Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Submitted by Vinícius da Silva Camargo null (viniciuscamargo.biologo@yahoo.com.br) on 2018-02-06T00:15:46Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Vinicius FINAL.pdf: 523374 bytes, checksum: fa2400897eda6d16d5e9d42d2da8984e (MD5) / Approved for entry into archive by Isabel Pereira de Matos null (isabel@fmva.unesp.br) on 2018-02-07T13:04:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 camargo_vs_me_araca_int.pdf: 523374 bytes, checksum: fa2400897eda6d16d5e9d42d2da8984e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-07T13:04:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 camargo_vs_me_araca_int.pdf: 523374 bytes, checksum: fa2400897eda6d16d5e9d42d2da8984e (MD5) Previous issue date: 2017-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho teve como objetivos determinar a ocorrência e realizar a caracterização molecular de Cryptosporidium spp. e comparar três métodos de detecção deste protozoário em amostras fecais de canários (Serinus canaria) criados em cativeiro nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. Um total de 498 amostras foi purificado por centrífugo-flutuação em solução de Sheather. A detecção de Cryptosporidium spp. foi realizada utilizando três métodos de diagnóstico: análise microscópica pela coloração negativa com verde malaquita, nested PCR (gene 18S rRNA), seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados, e PCR em duplex em tempo real (gene 18S rRNA) específica para detecção de Cryptosporidium galli e Cryptosporidium genótipo III de aves. A positividade para Cryptosporidium spp. (total de amostras positivas em pelo menos um método de diagnóstico) obtida pela análise microscópica, nested PCR e PCR duplex em tempo real foi de 13,3% (66/498). As taxas de positividade para Cryptosporidium spp. foram 2,0% (10/498) e 4,6% (23/498) por microscopia e nested PCR, respectivamente. O sequenciamento de 20 amostras amplificadas pela nested PCR identificou C. galli (3,0%;15/498), Cryptosporidium genótipo I de aves (0,8%; 4/498) e Cryptosporidium avium (0,2%; 1/498). A PCR duplex em tempo real revelou positividade de 7,8% (39/498) para C. galli e 2,4% (12/498) para Cryptosporidium genótipo III de aves. A análise microscópica diferiu significativamente da nested PCR para detecção de Cryptosporidium spp. A PCR duplex em tempo real apresentou maior sensibilidade que a nested PCR/sequenciamento para detectar as espécies/genótipos gástricos de Cryptosporidium. / This study used several diagnostic methods to examine the occurrence of and molecularly characterize Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) in southern and southeastern Brazil. A total of 498 samples were purified by centrifugal-flotation using Sheather's solution. Cryptosporidium spp. diagnosis was performed using three diagnostic methods: malachite green negative staining, nested PCR targeting the 18S rRNA gene, followed by sequencing the amplified fragments, and duplex real-time PCR targeting the 18S rRNA specific to detect Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III. The overall positivity for Cryptosporidium spp. (total samples positive in at least one protocol) from the microscopic analysis, nested PCR and duplex real-time PCR protocol results was 13.3% (66/498). The positivity rates were 2.0% (10/498) and 4.6% (23/498) for Cryptosporidium spp. by microscopy and nested PCR, respectively. Sequencing of 20 samples amplified by nested PCR identified C. galli (3.0%; 15/498), Cryptosporidium avian genotype I (0.8%; 4/498) and Cryptosporidium avium (0.2%; 1/498). Duplex real-time PCR revealed a positivity of 7.8% (39/498) for C. galli and 2.4% (12/498) for avian genotype III. Malachite green negative staining differed significantly from nested PCR in detecting Cryptosporidium spp.. Duplex real-time PCR was more sensitive than nested PCR/sequencing for detecting gastric Cryptosporidium in canaries. / FAPESP: 15/26334-8

Orientador: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca: Kátia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Jeffrey Jon Shaw / Resumo: No período de março de 2005 a fevereiro de 2006, coletaram-se amostras de sangue e medula óssea de 112 gambás (Didelphis sp.) na região urbana da cidade de Bauru,estado de São Paulo, Brasil, com o objetivo de se verificar a possibilidade destes animais atuarem como reservatórios de Leishmania. Em amostras de soro foram detectados, anticorpos anti - Leishmania sp. pela técnica de ensaio imunoenzimático em fase sólida indireto (ELISA) e em medula óssea o DNA de Leishmania sp foi amplificado por meio da reação em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando os primers 13A e 13B. Na reação de ELISA das 107 amostras analisadas 71,02% apresentaram se positivas, no PCR das 112 amostras de medula óssea analisadas 91,56% foram positivas. A evidência de fatores epidemiológicos de