A produção de PHAMCL por Pseudomonas putida IPT 046 em cultivo contínuo sob limitação múltipla de nutrientes foi estudada, utilizando glicose e frutose como fontes de carbono. O estudo da limitação em nitrogênio, fósforo e simultânea de nitrogênio e fósforo para indução de acúmulo de polihidroxialcanoato, apontou que maiores valores de polímero foram acumulados quando fósforo foi o nutriente limitante (70%). Limitação em nitrogênio resultou no máximo em 40% de polímero. A limitação simultânea de nitrogênio e fósforo resultou em 68% de polímero, menor consumo de oxigênio para gerar células e maior fator de conversão de fonte de carbono em polímero (0,19 g/g) quando comparado com a limitação em fósforo, 0,16 g/g, ou à limitação em nitrogênio, 0,10 g/g. Oxigênio utilizado para manutenção das células não dependeu do tipo de limitação e dos valores das vazões específicas de alimentação. Um modelo metabólico foi proposto, ajustando aos dados experimentais na condição de limitação em nitrogênio. / Multiple nutrient limited growth of Pseudomonas putida IPT 046 was studied in chemostat culture from glucose and fructose as carbon source. Nitrogen, phosphorus and both nitrogen and phosphorus limitation was performed in order to accumulate medium-chain-length polhydroxyalkanoate. Phosphorus limitation resulted in higher polymer content accumulated (70%). Nitrogen limited assays achieved only 40% of polymer. Nitrogen and phosphorus simultaneous limitation resulted in 68 % polymer content, less oxygen demand to synthesize cells and best yields of carbon into polymer (0,19 g/g) when compared with 0,16 g/g on phosphorus limitation and 0,10 g/g on nitrogen limitation. Oxygen demand for maintenance is the same, independent of limitation strategy or dilution rate performed. A metabolic pathway model was proposed and fitted with nitrogen limited experimental data.

Foi avaliado o potencial de Halomonas sp. HG01, uma bactéria halófila, isolada de uma lagoa salina no Peru, com relação à produção de polihidroxialcanoatos (PHA). Halomonas sp. HG01 foi capaz de utilizar eficientemente sacarose, glicose e frutose como fontes de carbono. Os melhores desempenhos foram obtidos com glicose ou sacarose. 3-Hidroxibutirato (3HB) foi o único monômero detectado a partir de carboidratos. Precursores de outros monômeros foram avaliados. Monômeros de 3-hidroxivalerato (3HV) foram incorporados ao polímero quando os ácidos propiônico ou valérico foram supridos. 4-Hidroxibutirato (4HB) também foi utilizado como monômero pela PHA sintase de Halomonas sp. HG01. Engenharia evolutiva permitiu aumentar a eficiência de consumo de xilose e glicerol. Cultivos em biorreator permitiram atingir produtividades volumétricas de 0,13; 0,07 e 0,06 g/L.h, quando glicose, xilose e glicerol, respectivamente, foram supridas. Maiores produtividades deverão ser atingidas com aumento na densidade celular dos cultivos. / The potential of Halomonas sp. HG01, a halophilic bacteria isolated from a saline lagoon in Peru, was evaluated regarding the production of polyhydroxyalkanoates (PHA). Halomonas sp. HG01 was able to use efficiently sucrose, glucose and fructose as carbon sources. The best performance was obtained with glucose or sucrose. 3-hydroxybutyrate (3HB) was the only monomer detected from carbohydrates. Precursors of other monomers were evaluated. 3-Hydroxyvalerate (3HV) was inserted in the polymer when propionic or valeric acids were supplied. 4-Hydroxybutirate (4HB) was also used as a monomer for the PHA synthase from Halomonas sp. HG01. Evolutive engineering allowed to increase the uptake efficiency of xylose and glycerol. Cultures in bioreactor allowed achieving volumetric productivities of 0.13; 0.07 and 0.06 g /L.h when glucose, xylose, and glycerol, respectively, were supplied. Higher productivities should be achieved with increased cell density of cultures.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:16:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 257945.pdf: 4275959 bytes, checksum: 73f6737902445ce4bdfb3bc4e51d2175 (MD5) / Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros sintetizados por vários microrganismos e armazenados na forma de reserva de energia e carbono. Sua produção se dá sob condições desfavoráveis de crescimento, como limitação de nitrogênio ou fósforo, e na presença de excesso de fonte de carbono. Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) é o polímero mais estudado dentre os PHAs, possuindo características próximas às encontradas no polipropileno. Os PHAs chamam atenção devido à sua biodegradabilidade e possibilidade de substituição dos plásticos petroquímicos. Embora os PHAs apresentem vantagens ambientais sobre os plásticos de origem petroquímica, a sua principal desvantagem é o alto custo de produção, principalmente relativo ao substrato, recuperação e extração do polímero. Neste trabalhou teve-se por objetivo a melhoria das condições de cultivo para o crescimento e produção de P(3HB) por R. eutropha em diferentes temperaturas, seguido de um estudo de extração, caracterização e recuperação do polimero obtido. Os experimentos foram conduzidos em culturas em biorreator utilizando como microrganismo produtor a bactéria Ralstonia eutropha