Hepatitis C virus (HCV), a positive-sense RNA virus that chronically infects between 2.7 and 3.9 million Americans, is highly mutational, making the HCV infection difficult to treat. Thus, it is of high interest to search for highly conserved therapeutic targets within the HCV genome. Two such sequences are located within the 5' untranslated region (UTR) of HCV, being complementary for the microRNA miR-122, a liver microRNA essential for the production of the infectious virus. The use of peptide nucleic acids (PNAs) as therapeutic agents has become a promising area of study in recent years. In this study, we characterized the interactions between miR-122 and the HCV 5'UTR and designed PNAs to disrupt these interactions and thus, inhibit RNA replication and translation. Our results show that the PNAs effectively disrupt the interactions involving miR-122 and the 5'UTR, thereby increasing the possibility of a new therapeutic option against HCV. / Bayer School of Natural and Environmental Sciences / Chemistry and Biochemistry / MS / Thesis

Ce travail s’inscrit dans le cadre de la recherche relative au développement de biosenseurs à ADN électrochimiques. Des aspects fondamentaux, ainsi que des aspects d’application de la détection d’hybridation d’ADN sont envisagés. Dans un premier temps, le comportement interfacial et le processus d’hybridation d’oligonucléotides d’ADN linéaires et ADN hairpin (structure en épingle à cheveux) nonmarqués sont étudiés en formant des monocouches auto-assemblées mixtes de monobrins d’ADN (ssADN) thiolés et d’un hydroxyalcanethiol (4-mercaptobutan-1-ol) par coadsorption spontanée sur des électrodes d’or polycristallin. L’immobilisation de monocouches mixtes ssADN/MCB est caractérisée par voie électrochimique et par spectroscopie des photoélectrons X. Des mesures de chronocoulométrie, en présence de [Ru(NH3)6]3+ (RuHex), permettent de déterminer la quantité d’ADN dans la monocouche mixte formée. Les résultats montrent que l’excès superficiel d’ADN linéaire est plus important que l’excès superficiel d’ADN hairpin sous des conditions de formation identiques. La réaction de reconnaissance moléculaire d’hybridation est détectée par des mesures d’impédance en présence de [Fe(CN)6]3-/4-. L’hybridation se traduit dans le cas de l’ADN linéaire par une augmentation de la résistance au transfert d’électron Rct tandis que dans le cas de l’ADN hairpin, Rct diminue. Ces différences sont dues au plus faible recouvrement et au changement de conformation des molécules d’ADN hairpin lors de l’hybridation. Des mesures de réflectivité de neutrons nous ont permis de mettre en évidence l’augmentation de l’épaisseur du film d’ADN hairpin et de confirmer le changement conformationel ces sondes lors de la reconnaissance moléculaire. Dans la seconde partie, nous présentons une nouvelle méthode électrochimique de détection d’hybridation, basée sur les interactions électrostatiques entre le complexe cationique RuHex et les groupements phosphates de l’ADN. Afin d’améliorer la détection des molécules de PNA (peptide nucleic acid) ont été immobilisées comme sondes de reconnaissance moléculaire. Après hybridation des sondes PNA avec le brin complémentaire, RuHex s’adsorbe sur l’ADN hybridé et un signal de réduction de ces complexes redox, enregistré par voltampérométrie alternative, constitue une signature claire de l’hybridation d’ADN à l’interface modifiée. Les interactions RuHex/PNA-ADN ont été étudiées. La constante d’adsorption de RuHex sur l’électrode modifiée PNA/MCB après hybridation est évaluée à 2,9 (±0,3) 105 M-1 en milieu Tris-HCl 0,01M, selon une isotherme de Langmuir. Les performances analytiques de la méthode de détection (sensibilité, sélectivité et reproductibilité) ont été évaluées et optimisées pour la détection des séquences d’ADN du gène de l’ARNr 23S d’Helicobacter pylori. La méthode de détection électrochimique présentée est assez sélective pour permettre de discriminer les mutations ponctuelles A2143G et A2144C de la séquence de type sauvage. La diminution significative des signaux d’admittance enregistrés en présence des séquences mutées est attribuée à la capacité accrue de discrimination de mutations ponctuelles des molécules PNA. La réponse de détection est linéaire en fonction du logarithme de la concentration de la cible d’ADN sur plus de quatre ordres de grandeur (10-6 M à 10-10 M). La limite de détection de l’oligonucléotide d’ADN complémentaire de 80 pM est très bonne. La méthode a été appliquée avec succès à la détection de fragments PCR complémentaires de 100 et 400 paires de bases, amplifiés à partir de souches SS1 d’H.pylori.

