Um total de 1.520 bactérias isoladas a partir de amostras de lodo de esgoto doméstico e de solo de área preservada foi avaliado para a produção de polihidroxialcanoatos (PHA) com os corantes lipofílicos Nile Red A e Sudan Black B, permitindo a detecção de 261 isolados. Ensaios de produção de PHA revelaram isolados produtores de P3HB apresentando valores superiores à linhagem Burkholderia sacchari LFM101 e valores de produção de PHAMCL superiores à linhagem Pseudomonas sp. LFM046, além de 6 isolados produtores da mistura de P3HB e PHAMCL. Os primers RECF1/RECR permitiram a detecção específica do gene phaC do tipo I de três bactérias produtoras de P3HB, e os primers P613F/P613R detectaram genes phaC do tipo I em bactérias produtoras da mistura de polímeros. Um fragmento de DNA de 4 kpb de uma biblioteca genômica do isolado RMP1058BII, produtor da mistura de P3HB e PHAMCL, foi detectado utilizando os primers P613F/P613R, e a expressão desse fragmento de DNA uma linhagem de Pseudomonas mutada no gene phaC levou à produção de pequena quantidade de P3HB. / A total of 1520 isolates from domestic sewage sludge or soil of preserved area were evaluated in regards of PHA production using the lipophilic Nile Red A or Sudan Black B dyes, allowing the detection of 261 isolates. PHA production experiments revealed P3HB producing isolates at higher amounts than the strain Burkholderia sacchari LFM101 and PHAMCL production rates higher than those presented by the strain Pseudomonas sp. LFM046, besides 6 isolates producing P3HB and PHAMCL mixtures. The RECF1/RECR primers allowed the specific type I phaC genes detection in three P3HB producing bacteria and the P613F/P613R primers detected type I phaC genes in the polymer mixture producing isolates. A 4 kbp DNA fragment from a genomic library of the isolate RMP1058BII was detected using the P613F/P613R primers. This DNA fragment expression in a Pseudomonas strain mutated in phaC gene leaded to the production of small amounts of P3HB.

Os polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres bacterianos. Na sua biossíntese, a PHA sintase incorpora monômeros 3HA à cadeia polimérica. O objetivo deste trabalho foi estudar o potencial da PHA sintase de 2 isolados do gênero Burkholderia sp. na produção de copolímeros. Construiram-se linhagens recombinantes que abrigavam os genes da PHA sintase classe I, em mutantes de Pseudomonas sp. e Burkholderia sacchari, que não acumulam PHA. Foram realizados ensaios de acúmulo de PHA usando glicose como fonte de carbono, apresentando a produção de unidades de 3HB, 3HO e 3HD nas linhagens recombinantes de Pseudomonas sp. As linhagens recombinantes de B. sacchari incorporaram como único constituinte P(3HB). Ensaios de acúmulo de PHA foram realizados nas linhagens recombinantes de B. sacchari, usando como co-substratos diferentes ácidos graxos, sendo detectada a incorporação de unidades de 3HV e 3HHx além do 3HB, quando foram fornecidos acido hexanóico e valérico. Estes resultados indicam que as PHA sintases classe I são capazes de incorporar diferentes unidades monoméricas. / The polyhydroxyalkanoates (PHA) are bacterial polyester. In their biosynthesis, the PHA synthase incorporates monomers 3HA to the polymer chain. The objective of this work was to study the potential of PHA synthase of 2 isolates of the genus Burkholderia sp. in the production of copolymers. Were constructed recombinant strains that housed the genes of PHA synthase class I mutants of Pseudomonas sp. and Burkholderia sacchari, which do not accumulate PHA. PHA accumulation assays were performed using glucose as carbon source, showing the production of units of 3HB, 3HO and 3HD in recombinant strains of Pseudomonas sp. The recombinant strains of B. sacchari incorporated as single constituent P(3HB). PHA accumulation assays were performed on the recombinant strains of B. sacchari, Using as co-substrates different fatty acids, being detected the incorporation of units of 3HV and 3HHx beyond the 3HB, when were supplied hexanoic acid and valerico. These results indicate that the PHA synthases class I are able to incorporate different monomer units.