DSM 545. O processo foi dividido em duas fases sendo a primeira um crescimento balanceado e a segunda um crescimento desbalanceado com carência de nitrogênio para acúmulo intracelular do polímero. Primeiramente, a modelagem matemática do crescimento da bactéria foi utilizada para estimar os parâmetros: velocidade específica de crescimento ( max), tempo da fase lag ( ) e aumento logarítmico da população (A), posteriormente definiu-se a melhor temperatura de cultivo para o crescimento e produção de P(3HB) por Ralstonia eutropha. Os modelos de Gompertz Modificado e o Logístico foram ajustados às curvas de crescimento. O modelo que melhor se ajustou aos dados experimentais foi o Modelo de Gompertz Modificado. Não foi possível a obtenção de um modelo secundário que descrevesse a influência da temperatura sobre os parâmetros de crescimento µ, e A, nas diferentes temperaturas de cultivo testadas. A temperatura que proporcionou as melhores condições de cultivo tanto para o crescimento quanto para a produção de P(3HB) foi a temperatura de 32,5ºC, onde nesta condição obteve-se uma produção de P(3HB) de 70,3% em 26,5 horas de cultivo, com uma produtividade de 0,47 g.L-1h-1. O estudo da respirometria como alternativa para definição do estado fisiológico da célula e como ferramenta indicativa de limitações de nutrientes durante a produção de P(3HB) também foi realizado deste trabalho. Foi observado que, para concentrações de substrato inferiores a 12g/L, a cultura começa a sofrer uma desaceleração na sua velocidade específica de respiração (QO2), tornamdo-se um fator limitante na produção de P(3HB). Foi possível visualizar também, através do acompamamento da velocidade específica de respiração, o momento em que começa a ocorrer a limitação de nitrogênio e, consequentemente, o início da produção de P(3HB), isto é indicado através do início da sua desaceleração, o que passa a ser mais acentuado a partir do momento em que ocorre a exaustão do nitrogênio no meio. Como última parte deste estudo, foram realizados testes em diferentes condições de pré-tratamentos celular antes da extração, e testes durante a extração variando-se o tempo e a temperatura, utilizando como solvente o carbonato de propileno. Nesta etapa, observou-se que o melhor resultado foi obtido nas extrações realizadas com pré-tratamento de pH e temperatura de extração a 130ºC/30 min onde obte-se um peso molecular de 1,3.106g/mol, com uma recuperação e pureza de 96,3% e 94,6%. O conjunto de dados obtidos neste trabalho é bastante relevante para a melhoria do processo de produção de P(3HB) Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are polymers synthesized by various microorganisms and stored as reserve of energy and carbon. Their production occurs under unbalanced growth conditions, such as limitation of nitrogen or phosphorus and excess of carbon source. Polyhydroxybutyrate (P(3HB)) is the most studied polymer among the PHAs since its physical properties are remarkably similar to those of polypropylene. The PHAs are important due to their biodegradability and also because the possibility to use them rather than petrochemical plastics. Although PHAs show ecological advantages over petrochemical plastics, their main disadvantage is the high cost of production, mainly due to the polymer substrate, recovery and extraction. In this work, the target was to improve the culture conditions for growth and production of P(3HB) by Ralstonia eutropha in different temperatures, following by the study of extraction, characterization and recovery of the polymeric obtained. The experiments were carried out in a bioreactor using Ralstonia eutropha DSM 545. The process was divided in two phases. The first phase was characterized by balanced growth conditions and the second one occurred under unbalanced growth conditions such as limitation of nitrogen in order to produce intracellular polymer accumulation. Firstly, the mathematical modeling of bacteria growth was used to estimate the following parameters: maximum specific growth rate ( max), time of lag phase ( ) and logarithmic increase of population (A). After, the best cultivation temperature was defined in order to produce P(3HB) by Ralstonia eutropha. The growth models "Modified Gompertz" and "Logistic" was fit to the growth curves. The best model fitted to the experimental data was Modified Gompertz. It was not possible to find a secondary model able to describe the influence of temperature over growth parameters µmax, and A in the different cultivation temperatures tested. The best cultivation temperature for growth and for P(3HB) production was 32.5°C, in which 70.3% of P(3HB) was produced in 26.5 hours of cultivation, with productivity of 0.47 g.L-1h-1. The respirometry study, as a alternative for definition of the physiologic state of the cell and also as a toll which give indication of nutrients limitation during the P(3HB) production, was done in this work too. It was observed that when the concentration of substrate was under 12g/L, the culture start to suffer a slowdown of its specific respiration rate (QO2), becoming itself a limiting factor of P(3HB) production. It was also possible to see, following the specific respiration rate, the