RÊGO, João Paulo Arcelino do. Análise proteômica do plasma seminal de carneiros Santa Inês adulto. 2010. 107 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Zootecnia, Fortaleza-CE, 2010 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-29T14:08:18Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_jparego.pdf: 805870 bytes, checksum: a59ce42229b6d0d23c4b460911c6fe88 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-29T14:08:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_jparego.pdf: 805870 bytes, checksum: a59ce42229b6d0d23c4b460911c6fe88 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T14:08:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_jparego.pdf: 805870 bytes, checksum: a59ce42229b6d0d23c4b460911c6fe88 (MD5) Previous issue date: 2010 / Northeastern Brazil has a significant population of sheep and, among the native hairy breeds, Santa Inês is known for its good performance and adaptability to tropical environments. Recently, it has been shown that the protein profile of the seminal plasma of Santa Inês rams changes during sexual development, in concert with changes in semen parameters, such as sperm motility, morphology and concentration. However, the identity of seminal plasma proteins from these hairy rams is still unknown. Therefore, we pursued the identification of seminal plasma proteins from Santa Inês rams using a proteomic approach. Semen samples were collected from eight mature rams, and seminal plasma saved after centrifugation. Seminal plasma protein maps, obtained by two-dimensional electrophoresis, were stained with colloidal Coomassie. The gels were scanned and analyzed using PDQuest software. Protein spots were individually cut, in-gel digested with trypsin and identified after tandem mass spectrometry and database search. On average , we detected 302 spots per gel, from which 143 were present on every member of the match set generated by PDQuest. Thirty-nine spots were positively identified by mass spectrometry, corresponding to 26 different proteins. The major proteins present in the maps were the BSP-like RSVP14 and RSVP22 and the spermadhesins bodhesin 1 and 2. Other proteins detected in the maps included albumin, clusterin, peroxiredoxin, lactoferrin, transferrin, matrix metalloproteinase 2, beta galactosidase and heat shock proteins. The Identity of these proteins suggest their participation on several physiological events, such as sperm protection, regulation of sperm motility and capacitation, modification of sperm membrane and fertilization. The knowledge of the proteome of the ovine seminal plasma is a necessary step towards the understanding of the mechanisms underlying the regulation of sperm function by seminal plasma components in rams / O Nordeste brasileiro é detentor de um expressivo rebanho ovino, e, dentre as raças deslanadas existentes na região, a Santa Inês se destaca por apresentar bom desenvolvimento corporal, ganho de peso e adaptabilidade às condições tropicais. Recentemente, demonstrou-se que o perfil protéico do plasma seminal de carneiros Santa Inês passa por alterações significativas durante o desenvolvimento reprodutivo, simultaneamente a mudanças nos parâmetros de motilidade e concentração espermática. Contudo, ainda não se conhece a identidade de todas essas proteínas. Dessa forma, o presente trabalho foi conduzido com o objetivo de identificar as proteínas do plasma seminal de carneiros Santa Inês maduros, utilizando as técnicas de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa. Amostras de sêmen foram coletadas de oito carneiros adultos e o plasma seminal obtido através de centrifugação e submetido à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo PDQuest. Os spots foram cortados individualmente dos géis, digeridos com tripsina, e submetidos a identificação por espectrometria de massa (MALDI-ToF/ToF). A sequência peptídica das proteínas mais abundantes e a distribuição dos domínios foram representadas graficamente utilizando o aplicativo Caititu. Foram detectados, em média, 302 spots por gel. Destes, 143 estavam presentes em todos os géis. Trinta e nove spots foram identificados, correspondendo a 26 diferentes proteínas. As proteínas mais abundantes foram as RSVPs 14 e 22 kDa, pertencentes à família das binder of sperm proteins, e as Bodesinas-1 e 2, pertencentes à família das espermadesinas. Outras proteínas foram identificas no estudo, incluindo albumina, clusterina, peroxiredoxina, lactotransferrina, metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2), beta galactosidase e heat shock proteins. Dessa forma, a identidade dessas proteínas sugere que o plasma seminal de carneiros Santa Inês contém componentes que participam de diversos processos fisiológicos, incluindo proteção do espermatozóide, modulação da motilidade e capacitação espermática, modificação da membrana do espermatozóide e interação entre gametas. O conhecimento dessas proteínas contribuirá para uma melhor compreensão dos mecanismos de regulação do plasma seminal sobre a função espermática em ovinos

