Les chromodomaines sont présents dans de nombreux régulateurs de la structure chromatinienne. Ils sont très conservés et reconnaissent spécifiquement certaines lysines méthylées sur les histones. Chez la drosophile, l'Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto, impliqué dans la répression et dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes, contient un chromodomaine (CortoCD). La surexpression de CortoCD dans des drosophiles transgéniques montre que c'est un module d'adressage à la chromatine. L'identification par spectrométrie de masse des polypeptides retenus par CortoCD in vitro révèle qu'ils correspondent à des protéines ribosomiques nucléaires (RPs). Je me suis concentrée sur l'une d'entre elle, RPL12, car les homologues de cette dernière dans d'autres espèces possèdent de nombreux résidus lysines méthylés. J'ai montré que CortoCD reconnaît spécifiquement la lysine 3 de RPL12 triméthylée (RPL12K3me3). De plus, Corto et RPL12 co-localisent avec des marques épigénétiques activatrices sur les chromosomes polytènes. L'analyse par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine), de deux cibles transcriptionnelles de Corto et RPL12, révèle que ces deux protéines sont localisées dans le corps des gènes et ne sont pas enrichies sur les promoteurs, suggèrant un rôle dans l'élongation de la transcription. Des analyses transcriptomiques (RNAseq) montrent que Corto et RPL12 régulent majoritairement des gènes impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Nos résultats mettent en évidence pour la première fois une coopération entre une protéine ribosomique et un facteur de maintien de la mémoire épigénétique dans la régulation transcriptionnelle. Les chromodomaines sont présents dans de nombreux régulateurs de la structure chromatinienne. Ils sont très conservés et reconnaissent spécifiquement certaines lysines méthylées sur les histones. Chez la drosophile, l'Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto, impliqué dans la répression et dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes, contient un chromodomaine (CortoCD). La surexpression de CortoCD dans des drosophiles transgéniques montre que c'est un module d'adressage à la chromatine. L'identification par spectrométrie de masse des polypeptides retenus par CortoCD in vitro révèle qu'ils correspondent à des protéines ribosomiques nucléaires (RPs). Je me suis concentrée sur l'une d'entre elle, RPL12, car les homologues de cette dernière dans d'autres espèces possèdent de nombreux résidus lysines méthylés. J'ai montré que CortoCD reconnaît spécifiquement la lysine 3 de RPL12 triméthylée (RPL12K3me3). De plus, Corto et RPL12 co-localisent avec des marques épigénétiques activatrices sur les chromosomes polytènes. L'analyse par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine), de deux cibles transcriptionnelles de Corto et RPL12, révèle que ces deux protéines sont localisées dans le corps des gènes et ne sont pas enrichies sur les promoteurs, suggèrant un rôle dans l'élongation de la transcription. Des analyses transcriptomiques (RNAseq) montrent que Corto et RPL12 régulent majoritairement des gènes impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Nos résultats mettent en évidence pour la première fois une coopération entre une protéine ribosomique et un facteur de maintien de la mémoire épigénétique dans la régulation transcriptionnelle.

Our lab has recently found that E2F3, an essential cell cycle regulator, regulates the self-renewal capacity of neural precursor cells (NPCs) in the developing mouse brain. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and immunoblotting techniques revealed several E2F3 target genes, including the polycomb group (PcG) protein, EZH2. Further ChIP and immunoblotting techniques identified the neural stem cell self-renewal regulators p16INK4a and Sox2 as shared gene targets of E2F3 and PcG proteins, indicating that E2F3 and PcG proteins may co-regulate these target genes. E2f3-/- NPCs demonstrated dysregulated expression of EZH2, p16INK4a, and SOX2 and decreased enrichment of PcG proteins at target genes. Restoring EZH2 expression to E2f3+/+ levels restores p16INK4a and SOX2 expression levels to near E2f3+/+ levels, and also partially rescues NPC self-renewal capacity toward E2f3+/+ levels. Taken together, these results suggest that E2F3 controls NPC self-renewal by modulating expression of p16INK4a and SOX2 via regulation of PcG expression, and potentially PcG recruitment.

