The Finite-Difference Time-Domain (FDTD) method has become a very powerful tool for the analysis of propagating electromagnetic waves. It involves the discretization of Maxwell's equations in both time and space that leads to a numerical solution of the wave propagation problem in the time domain. The technique's main benefits are that it permits the description of wave propagation in non-uniform media, it can easily accommodate a wide range of boundary conditions, and it can be used to model nonlinear effects as well as the wave behaviour near localized structures or material defects. In this study, we extend this technique to mechanical wave propagation in piezoelectric crystals. It is observed to give large reflection artefacts generated by the computational boundaries which interfere with the desired wave propagation. To solve this problem, the renowned absorbing boundary condition called perfectly matched layer (PML) is used. PML was first introduced in 1994 for electromagnetic wave propagation. Our research has further developed this idea for acoustic wave propagation in piezoelectric crystals. The need to improve the large reflection artefacts by introducing a finite thickness PML has reduced acoustic wave reflection occurring due to practical errors to less than 0.5 %. However, it is found that PML can generate numerical instabilities in the calculation of acoustic fields in piezoelectric crystals. Theses observations are also discussed in this report. / Thesis / Master of Applied Science (MASc)

O benzeno é um hidrocarboneto aromático produzido pela combustão de produtos naturais. A exposição ocupacional ao benzeno é caracterizada por ambientes industriais que o empregam em seus processos produtivos. Nos laboratórios de indústria do petróleo ele é utilizado em forma pura para análise, e está presente como contaminante em derivados, como gasolina, hexano, querosene, tolueno, entre outros. No Brasil o valor recomendado pela legislação como limite de exposição ambiental ao benzeno é de 1ppm. O câncer hematológico é considerado um dos principais fatores de risco para a saúde dos trabalhadores expostos ao benzeno e a utilização de biomarcadores no monitoramento destes profissionais tem sido sugerida em diferentes países. O presente trabalho teve como objetivo avaliar diferentes biomarcadores em sangue periférico de trabalhadores homens, cronicamente expostos ao benzeno em refinarias e siderurgia (18 deles com diagnóstico de intoxicação), que estavam afastados de suas funções por períodos que variaram de cinco meses a 27 anos, com idade média de 46,8 ± 9,33 anos comparado com um grupo controle composto também de 20 homens, selecionados em Bancos de Sangue (idade média de 45,7 ± 8,00 anos), com diferentes ocupações não correlacionadas ao agente em estudo. Em ambos os grupos foram realizados hemograma completo, teste do micronúcleo em linfócitos com bloqueio da citocinese (CBMN), teste de FISH em linfócitos para a translocação t(15;17), bem como testes moleculares para avaliação de polimorfismos em genes envolvidos na metabolização do benzeno (MPO, NQO1, CYP1A1 e CYP2E1) e na eliminação de xenobióticos (GSTM1/GSTT1). Quanto ao hemograma à análise estatística realizada pelo teste t-Student revelou que os expostos ao benzeno apresentavam leucopenia com diferença altamente significante na contagem de leucócitos (p<0,001), neutrófilos (p<0,001), segmentados (p<0,001), linfócitos (p=0,013) e monócitos (p=0,010). A avaliação da série eritrocitária também revelou diferenças estatísticas entre os grupos para os índices de RDW-CV (p= 0,031) e RDW-SD (p=0,008), assim como para o VPM (p=0,001). Não foi verificada diferença entre os grupos quanto à frequência de polimorfismos nos genes CYP1A1, CYP2E1, MPO, NQO1, GSTM1, GSTT1. No teste do CBMN a contagem de células com MN e pontes núcleoplasmáticas foi três vezes maior nos expostos (1,95 ± 2,37) que nos controles (0,65 ± 0,75), diferença essa considerada estatisticamente significante (t=2,33; 38gl; p=0,024). Na análise de FISH para o rearranjo PML/RAR? os trabalhadores expostos também apresentaram frequência três vezes maior de células com pelo menos uma fusão gênica (9,79 ± 9,54) em comparação aos controles (3,95 ± 3,17), diferença essa considerada estatisticamente significante pelo teste t-Student (p=0,019). Os resultados obtidos na presente investigação parecem estar de acordo com os dados da literatura que revelam alteração nas células primordiais da medula, decorrente da exposição ocupacional ao benzeno, bem como ação genotóxica, identificada pelos testes do CBMN e FISH em linfócitos de sangue periférico. Embora o número de trabalhadores estudados seja reduzido, e a exposição ocupacional possivelmente inclua outros agentes potencialmente genotóxicos que não só o benzeno é interessante ressaltar que os resultados positivos foram observados após em média nove anos de afastamento profissional. A utilização do teste do CBMN e o estudo de outras translocações, que não só a PML/ RAR?, em linfócitos de trabalhadores expostos pode representar um biomonitoramento importante e menos invasivo no acompanhamento destes trabalhadores. A análise de um grupo maior de trabalhadores, inclusive expostos a baixas concentrações de benzeno pode ser fundamental na validação destes biomarcadores. / Benzene is an aromatic hydrocarbon produced by the burning of natural products. The occupational exposure to benzene is characterized by industrial environments that use in their production processes. In the laboratories of Petroleum industry it is used in the pure form for analysis, and it is present as