risco como, a presença do parasito circulante e dos vetores levam a acreditar que o gambá possa estar incluindo no ciclo da transmissão da Leishmaniose na cidade de Bauru. / Abstract: Between March 2005 and February 2006, blood and Bone marrow samples were collected from 112 Opossums (Didelphis sp.) in the urban region of Bauru city - São Paulo state - Brazil . The objective was to verify the possibilities of these animals to be the reservoir of Leishmaniasis. Anti- Leishmania sp. antibodies were detected in serum by the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and DNA from Leishmania sp was detected in bone marrow through polymerase chain reaction (PCR). The 13A and 13B primers were used to perform the PCR. From 107 samples analysed with ELISA, 71,02% were positive for Leishmania sp, and positive outcome of 91,56% was observed by PCR. The evidence of epidemiologic risk factors like, the presence of a circulating parasite and of vectors leads to the conclusion that Opossums might be included in the leishmaniasis transmission cycle in Bauru city. / Mestre

Resumo: Meningoencefalite não supurativa causada pelo Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) ocorre de forma endêmica em algumas regiões do Brasil, com ênfase no Rio Grande do Sul. No entanto, outras regiões possuem poucos relatos da ocorrência da doença, como os estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul. O presente trabalho objetivou realizar a classificação histológicas das lesões desenvolvidas durante a infecção aguda pelo BoHV-5, no encéfalo de 20 animais naturalmente acometidos pelo infecção. As principais lesões observadas, em 80% dos animais, foram de meningoencefalite não supurativa, caracterizadas por infiltrado linfo-histiocitária inflamatório. Em 20% dos animais as lesões encontradas foram não significativas, mas nestes casos todos os bovinos desenvolveram sintomatologia neurológica, e o diagnóstico da doença foi confirmado na reação em cadeia pela polimerase (PCR), com amplificação do DNA do BoHV-5. Esta classificação histológica permitiu observar alterações compatíveis com a doença, mas também mostrou que nem sempre nestes casos vai ocorrer o desenvolvimento de alterações histológicas. Todas as amostras frescas (n=20) foram submetidas ao isolamento viral e a técnica da técnica de PCR. Já os fragmentos fixados em formol e incluídos em parafina foram testados quanto à presença do vírus por meio da técnica de PCR. As vinte amostras congeladas foram consideradas positivas para o isolamento viral e para a amplificação do DNA viral na técnica de PCR, enquanto apenas 15 das 20 incluídas em parafina foram consideradas positivas para o vírus. Os fragmentos de tecidos que apresentaram alterações histopatológicas permitiram suspeitar de infecção viral por BoHV-5, mas nos casos em que estas alteração não estão presentes testes mais sensíveis são necessários. / Abstract: Meningoencephalitis occasioned by Bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) has been described as localized in some regions inside Brazil, like Rio Grande do Sul State and, also characterized as an endemic encephalitis disorder. However, the often description of its occurrence in São Paulo end Mato Grosso has being notice. The aim of this work was to first characterize the histologic lesions obtained from bovine brains suspected of suffering of neurological disorders. For this purpose, 20 brains were collected from acute cases of the disease, naturally infected by BoHV-5, confirmed by virus isolation and PCR. The most observed lesions were described as being: inflammatory cells, specially infiltrated lymphocytes (80%), necrosis (20%), and less focal gliosis and hemorrhage, in spite of these lesions have been characterized as no-specific. Brains were divided into two halves, one kept fresh for virus isolation and PCR assay, targeting the glycoprotein C gene from BoHV-5 genome. The other half brain, corresponding to cortex region, was submitted to formalin fixation and embedded into paraffin blocks for total DNA isolation. The 20 fresh samples were confirmed, by virus isolation and PCR assay, as having the BoHV-5 virus, while 15 of 20 formalin-fixed, paraffin-embedded samples were considered positive for the same analysis. Finally, the gross lesions and microscopic damage of the brain structure were sufficient for the virus infection suspicion, however it is necessary the complementary techniques to confirm the diagnosis in most of the cases. / Orientador: Tereza Cristina Cardoso Silva / Coorientador: Maria Cecília Rui Luvizotto / Banca: Jane Megid / Banca: Iveraldo dos Santos Dutra / Mestre