Chez les organismes pluricellulaires, la prolifération, la différenciation ou encore la<br />mort des cellules reposent en partie sur l'activation et la répression de gènes spécifiques. Les<br />profils d'expressions géniques ainsi mis en place sont maintenus d'une génération cellulaire à<br />l'autre par des mécanismes épigénétiques stables qui altèrent la structure de la chromatine au<br />niveau des gènes cibles. Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG)<br />établissent une mémoire cellulaire au cours des mitoses en maintenant l'état transcriptionnel<br />de nombreux gènes par une réorganisation de la structure chromatinienne. Les protéines PcG<br />maintiennent la répression des gènes cibles en créant des domaines chromatiniens compacts<br />où l'ADN est peu accessible. Les protéines TrxG assurent le maintien de l'activation des gènes<br />en bloquant la propagation des complexes PcG et en déplaçant les nucléosomes. Chez la<br />drosophile, ces protéines agissent au sein de complexes multimèriques qui se lient à la<br />chromatine au niveau de modules communs appelés modules de mémoire cellulaire (CMM).<br />Les PcG et TrxG régulent l'expression de nombreux gènes dont les plus étudiés sont les gènes<br />homéotiques. Aujourd'hui, si les différents acteurs de la mémoire cellulaire commencent à<br />être bien connus, plusieurs questions restent posées. Quels sont les moyens de recruter<br />spécifiquement les PcG et TrxG sur leurs cibles ? Quels sont les mécanismes moléculaires qui<br />permettent le maintien de cette mémoire ? Quels sont les gènes cibles ? Est-ce que les<br />mécanismes d'action que nous étudions au niveau des gènes homéotiques sont communs à<br />l'ensemble des gènes régulés par les PcG et TrxG ?<br />Notre équipe travaille sur une protéine à boîte HMG de drosophile : DSP1 (Dorsal<br />Switch Protein 1). L'étude d'un mutant nul dsp11 a montré que la protéine intervient dans la<br />régulation des gènes homéotiques. Par ailleurs, des études d'interactions génétiques et des<br />expériences de digestion à la DNase I montrent que DSP1 est un facteur de remodelage de la<br />chromatine qui agit suivant le locus considéré en synergie avec les protéines des groupes PcG<br />ou TrxG. DSP1 fait donc partie des protéines qui participent à la mémoire cellulaire.<br />Le travail de thèse que nous présentons ici a pour objectif la recherche des gènes cibles<br />de DSP1 et du rôle de cette protéine dans la régulation de l'expression de ces gènes. Nous<br />avons identifié des cibles préférentielles de DSP1 sur l'ensemble du génome par la technique<br />d'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôle de DSP1<br />sur l'une de ces cibles, le CMM Fab-7 dont l'activité régule le gène homéotique<br />Ultrabithorax. Au cours de cette étude nous montrons par des expériences de transgenèse que<br />DSP1 est indispensable au fonctionnement du CMM. Le recrutement des protéines PcG et<br />TrxG sur les CMM reste mal connu. La fixation de DSP1 sur le CMM Fab-7 est essentielle au<br />recrutement des PcG. Ainsi nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteur<br />précoce de ces protéines suivant le locus considéré au cours de l'embryogenèse. Au contraire,<br />nous montrons que DSP1 intervient tardivement dans l'activation du gène homéotique Sex<br />combs reduced. Dans ce cas, la protéine n'est essentielle qu'au cours de la vie larvaire. Enfin,<br />nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène de segmentation knirps et est impliquée<br />dans l'établissement de son profil d'expression plutôt que dans son maintien.<br />161<br />Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) établissent une<br />mémoire cellulaire en maintenant l'état transcriptionnel de nombreux gènes par un<br />remodelage de la chromatine. Chez la drosophile, ces protéines agissent au sein de complexes<br />multimériques qui se lient à des unités fonctionnelles appelées Modules de Mémoire<br />Cellulaire (CMM). Quels sont les gènes cibles des protéines PcG/TrxG ? Quels sont les<br />moyens de recruter spécifiquement ces protéines ? Sont deux questions auxquelles nous avons<br />voulu répondre. Notre équipe travaille sur une protéine à boîtes HMG de drosophile : DSP1.<br />L'objectif du travail que nous présentons ici est de rechercher des gènes cibles de DSP1 et son<br />rôle dans la régulation de l'expression de ces gènes. Plusieurs cibles ont été identifiées par la<br />technique d'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôle<br />de DSP1 sur le CMM Fab-7 qui régule le gène Ultrabithorax. Nous montrons par des<br />expériences de transgenèse que la fixation de DSP1 est indispensable à l'activité du CMM.<br />Par ailleurs, nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteur précoce des<br />protéines PcG. Nous montrons également que DSP1 intervient en tant que protéine du groupe<br />TrxG dans l'activation du gène Sex combs reduced. Dans ce cas, DSP1 est essentielle au cours<br />de la vie larvaire. Enfin, nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène knirps et<br />participe à l'établissement de son profil d'expression plutôt qu'à son maintien.