a contaminant in other products like gasoline, hexane, kerosene, toluene, etc. In Brazil the threshold limit value recommended by law in environmental exposure to benzene is 1 ppm. The hematological cancer is considered one of the main risk factors for the health of workers occupationally exposed to benzene and the use of biomarkers in monitoring these professionals has been suggested in different countries. The aim of this study was to assess different biomarkers in peripheral blood lymphocytes from 20 men workers chronically exposed to benzene in Petroleum Refinery and Steel Industry (18 workers with poisoning diagnosis), who were removed from workplace for periods ranging from five months to 27 years, with average age 46.8 ± 9.33 years old compared to a control group consisting also of 20 men, selected in Blood Banks (average age 45.7 ± 8.00 years old), with different occupations unrelated to the agent under study. In both groups were performed blood cell counts, cytokinesis-block micronucleus assay (CBMN), FISH assay in peripheral blood lymphocytes for translocation t(15;17), and molecular tests for evaluation of genetic polymorphisms in genes involved in benzene metabolism (MPO, NQO1, CYP1A1 e CYP2E1) and detoxification (GSTM1/GSTT1). Despite blood cell counts the statistical analysis performed by t-Student test revealed that workers exposed to benzene had leukopenia with a highly significant difference in leukocyte count (p<0.001), neutrophils (p<0.001), segmented (p<0.001), lymphocytes (p=0.013) and monocytes (p=0.010). The evaluation of red blood cells also revealed statistically significant differences between groups for RDW-CV (0.031), RDW-SD (0.008) and MPV (0.001). There were no differences between groups regarding the frequency of genetic polymorphisms in CYP1A1, CYP2E1, MPO, NQO1, GSTM1, and GSTT1. In the CBMN test the cell counts with MN and nucleoplasmic bridges was three times higher in exposed (1.95 ± 2.37) than in controls (0.65 ± 0.75), and the difference was considered statistically significant (t=2.33;38gl;p=0.024). In the FISH analysis for the PML/RAR? rearrangement the exposed workers also showed three times higher frequency of cells with at least one signal fusion (9.79 ± 9.54) in comparison to controls (3.95 ± 3.17), and the difference was statistically significant by the t-Student test (p=0.019). The results obtained in this study seem to agree with the literature data that show alterations in the stem cells of the bone marrow, resulting from occupational exposure to benzene, as well genotoxicity, identified by CBMN and FISH assay in peripheral blood lymphocytes. Although the number of subjects evaluated is reduced, and the occupational exposure includes other potentially genotoxic agents not only benzene, it is interesting to note that positive results were observed after an average of nine years of removal professional. The use of the CBMN test and the study of other translocations, not only PML/ RAR?, in lymphocytes of workers exposed may represent an important biomonitoring and less invasive monitoring of workers. The analysis of a major number of individuals, including those exposed to low concentrations of benzene, may be essential in validation of these biomarkers.

O fator CIITA é a proteína responsável por controlar a transcrição de genes do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II) envolvidos na apresentação antigênica a linfócitos T CD4+. A expressão desta proteína é complexa e célula-específica, dependendo de mecanismos de regulação transcricionais e póstranscricionais. Com o intuito de investigar o potencial do fator CIITA como adjuvante molecular, no presente estudo desenvolvemos e validamos sistemas de transferência gênica capazes de promover a eficiente expressão de CIITA em vários tipos celulares. Além disso, investigamos a regulação pós-traducional deste fator em células não hematopoéticas. Desta forma, foram produzidos um vetor plasmidial e um vetor lentiviral, ambos carreando a sequência do fator CIITA humano desenhada in silico visando a eliminação de elementos cis-reguladores, e otimizada para eficiente expressão em células humanas. A transfecção/transdução de três linhagens de células humanas não hematopoéticas resultou na eficiente expressão de CIITA com localização nuclear apropriada. Células expressando CIITA apresentaram síntese de novo do MHC II, confirmando a funcionalidade da proteína e validando ambos os vetores para a análise futura da atividade adjuvante do CIITA em imunizações gênicas. Ensaios preliminares de inoculação de explantes de pele humana com o vetor lentiviral evidenciaram a eficiente transdução e expressão do CIITA exógeno em células primárias. Em seguida, células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos de indivíduos saudáveis ou infectados com HIV-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral para confirmar a expressão do CIITA em células primárias e avaliar a aplicação desse sistema adjuvante no aprimoramento da vacina de DCs anti-HIV. DCs de indivíduos saudáveis ou infectados foram transduzidas com sucesso pelo lentivírus, o qual induziu uma produção prolongada do mRNA codificando CIITA. Entretanto, os vetores lentivirais induziram um aumento inespecífico da expressão de marcadores fenotípicos das DCs, incluindo as moléculas do MHC II, o que impediu a avaliação indireta da expressão e atividade do fator CIITA através da detecção da expressão aumentada do MHC II. Ensaios futuros irão avaliar se o fator transcricional é expresso pelas DCs transduzidas ou se essas células apresentam um controle mais restrito