Os antígenos plaquetários humanos são estruturas imunogênicas resultantes de alterações pontuais (SNP) que levam a substituição de um aminoácido a nível proteico. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência alélica e genotípica do sistema HPA-1 a -5 e -15 em doadores de plaquetas do Estado do RS e comparar as frequências alélicas encontradas com as observadas em outras populações. A genotipagem HPA foi realizada através do método de PCR-SSP. Um total de 201 doadores de plaquetas foram incluídos no estudo sendo 167 caucasoides e 34 não caucasoides. O alelo “a” foi o mais frequente nos sistemas HPA-1 a -5 em ambos grupos. O genótipo HPA-15AB foi predominante sobre os genótipos homozigotos para este sistema. O teste exato de Fisher revelou diferença estatisticamente significativa para o sistema HPA-5. Houve maior prevalência do alelo HPA-5B no grupo não caucasoide. Para o grupo caucasoide, o método de neighbor-joining e a PCA revelaram proximidade genética entre este grupo e as populações europeias. De um modo geral, concluímos que as frequências alélicas para os sistemas HPA-1 a -5 e -15 encontradas em nosso grupo caucasoide são similares às descritas em populações europeias. Estes dados corroboram a formação étnica da população do RS. A maior frequência do alelo HPA-5b encontrada no grupo não caucasoide de nosso estudo indica a possibilidade de alosensibilização para pacientes que recebem transfusões de plaquetas não compatibilizadas geneticamente. / Human platelet antigens are immunogenic structures that result from single nucleotide polymorphisms (SNPs) leading to single amino acid substitutions. The present study sought to determine the allele and genotype frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 in platelet donors from the state of Rio Grande do Sul, Brazil, and compare their allele frequencies to those observed in other populations. HPA genotyping was performed via the single specific primer-polymerase chain reaction (PCR-SSP) method. The study sample comprised 201 platelet donors (167 Caucasians and 34 non-Caucasians). Allele “a” was that most commonly found for HPA-1 through 5 in both groups. The HPA-15AB genotype predominated over homozygous genotypes of this system. Fisher’s exact test revealed statistically significant differences for the HPA-5 system, with a greater prevalence of the HPA- 5B allele in non-Caucasians. The neighbor-joining method and principal components analysis (PCA) revealed genetic proximity between the Caucasian group and European populations. We conclude that the allele frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 found in our Caucasian sample are similar to those reported for European populations. These findings corroborate the ethnic makeup of the population of Rio Grande do Sul. The higher frequency of the HPA-5b allele found in the non-Caucasian group of our sample suggests the possibility of allosensitization in patients who receive platelet transfusions from genetically incompatible donors.

Philosophiae Doctor - PhD / This thesis has been placed under a long term embargo. Forensic and population genetic parameters were investigated in the Botswana population using autosomal and Y-chromosome short tandem repeat markers. AmpFlSTR Profiler plus markers were used to investigate the genetic diversity and forensic parameters in 773 individuals from Botswana from the reference database of the Botswana Police. The levels of polymorphism found using the AmpFlSTR Profiler Plus markers showed that the nine loci that make up the AmpFlSTR Profiler Plus can differentiate individuals for forensic casework in the Botswana population. AmpFlSTR Identifiler autosomal STR markers were used to investigate the population structure according to ethno-linguistics and geography 990 individuals from Botswana that serve as a reference database for the Botswana Police. Using pairwise genetic distances (Fst), analysis of molecular variance (AMOVA), factorial correspondence analysis (FCA), and the unsupervised Bayesian clustering method found in STRUCTURE and the landscape genetics software TESS, ethno-linguistics were found to have a greater influence on population structure than geography. The patterns of population structure found using these markers highlight the need for regional reference databases that include both ethnolinguistic and geographic location information. These markers have important potential for bio-anthropological studies as well as for forensic applications. The 17 Y-chromosomal short tandem repeats found in AmpFlSTR Y-filer and a highly discriminatory Y-STR genotyping system (the Y-STR 10-plex developed in the Forensics DNA Laboratory at the University of the Western Cape) were analysed in 249 unrelated male individuals from Botswana. Rst, multi-dimensional scaling (MDS) and AMOVA were used to investigate population differentiation in Botswana. The discrimination capacity (DC) was found to be higher using the Y-STR 10-plex as compared to the 17 markers in the Y-filer genotyping system. No geographic regional or ethnic differentiation was observed between the Northern and Southern regions of Botswana using both marker systems. Regional and ethnic variation can be useful in forensic working hypotheses. Cluster analysis using the highly discriminatory Y-STR 10-plex haplotypes may provide information about ancestry and haplogroup information. / National Research Foundation (NRF)