Chromatin is a multi-layered structure composed of DNA, nucleosomes, histone modifications, and associated proteins that critically affects genome function. Recently developed sequencing technologies enable genomewide characterization of certain aspects of chromatin structure, including nucleosome positioning and histone modifications. However, chromatin proteins present several challenges due to their dynamic nature and variable association with DNA. Chromatin proteins such as Polycomb regulators and heterochromatic factors play critical and global roles in epigenetic repression and hence new approaches are needed for their study. We first sought to identify sequences that recruit Polycomb repressive complex 2 (PRC2) in mammalian cells. We combined chromatin immunoprecipitation with sequencing (ChIP-seq) to map the candidate transcription factor YY1, and found that it does not correlate with PRC2 localization, suggesting that YY1 is not directly involved in PRC2 recruitment. We also identified GC-rich sequences that are necessary and sufficient for PRC2 recruitment. Yet attempts to map additional Polycomb proteins and other repressors using ChIP-seq proved difficult. Since chromatin proteins are often broadly, secondarily or transiently bound to DNA, they are difficult to crosslink. Antibody quality also varies, further hampering ChIP-seq technology. Here, we adapt DamID, a method for mapping chromatin regulators that uses a fusion enzyme and that does not rely on crosslinking or antibodies, for high-throughput sequencing. We show that DamID-seq can be used to globally characterize chromatin repressors in human cells. We used DamID-seq to map the binding of 12 chromodomain-containing and related proteins in K562 cells. We found that these proteins cluster into two modules: 1) Polycombrelated and 2) heterochromatin-related. Polycomb proteins bind developmental genes, while heterochromatin proteins bind broad olfactory receptor (OR) and zinc finger (ZNF) domains. Surprisingly, unlike other Polycomb proteins, CBX2 uniquely binds genes involved with modifying proteins. Our findings advance the model that the genome is compartmentalized into domains, and identify the distinct protein components that associate respectively with Polycomb and heterochromatin domains in human cells. We expect that DamID-seq, along with further advancements in characterizing the three-dimensional organization of chromatin, will bring us towards a better understanding of the role of chromatin in differentiation, development, and disease.

Our lab has recently found that E2F3, an essential cell cycle regulator, regulates the self-renewal capacity of neural precursor cells (NPCs) in the developing mouse brain. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and immunoblotting techniques revealed several E2F3 target genes, including the polycomb group (PcG) protein, EZH2. Further ChIP and immunoblotting techniques identified the neural stem cell self-renewal regulators p16INK4a and Sox2 as shared gene targets of E2F3 and PcG proteins, indicating that E2F3 and PcG proteins may co-regulate these target genes. E2f3-/- NPCs demonstrated dysregulated expression of EZH2, p16INK4a, and SOX2 and decreased enrichment of PcG proteins at target genes. Restoring EZH2 expression to E2f3+/+ levels restores p16INK4a and SOX2 expression levels to near E2f3+/+ levels, and also partially rescues NPC self-renewal capacity toward E2f3+/+ levels. Taken together, these results suggest that E2F3 controls NPC self-renewal by modulating expression of p16INK4a and SOX2 via regulation of PcG expression, and potentially PcG recruitment.