A criação de equinos tem se desenvolvido ativamente no Brasil. Assim, o interesse dos proprietários em biotecnologias reprodutivas equinos vem aumentando. Entretanto, o sêmen equino tem baixa tolerância à criopreservação comparada com outras espécies, sendo o estresse oxidativo um entrave por seus efeitos deletérios sobre a célula espermática. Neste contexto, o plasma seminal possui antioxidantes que promovem um papel importante na proteção do espermatozoide. Porém o, durante o processo de criopreservação, o plasma seminal é retirado. Em estudo anterior verificamos que, na ausência do plasma seminal os espermatozoides equinos tornam-se mais susceptíveis ao estresse oxidativo, principalmente causado pelo malondialdeído (MDA), subproduto da oxidação de lipídeos. Um dos motivos para este resultado seria a retirada da carnosina, um dos principais antioxidantes responsáveis pela proteção contra o acúmulo de MDA e seus efeitos deletérios, presente no plasma seminal. O objetivo do presente estudo é identificar e quantificar carnosina no plasma seminal de garanhões e comparar as características seminais em diferentes grupos de bons e maus refrigeradores e congeladores, baseando-se na análise da motilidade posterior ao processo de refrigeração e congelação. Foram colhidos dois ejaculados de quarenta garanhões (idades entre 4 e 16 anos de idade). As variáveis analisadas foram cinética espermática pelo sistema CASA, avaliação funcional (coloração de eosina-nigrosina para membranas, fast-green/rosa bengala para acrossomos, coloração 3-3diaminobenzidina para atividade mitocondrial e SCSA™ para susceptibilidade a denaturação de cromatina) e avaliação do índice de peroxidação lipídica (TBARS) do espermatozoide e do plasma seminal. Também foram realizadas análises da integridade de membranas plasmática e acrossomal, e potencial de atividade mitocondrial pelas sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox. A carnosina do plasma seminal foi mensurada utilizando kit de ELISA Biomatik® comercial. Foram comparados os grupos bons e maus refrigeradores, e bons e maus congeladores (p≤0,05). Verificamos uma maior concentração de carnosina nos bons refrigeradores em relação aos que refrigeraram mau. Isso pode ter ocorrido pela maior concentração de TBARS no plasma seminal destes animais, possivelmente por um efeito fisiológico de reações de oxidação. Além disto, os bons refrigeradores apresentaram porcentagens significativamente maiores de células com alta atividade mitocondrial, acrossomo intacto e membrana intacta sugerindo um efeito benéfico da carnosina. Em relação ao efeito da congelação do sêmen, não foi observada diferença na concentração de carnosina entre os que congelaram bem ou não. Este resultado era esperado uma vez que, durante o processo de criopreservação do sêmen equino o plasma seminal é retirado. De fato, a maior porcentagem de células com lesão mitocondrial, de membrana e DNA lesado nos maus congeladores e as correlações entre as lesões e o estresse oxidativo pode indicar um mecanismo mitocondrial de geração de estresse oxidativo e consequente lesão das estruturas celulares. Conclui-se que a carnosina apresentou efeito protetor durante a refrigeração espermática protegendo contra injúrias causadas pela mesma e consequentemente é um dos fatores que melhora a qualidade espermática após 24 horas de refrigeração. / Equine breeding has been actively developing in Brazil, leading to increased interest in reproductive biotechnology. However, there is a limitation due to a tolerance of some stallions to cryopreservation, especially when compared to other species. In this context, oxidative stress represents an obstacle due to its deleterious effects on equine sperm. To counterattack such effect, seminal plasma has antioxidants that play an important role in protecting the sperm. However, during the cryopreservation process, the seminal plasma is withdrawn. In a previous study we verified that, in the absence of seminal plasma, equine spermatozoa are more susceptible to oxidative stress, mainly caused by malondialdehyde (MDA), a product of lipid oxidation. One of the reasons for this result would be the removal of carnosine present in the seminal plasma, one of the main antioxidants responsible for protection against the MDA accumulation and its deleterious effects. The objective of the present study was to identify and quantify carnosine in the seminal plasma of stallions and to compare the seminal characteristics in different groups of sperm samples with high and low tolerance to the cryopreservation or cooling, based on analysis of total motility after these processes. Two ejaculates of forty stallions (N= 80; ages between 4 and 16 years old) were collected. Each ejaculate was divided into two aliquots, one submitted to a 24h cooling and the other submitted to cryopreservation. The variables analyzed were: Computer Assisted Sperm Analysis (CASA system), functional evaluation (eosin-nigrosin stain for membranes, fast-green/rose bengal for acrosomes, 3-3\'diaminobenzidine staining for mitochondrial activity and SCSA™ for susceptibility to chromatin denaturation) and lipid peroxidation index (TBARS assay) of sperm and seminal plasma. Furthermore, plasma and acrossomal membranes integrities and mitochondrial membrane potential were also analyzed using the fluorescence probes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA, JC-1 and ROS detection by CellRox fluorescent probes. Carnosine from the seminal plasma was measured using commercial Biomatik® ELISA kit. Thus, samples with high and low tolerance were compared (p≤0.05). We found a higher concentration of carnosine in good cooler compared to those showing low motility. This may have occurred in response to the higher concentration of TBARS in the seminal plasma of these animals, possibly due to a physiological effect of oxidation reactions. In addition, good coolers presented significantly higher percentages of cells with high mitochondrial activity, intact acrosome and intact membrane suggesting a beneficial effect of carnosine. Regarding the effect cryopreservation, no difference was observed between those with high and low post-thaw motility. This result was expected since, during the cryopreservation process of equine semen, the seminal plasma is removed. In fact, the higher percentage of cells with mitochondrial lesions, damaged membrane and fragmented DNA in bad freezers and the correlations between lesions and oxidative stress may indicate a mitochondrial mechanism of oxidative stress generation and consequent lesion of cellular structures. In conclusion, carnosine had a protective effect during sperm cooling, protecting against damages being probably one of the factors that improves sperm quality after 24 hours of refrigeration.