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2013-06-25T23:25:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 312251.pdf: 1753319 bytes, checksum: a37fe5bbb1eafe81394d43b9c6c92ac5 (MD5) / Empregando processos com membranas, isolados ou conjugados, é possível concentrar e fracionar proteínas e eliminar gordura do soro de queijo, reduzindo sua carga poluente e permitindo utilizar as correntes concentradas em produtos alimentícios, agregando-lhes valor econômico e nutricional. Através da ultrafiltração, por exemplo, é possível concentrar as principais proteínas do soro lácteo (albuminas e globulinas), enquanto a nanofiltração permite concentrar a lactose e parte dos sais minerais, especialmente os bi e tri-valentes. Considerando-se, ainda, o teor de matéria orgânica presente na corrente permeada da ultrafiltração do soro lácteo, principalmente a lactose, abre-se a possibilidade de utilizá-la como matéria prima para a produção de compostos de interesse tecnológico, como biopolímeros, através de bioprocessos. Podem ser citados como exemplos os poli-hidroxialcanoatos (PHAs), que são poliésteres sintetizados por bactérias a partir de substratos carbônicos. Por serem biodegradáveis e produzidos a partir de fontes renováveis de carbono, os PHAs são considerados uma alternativa aos materiais plásticos convencionais. Comercialmente, há interesse em reduzir custos na produção destes biopolímeros, buscando-se substratos de baixo valor comercial. Neste caso, o permeado do soro de queijo, obtido por ultrafiltração, se apresenta como fonte de carbono para esta finalidade, já que é um subproduto de baixo custo. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o emprego de processos de separação com membranas no tratamento do soro de queijo, propondo-se a produção biotecnológica do polímero biodegradável - PHA - utilizando-se a bactéria E. coli recombinante, a partir do permeado obtido da concentração das proteínas do soro. Foram utilizadas membranas de ultra e nanofiltração com massa molar de corte de 50.000 e de 150 a 300 g?mol-1, respectivamente. Buscando-se estabelecer as melhores condições operacionais durante o processamento do soro lácteo, em unidade piloto, variou se a temperatura, a pressão transmembrana e a vazão de alimentação. Foram avaliados os fatores de concentração dos componentes presentes no soro de queijo, o fluxo permeado e as resistências ao fluxo permeado que se estabelecem durante o processo. Para a produção de PHAs, utilizou-se E. coli recombinante linhagens JM 101 e ATCC 25922, contendo o plasmídeo pRLC2, ancorando genes responsáveis pela resistência a ampicilina e biossíntese de PHAs, obtidas através de técnicas de engenharia genética. As condições de cultivo da E. coli foram avaliadas em relação à produção de massa celular seca (MCS) (g?L-1) e do percentual de acúmulo intracelular de PHAs (g?L 1). Durante a ultrafiltração do soro de queijo, observou-se que o fouling e a formação de camada gel alteraram particularmente a seletividade da membrana em algumas condições experimentais, retendo compostos com massa molar inferior ao ponto de corte da membrana, levando a uma redução do fluxo permeado. Em relação aos cultivos, observou-se um efeito significativo (p<0,05) da utilização da lactose presente no soro de queijo sobre a produção de MCS. Observou-se, também, acúmulo intracelular de PHAs em E. coli recombinante linhagem JM 101 com o plasmídeo pRLC2, não sendo necessária a utilização do promotor de expressão gênica IPTG, apresentando acúmulo intracelular de PHAs de até 11,0% (±0,6). A utilização do permeado do soro de queijo obtido por ultrafiltração, como substrato para a produção de PHAs em E. coli recombinante linhagem ATCC 25922 (pRLC2), levou à produção de até 3,1 g?L-1 de MCS e acúmulo intracelular de PHAs de até 86,5%, evidenciando a possibilidade de se utilizar o soro de queijo ultrafiltrado na produção de PHAs, dando um destino biotecnológico ao tratamento deste resíduo originado das queijarias. / Membrane separation processes can be used for defatting, concentrate and to fractionate proteins of cheese whey. The fraction obtained this way can be used in formulation of different food products, thus adding value to this byproduct of dairy industries. The major whey proteins (albumins and globulins) can be concentrated by ultrafiltration, while nanofiltration can concentrate part of the lactose and minerals, particularly the bi- and trivalent salts. The permeate stream obtained in the ultrafiltration of the cheese whey still holds a large organic load due to the high content of lactose. Hence, it might be used as raw material for the production of compounds of technological interest, like the biopolymers aspolyhydroxyalkanoates (PHAs). PHA is a class of polyesters synthesized by bacteria. Since PHAs are biodegradable and produced from renewable