Introdução: Dos arbovírus transmitidos no Brasil, os Flavivirus apresentam destaque por causarem o maior número de infecções e doenças no homem e pela gravidade das doenças que provocam. A cidade de São Paulo possui áreas verdes, representadas por parques municipais em que existem lagos, aves e mamíferos. Esses locais são frequentados pela população e podem servir de refúgio para mosquitos que infestam a área urbana. Alguns trabalhos revelam a ocorrência de espécies de mosquitos conhecidas como vetoras de Flavivirus em tal cidade, o que pode favorecer o aparecimento de casos e transmissão de doenças causadas por este tipo de vírus. No entanto, a presença de Flavivirus infectando tais artrópodes não é conhecida. Objetivo: Identificar presença de Flavivirus em mosquitos (Diptera: Culicidae) provenientes de áreas verdes da cidade de São Paulo. Método: Sete parques municipais localizados em diferentes regiões da cidade foram selecionados para o estudo. Foram realizadas coletas de mosquitos mensais em cada parque no período de março de 2011 e fevereiro de 2012. As armadilhas utilizadas foram: aspirador, Shannon e CDC-CO2. Os mosquitos foram transportados para o laboratório em gelo seco, identificados em mesa fria e agrupados em \"pools\" de até 10 fêmeas não ingurgitadas, segundo espécie, data e local de coleta. Fêmeas ingurgitadas foram armazenadas individualmente. As amostras foram submetidas à extração de ácidos nucleicos, seguida de RT-PCR em tempo real para amplificação de fragmento de aproximadamente 200pb do gene NS5 de Flavivirus. Amostras positivas foram encaminhadas para sequenciamento e análises filogenéticas. Resultados: Dentre as 5.213 fêmeas não ingurgitadas (818 pools) e as 778 fêmeas ingurgitadas coletadas, ocorreu presença de onze gêneros de Culicídeos, sendo mais frequentes Culex e Aedes. Dezenove pools de fêmeas não ingurgitadas obtiveram resultado positivo para Flavivirus. Análises filogenéticas mostraram presença de RNA relacionado à Aedes flavivirus (AEFV) em dois pools de Aedes e à Culex flavivirus (CxFV) nos demais pools, todos de Culex. Conclusões: CxFV e AEFV estão presentes em mosquitos dos gêneros Culex e Aedes, respectivamente, coletados em parques municipais da cidade de São Paulo. Embora flavivírus patogênicos ao homem não tenham sido encontrados no presente trabalho, recomenda-se vigilância de flavivírus nas áreas estudas, visto que elas possuem presença de mosquitos vetores e hospedeiros vertebrados, ou seja, elementos necessários para a transmissão destes vírus. / Introduction: Among the arboviruses transmitted in Brazil, Flavivirus are noteworthy once they cause the largest number of infections and diseases in humans and also because they can cause serious illnesses. In the city of São Paulo there are green spaces, represented by city parks in which lakes, birds and mammals are found. The population visits those places, which can also be a refuge for mosquitoes that infect the urban area. Some studies reveal the occurrence of mosquitoes species known to be vectors of Flavivirus in this city, what can contribute to the emergence of cases and transmission of diseases caused by this kind of virus. However, the presence of Flavivirus infecting those arthropods is not known. Objective: To Identify infection by Flavivirus in mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in São Paulo\'s city parks. Method: Seven city parks located in different places of the city were selected for the study. Monthly mosquito collections were carried out in each park from March 2011 to February 2012. The traps employed were aspirator, Shannon and CDC-CO2. The mosquitoes were transported to the laboratory on dry ice. Identification was performed in a chill table. Up to 10 non-engorged females were pooled according to specie, date and place of collection. Engorged females were stored individually. Nucleic acids were extracted and submitted to real time RT-PCR that amplifies a 200pb fragment of NS5 gene of Flavivirus. Positive samples were sequenced and phylogenetic analyses were performed. Results: Eleven genus of Culicidae were found among the 5,213 non engorged females (818 pools) and the 778 engorged females. Culex and Aedes were the most frequent collected genus. Nineteen non engorged female pools had positive results for the presence of Flavivirus RNA. Phylogenetic analyses showed the RNA found was related to Aedes flavivirus (AEFV) in two pools of Aedes and to Culex flavivirus (CxFV) in the other pools, all of them consisting of Culex. Conclusion: CxFV and AEFV are present in mosquitoes Culex and Aedes, respectively, collected in São Paulo\'s city parks. Flavivirus of medical importance were not detected. Although, once there are species of mosquitoes that can act as vectors of pathogenic Flavivirus and vertebrate hosts, which are required for the transmission cycle of those virus, surveillance is recommended in the studied areas.