A quantificação dos componentes bioquímicos como frutose, ácido cítrico e proteína total existentes no plasma seminal de caprinos e ovinos localizados na região Centro-Oeste do Brasil é uma forma de avaliar a atividade fisiológica e bioquímica espermáticas. Estes dados servem como indicadores de prováveis problemas com os testículos e glândulas acessórias desses animais e de sua respectiva fertilidade. A frutose e o ácido cítrico são importantes para o sêmen como fonte de energia metabólica e como componente de sistema tampão, respectivamente. A frutose é um marcador da função secretora das vesículas seminais, e é um componente importante para a sobrevivência dos espermatozóides em condições anaeróbicas e está estreitamente relacionada com a motilidade inicial das células espermáticas. Sendo assim, os objetivos do presente projeto foram analisar quantitativamente esses componentes do plasma seminal de bodes e carneiros sob latitude 20°31\'S em quatro épocas do ano e purificar, através de técnicas cromatográficas, a enzima fosfolipase A2, importante proteína presente no plasma seminal. As análises bioquímicas foram feitas usando-se um espectrofotômetro UV/Vis para obtenção da curva padrão e para a determinação das concentraçõoes mensais e da concentração anual média dos constituintes analisados. A purificação da PLA2 foi feita por cromatografia líquida preparativa usando-se como fase estacionária a coluna Superdex 75-16/60 (GE HealthCare) de exclusão por tamanho e membranas semipermeáveis de 10 e 30 kDa. Como resultado das análises bioquímicas, obteve-se a concentração anual média de proteínas totais de 3,27 ± 0,60 g/dL para ovinos e de 5,02 ± 0,43 para caprinos, ácido cítrico de 1015,33 ± 66,50 µg/mL para ovinos e de 1584,35 ± 143,90 µg/mL para caprinos e frutose de 23,40 ± 4,80 mg/dL para ovinos e 72,73 ± 18,50 mg/dL para caprinos. Os resultados mostraram que a PLA2 extraída do plasma seminal de ovinos tem massa molecular próxima de 13,8 kDa e a PLA2 do plasma seminal de caprinos tem massa molecular próxima a 12,8 kDa. / Quantification of biochemical components in seminal plasma including fructose, citric acid and total protein of goat and sheep of the Midwest region of Brazil is one way of evaluating the biochemical and physiological activity of the sperm. These data serve as indicators of potential problems with the testicles and accessory glands of these animals and their relative fertility. The fructose and citric acid are important for the semen as a source of metabolic energy and as a component of a buffer, respectively. Fructose is a marker of secretory function of seminal vesicles, important for the survival of spermatozoa under anaerobic conditions, and is closely related to the initial motility of sperm cells. Therefore, the objectives of this project were to quantitatively analyze these components in the seminal plasma of goats and sheep in latitude 20°31\'S 3 1\'S in four seasons and purify by chromatographic techniques the enzyme phospholipase A2, an important protein in the seminal plasma. Biochemical analysis were done using a spectrophotometer UV / Vis to obtaining the standard curve and to determine the monthly and annual average concentration of the constituents analyzed. The purification of PLA2 was performed by preparative liquid chromatography using the column as stationary phase Superdex 75-16/60 (GE HealthCare) by size exclusion and semipermeable membranes 10 and 30 kDa. As a result of biochemical analysis, we obtained the annual average concentration of total protein of 3,27 ± 0,60 g / dL for sheep and 5,02 ± 0,43 g/dL for goats, citric acid of 1015,33 ± 66, 50 g / mL for sheep and 1584,35 ± 143,90 g / mL for goats and fructose 23,40 ± 4,80 mg / dL for sheep and 72,73 ± 18,50 mg / dL for goats. The results showed that the PLA2 extracted from seminal plasma of sheep has a molecular mass of 13,8 kDa and the next PLA2 from goat seminal plasma has a molecular mass close to 12,8 kDa.

A criopreservação do sêmen suíno ainda é um desafio devido a extensão dos danos causados pelo choque-frio. Os espermatozoides oriundos da fração rica do ejaculado suíno possuem a membrana plasmática mais estável, são mais resistentes ao choque-frio e a reação acrossomal precoce do que aqueles oriundo da fração total do ejaculado. Com isso, o uso do plasma seminal oriundo dessa fração do ejaculado suíno também poderia aumentar a criotolerância dos espermatozoides suínos e/ou reverter os danos oriundo da criopreservação. Entretanto, a grande maioria das técnicas de avaliação espermática inclui apenas um parâmetro de funcionalidade espermática. Por outro lado, quanto mais características espermáticas analisadas, mais fiel se torna a avaliação quanto ao potencial fertilizante da amostra. Nesse contexto, esse trabalho objetivou a validação de uma técnica de análise espermática por citometria de fluxo para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Além de avaliar os efeitos da adição/manutenção do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno sobre a cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, fluidez e peroxidação das membranas espermáticas, fosforilação do aminoácido tirosina, taxa de fertilidade e de prenhez precoce. A técnica sugerida em nosso trabalho é capaz de detectar (R2 = 0,9356; p < 0,01) simultaneamente os espermatozoides com a membrana plasmática e acrossomal integras e alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). O plasma seminal da fração rica do ejaculado suíno gera benefícios para a cinética espermática melhorando a motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados (p < 0,05). Por outro lado, a manutenção/adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno, não é capaz de alterar (p > 0,05) os espermatozoides PIAIA, a fosforilação do aminoácido tirosina, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas. Entretanto, essas características devem ser cuidadosamente interpretadas, uma vez que, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas são alteradas (p < 0,05) pelo processo de centrifugação. As taxas de fertilidade e de prenhez precoce também não foram influenciadas (p > 0,05) pela adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno. Portanto, podemos concluir que o plasma seminal da fração rica possui efeito benéfico sobre a fisiologia dos espermatozoides pós-descongelação, melhorando a criopreservação do sêmen suíno. / Boar semen cryopreservation is still a challenge due to the extension of cold shock damage. Boar spermatozoa arising from sperm-rich ejaculate fraction are reported to have a more stable plasma membrane, more resistant to cold shock and premature acrosome reaction than spermatozoa from the whole ejaculate. Thus, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction can increase cryotolerance of boar spermatozoa, and in other domestic species it has the ability to reverse cryopreservation damage. However, the majority of actual sperm evaluation techniques include a single sperm parameter, which makes the sperm characterization of a single population difficult. In this context, this work was performed to validate a sperm flow cytometry fourfold coloration technique for the simultaneous evaluation of plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential. Furthermore, we evaluate the seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction effects on sperm kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation, fertility and early pregnancy rate. The proposed technique is able (R2 = 0.9356; p < 0.01) to simultaneous detection of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). Seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction is able to improve (p < 0.05) total and progressive motility. Furthermore, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction maintenance/addition was not able to improve (p > 0.05) the IPIAH sperm population, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation. However, these sperm characteristics need to be carefully interpreted, once, membrane fluidity and peroxidation could be influenced (p < 0.05) by centrifugation. Fertility and early pregnancy rate we not improved (p > 0.05) by seminal plasma addition. Therefore, we concluded that sperm fourfold coloration can be used to evaluate simultaneously plasma and acrosomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential and that whole sperm-rich fraction seminal plasma can be beneficial to post-thawed sperm physiology, thereby improving boar semen cryopreservation.