carbon, they are considered as an alternative to conventional plastics. Commercially, there is an interest in reducing costs in the production of these biopolymers, using low cost substrates. In this context, the cheese whey permeate obtained by ultrafiltration is a potential carbon source for PHAs production. The aim of this study was to evaluate the use of membrane separation processes in the treatment of cheese whey, proposing the use of thepermeate fraction for the production of biodegradable biopolymer - PHAs bya recombinant E. coli strain.The whey was permeated through ultra and nanofiltration membranes with molecular weight cut off of 50.000 and 150-300 g·mol-1, respectively. The best operating conditions for membrane processing of the whey were determined in a pilot unit, varying temperature, transmembrane pressure and flow rate. The concentration factors of the constituents present in cheese whey were assessed, as well as the permeate flow and the resistance to the permeate flow during the process. Recombinant E. coli strains JM 101, and ATCC 25922 containing the plasmid pRLC2 anchoring genes encoding enzymes needed to PHAs biosynthesis were used in PHAs production assays.In the ultrafiltration of cheese whey, it was found that the fouling and formation of gel layer changed the selectivity of the membrane in some experimental conditions; causing the retention of compounds with lower molecular mass than the membrane nominal molecular mass cut-off, leading to a reduction in permeate flow. There was a significant effect (p<0.05) of lactose present in cheese whey on the bacterial dry cell weight (DCW) yield. The intracellular accumulation of PHAs in E. coli strain JM 101was up to 11.0% (±0.6). The use of the permeate from cheese whey ultrafiltration as substrate for the production of PHAs byrecombinant E. coli ATCC 25922 (pRLC2) led to a cell production up to 3.1 g·L-1 DCW and intracellular accumulation of PHAs up to 86.5%. These results suggestthe possibility of using the permeate of cheese whey ultrafiltrationfor production of PHAs, adding value to this dairy byproduct through a biotechnological application.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2013-07-15T22:41:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 211457.pdf: 782449 bytes, checksum: d435cd88c2395a1093a9452faf9e9c9a (MD5) / Poli(3-hidroxibutirato), P(3HB), é um polímero de reserva de carbono e energia acumulado intracelularmente por diversos microrganismos, sob condições desbalanceadas de crescimento. Além da vantagem de ser biodegradável e biocompatível, possui propriedades termoplásticas compatíveis aos plásticos convencionais. Embora apresente estas vantagens, apresenta um elevado custo de produção frente aos polímeros petroquímicos, o que dificulta o seu uso. Neste trabalho estudou-se a produção de P(3HB) em resíduos de indústrias de alimentos, objetivando reduzir os custos de produção. Primeiramente, verificou-se a capacidade de crescimento da bactéria Ralstonia eutropha nos resíduos das indústrias amiláceas e indústrias processadoras de maçã. Testou-se três modelos primários de crescimento, e o modelo Logístico, foi o que melhor descreveu o crescimento da bactéria nas diferentes fontes de carbono testadas. Após verificar a capacidade de crescimento da bactéria, foi realizada a produção de P(3HB), nos resíduos das indústrias de alimentos, e também a suplementação do meio de cultura com ácido oléico e óleo de soja, visando aumentar a produção de polímero. O resíduo da indústria amilácea mostrou-se uma boa fonte de carbono para a produção de P(3HB), onde os conteúdos de polímero acumulado foram de 46, 50 e 56% com produtividades de 0,22; 0,37 e 0,49 g.L-1.h-1 para as culturas sem suplementação, suplementação com ácido oléico e suplementação com óleo de soja. Quando se realizou o crescimento no resíduo da indústria processadora de maçã os conteúdos de P(3HB) acumulados foram de 14, 34 e 22% do total da massa celular seca, para as culturas sem suplementação, suplementação com ácido oléico e suplementação com óleo de soja. Apesar do baixo conteúdo de polímero acumulado, a utilização do bagaço de maçã como fonte de carbono para a produção de polihidroxialcanoatos é uma boa alternativa, pois é uma matéria-prima barata que pode contribuir na redução dos custos de produção deste biopolímero. A adição dos suplementos nutricionais ao meio de cultura favoreceu a produção de P(3HB) aumentando o conteúdo de polímero acumulado e a produtividade.