Interkalatorfarbstoffe wie Thiazolorange (TO) wurden an Stelle einer internen Nucleobase in PNA eingebaut. Solche Konjugate werden als FIT-Sonden (Forced Intercalation of Thiazole Orange) bezeichnet. Bei Hybridisierung interkaliert Thiazolorange in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem mismatch Basenpaar in einen PNA·DNA-Duplex . Diese Arbeit befasste sich zunächst mit der Entwicklung einer linearen Strategie für die Festphasensynthese von PNA. Um den Einfluss der stacking- und pairing-Partner von Thiazolorange auf Stabilität und optische Eigenschaften der entsprechenden PNA•DNA-Duplexe zu untersuchen, wurden sowohl N-terminal (x) als auch C-terminal (y) benachbarte. Basen von TO in Aeg-TO- und D-Orn-TO-Oligomeren variiert. Die durchgeführten Studien belegen, dass das Thiazolorange-Basensurrogat seine Fluoreszenzintensität bei Hybridisierung am stärksten ändert, wenn es von zwei Adenin-Bausteinen flankiert wird. In Light-up-Sonden ist TO über einen flexiblen Linker mit dem N-oder C-Terminus des Oligomers verbunden, in FIT-Sonden ist eine Base durch TO ersetzt. Beide Varianten wurde in Hybridisierungsexperimenten miteinander verglichen. / Intercalator dyes such as thiazole orange have been linked into PNA by replacing an internal nucleobase. In these conjugates the DNA stain thiazole orange (TO) was forced to intercalate next to mismatched base pairs in a PNA•DNA duplex. These conjugates were named as FIT (Forced Intercalation of Thiazole orange) probes and are used to find single base mutation. This work was first concerned with the development of a linear strategy for the solid-phase synthesis of FIT-PNA. To explore the influence of thiazole orange stacking and pairing partners on stability and optical properties of duplexes the N’-terminal (x) and C’-terminal (y) bases of thiazole orange environment were varied for both Aeg-TO and D-Orn-TO containing oligomers. The above studies showed that the fluorescence of the thiazole orange base surrogate is most responsive to hybridisation when TO is flanked by adenine-adenine. The influence of the different attachment modes was explored by the hybridization experiments.

Le PNA est un des mîmes d’ADN les plus prometteurs en biologie moléculaire et génomique fonctionnel, pour des applications en tant que biosenseur ou encore dans son utilisation pour du diagnostique et de la détection. Les PNAs sont résistants aux nucléases et aux protéases et s’apparient à leurs complémentaires ADN et ARN selon les règles de Watson Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen inverse. Cependant, les PNAs ont une faible solubilité et une pauvre absorption cellulaire qui leurs empêchent d’être utilisés dans des applications thérapeutiques. Différentes modifications ont été apportées pour améliorer ces propriétés. Notre travail consiste à synthétiser une nouvelle génération d’oligonucléotides modifiés : les N-oxy PNAs, avec un lien N-oxy amide au lieu du lien amide. Ce changement peut apporter de nouvelles liaisons hydrogène et donne la possibilité de fonctionnaliser l’azote de la fonction N-oxy amide, stable vis-à-vis des hydrolyses enzymatiques et chimiques. Différentes méthodes de synthèse de nucléoaminooxy esters protégés orthogonalement sont présentées depuis la L-sérine ou la L-méthionine. Les bases nucléiques sont liées au squelette par des liens N-oxy amide, amide ou triazole. Différents dinucléo N-oxy peptides ont également été préparés depuis la L-méthionine. Un deuxième projet en collaboration avec LBPA est entrepris pour déterminer la structure secondaire de l’ARN. Des sondes chimiques, des Ribosondes, ont été préparées afin d’identifier les nucléotides dont les bases nucléiques sont appariées et celles qui ne le sont pas. / The PNA is one of the most successful DNA mimics for molecular biology and functional genomics, DNA diagnostic and detection, and biosensor applications. PNAs, being resistant to nucleases and proteases, bind to complementary DNA and RNA obeying Watson-Crick, Hoogsteen or reverse Hoogsteen base pairing rules. However, PNA has poor water solubility and a lack of cell permeability which prevent its therapeutic application. Different modifications have been made to improve these properties. Our work consists to synthesize a new generation of modified oligonucleotides: the N-oxy PNA, with an N-oxy amide bond in place of amide one. This change could bring new hydrogen bonds and the possibility to functionalize the nitrogen of the N-oxy amide function which is stable to enzymes and chemical hydrolysis. Different practical methodologies are presented for the synthesis of different orthogonally protected nucleoaminooxy esters from L-serine or L-methionine, with nucleobase linked through N-oxy amide, amide or triazole. Some dinucleo N-oxy peptides have also been prepared from L-methionine. A second project with LBPA is undertaken to determine the secondary structure of RNA. Chemical probes, the Ribosondes, have been synthesized to identify nucleotides with nucleic bases paired and unpaired.