exactly moment when begins the nitrogen limitation and, consequently, the P(3HB) production phase. This phase is indicated by the decrease of QO2 value, followed by the acceleration of this diminution when the exhaustion of nitrogen occurs in the media. In the last step of this study, tests were made in different conditions of cellular pre-treatment before extraction and tests were made during the extraction under different time and temperature conditions, using propylene carbonate as a solvent. In this step, it was observed that the best results was found when the extractions were made with pre-treatment of pH and temperature of extraction at 130°C/30 min which was obtained molecular weight of 1.3 x 106g/mol and recuperation and purity of the 96.3% and 94.6%, respectively. The set of the data obtained in this work is enough relevant to the improvement of the P (3HB) production process. .

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T02:07:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 261290.pdf: 9078472 bytes, checksum: dbd8a796e4db42970ebb50a5d871f799 (MD5) / Polihidroxialcanoatos (PHAs) são poliésters biodegradáveis e biocompátiveis, produzidos por uma ampla variedade de microorganismos e estocados como fonte de carbono e energia. Poli-(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) é o membro mais comum desta família e tem sido usado na obtenção de carreadores de fármacos. Na maior parte dos casos, a liberação de fármacos a partir de microesferas de P(3HB) ocorre em taxas excessivas e tem sido assumido que o fenômeno de liberação é mais dependente da velocidade de dissolução do fármaco do que da degradação da matriz. A estratégia de misturar diferentes materiais em uma formulação pode ser empregada para modificar as propriedades físico-químicas de microesferas e controlar a liberação. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da formação de blendas de P(3HB) com trimiristato de gricerila (TMG) ou poli (D,L-ácido lático)-b-poli (etilenoglicol) (PLA-PEG) e da obtenção de partículas compostas de P(3HB) e gelatina (GEL) sobre as características físico-químicas das microesferas e o perfil de liberação do ibuprofeno. O método de emulsão/evaporação do solvente foi empregado no preparo das microesferas de P(3HB):TMG (9:1, 4:1, 3:1 e 1:1) e P(3HB):PLA-PEG (3:1 e 1:1), usando clorofórmio ou diclorometano/ álcool isopropílico como solventes. As microesferas de P(3HB):GEL 10:1 foram preparadas usando o procedimento de dupla emulsão/evaporação do solvente. Elevados valores de eficiência de encapsulação foram verificados em todas as formulações testadas. Partículas esféricas e de superfície rugosa, apresentando diâmetro médio entre 21,93 e 41,55 mm, foram obtidas. A utilização de diclorometano e o aumento da proporção de TMG na blenda conduziram à redução da porosidade das partículas. Entretanto, os estudos de liberação em tampão fosfato 0,02 M pH 7,4 mostraram que a associação de P(3HB) e TMG não conduz ao controle de liberação do IBF, a qual foi bastante pronunciada na primeira hora de ensaio. Elevados valores de liberação inicial (efeito burst) também foram observados nas microesferas preparadas a partir das blendas de P(3HB) e PLA-PEG 3:1 e P(3HB):GEL 10:1. Neste último caso, a adição de etanol acelerou a liberação do IBF, indicando que a adição do solvente afeta a localização do fármaco na matriz. As análises por calorimetria exploratória diferencial (DSC) e difração de raios-x indicaram a redução da cristalinidade do P(3HB) somente quando a blenda P(3HB):PLA-PEG 1:1 foi testada. Entretanto, independente das condições de preparo das microesferas, o IBF pareceu estar parcialmente disperso na sua forma amorfa ou molecular na matriz. Apesar da utilização da blenda de P(3HB) e PLA-PEG 1:1 ter conduzido à redução da cristalinidade, a velocidade de liberação foi mais prolongada quando as microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 foram testadas, sugerindo que o grau de hidratação da matriz pode ter interferido na cinética de liberação. A avaliação in vivo do ibuprofeno encapsulado nas microesferas de P(3HB):PLA-PEG 3:1 foi conduzida em ratos artríticos (modelo CFA). Os resultados obtidos indicaram redução do edema articular e da migração celular após administração das microesferas contendo IBF, quando comparado aos grupos tratados com IBF livre e microesferas brancas, respectivamente.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2008 / Made available in DSpace on 2012-10-24T02:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 275389.pdf: 3136937 bytes, checksum: 8db60fa4cf0a2a81b42e9d06190468e5 (MD5) / Este trabalho teve por objetivo a obtenção de poli-hidroxialcanoatos (PHAs) biossintetizados por Chromobacterium violaceum, em diferentes condições de escala, concentração e variação de substrato, nutrientes limitantes e pH. Embora a produção de PHAs por C. violaceum tenha sido um dos motivos pelos quais este microrganismo tenha tido seu genoma completamente sequenciado por um consórcio envolvendo grupos de pesquisa de todo o país, não se tem conhecimento de nenhum estudo sistemático da produção desses poliésteres em escalas de laboratório e de bancada. As propriedades dos biopolímeros produzidos