Estudou-se o perfil de proteínas de plasma seminal de touros das raças Nelore (Bos taurus primigerus indicus) e Simental (Bos taurus primigerus taurus), criados a campo, em regime de acasalamento múltiplo e manejo extensivo, na região de Dourados/MS, a fim de analisar a relação entre estas proteínas e características ligadas ao desempenho reprodutivo de touros. Coletaram-se amostras de sêmen no período de inverno (Julho/2001) e verão (Fevereiro/2002), realizando-se inicialmente o exame andrológico nos animais, e em seguida a análise padrão do sêmen. O plasma seminal foi, então, submetido à dosagem de proteínas totais, à dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliação da ocorrência de lipoperoxidação, e à eletroforese bidimensional de proteínas. Para análise do perfil proteico de plasma seminal da cada raça, foram utilizados os seguintes parâmetros: comparação entre os períodos de inverno e verão; comparação de grupos de amostras separados de acordo com a quantificação de características ligadas ao desempenho reprodutivo (morfologia espermática, dosagem de proteína total e dosagem de TBARS); e comparação de grupos de amostras separados de acordo com classificações para avaliação da capacidade reprodutiva, previamente descritas na literatura (Breeding Soundness Evaluations – BSEs). Os touros da raça Simental demonstraram menor adaptação às condições ambientais tropicais, com valores mais altos de defeitos espermáticos maiores, proteína total e dosagem de TBARS no período de verão. Observou-se grande variabilidade no perfil proteico entre as raças Nelore e Simental e, dentro de cada raça, encontrou-se expressiva variação individual. O perfil de proteínas de plasma seminal de touros Nelore apresentou 155 spots, entre os quais 04 se destacaram como possíveis marcadores de características ligadas ao desempenho reprodutivo. Já na raça Simental foram identificados 248 spots, com destaque para 04 spots, que demonstraram maior potencial como marcadores de características de interesse para a reprodução. Os resultados mostram que o perfil de proteínas de plasma seminal está relacionado ao desempenho reprodutivo de touros, fazendo-se necessários maiores estudos sobre as proteínas que se destacaram como marcadores, a fim de identificar as funções que elas exercem no trato reprodutivo e nos eventos ligados à fertilização. / Seminal plasma proteins profiles from Nelore (Bos taurus primigerus indicus) and Simmental (Bos taurus primigerus taurus) bulls, used for multiple-sire breeding under range conditions, at Dourados/MS region, were studied aiming to analyze the relation between these proteins and traits linked to bulls’ reproductive performance. Semen samples were collected in the winter (July/2001) and summer (February/2002). Initially, an andrological examination was performed, followed by standard semen analysis. Seminal plasma was subjected to total protein quantification, thiobarbituric acid reactive substances quantification (TBARS, to evaluate lipid peroxidation), and two-dimensional protein electrophoresis. To analyze seminal plasma protein profile of each breed, the following parameters were used: comparison between winter and summer, comparison among groups of samples divided by quantification of traits linked to reproductive performance (sperm morphology, total protein quantification, TBARS quantification) and comparison among groups of samples divided by breeding soundness evaluations (BSEs), previously reported in literature. Simmental bulls showed lower adaptability to tropical environment conditions, with higher values of major sperm defects, total protein and TBARS in the summer. A great variability was observed in the protein profile between Nelore and Simmental breeds, and, for each breed it was found great individual variability too. Nelore seminal plasma protein profile presented 155 spots, 04 of which were considered potential markers for traits linked to reproductive performance. For Simmental breed, 248 spots were identified, with special interest for 04 spots, which showed higher potential as markers to reproductive characteristics. Results show that seminal plasma protein profile is related to bulls’ reproductive performance. Further studies about those proteins which are potential markers are needed, to determine their function at bulls’ reproductive system and in the events related to fertilization.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-10T13:08:46Z No. of bitstreams: 1 Robespierre Augusto Joaquim Araujo Silva.pdf: 876319 bytes, checksum: 0f2c3e9ca22ca2262229c589230deed3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-10T13:08:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robespierre Augusto Joaquim Araujo Silva.pdf: 876319 bytes, checksum: 0f2c3e9ca22ca2262229c589230deed3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of this study was to evaluate the influence of different extenders [Tris buffer (Tris), Tris-egg yolk (EY) and Tris-soybean lecithin 1% (SL1) and 2% (SL2)] and the removal of seminal plasma process in goat sperm stored at 5 ºC for 48 hours. Semen was collected four goats (two Toggenburg and two American Alpine), using an artificial vagina twice a week for four weeks. Ejaculates with greater than 60% motility were pooled and each pool seminal (n = 8) was used in a repeat. The pool was divided equally, half diluted without removal of seminal plasma (non washed semen – NW), and packaged in straws of 0.25 mL (200x106 sperm/mL). The second half of the pool was subjected to removal of the seminal plasma (washed semen - W) by double centrifugation (2200 g/10 min) then diluted and packaged as mentioned above. Then, the samples were chilled to 5 °C (90 min) and kept under refrigeration for 48 hours. Computer analysis of sperm kinetics (CASA) and the evaluation of the plasma membrane (PMi) and acrosomal (ACi) integrity and mitochondrial membrane potential (MMP) were determined within five minutes after reaching 5 °C (T0), and after 24 (T24) and 48 (T48) hours of storage. No influence extender (p>0.05) was observed for sperm kinetic variables of NW semen, however, independent extender, progressive motility (PM), linearity (LIN), straightness (STR), straightline velocity (VSL) and average path velocity (VAP) were lower (p<0.05) in T48 compared to T0, a fact confirmed for total motility (TM) of SL2 group. In washed semen, TM and MP of EY group was higher (p <0.05) than the other groups throughout chilling period. After removal of the seminal plasma did not influence the cooling time (p>0.05) in