Submitted by Ligia Linardi Niero Rocha null (ligialinardi@yahoo.com.br) on 2017-09-20T15:22:27Z No. of bitstreams: 1 dissertFICHAcatal.pdf: 1496895 bytes, checksum: 6610a394252f7529b5cbd64a98cedde0 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-09-20T18:31:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rocha_lln_me_bot.pdf: 1496895 bytes, checksum: 6610a394252f7529b5cbd64a98cedde0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-20T18:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rocha_lln_me_bot.pdf: 1496895 bytes, checksum: 6610a394252f7529b5cbd64a98cedde0 (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os polihidroxialcanoatos (PHAs) são uma família de biopolímeros biodegradáveis, que podem substituir os plásticos petroquímicos em muitas aplicações, principalmente embalagens e utensílios domésticos. Contudo, estes bioplásticos são atualmente mais caros do que os de origem petroquímica. É possível encontrar vários estudos na literatura que investigam o uso de resíduos e substratos mais baratos, com o intuito de permitir a produção em grande escala do PHA. Os óleos vegetais são largamente utilizados na preparação de alimentos, na maioria das vezes no processo de fritura, o que acarreta grandes quantidades de resíduo, muitas vezes descartados incorretamente, trazendo prejuízo ao meio ambiente e à população. Sob esta consideração, os resíduos de óleo de fritura são abundantes e podem ser utilizados na produção de PHA sem qualquer tratamento adicional. Portanto, este trabalho analisou a produção de polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de duas linhagens de bactérias, Pseudomonas oleovorans e Bacillus megaterium, utilizando-se óleos residuais de frituras como fonte de carbono (óleo residual de fritura de batata, frango e pastel) e foram utilizados nas concentrações de 10 g.l-1 e 20 g.l-1, separadamente. Os ensaios de produção do biopolímero foram realizados em frascos agitados, em meio de cultura limitante em nitrogênio. A massa seca celular (MSC) foi determinada por gravimetria e a porcentagem de acúmulo e a composição do PHA foram determinados por cromatografia gasosa. A melhor condição de reação foi observada no óleo residual de fritura de batata, no qual a bactéria Bacillus megaterium alcançou uma concentração de 13,03 % de acúmulo de PHA (% MSC) e 3,93 g.l-1 de massa seca celular. Pelos resultados obtidos pode-se concluir que esta alternativa é promissora, além de não competir com a produção baseada em fontes de açúcar, que é comercialmente utilizada. / Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are a family of biodegradable biopolymers that can replace petrochemical plastics in many applications, especially packaging and household appliances. However, these bioplastics are currently more expensive than those of petrochemical origin. It is possible to find several studies in the literature that investigate the use of residues and cheaper substrates, in order to allow large scale production of the PHA. Vegetable oils are widely used in food preparation, most often in the frying process, which leads to large amounts of waste, often incorrectly discarded, causing damage to the environment and the population. Under this consideration, waste frying oils are abundant and can be used in the production of PHA without any further treatment. Therefore, this work studied the production of polyhydroxyalkanoates (PHA) from two strains of bacteria, Pseudomonas oleovorans and Bacillus megaterium, using waste frying oils as a source of carbon (waste oils from potato, chicken and pastel) and were used at concentrations of 10 g.l-1 and 20 g.l-1, separately. The biopolymer production assays were performed in shaken flasks, in nitrogen-limiting culture medium. The dry cell mass (DCM) was determined by gravimetry and the percentage of accumulation and the PHA composition were determined by gas chromatography. The best reaction condition was observed in the residual frying oil from potato, in which the bacterium Bacillus megaterium reached a PHA accumulation of 13.03 % and 3,93 g.l-1 of dry cell mass. From the results obtained it can be concluded that this alternative is promising, besides not competing with the production based on sources of sugar, that is commercially used.