são consequência da sua composição molecular, que pode ser influenciada pelas condições de operação, assim como do(s) substrato(s) utilizado(s). Em particular, o grau de copolimerização é um parâmetro que pode interferir diretamente no tipo de aplicação do PHA produzido. Como a C. violaceum é capaz de produzir o homopolímero de poli-hidroxivalerato (PHV) e copolímeros PHBV, que incorporam unidades de 3-hidroxibutirato (3HB), isto é, P(3HB-co-3HV), este estudo concentrou seus esforços na obtenção de diferentes graus de incorporação de unidades de valerato no copolímero, visando características desejáveis para novas aplicações comerciais. Foram estudados os copolímeros de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV) produzidos por C. violaceum em agitador orbital de laboratório e biorreator de 4 litros, a 30°C sob limitação de nitrogênio ou de fósforo, utilizando diferentes pH (6 e 7), concentrações de glicose (10, 20 e 30 g l-1) e concentração de propionato (0 e 10 mM). Os resultados demonstraram que a concentração de substrato, o pH e a adição de propionato afetam a quantidade total dos PHAs produzidos. Um acúmulo de 70% (g.g-1) foi obtido sob limitação de nitrogênio em agitador orbital a pH 7, 10 g l-1 de glicose e sem adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato aumentou a incorporação de unidades de valerato, mas diminuiu a quantidade de biomassa produzida. O controle do pH e da aeração nas condições de cultivo utilizando o biorreator aumentou a quantidade de biomassa formada, alcançando um máximo de 6,54 g l-1 sob limitação de fósforo, em pH 7, 20 g l-1 de glicose, sem a adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato às culturas realizadas em biorreator, contudo, não aumentou a incorporação de 3HV ao copolímero obtido, sugerindo que o controle do pH tem influência sobre a composição do PHBV acumulado. A caracterização dos polímeros extraídos dos cultivos em biorreator demonstrou que a incorporação de unidades de valerato ao polímero diminuiu a temperatura de fusão do material em relação ao PHB puro, ficando entre 174 e 178°C. A temperatura máxima de degradação do polímero também foi influenciada pelo percentual de unidades de valerato, ficando entre 302 e 312°C, cerca de 30°C acima da temperatura de degradação do PHB puro (278°C). A pureza dos copolímeros extraídos foi superior a 95%. As características físico-químicas analisadas destes biopolímeros (temperaturas de fusão, transição vítrea, degradação inicial, degradação total, grupos funcionais, incorporação de violaceína no biopolímero, diâmetro de poros das membranas formadas) sugerem que esses materiais podem ser utilizados para o desenvolvimento de novas aplicações nas áreas biotecnológica e biomédica como, por exemplo, na produção de novos arcabouços de engenharia de tecidos.Este trabalho teve por objetivo a obtenção de poli-hidroxialcanoatos (PHAs) biossintetizados por Chromobacterium violaceum, em diferentes condições de escala, concentração e variação de substrato, nutrientes limitantes e pH. Embora a produção de PHAs por C. violaceum tenha sido um dos motivos pelos quais este microrganismo tenha tido seu genoma completamente sequenciado por um consórcio envolvendo grupos de pesquisa de todo o país, não se tem conhecimento de nenhum estudo sistemático da produção desses poliésteres em escalas de laboratório e de bancada. As propriedades dos biopolímeros produzidos são consequência da sua composição molecular, que pode ser influenciada pelas condições de operação, assim como do(s) substrato(s) utilizado(s). Em particular, o grau de copolimerização é um parâmetro que pode interferir diretamente no tipo de aplicação do PHA produzido. Como a C. violaceum é capaz de produzir o homopolímero de poli-hidroxivalerato (PHV) e copolímeros PHBV, que incorporam unidades de 3-hidroxibutirato (3HB), isto é, P(3HB-co-3HV), este estudo concentrou seus esforços na obtenção de diferentes graus de incorporação de unidades de valerato no copolímero, visando características desejáveis para novas aplicações comerciais. Foram estudados os copolímeros de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV) produzidos por C. violaceum em agitador orbital de laboratório e biorreator de 4 litros, a 30°C sob limitação de nitrogênio ou de fósforo, utilizando diferentes pH (6 e 7), concentrações de glicose (10, 20 e 30 g l-1) e concentração de propionato (0 e 10 mM). Os resultados demonstraram que a concentração de substrato, o pH e a adição de propionato afetam a quantidade total dos PHAs produzidos. Um acúmulo de 70% (g.g-1) foi obtido sob limitação de nitrogênio em agitador orbital a pH 7, 10 g l-1 de glicose e sem adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato aumentou a incorporação de unidades de valerato, mas diminuiu a quantidade de biomassa produzida. O controle do pH e da aeração nas condições de cultivo utilizando o biorreator aumentou a quantidade de biomassa formada, alcançando um máximo de 6,54 g l-1 sob limitação de fósforo, em pH 7, 20 g l-1 de glicose, sem a adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato às culturas realizadas em biorreator, contudo, não aumentou a incorporação de 3HV ao copolímero obtido, sugerindo que o