Os membros da sub-famíla Toxoplasmatinae conhecidos são Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora hughesi, Neospora caninum e Hammondia heydorni. As duas primeiras espécies têm os felídeos como hospedeiro definitivo, enquanto as duas últimas têm desenvolvimento sexual em carnívoros da família dos canídeos. O ciclo biológico de N. hughesi é pouco conhecido. Foi estudado a variabilidade nucleotídica de seqüências intercaladas entre os genes codificadores das frações ribossômicas 18S, 5.8S (ITS-1). No entanto, como estas não permitem reconstruções filogenéticas com o uso de grupo externo, em virtude da inconsistência dos alinhamentos produzidos, pesquisamos uma seqüência codificadora de proteína sendo o marcador escolhido, o gene codificador da proteína de choque térmico HSP70 (heat shock protein 70KDa). Este gene é bastante utilizado para resolução de filogenias de outros organismos como, por exemplo, aqueles pertencentes ao gênero Cryptosporidium. No presente trabalho, amplificamos por PCR e seqüenciamos 951 pares de bases (pb) do gene codificador de HSP70 de oocistos T. gondii-like (oriundos de fezes gatos), de oocistos Neospora-like (de fezes de cães) e de taquizoitos de N. caninum, N. hughesi e T. gondii mantidos em laboratório. Os primers foram desenhados a partir de seqüências consenso obtidas em pesquisa de bancos de dados de seqüências EST de N. caninum e seqüências de RNAm de T. gondii. Seqüências ITS-1 destes oocistos também foram determinadas para a confirmação da espécie de parasito estudada. Os resultados mostram que os táxons H. hammondi e T. gondii são monofiléticos e geneticamente muito próximos, mas contrariando resultados anteriores, não foi demonstrada a monofilia entre os táxons H. heydorni e N. caninum. De fato, a análise de diversidade nucleotídica de gene codificador HSP70 mostra que a distância evolutiva entre H. heydorni e N. caninum é tão grande quanto a distância de cada uma destas espécies com T. gondii. Em adição, foi possível identificar dentre as amostras de oocistos, duas linhagens divergentes de H. heydorni. Paralelamente ao estudo filogenético também foi possível desenvolver um método diagnostico diferencial para oocistos tipo Hammondia. As seqüências de gene HSP70 obtidas foram alinhadas e dois pares de primers internos a estas seqüências foram desenhados. O primeiro par amplifica 771 pb de oocistos T. gondii-like e o segundo 400 pb de oocistos Neospora-like. A clivagem do fragmento de 771 pb com enzima de restrição Hin6I produz perfis eletroforéticos distintos para amostras de T. gondii e H. hammondi. A clivagem do fragmento de 400pb com a enzima de restrição MunI também produz perfis eletroforéticos distintos entre amostras de N. caninum e H. heydornii. A diferenciação dos perfis de restrição pode ser feita em eletroforese em gel de agarose a 2,5%. / Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, Neospora huguesi, Neospora caninum and Hammondia heydorni are the known members of the sub-family Toxoplasmatinae. H. heydorni and N. caninum use canids as definitive hosts whereas felids are the definitive hosts from T. gondii and H. hammondi. The definitive host of N. hughesi is unknown. Here, the nucleotide diversity at internal transcribed spacer (ITS-1) and heat shock protein (HSP70 kDa) loci in the subfamily toxoplasmatinae were studied. The HSP70 coding genes are widely used for phylogenetic studies in a number of other organisms specially within the genus Cryptosporidium. In the present study, it was amplified by PCR and sequenced 951 bases pairs (bp) from HSP70 coding gene from oocysts T.gondii-like (from cat), from oocysts N. caninum-like (from dog) and tachyzoites of N. hughesi grown on cell cultures. The primers were designed based on consensus sequences within EST sequences of N. caninum sequences and RNAm sequences of T. gondii. ITS-1 sequences amplified from oocysts were also obtained in order to confirm the species of the parasites. The results showed that T. gondii and H. hammondi are monophyletic and genetically very close, but the monophyletic status of H. heydorni N. caninum was not demonstrated. In fact, the nucleotide diversity at the HSP70 locus has shown that the evolutionary distance between H. heydorni and N. caninum is as high as that observed between either H. heydorni or N. caninum and T. gondii., In addition, it was possible to identify two distinct groups among the H. heydorni oocysts. Concomitantly to the phylogenetic study it was also possible to standardize a diagnostic test capable of differentiate the oocysts Hammondia-like was development a diagnostic method that differ oocysts T. gondii-like and N. caninum-like. The sequences obtained from HSP70 coding gene were aligned and two new pair of PCR primers was designed. The first pair amplifies 771bp from T. gondii-like oocysts, whereas the second pair amplifies 400 bp from N. caninum-like oocysts. The restriction enzyme Hin6I used to cleave the 771 bp amplicons generated distinct profiles with samples from H. hammondi and T. gondii. The same occurred with the restriction of the fragments of 400bp cleaved by the enzyme MunI used in N. caninum e H. heydorni samples. The profiles can be differentiated by 2.5% agarose gel electrophoresis.