As formas sintomáticas de toxoplasmose são um grave problema de saúde pública e ocorrem em cerca de 10 a 20% das pessoas infectadas. Com o objetivo de melhorar o diagnóstico molecular de toxoplasmose sintomática em pacientes brasileiros, este estudo avaliou o desempenho da PCR em tempo real (qPCR) na detecção do DNA de T. gondii testando dois conjuntos de iniciadores moleculares (B1 e REP-529) para diagnóstico molecular. A metodologia foi testada em 807 amostras clínicas com diagnóstico clínico conhecido, ELISA e PCR convencional (cPCR) em um período de 9 anos. Todas as amostras foram de pacientes com suspeita clínica de diferentes formas da toxoplasmose. De acordo com a curva mínima de limite de detecção (no CT), o REP-529 apresentou maior sensibilidade para detectar DNA de T. gondii do que B1. Ambos os conjuntos de iniciadores moleculares foram avaliados retrospectivamente usando o DNA de 515 amostras clínicas diferentes. Os 122 pacientes com resultado negativo na PCR em tempo real, provavelmente por terem infecção crônica, demonstraram alta especificidade (REP-529, 99,2% e B1, 100%). Das 393 amostras com ELISA positivo (IgG), 146 apresentaram diagnóstico clínico de toxoplasmose e cPCR positivo. As sensibilidades de REP-529 e B1 foram de 95,9% e 83,6%, respectivamente. A comparação dos desempenhos do REP-529 e B1 foi analisada prospectivamente em 292 amostras. Assim, a partir de um total de 807 amostras de DNA analisadas, 217 (26,89%) apresentaram PCR positivo, pelo menos em um conjunto de iniciadores e com toxoplasmose sintomática confirmada pelo diagnóstico clínico. O REP-529 foi positivo em 97,23%, enquanto o B1 amplificou apenas 78,80%. Depois de comparar várias amostras em um laboratório brasileiro de referência, este estudo concluiu que o conjunto de iniciadores REP-529 apresentou melhor desempenho do que B1. Essas observações foram baseadas após o uso de casos com diagnóstico clínico definido, ELISA e cPCR. / Symptomatic forms of toxoplasmosis are a serious public health problem and occur in around 10-20% of the infected people. Aiming to improve the molecular diagnosis of symptomatic toxoplasmosis in Brazilian patients, this study evaluated the performance of real time PCR (qPCR) in detecting T. gondii DNA testing two primer sets (B1 and REP-529) for molecular diagnosis. The methodology was assayed in 807 clinical samples with known clinical diagnosis, ELISA, and conventional PCR (cPCR) results in a 9-year period. All samples were from patients with clinical suspicion of several features of toxoplasmosis. According to the minimum detection limit curve (in CT), REP-529 had greater sensitivity to detect T. gondii DNA than B1. Both primer sets were retrospectively evaluated using 515 DNA from different clinical samples. The 122 patients without toxoplasmosis (with negative real-time PCR) provided high specificity (REP-529, 99.2% and B1, 100%). From the 393 samples with positive ELISA (IgG), 146 had clinical diagnosis for toxoplasmosis and positive cPCR. REP-529 and B1 sensitivities were 95.9% and 83.6%, respectively. Comparison of REP-529 and B1 performances was further analyzed prospectively in 292 samples. Thus, from a total of 807 DNA analyzed, 217 (26.89%) had positive PCR with, at least one primer set and with symptomatic toxoplasmosis confirmed by clinical diagnosis. REP-529 was positive in 97.23%, whereas B1 amplified only 78.80%. After comparing several samples in a Brazilian referral laboratory, this study concluded that REP-529 primer set had better perform than B1 one. These observations were based after using cases with defined clinical diagnosis, ELISA, and cPCR.