controle do pH tem influência sobre a composição do PHBV acumulado. A caracterização dos polímeros extraídos dos cultivos em biorreator demonstrou que a incorporação de unidades de valerato ao polímero diminuiu a temperatura de fusão do material em relação ao PHB puro, ficando entre 174 e 178°C. A temperatura máxima de degradação do polímero também foi influenciada pelo percentual de unidades de valerato, ficando entre 302 e 312°C, cerca de 30°C acima da temperatura de degradação do PHB puro (278°C). A pureza dos copolímeros extraídos foi superior a 95%. As características físico-químicas analisadas destes biopolímeros (temperaturas de fusão, transição vítrea, degradação inicial, degradação total, grupos funcionais, incorporação de violaceína no biopolímero, diâmetro de poros das membranas formadas) sugerem que esses materiais podem ser utilizados para o desenvolvimento de novas aplicações nas áreas biotecnológica e biomédica como, por exemplo, na produção de novos arcabouços de engenharia de tecidos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:37:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 303348.pdf: 1152772 bytes, checksum: a3e38c1e81994d268ca4f9b7b93e6cae (MD5) / Os PHAS são um grupo de poliésteres acumulados sob a forma de grânulos intracelulares por inúmeras bactérias, como reserva de carbono e energia. Entre os PHAs mais estudados estão os polímeros de cadeia curta PHB e P(3HB-co-3HV). O conhecimento das vias bioquímicas e enzimas envolvidas na biossíntese e degradação dos PHAs podem auxiliar na implementação de estratégias para sua produção industrial a partir de substratos renováveis e de baixo custo. Isolados de Escherichia coli recombinante contendo os genes de biossíntese de PHAs são capazes de acumular até 90 % (m/m) de biomassa seca de biopolímero. Este trabalho teve como objetivo geral a produção de PHA por Escherichia coli recombinante contendo a PHA sintase de Chromobacterium violaceum e Cupriavdus necator, em presença de soro de queijo. Neste estudo, foi avaliada a capacidade de produção de PHA por três isolados de E. coli (DH5?, JM101 e DH10B), a especificidade da enzima PHA sintase de C. violaceum em E. coli recombinante na produção de P(3HB-co-3HV) em presença de ácido propiônico e a composição do meio de cultivo, através de técnica de planejamento experimental (DCCR), onde as variáveis de estudo foram a quantidade de soro de queijo e concentração de glicose na produção de PHA, concentração de ácido propiônico na incorporação de unidades de valerato e o efeito da adição de IPTG como indutor de expressão gênica. Os resultados mostraram comportamento diferenciado da PHA sintase de C. violaceum para cada um dos isolados de E. coli estudadas sobre a produção de PHB. A PHA sintase de C. violaceum quando inserida em E. coli e em presença de ácido propiônico é capaz de incorporar 8,83 mol % de unidades de 3HV. Uma produção de PHA igual a 0,43 g de MCS.L-1 foi observada, em meio contendo 37 % (v/v) de soro de queijo, 2 g.L-1 de glicose, 4 mmol.L-1 de ácido propiônico na ausência de IPTG. Conclui-se que é possível produzir PHA a partir de isolados JM101 de E. coli contendo os genes da PHA sintase de C. violaceum a partir de soro de queijo, na presença ou ausência de indutor (IPTG). / The PHAS is a group of polyesters accumulated in the form of intracellular granules by many bacteria as carbon and energy reserves. Among the most studied PHAs are the short-chain polymers PHB and P (3HB-co-3HV). The information of biochemical pathways and enzymes involved in biosynthesis and degradation of PHAs can support in the strategies implementation for industrial production across renewable and low cost substrates. Recombinant strains of Escherichia coli containing the genes of the PHAs biosynthesis, are able to accumulate up 90% (w/w) of dry biomass biopolymer. This study aimed at the production of PHA by recombinant E. coli containing the Chromobacterium violaceum and Cupriavidus necator PHA synthase in the presence of cheese whey. This study evaluated the capacity to production of PHA by three strains of E. coli (DH5á, DH10B and JM101), the specificity of the enzyme PHA synthase of C. violaceum in E. coli recombinant in the production of P (3HB-co-3HV) in presence of propionic acid and the composition of the culture media, through experimental planning technique (DCCR), where the variables were the amount of cheese whey and concentration of glucose in the production of PHA, propionic acid concentration on the incorporation of valerate units and the effect of the added IPTG to induce gene expression. The results showed different behavior of the PHA synthase of C. violaceum for each strains of E. coli studied on the production of PHB. The PHA synthase of C. violaceum when inserted into E. coli and in the presence of propionic acid is able to incorporate valerate units. (8.83 mol% of 3HV units). A production of PHA (0.43 gCDW.L-1) was observed in medium containing 37% (v/v of cheese whey, 2 g.L-1 glucose, 4 mmol.L-1 propionic acid and absence of IPTG. Concluded that it is possible to production of PHA across strains of E. coli recombinant containing the PHA synthase of C. violaceum.