da expressão do CIITA comparadas às linhagens celulares avaliadas. Interessantemente, ensaios de western blot comparativos entre as três linhagens de células humanas transfectadas/transduzidas, juntamente com ensaios de inibição da degradação protéica pelo inibidor do proteassoma, nos permitiu descrever um novo mecanismo de regulação pós-traducional do CIITA. Aqui, nós identificamos que cada tipo de célula não hematopoética mantém níveis específicos da proteína, e portanto, da sua atividade transcricional, através da regulação da degradação do CIITA pelo proteassoma. Essa regulação é mediada pela modulação dos níveis das proteínas da leucemia promielocítica (PML) acopladas a proteínas SUMO (modificadores pequenos similares à ubiquitina), modificação pós-traducional requerida para a interação PML-CIITA que impede a degradação pelo proteassoma. Esse novo mecanismo aqui descrito contribui para o entendimento ainda incipiente da regulação pós-traducional do fator CIITA em células não hematopoéticas e pode ter implicações importantes na aplicação dessa proteína como adjuvante molecular para imunoterapias / The CIITA factor is a protein responsible for controlling the transcription of major histocompatibility complex class II (MHC II) genes involved on antigen presentation to CD4+ T helper cells. The expression of this transcription factor is complex and differs in various cell types depending on transcriptional and post-transcriptional regulatory mechanisms. In order to investigate the CIITA factor potential as molecular adjuvant, here we developed and validated two gene delivery systems capable of promoting efficient CIITA expression in various human cell types. Additionally, we applied the delivery systems to investigate the post-translational regulation of this factor in nonimmune cells. A DNA plasmid and a lentiviral vector were produced, both carrying the human CIITA DNA sequence in silico designed to avoid cis-regulatory elements, and genetic optimized for expression efficacy in human cells. Transfection or transduction of three different non-immune human cell lines resulted in efficient CIITA expression with proper nuclear localization. The CIITA-expressing cells presented de novo MHC II molecules expression confirming the functionality of the exogenous protein, and validating both delivery systems for the future analysis of the CIITA adjuvant activity in genetic immunizations. Preliminary assays involving the inoculation of the lentiviral vector into human skin explants showed efficient transduction and expression of exogenous CIITA in primary cells. Next, monocyte-derived dendritic cells (DCs) from healthy individuals and HIV-1-infected patients were transduced with the lentiviral vector to confirm the exogenous CIITA expression in primary human cells and also evaluate the applicability of this adjuvant system to improve the DC-based vaccines against HIV. DCs from healthy and infected individuals were successfully transduced by the lentivirus, which induced a sustained CIITA mRNA production. However, the vector particles by themselves induced an unspecific upregulation of DC`s phenotypic surface markers, including the MHC II molecules, impairing our strategy to indirectly evaluate CIITA expression and activity through the detection of MHC II enhanced expression. Further investigations are necessary to confirm whether the transcription factor is efficiently expressed in transduced DCs or if these cells present a more restrict control of CIITA protein expression than the evaluated non-immune cells. Interestingly, western blot assays comparing the three human cell lines, transfected or transduced, along with inhibition of protein degradation by proteasome inhibitor treatments, allowed us to describe a new and intricate mechanism of CIITA post-translational regulation. Here we identified that each non-immune cell type maintain specific protein levels, and hence transcriptional activity, by modulating the rate of CIITA proteasomal degradation. This modulation is achieved by controlling the levels of Promyelocytic Leukemia (PML) proteins attached to Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) proteins, a post-translational modification required for the PML-CIITA interaction, which impairs the proteasomal degradation. This new mechanism described here contributes to the developing understanding of the CIITA post-translational regulation in non-immune cells, and might have important implications in the use of this transcription factor as a molecular adjuvant for immunotherapies

Les interférons (IFN) constituent une famille de cytokines aux propriétés antiprolifératives et antivirales. Ils activent, via la voie Jak/STAT, des gènes spécifiques dont les produits sont les médiateurs des effets biologiques des IFN. C’est le cas de PML (Promyelocytic leukemia), appelée aussi TRIM19, qui joue un rôle central dans la défense antivirale. PML appartenant à la famille des protéines Tripartite Motif (TRIM), caractérisée par la présence en N-terminal d’un motif RBCC, constitué d’un domaine RING, d’une ou de deux boites B et d’un domaine coiled-coil. PML a été identifiée dans la leucémie aiguë promyélocytaire, une pathologie causée par la translocation chromosomique t(15 ;17) qui fusionne les gènes PML et RARA, aboutissant à la synthèse d'une protéine chimère PML-RARA. Le trioxyde d'arsenic (As2O3) cible la portion PML de la protéine oncogénique, entraînant sa dégradation et la rémission complète des patients. Dans les cellules saines, les transcrits PML issus d’un gène unique génèrent par épissage alternatif 7 isoformes