La RMN est un outil analytique extrêmement puissant pour l’analyse quantitative et structurale, et est très utilisée en biologie structurale. C’est dans ce contexte que nous avons choisi d’étudier les interactions par RMN. Le premier système choisi est un système de polymères, les PEO. Ils sont caractérisés par plusieurs grandeurs physiques dont l’indice de polydispersité. Cet indice représente la distribution de taille d’une population de polymères. Nous avons développé une nouvelle méthode de diffusion par RMN, la DOSY afin d’accéder à cet indice : J. Viéville et al. / Journal of Magnetic Resonance 212 (2011)169–173 Le deuxième système complexe étudié est un type de molécules chimiques mimétiques de l’ADN, les PNA, acides nucléiques peptidiques. Les PNA possèdent des bases nucléiques leur permettant de former des liaisons avec l’ADN ou l’ARN. Nous avons montré par des analyses de RMN que les PNA en solution peuvent former des complexes très stables avec des températures de fusion élevées. Ces analyses RMN sont complétées par des analyses de dichroïsme circulaire.Afin de compléter notre panel d’études sur les interactions moléculaires par RMN, nous avons étudié les interactions protéine-ligand avec greffage de la protéine sur phase solide : J.M.P. Viéville et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 89 (2014) 18–23 / NMR is a powerfull technique we decided to extend to follow interactions in complex mixtures. First part is about polydispersity index of polymer which is an important physical parameter when working with polymers. We developed here a new method, based on PEO analysis, using diffusion experiments (DOSY) by NMR to assess the polydispersity index: J. Viéville et al. / Journal of Magnetic Resonance 212 (2011) 169–173. In a second time, we worked on peptidic nucleic acids, PNA. These chemicals molecules are designed to bind DNA or RNA for clinical studies. We studied PNA in solution, by NMR to showwhich kind of interactions they form on themselves. We found very stable complexes with high fusion temperatures. Circular dichroism measurements were helpful for fusion temperature determination and structural studies. To complete this panel, we were interested in the study of protein-ligand interaction. We developed a new way to follow them, using a grafted protein on a solid phase based on HR-MAS NMR technology: J.M.P. Viéville et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 89 (2014) 18–23

Single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (indels) constitute important sources of genetic variation which provide insight into disease aetiology and idiosyncratic differences in drug response. The analysis of such genetic variation relies upon the generation of allele-specific products, typically by enzymatic extension or the hybridization of allele-specific DNA probes. Herein, a distinct enzyme-free, dynamic chemistry-based method of producing allele-specific products for genotyping was developed. The approach was initially demonstrated in model systems using synthetic DNA, which was used as a template in a base-filling reductive amination reaction on a PNA backbone. The templated dynamic reaction between a free secondary amine at a ‘blank’ position on the PNA strand and four aldehyde-modified nucleobases drove selective formation of the ‘correct’ iminium intermediate according to Watson-Crick base-pairing rules. In a blind trial, the method was extended to genotype twelve cystic fibrosis patients for two mutations (one SNP and one indel) linked to this disease. Enzyme-free dynamic chemistry thus permitted successful genotyping in both singleplex and duplex formats, demonstrating the application of dynamic chemistry as a distinct method of allelediscrimination with certain advantages over those reported previously. The application of this method as a tool for the discovery of non-natural nucleobases with improved properties for antisense and genotyping applications was also investigated. Furthermore, progress was made towards the use of dynamic chemistry as a means of full nucleic acid sequence analysis, through the templated sequence-selective extension of PNA probes by reductive amination.