Os polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres bacterianos. Na sua biossíntese, a PHA sintase incorpora monômeros 3HA à cadeia polimérica. O objetivo deste trabalho foi estudar o potencial da PHA sintase de 2 isolados do gênero Burkholderia sp. na produção de copolímeros. Construiram-se linhagens recombinantes que abrigavam os genes da PHA sintase classe I, em mutantes de Pseudomonas sp. e Burkholderia sacchari, que não acumulam PHA. Foram realizados ensaios de acúmulo de PHA usando glicose como fonte de carbono, apresentando a produção de unidades de 3HB, 3HO e 3HD nas linhagens recombinantes de Pseudomonas sp. As linhagens recombinantes de B. sacchari incorporaram como único constituinte P(3HB). Ensaios de acúmulo de PHA foram realizados nas linhagens recombinantes de B. sacchari, usando como co-substratos diferentes ácidos graxos, sendo detectada a incorporação de unidades de 3HV e 3HHx além do 3HB, quando foram fornecidos acido hexanóico e valérico. Estes resultados indicam que as PHA sintases classe I são capazes de incorporar diferentes unidades monoméricas. / The polyhydroxyalkanoates (PHA) are bacterial polyester. In their biosynthesis, the PHA synthase incorporates monomers 3HA to the polymer chain. The objective of this work was to study the potential of PHA synthase of 2 isolates of the genus Burkholderia sp. in the production of copolymers. Were constructed recombinant strains that housed the genes of PHA synthase class I mutants of Pseudomonas sp. and Burkholderia sacchari, which do not accumulate PHA. PHA accumulation assays were performed using glucose as carbon source, showing the production of units of 3HB, 3HO and 3HD in recombinant strains of Pseudomonas sp. The recombinant strains of B. sacchari incorporated as single constituent P(3HB). PHA accumulation assays were performed on the recombinant strains of B. sacchari, Using as co-substrates different fatty acids, being detected the incorporation of units of 3HV and 3HHx beyond the 3HB, when were supplied hexanoic acid and valerico. These results indicate that the PHA synthases class I are able to incorporate different monomer units.

Este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de 39 isolados bacterianos para produção de polihidroxialcanoatos contendo monômeros de cadeia média (PHA|MCL). Os isolados foram incapazes de utilizar eficientemente amido, lactose ou sacarose. O desempenho na produção de PHA a partir de glicose ou frutose pelos isolados foi inferior à linhagem de referência (Pseudomonas sp. LFM046). Muitos dos isolados apresentaram bom desempenho na conversão de glicerol em PHAMCL. Pela primeira vez, foram detectadas bactérias capazes de produzir PHAMCL a partir de xilose. Com base no sequenciamento do rDNA 16S, estes isolados foram identificados como pertencentes ao gênero Pseudomonas. Cultivos em biorreator, resultaram em uma biomassa de aproximadamente 6 g/L, contendo cerca de 11 a 14% de PHA. A superexpressão dos genes responsáveis pelo catabolismo de xilose (xylAB) em Escherichia coli não levou a melhora no consumo de xilose ou produção de PHAMCL. / This work aimed to evaluate the potential of 39 bacterial isolates to produce polyhydroxyalkanoates containing medium-chain monomers (PHAMCL). The isolates were unable to efficiently utilize starch, lactose or sucrose. The performance of the PHA production from glucose or fructose by the isolates was lower than the reference strain (Pseudomonas sp. LFM046). Many isolates showed good performance in the conversion of glycerol into PHAMCL. For the first time, bacterial isolates capable of producing PHAMCL from xylose were detected. Based on the sequencing of 16S rDNA, these isolates were identified as belonging to the genus Pseudomonas. Bioreactor cultures resulted in a biomass of approximately 6 g/L, containing about 11 to 14% PHA. Overexpression of the genes responsible for the catabolism of xylose (xylAB) in Escherichia coli did not led to improved xylose consumption or production of PHAMCL.