principales de PML, dont six sont nucléaires (PMLI à PMLVI) et une cytoplasmique (PMLVIIb). Toutes possèdent la même extrémité N-terminale mais diffèrent au niveau de leur extrémité C-terminale, conférant à chaque isoforme des fonctions spécifiques.PML est l’organisatrice d’une structure multi-protéique appelée corps nucléaires (CN), impliquée dans divers processus cellulaires tels que l’apoptose, la dégradation des protéines ou encore la défense antivirale.PML est modifiée par SUMO de façon covalente au niveau de trois sites lysines (K65, K160, K490) et de façon non covalente, via son domaine SIM (pour « SUMO Interacting Motif »). Ces modifications sont requises pour la formation de CN fonctionnels et le recrutement de protéines partenaires au sein de ceux-ci. Le but de ma thèse a été d’étudier le rôle différentiel des différentes isoformes de PML en réponse à l’As2O3 et suite à l’infection virale. Nous avons montré que le SIM de PML est nécessaire à sa dégradation en réponse à l'As2O3. Ce motif est présent dans toutes les isoformes de PML, hormis l’isoforme nucléaire PMLVI et l’isoforme cytoplasmique PMLVIIb. Le SIM de PML n’est pas requis pour sa SUMOylation et son interaction avec RNF4 (une E3 ubiquitine ligase responsable de la dégradation de PML via le protéasome). En revanche, ce motif est requis pour l’ubiquitination de PML, le recrutement des composants du protéasome et sa dégradation en réponse à l’As2O3. Concernant les propriétés antivirales de PML, l’étude que nous avons menée avec toutes les isoformes de PML a permis de montrer que seules PMLIII et PMLIV confèrent une résistance au Virus de la Stomatite Vésiculaire (VSV). L’effet antiviral de PMLIII n'est observé qu'à faible multiplicité d’infection (MOI) et est indépendant de la production d’IFN. Par contre, PMLIV exerce une puissante activité anti-VSV, y compris à forte MOI et s'exerce selon deux mécanismes distincts : (i) PMLIV inhibe la réplication du VSV par un mécanisme précoce indépendant de l’IFN, (ii) PMLIV augmente tardivement la production d’IFN-β via une plus forte activation d’IRF3 qui est due à la séquestration spécifique de Pin1 au sein des CN par PMLIV. Ces deux processus nécessitent la SUMOylation de PMLIV. Ces résultats montrent que PMLIV exerce une activité antivirale intrinsèque et est impliquée dans l’immunité innée en régulant positivement la voie de transduction conduisant à la synthèse d’IFN-β. / Interferons (IFNs) are a family of cytokines with antiproliferative and antiviral properties.They activate, via the Jak/Stat pathway, specific genes whose products are the mediators of the biological effects of IFNs. This is the case of PML (Promyelocytic leukemia), also known as TRIM19, which plays a central role in antiviral defense.PML belongs to the Tripartite Motif (TRIM) protein family, characterized by the presence of an N- terminal RBCC pattern, consisting of a RING domain, one or two B-boxes and a coiled-coil domain. PML was identified in acute promyelocytic leukemia, a disease caused by the chromosomal translocation t(15 ;17), which fuses the PML and RARA genes, leading to the synthesis of a chimeric protein PML-RARA . Arsenic trioxide (As2O3) targets the PML moiety of the oncogenic protein, resulting in its degradation and in the complete remission of patients.In healthy cells, PML transcripts derived from a single gene generate seven major isoforms of PML by alternative splicing, including six nuclear (PMLI to PMLVI) and one cytoplasmic (PMLVIIb). All share the same N-terminus but differ at their C-terminus, giving each isoform specific functions.PML is the organizer of a multi-protein structure called nuclear bodies (NBs) that are involved in various cellular processes such as apoptosis, protein degradation or antiviral defense.PML is covalently modified by SUMO at three lysine residues (K65, K160, K490) but also non-covalently via its SIM domain (for « SUMO Interacting Motif »). These modifications are required for the formation of functional NBs and the recruitment of partner proteins within them.The aim of my thesis was to study the differential role of the different PML isoforms in response to As2O3 and during viral infection.We have shown that the SIM PML SIM is necessary for its degradation in response to As2O3. This motif is present in all PML isoforms, except the nuclear PMLVI and the cytoplasmic PMLVIIb isoforms. The SIM of PML is not required for its SUMOylation and its interaction with RNF4 (the E3 ubiquitin ligase responsible for PML proteasome-dependent degradation). However, this motif is required for the ubiquitination of PML, the recruitment of proteasome components and the degradation of PML in response to As2O3.Concerning the antiviral properties of PML, the study that we conducted with all PML isoforms allowed us to show that only PMLIII and PMLIV confer resistance to Vesicular Stomatitis Virus (VSV). Whereas the antiviral activity of PMLIII is only observed at low multiplicity of infection (MOI) and is independent of IFN production, PMLIV has a potent anti-VSV activity, including at high MOI, which is mediated through two distinct mechanisms: (i) PMLIV inhibits the replication of VSV by an early and IFN-independent mechanism, (ii) PMLIV later increases the production of IFN-β via a stronger activation of IRF3, which is due to the specific sequestration of Pin1 by PMLIV within NBs. Both processes require the PMLIV SUMOylation. These results show that PMLIV has an intrinsic antiviral activity and is also involved in innate immunity by positively regulating the transduction pathway leading to IFN-β synthesis.