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2012-10-24T11:23:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 267123.pdf: 1580855 bytes, checksum: 5daa4affb8d5bbf3d6b7a72f9cac3ba2 (MD5) / Frente aos problemas ocasionados pelo uso dos plásticos de origem petroquímica, surgiu a necessidade de se buscarem alternativas para substituição deste material. Apresentam-se como solução os plásticos biodegradáveis, ou bioplásticos, que são polímeros com as propriedades desejáveis dos plásticos convencionais e rapidamente biodegradados quando descartados no ambiente. Dentre eles, estão os polihidroxialcanoatos (PHAs), poliésteres compostos por monômeros de ácidos 3-hidroxialcanóicos, os quais são acumulados intracelularmente por bactérias, como reserva de carbono e/ou energia, sob limitação de um nutriente essencial ao seu crescimento, e o polímero mais estudado atualmente é o P(3HB) - poli(3-hidroxibutirato). Entretanto, o custo de produção de PHAs é um dos responsáveis pela limitação de sua produção e comercialização. A utilização de substratos de baixo custo se torna um fator importante para a redução do custo de produção, além da busca e obtenção de linhagens eficientes na conversão do substrato em polímero. O objetivo deste trabalho foi selecionar, numa coleção de microrganismos do Laboratório de Microbiologia Aplicada - UNIVALI/SC, uma linhagem bacteriana capaz de produzir PHA a partir de resíduo do processamento de mandioca. Inicialmente, 72 isolados de Bacillus, Paenibacillus e Geobacillus de 21 espécies diferentes foram cultivados em meio com limitação de fósforo e 20g/L de resíduo industrial oriundo do processamento de mandioca, rico em amido e açúcares redutores. Foram avaliados o crescimento dos microrganismos em meio com substrato amiláceo (técnica de MTT), sua capacidade de secretar enzimas no meio (avaliação de degradação de amido) e a produção de PHA (cultivo com corante vermelho do Nilo e observação em microscópio de epifluorescência). Finalmente foram selecionados 4 isolados: LAMA073, LAMA095, LAMA262 e LAMA265, classificados por métodos moleculares como Bacillus megaterium, os quais foram capazes de produzir P(3HB) a partir do resíduo amiláceo. O resíduo industrial utilizado mostrou-se, portanto, um substrato carbônico aplicável à produção de compostos de maior valor agregado, como P(3HB). Os isolados LAMA073, LAMA095, LAMA262 e LAMA265 acumularam 13,04% (p/p), 23,88% (p/p), 5,92% (p/p), e 25,00% (p/p) de P(3HB), respectivamente, a partir de 20% de resíduo hidrolisado adicionado ao meio. Quando adicionado resíduo hidrolisado na concentração de 40%, os isolados LAMA073 e LAMA095 apresentaram aumento na produção de P(3HB), para 30,45% (p/p) e 29,78% (p/p), respectivamente. A espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), das amostras de PHAs produzidos, mostraram bandas características da presença de P(3HB), confirmando a produção deste polímero pelos microrganismos. Portanto, os isolados identificados e caracterizados apresentam potencial para a produção de P(3HB) em substrato de baixo custo, sendo um próximo passo avaliá-los em uma escala superior de produção, bem como em outros resíduos amiláceos. There are many problems caused by use of petrochemical plastics, then it is necessary to find alternatives to replace this material. A solution for this problem is the use of biodegradable plastic, or bioplastics, which are polymers with desirable properties of conventional plastics, and they are rapidly biodegraded in the environment when they are discarded. Among the biodegradable plastics, there are the polyhydroxyalkanoates (PHAs), polyester containing hydroxyalkanoic acid monomers. They are accumulated intracellularly by bacteria as carbon or energy reserves, when there is a limitation of an essencial nutrient, and P(3HB) - poly(3-hydroxybutyrate) is the most studied polymer nowadays. However, the use of PHA is limited due to its high cost production. The use of low cost by-products becomes the main factor for the reduction of production cost, besides that it is also necessary to obtain strains for efficient substrate conversion into polymer. The objective of this work was to select a bacterial strain capable of producing PHA from cassava by-products as carbon source. First screening was conduced with 72 strains from culture collection of the Applied Microbiology Laboratory (UNIVALI/SC/Brazil), covering three generas (Bacillus, Geobacillus and Paenibacillus) and 21 different species, which were cultivated in Minimal Medium (MM) with limited phosphate and 20g/L of cassava by-product. It was evaluated microorganisms growth (measuring respiration by MTT assay) in medium with starchy substrate, their ability to secrete enzymes (starch degradation) and PHA production (Nile red dying assay and observation in epifluorescence microscope). Finally 4 isolates were selected: LAMA073, LAMA095, LAMA262 and LAMA265, classified by molecular methods (16S rRNA sequencing) as Bacillus megaterium, which were capable of producing P(3HB) from cassava processing by-products as a sole carbon source. Strains LAMA073, LAMA095, LAMA262 and LAMA265 were able to produce 13,04% of P(3HB) (w/w), 23,88% (w/w), 5,92% (w/w) and 25,00% (w/w) respectively, when cultivated in MM supplemented with 20% of hydrolized cassava by-product. However, when 40% of hydrolized cassava by-product was used, higher P(3HB) percentage, 30,45% and 29,78% (w/w), was observed for LAMA073 and LAMA095, respectively. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) showed characteristic bands of P(3HB) presence, confirming polymer production by microorganisms. Therefore, the identified and characterized strains have potential to produce P(3HB) in low-cost substrate, and a next study would be evaluate them on a higher scale of production, as well as production in others starchy waste.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-11-24T03:06:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336257.pdf: 2482004 bytes, checksum: a4c93532f0421c450fb8d20e728e4e74 (MD5) Previous issue date: 2015 / O poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) é um biopolímero sintetizado por bactérias e acumulado intracelularmente como material de reserva energética. Esse poliéster é biodegradável e biocompatível e possui propriedades mecânicas próximas ao do polipropileno. Entretanto seu alto custo de produção em relação ao dos polímeros de origem petroquímica torna esses biopolímeros comercialmente pouco atraentes, o que levou ao desenvolvimento de estratégias de cultivo e extração do polímero, assim como a utilização de substratos de baixo custo, visando tornar o P(3HB) mais competitivo. Desse modo, o principal objetivo desse trabalho foi realizar um estudo econômico do processo de produção de P(3HB) por Cupriavidus necator, empregando carbonato de propileno como solvente e métodos mecânicos de extração, e utilizando melaço cítrico como substrato. Quatro diferentes rotas de extração foram avaliadas: tratamento térmico da biomassa seguido por extração com solvente, tratamento utilizando equipamento ultrasonificação e extração com solvente, tratamento utilizando alta pressão e extração com solvente, e somente o uso de solvente na extração do biopolímero. Foram efetuadas simulações utilizando o software comercial Aspen Plus de todas as etapas que compõem o processo para todas as alternativas avaliadas, obteve-se assim, os balanços de massa e energia e possibilitando estimar sobre o investimento em capital necessário e consumo de matérias-primas e utilidades, realizando, posteriormente a análise econômica comparativa das alternativas. Os resultados indicam vantagem das alternativas que utilizam o tratamento a alta pressão e térmico da biomassa, apresentando menores custos de produção (US$ 7,41 e US$ 7,51 por quilo de biopolímero, respectivamente) e melhores indicadores econômicos. Observou-se que a capacidade de extração do método não é determinante na seleção da melhor alternativa, de modo que deve haver uma análise conjunta da capacidade de extração e desembolsos com equipamentos e utilidades no tratamento da biomassa. A análise de sensibilidade para a melhor alternativa (alta pressão) mostrou que o aumento da capacidade de produção da planta e aumento da concentração final de biomassa no biorreator causa significativa redução do preço do produto e no investimento específico.<br> / Abstract : Poly(3-hydroxybutyrate) (P(3HB)) is a biopolymer synthesized by bacterias and intracellularly accumulated as energy reserve. This polyester is biocompatible and biodegradable and has mechanical properties comparable to polypropylene. However its high production cost in compare to the petroleum polymers makes these biopolymers commercially unattractive, which led to the development of strategies of fermentation and extraction of the polymer as well as the use of low cost substrates, in order to make P(3HB) more competitive. Thus, the aim of this study was to conduct an economic assessment of the P(3HB) production process by Cupriavidus necator, using propylene carbonate as solvent coupled with mechanical methods of extraction, and using citric molasses as substrate. Four different extraction routes have been assessed: heat treatment of the biomass followed by solvent extraction; treatment using ultrasonication equipment and solvent extraction; treatment using high pressure followed by solvent extraction; and the fourth, the use of solvent alone. Simulations were performed using the commercial software Aspen Plus, all the steps that comprise the process for all the four alternatives were evaluated, obtaining, mass and energy balances allowinga the estimation on the capital investment and consumption of raw materials and utilities, then, performing the comparative economic analysis of alternatives. The results indicate advantage of the alternative that make use of high pressure and heat to treat the biomass, showing lower production costs (US $ 7.41 and US $ 7.51 per pound biopolymer, respectively) and better economic indicators. It was observed that the methods extraction capacity is not decisive in selecting the best alternative, so that there must be the a simultaneous analysis of extractability capacity and expenditures in equipment and utilities in treating the biomass. The sensitivity analysis for the best alternative (high pressure treatment) showed that the increase of the plant's production capacity and final biomass concentration in the bioreactor leads to a significant reduction in the cost of the product and in the specific investment.