This thesis is focused on multiple myeloma (MM), a haematological malignancy that still remains incurable. The pathogenesis of MM is not fully understood and there is a large intra-tumour and interclonal genetic variation in MM patients. One of the most challenging areas in MM research is to find mechanisms for initiation and progression of MM, but also to overcome the arising resistance to therapy. In paper I, a signature of under-expressed genes in MM was found to significantly correlate with already defined Polycomb target genes. In selected genes from the profile we found an enrichment of H3K27me3, a repressive mark catalysed by Polycomb repressive complex 2 (PRC2), in MM patients and MM cell lines. Treatment with LBH589 (HDAC inhibitor) and DZNep (methyltransferase inhibitor) reactivated the H3K27me3 target genes and induced apoptosis in MM cell lines. LBH589 reduced tumour load and increased overall survival in the 5T33MM mice. These results suggest an important role for Polycomb complex in MM development and highlight PRC2 as a drug target in MM. In paper II, the insulin-like growth factor type 1 receptor tyrosine kinase (IGF-1RTK) inhibitor picropodophyllin (PPP) in combination with LBH589 synergistically inhibited cell proliferation and enhanced the apoptotic effect in MM. Since the bone marrow microenvironment has an important role in MM disease and also contributes to drug-resistance, we therefore evaluated the drug combination in the immunocompetent 5T33MM murine model. The drug combination significantly prolonged the survival of the 5T33MM mice compared to single drug treatment. We conclude that the combination of PPP and LBH589 has a therapeutic potential in MM. In paper III, the role of the cellular inhibitor of apoptosis protein 2 (cIAP2) was evaluated in MM cells harbouring TRAF3 deletion/mutation. By overexpressing cIAP2 in these cells we found an increased resistance to proteasome inhibitors. cIAP2 over-expression by lentiviral constructs led to decreased caspase activation, activation of the canonical NF-κB pathway, and down-regulation of tumour suppressor genes and genes that contribute to apoptosis. Supporting the role of cIAP2 mediated drug-resistance, we here demonstrate that inhibiting cIAP2 using an IAP antagonist, increased the sensitivity to the proteasome inhibitor, bortezomib.

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AN ABSTRACT OF THE DISSERTATION OF Priya Londhe, for the Doctor of Philosophy degree in Biochemistry and Molecular Biology, presented on 30th July, 2013 at Southern Illinois University Carbondale. TITLE: UNRAVELING THE MOLECULAR MECHANISMS OF THE CLASS II TRANSACTIVATOR IN SKELETAL MUSCLE MAJOR PROFESSOR: Dr. Judy Davie The inflammatory cytokine, interferon gamma, IFN-gamma orchestrates a diverse array of fundamental physiological processes and exhibits complex effects on myogenesis. IFN-gamma also induces the class II transactivator, CIITA, which is a critical mediator of IFN-gamma mediated repression and activation. The aims in my dissertation are directed towards understanding the role of IFN-gamma and CIITA in muscle. Stimulation by IFN-gamma in skeletal muscle cells induces CIITA expression as well as MHC class II gene expression. We show that the IFN-gamma induced inhibition of myogenesis is mediated by CIITA, which specifically interacts with myogenin. CIITA acts by both, repressing the expression and inhibiting the activity of myogenin at different stages of myogenesis. The IFN-gamma mediated repression is reversible, with myogenesis proceeding normally upon removal of IFN-gamma. We also show that CIITA is indispensible for the inhibition of myogenesis. To gain a mechanistic insight into the IFN-gamma induced repression of myogenesis, we have discovered that IFN-gamma and CIITA inhibit myogenesis by modifying gene regulation in a muscle cell subject to inflammation. We show that CIITA first interacts with JARID2, a non catalytic subunit of PRC2 complex, which induces a paused RNAPII, phosphorylated at serine 5 and then interacts with the catalytic subunit EZH2, in a JARID2 dependent manner. Our data show that both CIITA and IFN-gamma block myogenesis by the induction and recruitment of the PRC2 complex, which is normally silenced in a differentiating muscle cell. One of my dissertation aims sheds light on the silencing of CIITA in Rhabdomyosarcoma. Silencing of CIITA prevents the expression of MHC Class I and II genes. We have found that IFN-gamma signaling is intact in these cells, but pSTAT1 and IRF1 do not bind to the CIITA PIV promoter. The CIITA promoter is not hypermethylated in RD (ERMS) cells, but