any of the kinetic variables SL2 group. However, LIN, STR, VSL values for Tris-EY and SL1 groups, and PM and VAP values for Tris-EY group, were lower in T48 compared to T0. It was observed also that in the T48 TM, PM, VSL and VAP variables of LS2 group, and PM variable of Tris-EY group were higher in semen washed when compared to semen non whased. The PMi was not influenced by the type of extender, but in NW semen PMi of Tris-EY and SL2 groups was lower (p <0.05) in T48 compared to T0. Greater (p <0.05) PMi was observed for the washed compared to non washed semen. The ACi and kinetics (curvilinear velocity – VCL) were not affected (p>0.05) by extender, or by storage time or the removal of seminal plasma. Thus, it is concluded that the soybean lecithin can be used as a substitute for egg yolk for cooling of goat semen and which removal of the seminal plasma enhances the preservation of the caprine semen. / O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de diferentes diluidores [Tris tampão (Tris), Tris-Gema (TG) e Tris-lecitina de soja 1% (LS1) e 2% (LS2)] e do processo de remoção do plasma seminal no sêmen caprino armazenado a 5 ºC por 48 horas. O sêmen foi colhido de quatro caprinos (dois Toggenburg e dois Alpino Americano), com vagina artificial, duas vezes por semana, durante quatro semanas. Ejaculados com motilidade superior a 60% foram agrupados e cada pool seminal (n=8) foi utilizado em uma repetição. O pool foi igualmente dividido, sendo metade diluído, sem remoção do plasma seminal (sêmen não lavado – NL), e envasado em palhetas de 0,25 mL (200x106 espermatozoides/mL). A segunda metade do pool foi submetida a remoção do plasma seminal (sêmen lavado – L) por dupla centrifugação (2200 g/10min) e depois diluída e envasada como citado anteriormente. Em seguida, as amostras foram refrigeradas até 5 ºC (90 min) e mantidas sob refrigeração por 48 horas. Análise computadorizada da cinética espermática (CASA) e a avaliação da integridade de membrana plasmática (iMP) e acrossomal (iAC) e do potencial de membrana mitocondrial (PMM) foram determinadas cinco minutos após atingir 5 ºC (T0), após 24 (T24) e 48 (T48) horas de armazenamento. Nenhuma influência do diluidor (p>0,05) foi observada para as variáveis de cinética espermática do sêmen NL, porém, independente do diluidor, motilidade progressiva (MP), linearidade (LIN), retilinearidade (STR), velocidade em linha reta (VSL) e velocidade média do percurso (VAP) foram menores (p<0,05) no T48 em relação ao T0, fato também observado para motilidade total (MT) do grupo LS2. No sêmen lavado, MT e MP do grupo Gema foi superior (p<0,05) aos demais grupos durante todo período de refrigeração. Após a remoção do plasma seminal não houve influência do tempo de refrigeração (p>0,05) sobre quaisquer das variáveis cinéticas do grupo LS2. Entretanto, os valores de LIN, STR, VSL para os grupos Tris-Gema e LS1, e MP e VAP para o grupo Tris-Gema, foram inferiores no T48 em relação ao T0. Observou-se, ainda, que no T48 as variáveis de MT, MP, VSL e VAP do grupo LS2, e MP do grupo Tris-Gema foram superior no sêmen lavado quando comparado ao sêmen não lavado. A iMP não foi influenciada pelo tipo de diluidor, porém no sêmen NL a iMP dos grupos Tris-Gema e LS2 foi inferior (p<0,05) no T48 em relação ao T0. Maior (p<0,05) iMP foi observada para o sêmen lavado em relação ao não lavado. A iAC e a cinética (velocidade curvilinear-VCL), não foram influenciadas (p>0,05) pelo diluidor, nem pelo tempo de armazenamento ou pela remoção do plasma seminal. Assim, conclui-se que a lecitina de soja pode ser utilizada como substituto à gema de ovo para refrigeração do sêmen caprino e que a remoção do plasma seminal melhora a conservação do sêmen dessa espécie.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Objetivou-se por meio deste estudo caracterizar a composiÃÃo bioquÃmica do plasma seminal e dos parÃmetros seminais de coelhos criados no NE do Brasil, identificando ainda as variaÃÃes que possam ocorrer ao longo do ano. O experimento foi conduzido nas instalaÃÃes do Setor de Cunicultura do Departamento de Zootecnia/UFC. O Ãndice de conforto tÃrmico dentro da instalaÃÃo foi calculado de acordo com a fÃrmula do ITU, modificada para coelhos. Foram utilizados 20 coelhos da raÃa Nova ZelÃndia Branca, criados em sistema flat-deck, alimentados com raÃÃo comercial. Os ejaculados foram coletados duas vezes por semana (outubro/2009 a setembro/2010), utilizando-se uma vagina artificial. Em seguida, os ejaculados foram avaliados quanto ao volume, cor, aspecto, vigor, motilidade e concentraÃÃo espermÃtica, apÃs foram centrifugados e o PS (plasma seminal) foi removido e acondicionado em tubos eppendorfs a -18 oC. Para realizaÃÃo das anÃlises bioquÃmicas foi feito um pool mensal de PS de cada animal, onde foram avaliadas as concentraÃÃes de glicose, frutose, colesterol total e proteÃnas totais. Neste estudo, os parÃmetros seminais foram influenciados significativamente (p<0,05) pelo mÃs de coleta, independente da existÃncia de estresse pelo calor. Na avaliaÃÃo dos parÃmetros seminais pela cor foi verificado que os ejaculados de cor branca perolada foram representativos da boa qualidade do sÃmen. Quanto ao aspecto, os melhores resultados foram encontrados nos ejaculados com aspecto cremo-leitoso. No que se refere Ãs caracterÃsticas bioquÃmicas, o aspecto do ejaculado influenciou significativamente (p<0,05) somente as concentraÃÃes de frutose e glicose. Foram constatadas diferenÃas significativas das concentraÃÃes de frutose entre os diferentes meses do ano. A glicose foi identificada como um constituinte, comumente encontrada no PS. A concentraÃÃo de colesterol total no PS de coelhos no presente experimento foi mais baixa que o encontrado por outros autores. O estudo das correlaÃÃes de Pearson demonstrou associaÃÃes significativas (baixas e moderadas), positivas e negativas entre os parÃmetros seminais e os bioquÃmicos. Os parÃmetros bioquÃmicos apresentaram correlaÃÃes entre si. Nesse estudo foi encontrada correlaÃÃo negativa da concentraÃÃo espermÃtica com a frutose. Os resultados permitiram concluir demonstram que os coelhos criados no nordeste do Brasil sÃo perfeitamente adaptados, pois apresentam caracterÃsticas seminais e bioquÃmicas normais, apesar da existÃncia de estresse tÃrmico. / This study was carried out to characterize the biochemical composition of seminal plasma and semen parameters of rabbits reared in Northeast Brazil, also identifying the changes that occur throughout the year. The experiment was conducted at the Sector of the