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2013-07-15T22:37:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 222131.pdf: 1388356 bytes, checksum: ec3e45feb5317df995c748f9a8eb33f4 (MD5) / Uma classe de polímeros bacterianos que se destaca pela proximidade de suas características com as de plásticos de origem petroquímica são os polihidroxialcanoatos (PHA's). PHA sintases são enzimas chave para a biossíntese destes polímeros. A PHA sintase de Chromobacterium violaceum, que é do tipo I, utiliza como substrato hidroxiacil-CoA (HA-CoA) de 3 a 5 carbonos, enquanto a PHA sintase do tipo II de Pseudomonas aeruginosa, utiliza HA-CoA contendo de 6 a 14 carbonos. Com o objetivo de modificar a especificidade da PHA sintase de C. violaceum, buscou-se determinar sítios específicos para mutação, por técnica de DNA recombinante, de maneira a torná-la capaz da biossíntese de copolímeros contendo HA's de cadeia curta e média. O conhecimento da estrutura terciária, e particularmente, do sítio ativo da proteína, é uma etapa importante para o estudo de possibilidades de mudança de sua especificidade. Com base neste propósito, o modelo teórico para a PHA sintase de C. violaceum foi obtido através das técnicas de modelagem por homologia, utilizando-se uma lipase gástrica humana como referência (Depositada no PDB, Protein Data Bank, com o código de acesso 1HLG). O modelo foi desenvolvido baseado no alinhamento entre as seqüências primárias da PHA sintase de C. violaceum e P. aeruginosa, e a lipase, e validado através do gráfico de Ramachandran, apresentando 94% e 96% dos resíduos modelados com ângulos espacialmente possíveis, respectivamente para C. violaceum e P. aeruginosa. A estrutura 3D resultante apresenta uma díade catalítica composta pelos aminoácidos C292 e H478. O aminoácido D448, proposto como uma base geral catalítica que ativa o grupamento 3-hidroxil do HB-CoA para formar o intermediário tioéster pode, na verdade, ter o papel de auxiliar no transporte do substrato e na estabilização do estado de transição. Não foi possível confirmar que este faz parte de uma tríade catalítica, conforme sugerido na literatura. Os resultados obtidos pela modelagem da estrutura serviram de base para a escolha de mutações sítio-específicas, testadas neste trabalho. O gene phaCCv do genoma da C. violaceum (ATCC12472) foi amplificado por PCR, utilizando-se um par de oligonucleotídios complementares às extremidades 3' e 5' do gene phaC contendo sítios de restrições apropriados à ligação ao vetor. O plasmídio pBHR69 continha, além do gene de resistência à ampicilina, os genes phaA e phaB, codificando para a b-cetotiolase e acetoacil-CoA redutase de R. eutropha, respectivamente. O produto de PCR foi purificado e ligado ao pBHR69 previamente digerido com SmaI/BamHI; uma alíquota da reação de ligação foi utilizada para transformar as células competentes DHa5TM-TR. Os transformantes foram selecionados através da utilização de meio agar LB contendo ampicilina. A sintase de C. violaceum clonada e expressa em E. coli produziu PHB, e a diferença na produção de PHB pela PHA sintase não mutada e nos mutantes sugere uma possível mudança na afinidade enzima-substrato.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 222778.pdf: 2018552 bytes, checksum: 791791fc4e4bd5e0be25e93e2147d9f2 (MD5) / Estudou-se o efeito da adição de suplementos (acetato e ácido oléico) ou inibidor do metabolismo do propionato (itaconato), visando estabelecer condições nas quais a houvesse maior incorporação de unidades de 3HV, ao copolímero. A quantificação e caracterização dos polímeros foram feitas por cromatografia gasosa. Os resultados obtidos mostraram que sob limitação de fosfato, na presença de glicose e propionato 15 mM, ocorreu a maior incorporação de unidades de 3HV ao copolímero. Nestas condições, observou-se uma produção de 33,6% de P[3HB-co-3HV] na biomassa (0,086 g. L-1), contendo 18,3 mol% de 3HV. Em condições similares, porém sob limitação de nitrogênio, obteve-se uma produção de 31,6% de P[3HB-co-3HV] na biomassa (0,25 g. L-1), contendo apenas 3,6 mol% de 3HV. A suplementação da cultura, com extrato de levedura, sob limitação de fosfato, na presença de propionato 10 mM aumentou a produção de biomassa (0,16 g. L-1), porém, teve efeito negativo sob a incorporação de 3HV ao copolímero. C. violaceum é capaz de produzir P[3HB-co3HV], mesmo sem adição de um precursor de 3HV, provavelmente a partir de intermediários do metabolismo de aminoácidos. Tanto a suplementação com acetato, quanto com itaconato e ácido oléico, não incrementaram a incorporação de 3HV ao copolímero. Os pHs das culturas, ao final dos cultivos, atingiram valores iguais a 6,0 e 5,0, sob limitação de nitrogênio e fosfato, respectivamente, sugerindo que o decréscimo do efeito tamponante do fosfato, seja responsável pela inibição do crescimento celular, sob limitação do fosfato. Através deste estudo, foram definidas condições de cultivo para C. violaceum que permitiram a produção de copolímero com elevado percentual molar de 3HV, o que confere ao polímero características bastante interessantes do ponto de vista biotecnológico.