O fator CIITA é a proteína responsável por controlar a transcrição de genes do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II) envolvidos na apresentação antigênica a linfócitos T CD4+. A expressão desta proteína é complexa e célula-específica, dependendo de mecanismos de regulação transcricionais e póstranscricionais. Com o intuito de investigar o potencial do fator CIITA como adjuvante molecular, no presente estudo desenvolvemos e validamos sistemas de transferência gênica capazes de promover a eficiente expressão de CIITA em vários tipos celulares. Além disso, investigamos a regulação pós-traducional deste fator em células não hematopoéticas. Desta forma, foram produzidos um vetor plasmidial e um vetor lentiviral, ambos carreando a sequência do fator CIITA humano desenhada in silico visando a eliminação de elementos cis-reguladores, e otimizada para eficiente expressão em células humanas. A transfecção/transdução de três linhagens de células humanas não hematopoéticas resultou na eficiente expressão de CIITA com localização nuclear apropriada. Células expressando CIITA apresentaram síntese de novo do MHC II, confirmando a funcionalidade da proteína e validando ambos os vetores para a análise futura da atividade adjuvante do CIITA em imunizações gênicas. Ensaios preliminares de inoculação de explantes de pele humana com o vetor lentiviral evidenciaram a eficiente transdução e expressão do CIITA exógeno em células primárias. Em seguida, células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos de indivíduos saudáveis ou infectados com HIV-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral para confirmar a expressão do CIITA em células primárias e avaliar a aplicação desse sistema adjuvante no aprimoramento da vacina de DCs anti-HIV. DCs de indivíduos saudáveis ou infectados foram transduzidas com sucesso pelo lentivírus, o qual induziu uma produção prolongada do mRNA codificando CIITA. Entretanto, os vetores lentivirais induziram um aumento inespecífico da expressão de marcadores fenotípicos das DCs, incluindo as moléculas do MHC II, o que impediu a avaliação indireta da expressão e atividade do fator CIITA através da detecção da expressão aumentada do MHC II. Ensaios futuros irão avaliar se o fator transcricional é expresso pelas DCs transduzidas ou se essas células apresentam um controle mais restrito da expressão do CIITA comparadas às linhagens celulares avaliadas. Interessantemente, ensaios de western blot comparativos entre as três linhagens de células humanas transfectadas/transduzidas, juntamente com ensaios de inibição da degradação protéica pelo inibidor do proteassoma, nos permitiu descrever um novo mecanismo de regulação pós-traducional do CIITA. Aqui, nós identificamos que cada tipo de célula não hematopoética mantém níveis específicos da proteína, e portanto, da sua atividade transcricional, através da regulação da degradação do CIITA pelo proteassoma. Essa regulação é mediada pela modulação dos níveis das proteínas da leucemia promielocítica (PML) acopladas a proteínas SUMO (modificadores pequenos similares à ubiquitina), modificação pós-traducional requerida para a interação PML-CIITA que impede a degradação pelo proteassoma. Esse novo mecanismo aqui descrito contribui para o entendimento ainda incipiente da regulação pós-traducional do fator CIITA em células não hematopoéticas e pode ter implicações importantes na aplicação dessa proteína como adjuvante molecular para imunoterapias / The CIITA factor is a protein responsible for controlling the transcription of major histocompatibility complex class II (MHC II) genes involved on antigen presentation to CD4+ T helper cells. The expression of this transcription factor is complex and differs in various cell types depending on transcriptional and post-transcriptional regulatory mechanisms. In order to investigate the CIITA factor potential as molecular adjuvant, here we developed and validated two gene delivery systems capable of promoting efficient CIITA expression in various human cell types. Additionally, we applied the delivery systems to investigate the post-translational regulation of this factor in nonimmune cells. A DNA plasmid and a lentiviral vector were produced, both carrying the human CIITA DNA sequence in silico designed to avoid cis-regulatory elements, and genetic optimized for expression efficacy in human cells. Transfection or transduction of three different non-immune human cell lines resulted in efficient CIITA expression with proper nuclear localization. The CIITA-expressing cells presented de novo MHC II molecules expression confirming the functionality of the exogenous protein, and validating both delivery systems for the future analysis of the CIITA adjuvant activity