Strongyloides venezuelensis é um parasita intestinal de ratos frequentemente utilizado como modelo para o estudo da estrongiloidíase humana e animal. O objetivo deste estudo foi comparar os métodos parasitológicos, sorológico e molecular no diagnóstico da infecção experimental por S. venezuelensis em ratos (Rattus norvegicus). Amostras de fezes e soro foram colhidas e analisadas até o 60º dia pós-infecção (d.p.i.). Os métodos parasitológicos (contagem de ovos por gramas de fezes e cultura em carvão) foram positivos do 5º ao 45º d.p.i. Utilizando o teste sorológico (imunoenzimático, ELISA), os níveis séricos de anticorpos IgG aumentaram até o 28º d.p.i., e posteriormente reduziram até o 60º d.p.i. A reação em cadeia da polimerase (PCR) detectou DNA específico de S. venezuelensis nas amostras de fezes do 5º até 21º d.p.i. e do 2º até o 8º d.p.i. nas amostras de soro. Conclui-se que a detecção de DNA de S. venezuelensis, a partir de amostras de soro, é uma ferramenta diagnóstica promissora. Portanto, o presente estudo apresenta uma importante contribuição na melhoria do diagnóstico da estrongiloidíase experimental. / Strongyloides venezuelensis is an intestinal parasite of rats frequently used as a model for studying animal and human strongyloidiasis. The aim of this study was to evaluate the parasitological, serological and molecular methods for the diagnosis of experimental S. venezuelensis in rats (Rattus norvegicus). Stool and serum samples were collected and analyzed up to 60 days post-infection (d.p.i.). The parasitological methods (eggs per gram of feces and charcoal culture) were positive from 5 to 45 d.p.i. Using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) serum levels of IgG antibodies increased up to 28 d.p.i. and thereafter decreasing by 60 d.p.i. Polymerase chain reaction (PCR) assays detected S. venezuelensis DNA in stool samples of rats from 5 to 21 d.p.i. and in serum samples from 2 to 8 d.p.i. In conclusion, detection of S. venezuelensis DNA from serum samples is a promising diagnostic tool. The present study presents an important contribution to improve the diagnosis of experimental strongyloidiasis.