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Over the past few years, the involvement between oral pathogens and vascular disease has been investigated, with growing attention to the pathogenesis and progression of atherosclerosis. Oral bacteria have been detected in atherosclerotic plaques at a variable frequency; however, the connection between oral health and vascular and oral bacterial profiles of these patients is not clearly established. The aim of this study was to evaluate the presence of oral bacteria DNA in the mouth and atherosclerotic plaques, in addition to assess the patientâs caries and periodontal disease history. Thirty samples of supragingival and subgingival plaque, saliva and atherosclerotic plaques of 13 patients with carotid stenosis or aortic aneurysm were evaluated, through Real Time Polymerase Chain Reaction, for the presence/absence of Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola. For edentulous patients, the variables of supragingival and subgingival plaques were not considered. All patients were submitted to oral exams using the DMTF (decayed, missing and filled teeth) and PSR (Periodontal Screening and Recording) indexes for dental and periodontal evaluation, respectively, and histopathological analysis of the atherosclerotic plaques was performed. Most of the patients were edentulous (76.9%). Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola were detected in 100.0%, 92.0%, 15.3% and 30.7% of the oral samples, respectively. Streptococcus mutans was the most prevalent targeted bacteria in atherosclerotic plaques (p<0,05), detected in 100% of the samples, followed by Prevotella intermedia (7.1%), and the vascular samples were negative for Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola. There was a statistically significant difference (p<0,05) between the presence of Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola in the oral cavity and vascular samples. In conclusion, Streptococcus mutans was found at a high frequency in oral and vascular samples, even in edentulous patients, and its presence in atherosclerotic plaques suggests the possible involvement of this bacteria with the disease progression. / Nos Ãltimos anos, a relaÃÃo entre patÃgenos orais e doenÃa vascular tem sido investigada, com crescente atenÃÃo para a etiopatogÃnese e progressÃo da aterosclerose. BactÃrias orais tÃm sido detectadas em placas aterosclerÃticas, com variÃvel frequÃncia, porÃm, a relaÃÃo entre saÃde bucal e perfis bacterianos vasculares e orais dos pacientes nÃo està claramente estabelecida. Foi objetivo deste estudo avaliar a presenÃa de DNA de bactÃrias orais na boca e placas aterosclerÃticas, alÃm de avaliar histÃrico de cÃrie e doenÃa periodontal dos pacientes. Trinta amostras de placa dental supragengival, subgengival, saliva, e placas aterosclerÃticas de 13 pacientes com estenose de carÃtida ou aneurisma de aorta foram avaliadas, atravÃs de ReaÃÃo em Cadeia da Polimerase em Tempo Real, para presenÃa/ausÃncia de Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola. Para pacientes desdentados totais, nÃo foram consideradas as variÃveis de placa supragengival e subgengival. Todos os pacientes foram submetidos a exames de CPO-D (dentes permanentes cariados, perdidos e obturados) e PSR (registro periodontal simplificado) para avaliaÃÃo dentÃria e periodontal, respectivamente, bem como anÃlise histopatolÃgica das placas aterosclerÃticas. A maioria dos pacientes eram edÃntulos (76,9%). Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola foram detectados em 100,0%, 92,0%, 15,3% e 30,7% das amostras orais, respectivamente. O micro-organismo mais prevalente em placas aterosclerÃticas foi o Streptococcus mutans (p<0,05), presente em 100,0% das amostras, seguido de Prevotella intermedia (7,1%), e as amostras vasculares foram negativas para Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola. Observou-se diferenÃa estatisticamente significante (p<0,05) com relaÃÃo à presenÃa de Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola em cavidade oral e amostra vascular. Em conclusÃo, Streptococcus mutans foi encontrado em alta frequÃncia em amostras orais e vasculares, mesmo de pacientes desdentados, e sua presenÃa em placas aterosclerÃticas sugere o possÃvel envolvimento desse patÃgeno na progressÃo da doenÃa.