Peptide nucleic acids (PNAs) were used as encoding tags to enable the analysis of peptide libraries by PNA/DNA hybridisation onto DNA microarrays. This allowed entire peptide libraries to be organised and sorted in a two dimensional format whereby all library members could be interrogated and analysed on a one-byone basis. In this thesis, PNA-encoded peptide libraries, generated by split-and-mix library synthesis, were screened for a variety of functions. Peptide sequences identified from the screening of a PNA-encoded library were analysed in detail as the first specific substrates for chymopapain. A new PNAencoded library consisting of D-amino acids was synthesised and screened with a number of proteases in attempts to identify novel/unusual substrates. PNA-encoded libraries were also used in the screening of peptide libraries for other activities. Thus substrates for catalyst-free Hüisgen cycloaddition were identified following the reaction between an alkyne modified peptide library and azidofluorescein, while cell-penetrating peptides were identified by hybridization of an internalized encoded library onto a DNA microarray.

Hepatitis C, a life threatening disease, caused by the hepatitis C virus (HCV) currently affects over 170-200 million people worldwide (~3% of global human population), more than five times the percentage of total HIV infections. HCV infection has been shown to be a major cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma and is the leading cause of liver transplantation in the U.S. HCV has escaped every therapeutic target to date by means of its error-prone RNA polymerase, which allows it to mutate prolifically. The current standard anti-HCV therapy, which is pegylated interferon a combined with ribavirin, is difficult to tolerate, and more than 50% of HCV patients are refractory to it. No protective vaccine or therapeutic antibody is available, making the need for the development of an efficacious immunoprophylactic and therapeutic agent imperative. HCV is an enveloped virus with a positive sense RNA genome of ~9.6 kilobases (kb), which carries a large open reading frame (ORF), flanked by 5'- and 3'- untranslated regions (UTRs). Interestingly, within the highly mutational HCV RNA, there are a limited number of 100% conserved and functionally vital motifs, located in the 5' UTR, coding region and in the 3' UTR. Within the HCV genome, these motifs have been proposed to be involved in multiple exclusive interactions with each other and furthermore, these interactions have been demonstrated to be essential for HCV replication and/or translation of the viral proteins. / Bayer School of Natural and Environmental Sciences; / Chemistry and Biochemistry / PhD; / Dissertation;

The plasma membrane functions as a barrier, restricting entry of hydrophilic pharmaceutical agents. Cell-penetrating peptides (CPPs) are capable of transporting bioactive cargos into the cell and have consequently been extensively investigated for their mechanism of entry and capability to deliver various cargos spanning from peptides to plasmids. The main aim of this thesis was to investigate the mechanism and capability of some of these CPPs to deliver mainly oligonucleotides and peptides into the cell. Oligonucleotides in the form of ds DNA decoy for sequestering of transcription factors or PNAs for redirection of splicing. In addition, peptides derived from the interaction interface of a tumor suppressor protein were investigated for their potential to combine a biological effect with internalization. Peptides with or without any cargo were predominantly dependent on some form of endocytic mechanism for internalization, substantiated by using a functional assay, where all tested CPPs were associated with endocytosis for delivery of splice correcting PNAs. A new CPP, M918 proved most efficient in promoting splice correction and internalized mainly via macropinocytosis. In addition, TP10 efficiently delivered dsDNA decoy oligonucleotides for sequestering of the transcription factor Myc with a concomitant biological response, i.e. reduced proliferation. Finally, for the first time, to our knowledge, a novel pro-apoptotic peptide with cell-penetrating properties was designed from the tumor suppressor p14ARF, which decreased proliferation and induced apoptosis in cancer cell-lines, potentially mimicking the full-length protein. Altogether, this thesis highlights the functionality of CPPs and the possibility to develop new CPPs with improved or new properties, having the potential to advance delivery of therapeutic compounds.

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