Rabbit Department of Animal Science / UFC. The index of thermal comfort inside the facility was constructed according to the formula of the THI, modified for rabbits. The ejaculates were obtained twice a week from 20 New Zealand White rabbits, reared in flat-deck system (October/2009 to September/2010). After collection, the semen was measured and evaluated for volume, color, appearance, vigor, sperm concentration and motility. To obtain the SP, the semen was centrifuged and then stored at - 18ÂC. To perform the biochemical analysis was made a monthly pool of PS of each animal. The samples were tested according to the concentrations of fructose, glucose, total cholesterol and total protein. In this study, semen parameters were affected significantly (p <0.05) by sampling month, despite the presence of heat stress. In the evaluation of semen parameters was found that the color of the ejaculates was pearly white representative of good semen quality. Regarding the aspect, the best results were found in ejaculates with cream-milky appearance. With regard to biochemical characteristics, the aspect of the ejaculate significantly (p <0.05) only the concentrations of fructose and glucose. Significant differences in concentrations of fructose among the different months of the year. Glucose was identified as a constituent, usually found in the PS. Significant differences in concentrations of fructose among the different months of the year. Glucose was identified as a constituent, usually found in the PS. The study of the Pearson correlations showed significant associations (low and moderate) positive and negative differences between the semen parameters and biochemical. In this study we found a negative correlation with sperm concentration of fructose. The results showed that rabbits show created in Northeastern Brazil are perfectly adapted, as seminal and biochemical characteristics have normal, despite the existence of heat stress.

A criopreservação do sêmen suíno ainda é um desafio devido a extensão dos danos causados pelo choque-frio. Os espermatozoides oriundos da fração rica do ejaculado suíno possuem a membrana plasmática mais estável, são mais resistentes ao choque-frio e a reação acrossomal precoce do que aqueles oriundo da fração total do ejaculado. Com isso, o uso do plasma seminal oriundo dessa fração do ejaculado suíno também poderia aumentar a criotolerância dos espermatozoides suínos e/ou reverter os danos oriundo da criopreservação. Entretanto, a grande maioria das técnicas de avaliação espermática inclui apenas um parâmetro de funcionalidade espermática. Por outro lado, quanto mais características espermáticas analisadas, mais fiel se torna a avaliação quanto ao potencial fertilizante da amostra. Nesse contexto, esse trabalho objetivou a validação de uma técnica de análise espermática por citometria de fluxo para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Além de avaliar os efeitos da adição/manutenção do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno sobre a cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, fluidez e peroxidação das membranas espermáticas, fosforilação do aminoácido tirosina, taxa de fertilidade e de prenhez precoce. A técnica sugerida em nosso trabalho é capaz de detectar (R2 &#61; 0,9356; p &lt; 0,01) simultaneamente os espermatozoides com a membrana plasmática e acrossomal integras e alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). O plasma seminal da fração rica do ejaculado suíno gera benefícios para a cinética espermática melhorando a motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados (p &lt; 0,05). Por outro lado, a manutenção/adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno, não é capaz de alterar (p &gt; 0,05) os espermatozoides PIAIA, a fosforilação do aminoácido tirosina, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas. Entretanto, essas características devem ser cuidadosamente interpretadas, uma vez que, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas são alteradas (p &lt; 0,05) pelo processo de centrifugação. As taxas de fertilidade e de prenhez precoce também não foram influenciadas (p &gt; 0,05) pela adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno. Portanto, podemos concluir que o plasma seminal da fração rica possui efeito benéfico sobre a fisiologia dos espermatozoides pós-descongelação, melhorando a criopreservação do sêmen suíno. / Boar semen cryopreservation is still a challenge due to the extension of cold shock damage. Boar spermatozoa arising from sperm-rich ejaculate fraction are reported to have a more stable plasma membrane, more resistant to cold shock and premature acrosome reaction than spermatozoa from the whole ejaculate. Thus, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction can increase cryotolerance of boar spermatozoa, and in other domestic species it has the ability to reverse cryopreservation damage. However, the majority of actual sperm evaluation techniques include a single sperm parameter, which makes the sperm characterization of a single population difficult. In this context, this work was performed to validate a sperm flow cytometry fourfold coloration technique for the simultaneous evaluation of plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential. Furthermore, we evaluate the seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction effects on sperm kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation, fertility and early pregnancy rate. The proposed technique is able (R2 &#61; 0.9356; p &lt; 0.01) to simultaneous detection of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). Seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction is able to improve (p &lt; 0.05) total and progressive motility. Furthermore, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction maintenance/addition was not able to improve (p &gt; 0.05) the IPIAH sperm population, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation. However, these sperm characteristics need to be carefully interpreted, once, membrane fluidity and peroxidation could be influenced (p &lt; 0.05) by centrifugation. Fertility and early pregnancy rate we not improved (p &gt; 0.05) by seminal plasma addition. Therefore, we concluded that sperm fourfold coloration can be used to evaluate simultaneously plasma and acrosomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential and that whole sperm-rich fraction seminal plasma can be beneficial to post-thawed sperm physiology, thereby improving boar semen cryopreservation.