shows a modestly enhanced methylation status in SJRH30 (ARMS) cells. We have also observed that histone acetylation, which normally increases on the CIITA PIV promoter following IFN-gamma treatment, is blocked in both types of RMS cells. Further, our studies also impart a novel role for IFN-gamma and CIITA in inhibiting the IGF induced activation of muscle specific genes. Our data show that IFN-gamma does not block the signaling cascade of IGF. However, blocking exogenous IFN-gamma restores IGF activation of muscle specific genes. My dissertation also reveals an important role for the FACT complex in the early steps of gene activation through its histone chaperone activities that serve to open chromatin structure and facilitate transcription promoting muscle differentiation. We show that myogenin interacts with the FACT complex and the recruitment of FACT complex to muscle specific genes is dependent on myogenin. The final aim in my dissertation highlights the distinct binding profiles of the MRFs and E proteins during proliferation and differentiation. Our sequential ChIP assays show that MYOD, MYOG, and MYF5 co-occupy promoters. Taken together, my dissertation provides a comprehensive understanding of the molecular mechanisms during myogenesis and reveals the deleterious effects of chronic inflammation in skeletal muscle.

Au cours du développement, les cellules acquièrent progressivement leur identité en établissant des profils transcriptionnels spécifiques qui seront maintenus à travers les divisions cellulaires successives par des mécanismes dits épigénétiques. En dépit de nombreuses sources de variations de l’environnement, génétiques ou aléatoires, les organismes vivants présentent des phénotypes très stéréotypés. Cela suggère l’existence de processus de régulation assurant l’homéostasie du développement. Chez la drosophile, la protéine Cycline G jouerait un rôle dans la stabilité du développement, processus qui tamponne les variations aléatoires du développement. De plus, cette cycline est un régulateur trancriptionnel et interagit avec deux Enhancers de Trithorax et Polycomb (ETP) : ASX et Corto, impliqués dans l’activation et la répression de nombreux gènes. L’analyse du= transcriptome des disques imaginaux d’ailes de larves de drosophile qui surpexpriment CycG nous a permis d’identifier ses cibles transcriptionnelles. Nous avons montré que le domaine d’interaction avec les ETP (ASX et Corto) de Cycline G pourrait être impliqué dans la stabilité du développement. Nos résultats suggèrent qu’une interaction fonctionnelle entre Cycline G et deux complexes Polycomb répresseurs (PR-DUB et PRC1), contrôlerait l’expression de gènes importants pour la stabilité du développement. Par ailleurs, l’interaction fonctionnelle entre des facteurs d’épissage et Cycline G serait également impliquée dans la stabilité du développement. Nos résultats suggèrent que la dérégulation de CycG induirait une augmentation du bruit transcriptionnel, ayant des répercussions sur la stabilité du développement. / During development, cells progressively acquire their identity by establishing specific transcriptional profiles that will be maintained throughout successive cell divisions by epigenetic mechanisms. Despite numerous sources of developmental variability - whether environmental, genetic or stochastic, living organisms exhibit uncannily stereotyped phenotypes, suggesting the existence of regulation processes tending to developmental homeostasis. In Drosophila, Cyclin G could participate in developmental stability, which buffers stochastic developmental variation. Moreover, this cyclin is a transcriptional regulator and interacts with two Enhancers of Trithorax and Polycomb (ETP): ASX and Corto, both involved in transcriptional gene silencing and activation. By studying the transcriptome of Drosophila imaginal wing discs overexpressing Cyclin G, we have identified its transcriptional targets. We determined that the ETP-interacting domain of Cyclin G (which binds ASX and Corto) may be involved in developmental stability. Our results show that a functional interaction between Cyclin G and two Polycomb group complexes involved in transcriptional gene silencing (PR-DUB and PRC1), may control the expression of genes required for developmental stability. Additionally, Cycling G might participate indevelopmental stability through functional interactions with splicing factors. Altogether, our results suggest that Cyclin G deregulation may induce an increase in transcriptional noise, resulting in heightened developmental variation.

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