O objetivo deste estudo foi avaliar a plataforma OpenArray para testes genéticos em doadores de sangue e determinar as frequências genotípicas e alélicas de alterações pontuais (SNPs) associadas à trombose venosa (G1691A e G20210A), à hiperhomocisteinemia (C677T, A1298C), e à hemocromatose hereditária (C282Y, H63D e S65C) na população de doadores de sangue de São Paulo, Brasil. Foram analisadas 400 amostras de sangue total coletadas de outubro a novembro de 2011. A detecção dos SNPs foi realizada utilizando a tecnologia de microarray em superfície sólida OpenArray. As amostras também foram analisadas utilizando a técnica de PCR em Tempo Real sistema FRET para comparação dos resultados e determinação da acurácia do sistema OpenArray. Observamos que houve 100% de concordância de resultados entre ambas as técnicas para todas as amostras, em todas as variantes pesquisadas, com exceção da mutação C282Y no gene HFE, a qual apresentou 99,75% de concordância. O resultado da amostra em questão foi posteriormente confirmado por sequenciamento direto (Sanger), que confirmou o resultado fornecido pelo método OpenArray. As frequências calculadas para cada SNP foram: FV G1691A 98,8% (G/G), 1,2% (G/A); FII G2021A 99,5% (G/G), 0,5% (G/A); MTHFR C677T 45,5% (C/C), 44,8% (C/T), 9,8% (T/T); MTHFR A1298C 60,3% (A/A), 33,6% (A/C), 6,1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78,1%(C/C), 20,3% (C/G), 1,6% (G/G); e HFE S65C 98,1% (A/A), 1,9% (A/T). Esses resultados descrevem as frequências de SNPs associados a doenças e são importantes para aprimorar o conhecimento atual do perfil genético da população de doadores de sangue brasileiros, embora um estudo maior seja necessário para determinar com a maior acurácia a frequência das mutações pesquisadas. Além disso, observamos que a plataforma OpenArray, demonstrou alta taxa de concordância com o método de PCR em Tempo Real sistema FRET. / The aim of this study was to evaluate the OpenArray platform for genetic testing of blood donors and to assess the genotype frequencies of nucleotide-polymorphisms (SNPs) associated with venous thrombosis (G1691A and G20210A), hyperhomocysteinemia (C677T, A1298C), and hereditary hemochromatosis (C282Y, H63D and S65C) in blood donors from Sao Paulo, Brazil. We examined 400 blood donor samples collected from October to November 2011. The SNPs were detected using OpenArray technology. The blood samples were also examined using a real-time PCR-FRET system to compare the results and determine the accuracy of the OpenArray method. We observed 100% agreement in all assays tested, except HFE C282Y, which showed 99.75% agreement. The HFE C282Y assay was further confirmed through direct sequencing, and the results showed that OpenArray analysis was accurate. The calculated frequencies of each SNP were FV G1691A 98.8% (G/G), 1.2% (G/A); FII G2021A 99.5% (G/G), 0.5% (G/A); MTHFR C677T 45.5% (C/C), 44.8% (C/T), 9.8% (T/T); MTHFR A1298C 60.3% (A/A), 33.6% (A/C), 6.1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78.1%(C/C), 20.3% (C/G), 1.6% (G/G); and HFE S65C 98.1% (A/A), 1.9% (A/T).Taken together, these results describe the frequencies of SNPs associated with diseases and are important to enhance our current knowledge of the genetic profiles of Brazilian blood donors, although a larger study is needed for a more accurate determination of the frequency of the alleles. Furthermore, the OpenArray platform showed a high concordance rate with standard FRET RT-PCR

Orientador: Ricardo Della Coletta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:13:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bitu_CarolinaCavalcante_M.pdf: 2697106 bytes, checksum: fa0aa1863121c0b931af7b4d2def776b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Genes homeobox, especialmente os da família HOX, exercem um papel importante no desenvolvimento por meio de um intenso controle da proliferação, diferenciação e morte celular. Os genes HOX também estão relacionados com o surgimento de diferentes tipos de neoplasias, incluindo os cânceres de próstata, ovário, rim, pulmão, pele e leucemias, sendo pouco estudados em câncer oral. O objetivo deste estudo foi quantificar os genes da família