Os polihidroxialcanoatos constituem um grupo de poliésteres acumulados por inúmeras bactérias na forma de grânulos intracelulares, que podem representar até 80% da massa seca celular. No presente trabalho, foi avaliado o comportamento de diferentes linhagens quanto a capacidade de metabolizarem ácidos graxos livres e óleo de soja para a produção de biopolímeros e, posteriormente, em biorreator, algumas linhagens selvagens e recombinantes foram testadas na presença ou não de um inibidor da b-oxidação. Experimentos em frascos agitados, mostraram valores de teor de PHA em até cerca de 70% na biomassa total com cerca de 5% de monômeros de cadeia média permitindo selecionar as linhagens Cupriavidus necator e Burkholderia cepacia para os ensaios seguintes. Experimentos em biorreator mostraram que, as variáveis manipuláveis quanto ao fluxo de óleo de soja, de co-substratos e o inibidor de b-oxidação não influenciaram, significativamente, no rendimento de P3HB/3HAmcl formado quando utilizado Burkholderia cepacia IPT-048, entretanto, contribuíram na síntese de 3HV. Durante os ensaios, o aumento do número de cópias do gene phaB em Cupriavidus necator, aparentemente, não contribuíram para o aumento do rendimento de 3HHx, porém, outras variáveis manipuláveis deverão ser propostas para a confirmação. / The poly-3-hydroxyalkanoates (PHA) are a group of polyesters accumulated for several bacteria in the intracellular granule form, that can represent up to 80% of the dry mass cellular. The main advantage of the biopolymers on the synthetic materials is its degradation in the environment. Recycable raw materials can be used as carbon sources for the production biodegradable polymer. Some polymers have appeared in literature having mechanical characteristic considered appropriate in such a way for use in packings (flexible and covering films), how base for controlled release of asset to be applied in the pharmacological-medical and foods area. The P3HB-co-3HAmcl are 3-hydroxybutyrate copolymers and 3-hydroxyacyl of 6 or more carbon atoms which has aroused interest for to present intermediate properties between HB and HAmcl, having taken care of the requirements for diverse applications. Some strains are distinguished, however, assays in bottles agitated with the Cupriavidus sp. and Burkholderia sp. strains, using as substratum greasy free acid and soy oil, had led the promising results. In the present work, first, was evaluated the behavior of different strains (Cupriavidus necator DSM545 IPT-026, C. necator H16 IPT-027, Pseudomonas sp. IPT-066, Burkholderia cepacia IPT-048 and B. sacchari IPT-189) how much to metabolizer capacity of free fatty acids and soybean oil for the production of biopolymers and, later, in tank bioreactor some wild strains and recombinant had been tested together or not of an inhibitor of the boxidation (acid acrylic). Experiments in bottles with agitation, had shown values of PHA in about 70% of the total biomass with about 5% monomers chain average allowing to select the Burkholderia cepacia IPT-048 and Cupriavidus necator DSM545 strains for the following assays. Experiments in tank bioreactor had shown that, the interactions between the substratum, co-substratum and the inhibitor of boxidation had influenced in the amount of formed P3HB/3HAmcl when used the Burkholderia cepacia IPT-048 strains, contributing for the synthesis of 3HV and 3HHx. When used only the soybean oil (5g/L) was gotten an amount of HHx with about 6 mol% with Burkholderia cepacia strains. In this same condition was verified that after some determined period also proved monomer HV in an amount of 0.20 mol%. Adding the acid acrylic (0.18 g/L) were gotten 1.50 mol% of HHx, however, differently of the previous condition the amount of HV varied of 0.91 - 2.77 mol%. A conclusion for the condition soybean oil and acrylic acid is that, the strains is using the acrylic fatty acid as carbon source, or either, the formation of acrylil-CoA with consequent formation of chains with 5 carbons. Similar results had been gotten when analyzed extracted polymer, or either, after the stage of extraction with chloroform was verified that the amount varied of 1.60 - 2.14 mol%. When added to a cosubstratum in the phase of accumulation (caproic fatty acid) and absence of the acrylic acid, it did not have the increase of HHx in relation to the previous variable, as much that, the amount of monomer reached about 0.50 mol%. In this condition, the presence of the acrylic fatty acid also did not contribute for the HV synthesis, not having been observed monomers during the assays. In the following phase, in which we work with Cupriavidus necator and a recombinant (Cupriavidus necator::phaB) strains, was verified that the gotten amount of HHx had been similar, about 0.30 mol%. Our hypothesis, we believe that the increase of the number of copies of the gene phaB could contribute for the increase of the carbon flow in the direction to raise the amount of 3HB how much of other monomers. As in the assays in bottles with agitation substrat caproic and caprylic fatty acids they had been distinguished also when availabled 2g/L and the soybean oil of in a concentration of 5g/L, we analyze the strains recombinant with soybean oil and caprylic fatty acid with 5 g/L. The insistence in the use of the caprylic fatty acid was based on the fact of the possibility of strains to oxidate part of fatty acids for the production of cells and energy and, at the moment that had the nitrogen limitation, to begin the accumulation phase dividing two carbons for the production of acetyl-CoA and the remain of the chain was stored in the form of 3HHx. The caprylic fatty acid disponibility it did not have the monomer attainment, therefore, Cupriavidus necator and Cupriavidus necator::phaB had its replyed inhibited capacity by the substratum. In the added soybean oil bottles with and without the acrylic fatty acid the behavior it was the opposite to the observed with caprylic fatty acid. During the incubation period, for both the strains, the amount of PHA, and consequently, the percentage of 3HB in the dry mass cellular was of 22.95% (100 mol%) and 25.90% (100 mol%) in 28ª and 24ª hours, respectively. In this condition, in the recombinant strains, also was observed the presence of HHx between 32ª and 49ª hour with a maxim amount of 1.10 mol%. From the results it can be concluded that the Burkholderia cepacia is considered a promising strains for the attainment of HHx and HV allowing that soybean oil with and without the acrylic fatty acid, respectively. The increase in the number of copies of the gene phaB in Cupriavidus necator apparently did not contribute with the increase of 3HHx efficiency however, other handling variables will be proposed for confirmation.