in genetic immunizations. Preliminary assays involving the inoculation of the lentiviral vector into human skin explants showed efficient transduction and expression of exogenous CIITA in primary cells. Next, monocyte-derived dendritic cells (DCs) from healthy individuals and HIV-1-infected patients were transduced with the lentiviral vector to confirm the exogenous CIITA expression in primary human cells and also evaluate the applicability of this adjuvant system to improve the DC-based vaccines against HIV. DCs from healthy and infected individuals were successfully transduced by the lentivirus, which induced a sustained CIITA mRNA production. However, the vector particles by themselves induced an unspecific upregulation of DC`s phenotypic surface markers, including the MHC II molecules, impairing our strategy to indirectly evaluate CIITA expression and activity through the detection of MHC II enhanced expression. Further investigations are necessary to confirm whether the transcription factor is efficiently expressed in transduced DCs or if these cells present a more restrict control of CIITA protein expression than the evaluated non-immune cells. Interestingly, western blot assays comparing the three human cell lines, transfected or transduced, along with inhibition of protein degradation by proteasome inhibitor treatments, allowed us to describe a new and intricate mechanism of CIITA post-translational regulation. Here we identified that each non-immune cell type maintain specific protein levels, and hence transcriptional activity, by modulating the rate of CIITA proteasomal degradation. This modulation is achieved by controlling the levels of Promyelocytic Leukemia (PML) proteins attached to Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) proteins, a post-translational modification required for the PML-CIITA interaction, which impairs the proteasomal degradation. This new mechanism described here contributes to the developing understanding of the CIITA post-translational regulation in non-immune cells, and might have important implications in the use of this transcription factor as a molecular adjuvant for immunotherapies

O benzeno é um hidrocarboneto aromático produzido pela combustão de produtos naturais. A exposição ocupacional ao benzeno é caracterizada por ambientes industriais que o empregam em seus processos produtivos. Nos laboratórios de indústria do petróleo ele é utilizado em forma pura para análise, e está presente como contaminante em derivados, como gasolina, hexano, querosene, tolueno, entre outros. No Brasil o valor recomendado pela legislação como limite de exposição ambiental ao benzeno é de 1ppm. O câncer hematológico é considerado um dos principais fatores de risco para a saúde dos trabalhadores expostos ao benzeno e a utilização de biomarcadores no monitoramento destes profissionais tem sido sugerida em diferentes países. O presente trabalho teve como objetivo avaliar diferentes biomarcadores em sangue periférico de trabalhadores homens, cronicamente expostos ao benzeno em refinarias e siderurgia (18 deles com diagnóstico de intoxicação), que estavam afastados de suas funções por períodos que variaram de cinco meses a 27 anos, com idade média de 46,8 ± 9,33 anos comparado com um grupo controle composto também de 20 homens, selecionados em Bancos de Sangue (idade média de 45,7 ± 8,00 anos), com diferentes ocupações não correlacionadas ao agente em estudo. Em ambos os grupos foram realizados hemograma completo, teste do micronúcleo em linfócitos com bloqueio da citocinese (CBMN), teste de FISH em linfócitos para a translocação t(15;17), bem como testes moleculares para avaliação de polimorfismos em genes envolvidos na metabolização do benzeno (MPO, NQO1, CYP1A1 e CYP2E1) e na eliminação de xenobióticos (GSTM1/GSTT1). Quanto ao hemograma à análise estatística realizada pelo teste t-Student revelou que os expostos ao benzeno apresentavam leucopenia com diferença altamente significante na contagem de leucócitos (p<0,001), neutrófilos (p<0,001), segmentados (p<0,001), linfócitos (p=0,013) e monócitos (p=0,010). A avaliação da série eritrocitária também revelou diferenças estatísticas entre os grupos para os índices de RDW-CV (p= 0,031) e RDW-SD (p=0,008), assim como para o VPM (p=0,001). Não foi verificada diferença entre os grupos quanto à frequência de polimorfismos nos genes CYP1A1, CYP2E1, MPO, NQO1, GSTM1, GSTT1. No teste do CBMN a contagem de células com MN e pontes núcleoplasmáticas foi três vezes maior nos expostos (1,95 ± 2,37) que nos controles (0,65 ± 0,75), diferença essa considerada estatisticamente significante (t=2,33; 38gl; p=0,024). Na análise de FISH para o rearranjo PML/RAR? os trabalhadores expostos também apresentaram frequência