionais determinadas por meio de Ressonância Magnética Nuclear. O peptídeo natural não apresentou qualquer atividade anti- plaquetária in vitro quando testado por meio da metodologia de impedância elétrica, no entanto é possível atribuir-se a esta molécula discreta atividade relativa de inibição de agregação em ensaios de espalhamento plaquetário. Contudo, quando avaliados comparativamente sob mesma metodologia, os análogos sintéticos demonstram atividade anti-plaquetária significativamente superior ao peptídeo natural, utilizado neste trabalho como um arquétipo estrutural de desintegrina. Tais evidências, isto é, a comprovação experimental do surgimento de uma nova atividade biológica em análogos sintéticos, originalmente inexistente na molécula arquetípica, corrobora nossa hipótese sobre a importância da redistribuição das cargas (positiva e negativa) ao longo do eixo maior da estrutura 3D de cada análogo e da necessidade de um reposicionamento “Taylor-Made” dos motivos (Arg-Gly-Asp; Lys-Gly-Asp; His-Gly-Asp) para que as novas moléculas fossem ativas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Anurans are animals that have been much explored as models. Their skin is part of their immune system and it has special glands which secrete a rich mixture of substances related to their innate defense against predators and microorganisms. Among this molecules are active peptides which have been isolated and tested for many pathogens and are a growing field within pharmacology. The present work analyzed a specific peptide from the skin secretion of the amphibian Hypsiboas punctatus. It is formed by a 15 amino acid sequence with a KGD disintegrin-like motif in the center of a loop constricted by a disulfide bridge. This motif has never been registered for amphibians before. The natural peptide was modified into five analogues which were synthesized through solid phase tButyl/FMOC strategy. They were purified (Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography), characterized (Mass Spectrometry), had their biological activity tested and their 3D structures calculated with the use of Nuclear Magnetic Resonance. The natural peptide did not show any anti-platelet inhibition activity when tested through electric impedance methodology; however it did show relative biological activity when tested through platelet spreading assay methodology. The modified analogues showed a higher activity rate. The results indicate the verification of the hypothesis of the importance of an improved positioning of the positive and negative charges along the molecule structure and also of the need for the ligand section of the peptide to be centered in the active loop.