A criação de equinos tem se desenvolvido ativamente no Brasil. Assim, o interesse dos proprietários em biotecnologias reprodutivas equinos vem aumentando. Entretanto, o sêmen equino tem baixa tolerância à criopreservação comparada com outras espécies, sendo o estresse oxidativo um entrave por seus efeitos deletérios sobre a célula espermática. Neste contexto, o plasma seminal possui antioxidantes que promovem um papel importante na proteção do espermatozoide. Porém o, durante o processo de criopreservação, o plasma seminal é retirado. Em estudo anterior verificamos que, na ausência do plasma seminal os espermatozoides equinos tornam-se mais susceptíveis ao estresse oxidativo, principalmente causado pelo malondialdeído (MDA), subproduto da oxidação de lipídeos. Um dos motivos para este resultado seria a retirada da carnosina, um dos principais antioxidantes responsáveis pela proteção contra o acúmulo de MDA e seus efeitos deletérios, presente no plasma seminal. O objetivo do presente estudo é identificar e quantificar carnosina no plasma seminal de garanhões e comparar as características seminais em diferentes grupos de bons e maus refrigeradores e congeladores, baseando-se na análise da motilidade posterior ao processo de refrigeração e congelação. Foram colhidos dois ejaculados de quarenta garanhões (idades entre 4 e 16 anos de idade). As variáveis analisadas foram cinética espermática pelo sistema CASA, avaliação funcional (coloração de eosina-nigrosina para membranas, fast-green/rosa bengala para acrossomos, coloração 3-3diaminobenzidina para atividade mitocondrial e SCSA&trade; para susceptibilidade a denaturação de cromatina) e avaliação do índice de peroxidação lipídica (TBARS) do espermatozoide e do plasma seminal. Também foram realizadas análises da integridade de membranas plasmática e acrossomal, e potencial de atividade mitocondrial pelas sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox. A carnosina do plasma seminal foi mensurada utilizando kit de ELISA Biomatik&reg; comercial. Foram comparados os grupos bons e maus refrigeradores, e bons e maus congeladores (p&le;0,05). Verificamos uma maior concentração de carnosina nos bons refrigeradores em relação aos que refrigeraram mau. Isso pode ter ocorrido pela maior concentração de TBARS no plasma seminal destes animais, possivelmente por um efeito fisiológico de reações de oxidação. Além disto, os bons refrigeradores apresentaram porcentagens significativamente maiores de células com alta atividade mitocondrial, acrossomo intacto e membrana intacta sugerindo um efeito benéfico da carnosina. Em relação ao efeito da congelação do sêmen, não foi observada diferença na concentração de carnosina entre os que congelaram bem ou não. Este resultado era esperado uma vez que, durante o processo de criopreservação do sêmen equino o plasma seminal é retirado. De fato, a maior porcentagem de células com lesão mitocondrial, de membrana e DNA lesado nos maus congeladores e as correlações entre as lesões e o estresse oxidativo pode indicar um mecanismo mitocondrial de geração de estresse oxidativo e consequente lesão das estruturas celulares. Conclui-se que a carnosina apresentou efeito protetor durante a refrigeração espermática protegendo contra injúrias causadas pela mesma e consequentemente é um dos fatores que melhora a qualidade espermática após 24 horas de refrigeração. / Equine breeding has been actively developing in Brazil, leading to increased interest in reproductive biotechnology. However, there is a limitation due to a tolerance of some stallions to cryopreservation, especially when compared to other species. In this context, oxidative stress represents an obstacle due to its deleterious effects on equine sperm. To counterattack such effect, seminal plasma has antioxidants that play an important role in protecting the sperm. However, during the cryopreservation process, the seminal plasma is withdrawn. In a previous study we verified that, in the absence of seminal plasma, equine spermatozoa are more susceptible to oxidative stress, mainly caused by malondialdehyde (MDA), a product of lipid oxidation. One of the reasons for this result would be the removal of carnosine present in the seminal plasma, one of the main antioxidants responsible for protection against the MDA accumulation and its deleterious effects. The objective of the present study was to identify and quantify carnosine in the seminal plasma of stallions and to compare the seminal characteristics in different groups of sperm samples with high and low tolerance to the cryopreservation or cooling, based on analysis of total motility after these processes. Two ejaculates of forty stallions (N= 80; ages between 4 and 16 years old) were collected. Each ejaculate was divided into two aliquots, one submitted to a 24h cooling and the other submitted to cryopreservation. The variables analyzed were: Computer Assisted Sperm Analysis (CASA system), functional evaluation (eosin-nigrosin stain for membranes, fast-green/rose bengal for acrosomes, 3-3\'diaminobenzidine staining for mitochondrial activity and SCSA&trade; for susceptibility to chromatin denaturation) and lipid peroxidation index (TBARS assay) of sperm