HOX, especificamente dos loci A e D, que são expressos em amostras orais de mucosa normal e carcinoma espinocelular (CEC) por meio de ensaios semi-quantitativos de transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) ¿duplex¿. Pares de amostras orais de mucosa normal e CEC do mesmo paciente e amostras de mucosa oral normal de indivíduos sem história de tabagismo ou alcoolismo foram utilizadas para este propósito. Adicionalmente, nós avaliamos o perfil de expressão destes genes em linhagens celulares de queratinócitos normais e CEC oral. Nossos resultados demonstraram que os membros HOXA1, HOXA3, HOXA4, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXD1 e HOXD13 foram expressos em níveis elevados nas linhagens de CEC oral quando comparado com a linhagem de queratinócito normal. Os membros HOXA3, HOXA5, HOXA7, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXD3, HOXD4 e HOXD12 não foram expressos por nenhuma das amostras de mucosa oral normal provenientes de pacientes não associados a fatores de risco para o CEC oral, enquanto que apenas o membro HOXD12 não foi expresso pelas amostras de mucosa morfologicamente normal proveniente de pacientes portadores de CEC. Comparado às amostras de mucosa normal proveniente de pacientes com e sem fator de risco para CEC oral, nós observamos que as expressões de HOXA1, HOXA2 e HOXD8 foram estatisticamente maiores nas amostras oriundas de indivíduos com história de tabagismo e etilismo. A expressão dos genes HOXA4, HOXA5, HOXA7, HOXA10, HOXD9, HOXD10, HOXD11 e HOXD13 foi significantemente maior nas amostras de CEC oral comparado com mucosa normal, independente da associação com fatores de risco. Interessantemente, os membros HOXA6 e HOXA9 não foram expressos por nenhuma das amostras deste estudo. Estes resultados sugerem que uma expressão desregulada dos membros da família HOX de genes homeobox dos loci A e D foi identificada no desenvolvimento e/ou progressão do CEC oral. / Abstract: Homeobox genes, specifically the HOX family, play an important role in the development by controlling cellular proliferation, differentiation and apoptosis. Expression of HOX genes is associated with many cancers including those of the prostate, ovary, kidney, lung, skin and leukemia, but still there is little understanding of their roles in oral cancer. The aim of this study was to quantify the HOX genes from loci A and D expressed in oral samples from normal mucosa and squamous cell carcinoma (SCC) by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) duplex method. Normal oral mucosa and oral SCC obtained from the same patient, and normal oral mucosa from patients without history of exposition to risk factors related to oral SCC (smoking habit and alcohol consumption) were included in this study. Additionally, we analyzed the expression profile of those genes in normal keratinocyte and oral SCC cell lines. Our results demonstrated that HOXA1, HOXA3, HOXA4, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXD1 and HOXD13 were expressed in higher levels in oral SCC cell lines compared with normal keratinocyte cell line. None of the normal oral mucosa samples from patients without risk factors related to oral SCC expressed HOXA3, HOXA5, HOXA7, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXD3, HOXD4 and HOXD12, whereas only HOXD12 was not expressed by the normal mucosa samples from patients with oral SCC. Comparing the two groups of normal oral mucosa, we found that HOXA1, HOXA2 and HOXD8 had statistically significant higher expression levels in samples from patients with history of smoking habit and alcohol consumption. The expression of HOXA4, HOXA5, HOXA7, HOXA10, HOXD9, HOXD10, HOXD11 e HOXD13 was statistically higher in oral SCC samples when compared with those from normal oral mucosa, regardless of the risk factor association. Interestingly, HOXA6 and HOXA9 were not expressed by either the cell lines or tissue samples. The results of our study suggest that a dysregulated expression of specific members of the loci A and D of the HOX family of homeobox genes may be related to the tumorigenesis and/or tumor progression of oral SCCs. / Mestrado / Patologia / Mestre em Estomatopatologia