três vezes maior de células com pelo menos uma fusão gênica (9,79 ± 9,54) em comparação aos controles (3,95 ± 3,17), diferença essa considerada estatisticamente significante pelo teste t-Student (p=0,019). Os resultados obtidos na presente investigação parecem estar de acordo com os dados da literatura que revelam alteração nas células primordiais da medula, decorrente da exposição ocupacional ao benzeno, bem como ação genotóxica, identificada pelos testes do CBMN e FISH em linfócitos de sangue periférico. Embora o número de trabalhadores estudados seja reduzido, e a exposição ocupacional possivelmente inclua outros agentes potencialmente genotóxicos que não só o benzeno é interessante ressaltar que os resultados positivos foram observados após em média nove anos de afastamento profissional. A utilização do teste do CBMN e o estudo de outras translocações, que não só a PML/ RAR?, em linfócitos de trabalhadores expostos pode representar um biomonitoramento importante e menos invasivo no acompanhamento destes trabalhadores. A análise de um grupo maior de trabalhadores, inclusive expostos a baixas concentrações de benzeno pode ser fundamental na validação destes biomarcadores. / Benzene is an aromatic hydrocarbon produced by the burning of natural products. The occupational exposure to benzene is characterized by industrial environments that use in their production processes. In the laboratories of Petroleum industry it is used in the pure form for analysis, and it is present as a contaminant in other products like gasoline, hexane, kerosene, toluene, etc. In Brazil the threshold limit value recommended by law in environmental exposure to benzene is 1 ppm. The hematological cancer is considered one of the main risk factors for the health of workers occupationally exposed to benzene and the use of biomarkers in monitoring these professionals has been suggested in different countries. The aim of this study was to assess different biomarkers in peripheral blood lymphocytes from 20 men workers chronically exposed to benzene in Petroleum Refinery and Steel Industry (18 workers with poisoning diagnosis), who were removed from workplace for periods ranging from five months to 27 years, with average age 46.8 ± 9.33 years old compared to a control group consisting also of 20 men, selected in Blood Banks (average age 45.7 ± 8.00 years old), with different occupations unrelated to the agent under study. In both groups were performed blood cell counts, cytokinesis-block micronucleus assay (CBMN), FISH assay in peripheral blood lymphocytes for translocation t(15;17), and molecular tests for evaluation of genetic polymorphisms in genes involved in benzene metabolism (MPO, NQO1, CYP1A1 e CYP2E1) and detoxification (GSTM1/GSTT1). Despite blood cell counts the statistical analysis performed by t-Student test revealed that workers exposed to benzene had leukopenia with a highly significant difference in leukocyte count (p<0.001), neutrophils (p<0.001), segmented (p<0.001), lymphocytes (p=0.013) and monocytes (p=0.010). The evaluation of red blood cells also revealed statistically significant differences between groups for RDW-CV (0.031), RDW-SD (0.008) and MPV (0.001). There were no differences between groups regarding the frequency of genetic polymorphisms in CYP1A1, CYP2E1, MPO, NQO1, GSTM1, and GSTT1. In the CBMN test the cell counts with MN and nucleoplasmic bridges was three times higher in exposed (1.95 ± 2.37) than in controls (0.65 ± 0.75), and the difference was considered statistically significant (t=2.33;38gl;p=0.024). In the FISH analysis for the PML/RAR? rearrangement the exposed workers also showed three times higher frequency of cells with at least one signal fusion (9.79 ± 9.54) in comparison to controls (3.95 ± 3.17), and the difference was statistically significant by the t-Student test (p=0.019). The results obtained in this study seem to agree with the literature data that show alterations in the stem cells of the bone marrow, resulting from occupational exposure to benzene, as well genotoxicity, identified by CBMN and FISH assay in peripheral blood lymphocytes. Although the number of subjects evaluated is reduced, and the occupational exposure includes other potentially genotoxic agents not only benzene, it is interesting to note that positive results were observed after an average of nine years of removal professional. The use of the CBMN test and the study of other translocations, not only PML/ RAR?, in lymphocytes of workers exposed may represent an important biomonitoring and less invasive monitoring of workers. The analysis of a major number of individuals, including those exposed to low concentrations of benzene, may be essential in validation of these biomarkers.