and seminal plasma. Furthermore, plasma and acrossomal membranes integrities and mitochondrial membrane potential were also analyzed using the fluorescence probes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA, JC-1 and ROS detection by CellRox fluorescent probes. Carnosine from the seminal plasma was measured using commercial Biomatik&reg; ELISA kit. Thus, samples with high and low tolerance were compared (p&le;0.05). We found a higher concentration of carnosine in good cooler compared to those showing low motility. This may have occurred in response to the higher concentration of TBARS in the seminal plasma of these animals, possibly due to a physiological effect of oxidation reactions. In addition, good coolers presented significantly higher percentages of cells with high mitochondrial activity, intact acrosome and intact membrane suggesting a beneficial effect of carnosine. Regarding the effect cryopreservation, no difference was observed between those with high and low post-thaw motility. This result was expected since, during the cryopreservation process of equine semen, the seminal plasma is removed. In fact, the higher percentage of cells with mitochondrial lesions, damaged membrane and fragmented DNA in bad freezers and the correlations between lesions and oxidative stress may indicate a mitochondrial mechanism of oxidative stress generation and consequent lesion of cellular structures. In conclusion, carnosine had a protective effect during sperm cooling, protecting against damages being probably one of the factors that improves sperm quality after 24 hours of refrigeration.

No presente estudo três concentrações de N-acetil-l-cisteina (NAC) foram avaliadas no diluente equino resfriado a 5°C através da motilidade do sêmen, integridade da cromatina espermática e choque hiposmótico sobre o ejaculado em diluente Kenney na proporção 1:2 com 50% de plasma seminal. O ejaculado de nove garanhões diluído na proporção 1:2 em meio Kenney foi dividido em 4 partes iguais e suplementado com 5,0, 2,5 e 0,5mM de NAC e um grupo não suplementado (0,0mM). As avaliações foram realizadas a fresco (0h), 24 e 48h de resfriamento. A análise de motilidade nos dois experimentos foi avaliada até às 24 horas. No experimento 2, a adição de 0,5 e 5,0mM de NAC resultou em áreas de dispersão da cromatina espermática similares (59,7 e 55,5μM2, respectivamente). Entretanto, a área de dispersão da cromatina no grupo não suplementado (65,3μM2) e com 2,5mM de NAC (52,8μM2) apresentou diferença (P<0,05). O percentual de células com membrana plasmática funcional foi similar entre o grupo não suplementado e o grupo suplementado com 0,5mM de NAC (39,7 e 39,8%, respectivamente), porém superior a NAC 2,5mM (34,5%) e 5,0mM (34,2%). A motilidade progressiva dos ejaculados suplementados com NAC foram similares entre si e somente o grupo NAC 0,5mM (35,2%) apresentou similaridade de células móveis com o grupo não suplementado (36,2%). Os maiores danos à cromatina espermática no sêmen equino diluído com 50% de plasma seminal mantido resfriado a 5°C ocorrem a partir de 24h de resfriamento. A adição de 2,5 e 5,0mM de NAC comprometem a motilidade e a funcionalidade de membrana espermática equina, mas não causa efeito deletério sobre a integridade do DNA. / In this study, three concentrations of N-acetyl- l-cysteine (NAC) were evaluated by sperm motility, membrane functionality (hypo-osmotic test), and sperm chromatin integrity. the hypo-osmotic test showed only 32.4% (P <0.05) of the cells having a functional membrane 12h into the cooling process, while the fresh semen (0h) was 53.5%. The percentage of motile cells decreased within 12h of cooling from 38.9 to 19.7%, with no difference between 12 and 24h of cooling. The tests of sperm chromatin dispersion and hypo-osmotic shock revealed similarities between the periods of cooling at 24 to 48h. In Experiment 2, the nine stallion ejaculates were divided into 4 equal parts, diluted in half with Kenney milk powder supplemented with 5.0, 2.5 and 0.5mM NAC and a group not supplemented (0.0mM). The evaluations were made fresh (0h), 24 and 48h after cooling. The analysis of motility was assessed in all experiments up to 24 hours. In experiment 2, the addition of 0.5 to 5.0mM NAC resulted in areas of similar sperm chromatin dispersion (59.7 and 55.5μM2, respectively). However, the area of the chromatin dispersion between non-supplemented group=0.0mM (65.3μM2) and 2.5mM NAC (52.8μM2) differ (P <0.05). The percentage of cells with plasma membrane function were similar between the supplemented with 0.5mM NAC and non-supplemented (0.0mM) groups with (39.7 and 39.8%, respectively), but higher than 2.5mM (34.5%) and 5.0mM (34.2%). Progressive motility of ejaculates supplemented with NAC were similar, but only the group with 0.5mM NAC which resulted in 35.2% of mobile cells showed similarities with the non-supplemented group (36.2%). The greatest damage to sperm chromatin in equine semen diluted with 50% seminal plasma kept cooled to 5°C was due to 24h cooling. The addition of 2.5 and 5.0mM NAC inhibits the mobility and functionality of the equine sperm membrane, but does not cause a deleterious effect on the integrity of the DNA.