O presente estudo teve como objetivo realizar a triagem de PHA sintases numa biblioteca metagenômica de solo de Mata Atlântica, empregando duas técnicas de busca: o método de detecção fenotípica e a técnica de PCR. Resultados positivos foram obtidos com este último, empregando iniciadores descritos na literatura e iniciadores descritos neste trabalho. Em 10.67% dos clones da biblioteca foram obtidos amplicons, dos quais 7 foram seqüenciados, apresentando similaridade para os genes phaC dos tipos II e IV. Adicionalmente, 67 clones positivos para a classe III foram obtidos e 4 destes foram seqüenciados. Duas das seqüências obtidas mostraram alta similaridade com o gene codificador da enzima glutamina sintetase tipo I, outro deles para a proteína hipotética conservada pertencente à família de enzimas oxidoredutases e a outra para o componente D do gene hidrogenase-4. A partir da análise dos resultados, iniciadores mais específicos são propostos. Assim, a técnica de PCR foi mais eficiente na detecção de genes da biossíntese de PHA na biblioteca metagenômica estudada. / To perform a PHA synthase screening in a metagenomic library from Atlantic forest soil two search methods were applied: phenotypic detection and PCR. Positive results with PCR were obtained by using primers described in the literature and proposed in this study. Amplicons were obtained in 10.67% of the library, 7 of them were sequenced showing similarity with class II and IV phaC genes. In addition, 67 positive clones for class III were obtained and 4 of them were sequenced. Two of these sequences showed high similarity to the glutamine synthase gene type I, the third one showed similarity to the conserved hypothetical protein of the reductase family, and the forth presented similarity to the component D of the hidrogenase-4. According to the results, more specific primers are suggested. Therefore, PCR was more efficient in the detection of PHA biosynthesis genes in the studied metagenomic library.

A xilose é um dos principais componentes dos materiais lignocelulósicos, os quais são de grande interesse para produção de bioprodutos como etanol e polihidroxialcanoatos (PHA). Visando melhorar o consumo de xilose em Burkholderia sacchari, uma grande produtora de PHA, os seguintes genes codificadores de xilose isomerase foram nela inseridos e avaliados: xylABs, xylABc, xylAPl, xylABp e xylABx, respectivamente de B. sacchari, B. cenocepacia, Photorhabdus luminescens, B. phymatum e B. xenovorans. Foi ainda sintetizado o gene de B. sacchari (xylA*) no qual foram inseridas modificações descritas na literatura como capazes de aumentar o consumo de xilose em outros organismos. As linhagens recombinantes de B. sacchari abrigando os genes xylABs e xylA* tiveram um aumento de aproximadamente 30%, e aquelas abrigando os genes xylABp e xylABx de 23%, no consumo de xilose quando comparadas com a linhagem controle. Essas quatro linhagens recombinantes foram aquelas que conseguiram produzir maior quantidade de P3HB, aproximadamente 70% a mais do que linhagem controle. / Xylose is a major component of lignocellulosic materials, which are of great interest for the production of bio-products, such as ethanol and polyhydroxyalkanoates (PHA). To improve the consumption of xylose in Burkholderia sacchari, a major PHA producer, the following genes, encoding xylose isomerase, were introduced in these bacteria: xylABs, xylABc, xylAPl, xylABp and xylABx, respectively from B. sacchari, B. cenocepacia, Photorhabdus luminescens, B. phymatum e B. xenovorans. The gene of B. sacchari (xylA*) was also synthesized with several modifications described in the literature as able to increase the consumption of xylose in other organisms. Recombinant strains harboring B. sacchari xylABs and xylA* gene had an increase of approximately 30% in the xylose consumption compared to the control strain, and those harboring xylABx and xylABp gene an increase of 23%. These four recombinant strains were those that were able to produce more P3HB, approximately 70% more than the control strain.