Le rôle fonctionnel des transcrits de l’hétérochromatine péricentromérique reste à ce jour largement incompris chez les eucaryotes supérieurs. Néanmoins, il a été montré que ces transcrits sont soumis à un contrôle très précis, fonction du cycle cellulaire. La régulation de la transcription est fortement contrôlée par la structure de la chromatine qui peut être modifiée localement en changeant la composition biochimique du nucléosome, notamment par l’utilisation des variantes d’histones. L’objectif de ma thèse a été de mieux comprendre le rôle de la protéine chaperonne d’histone DAXX et de sa variante d’histone H3.3 dans la régulation de la transcription des séquences répétées péricentromériques. Par la méthode de purification TAP-TAG, les partenaires spécifiques de DAXX ont été identifiés à partir d’extraits solubles nucléaires de fibroblastes embryonnaires murins. Ces analyses ont mis en évidence que CAF-1, classiquement associé à H3.1, et les facteurs de remodelage de la chromatine ATRX et CHD4 interagissent spécifiquement avec DAXX. Le rôle de ces protéines dans le contrôle de la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique a ensuite été mis en évidence par une approche combinant l’interférence ARN et la Q-PCR. Enfin, les résultats suggèrent fortement que ces mécanismes de régulation ont lieu au niveau des corps nucléaires PML. L’ensemble de ces données montre qu’il existe une régulation spatio-temporel très fine de la structure de la chromatine régulant la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique. / The functional role of pericentromeric heterochromatin transcripts remains largely unknown in higher eukaryotes. Nevertheless, it has been shown that these transcripts are subject to very precise control, depending on the cell cycle. Regulation of transcription is tightly controlled by chromatin structure that can be modified locally by changing the biochemical composition of the nucleosome, including the use of histone variants. The aim of my thesis was to better understand the role of the histone chaperone protein DAXX and its histone variant H3.3 in the regulation of transcription of pericentromeric repeats. By the method of TAP-TAG purification, DAXX specific partners were identified from soluble nuclear extracts of murine embryonic fibroblasts. These analyzes revealed that CAF-1, classically associated with H3.1, and the chromatin remodeling factors, ATRX and CHD4, specifically interact with DAXX. The role of these proteins in the control of transcription of pericentromeric heterochromatin was then highlighted by an approach combining RNAi and Q-PCR. Finally, the results strongly suggest that these regulatory mechanisms take place at PML nuclear bodies. Taken together, these data show that there is a spatio-temporal regulation of the fine structure of chromatin regulates transcription of pericentromeric heterochromatin.

Tese de mestrado integrado. Engenharia Civil (Área de Especialização de Geotecnia). Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Pour réduire les nuisances sonores produites par un avion, les traitements acoustiques se doivent d'être réalisables par des matériaux caractérisés par des impédances complexes réglables.<br />L'objet de cette thèse est l'étude et le contrôle d'un modèle de perturbations aéroacoustiques d'un écoulement porteur stationnaire et subsonique, le système régi par les équations d'Euler linéarisées (EEL). Le but est de contrôler les phénomènes de propagations aéroacoustiques, générés dans un domaine (a priori infini) et localisés sur un observatoire spatio-temporel, en utilisant comme variables de contrôle des paramètres locaux d'impédances complexes caractérisant la frontière d'un obstacle solide situé à l'intérieur du domaine. En utilisant dans le cadre de l'aéroacoustique la théorie des systèmes de Friedrichs, et en classifiant les conditions aux limites admissibles à adjoindre au système des EEL, nous montrons le caractère bien posé sur un domaine spatio-temporel borné, d'un problème direct régissant les phénomènes physiques mis en jeu, ainsi que d'un problème adjoint rétrograde, étape indispensable à la résolution de problèmes inverses. <br />La méthode d'approximation choisie pour résoudre ces problèmes est une méthode de type Galerkine discontinue reposant sur un flux-splitting décentré en espace, combinée avec un schéma de type Runge-Kutta pour l'approximation temporelle. Comme toujours en propagations d'ondes, la simulation de l'espace libre est primordiale. Dans cette optique, une méthode PML adaptée aux EEL est proposée et numériquement validée.<br />Enfin, une attention toute particulière est portée à la signification physique de ce travail. Un modèle d'homogénéisation de matériaux poreux est utilisé, permettant de relier les variables de contrôle à des paramètres physiques caractérisant la faisabilité expérimentale de matériaux absorbants. Les résultats numériques obtenus sur un modèle académique de prise d'air, illustrent la nécessité de la mise en place de cette méthodologie pour résoudre les problèmes inverses en aéroacoustique dans toutes leurs complexités.

A partir de l'établissement d'une approximation in stationnaires en 3D des potentiels retardés pour des courants électromagnétiques sur des polyèdres non-nécessairement convexes, une méthode de résolution pour la simulation de la diffraction par un ensemble non-connexe d'objets est formulée. Une partition de ce dernier est effectuée suivant les inhomogénéités présentes. Le problème est alors traduit en un système d'équations de Maxwell couplées, chacune étant homogène hors d'un élément correspondant de la partition, qui induit la construction d'une solution du problème initial. Par approximation des termes de couplage, il s'en suit une méthode naturellement hybride et parallèle sur un système stable et bien-posé. La restriction de chaque sous-système à un voisinage du support de ses inhomogénéités est obtenue par introduction de conditions aux limites absorbantes de type "PML" dont un formalisme généralisé est étudié. Des exemples numériques illustrent l'ensemble de ces développements.