Os antígenos plaquetários humanos são estruturas imunogênicas resultantes de alterações pontuais (SNP) que levam a substituição de um aminoácido a nível proteico. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência alélica e genotípica do sistema HPA-1 a -5 e -15 em doadores de plaquetas do Estado do RS e comparar as frequências alélicas encontradas com as observadas em outras populações. A genotipagem HPA foi realizada através do método de PCR-SSP. Um total de 201 doadores de plaquetas foram incluídos no estudo sendo 167 caucasoides e 34 não caucasoides. O alelo “a” foi o mais frequente nos sistemas HPA-1 a -5 em ambos grupos. O genótipo HPA-15AB foi predominante sobre os genótipos homozigotos para este sistema. O teste exato de Fisher revelou diferença estatisticamente significativa para o sistema HPA-5. Houve maior prevalência do alelo HPA-5B no grupo não caucasoide. Para o grupo caucasoide, o método de neighbor-joining e a PCA revelaram proximidade genética entre este grupo e as populações europeias. De um modo geral, concluímos que as frequências alélicas para os sistemas HPA-1 a -5 e -15 encontradas em nosso grupo caucasoide são similares às descritas em populações europeias. Estes dados corroboram a formação étnica da população do RS. A maior frequência do alelo HPA-5b encontrada no grupo não caucasoide de nosso estudo indica a possibilidade de alosensibilização para pacientes que recebem transfusões de plaquetas não compatibilizadas geneticamente. / Human platelet antigens are immunogenic structures that result from single nucleotide polymorphisms (SNPs) leading to single amino acid substitutions. The present study sought to determine the allele and genotype frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 in platelet donors from the state of Rio Grande do Sul, Brazil, and compare their allele frequencies to those observed in other populations. HPA genotyping was performed via the single specific primer-polymerase chain reaction (PCR-SSP) method. The study sample comprised 201 platelet donors (167 Caucasians and 34 non-Caucasians). Allele “a” was that most commonly found for HPA-1 through 5 in both groups. The HPA-15AB genotype predominated over homozygous genotypes of this system. Fisher’s exact test revealed statistically significant differences for the HPA-5 system, with a greater prevalence of the HPA- 5B allele in non-Caucasians. The neighbor-joining method and principal components analysis (PCA) revealed genetic proximity between the Caucasian group and European populations. We conclude that the allele frequencies of HPA-1 through 5 and HPA-15 found in our Caucasian sample are similar to those reported for European populations. These findings corroborate the ethnic makeup of the population of Rio Grande do Sul. The higher frequency of the HPA-5b allele found in the non-Caucasian group of our sample suggests the possibility of allosensitization in patients who receive platelet transfusions from genetically incompatible donors.

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T06:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Albuquerque_DulcineiaMartinsde_M.pdf: 5471882 bytes, checksum: d76b070e587d57837f8b747721f15926 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O Citomegalovírus Humano (HCMV) é um dos mais importantes agentes infecciosos que acometem pacientes imunocomprometidos, causando significante morbidade e mortalidade nesse grupo. A detecção do genoma do HCMV pela PCR (Reação em cadeia da polimerase) é específica e sensível e pode servir como uma poderosa ferramenta para o diagnóstico precoce da infecção causada por esse vírus. Variações em regiões funcionalmente relevantes do genoma do HCMV têm sido usadas como marcadores' genéticos em numerosos estudos clínicos para diferenciar as linhagens e associá-las a pato gênese viral e manifestação clínica no paciente. As glicoproteínas do envelope do citomegalovírus são provavelmente essenciais para a entrada e disseminação viral nas células hospedeiras; são também imp9rtantes alvos da resposta imune humana que induz a formação de anticorpos de neutralização do vírus. A PCR, combinada com análise de restrição de regiões polimórficas de produtos amplificados (PCR-RFLP), é eficaz para identificação dos genotipos de HCMV, sendo possível a distinção de pelo menos 4 padrões eletroforéticos. Por outro lado, a determinação da carga viral em pacientes comprometidos imunologicamente, tem sido associada como marcador ou preditor para o desenvolvimento de doença órgão-específica pelo HCMV, sendo de fundamental importância para a monitorização da terapêutica. Além disso, o valor da carga viral está relacionado com o grupo de paciente e/ou tipo de transplante, pato gênese do HCMV e níveis de imunossupressão e pode indicar o inicio da terapia antiviral. Sabendo-se da importância da identificação das linhagens de HCMV em pacientes imunocomprometidos, sua possível relação com a infectividade e apresentação clínica, e a relevância da determinação da carga viral nos diversos grupos, este trabalho, avaliando diferentes populações imunologicamente comprometidas atendidas no HC-UNICAMP, teve como objetivos principais: determinar a prevalência dos genotipos de HCMV e avaliar uma possível associação do subtipo com IV o quadro clínico apresentado pelos diferentes grupos estudados; padronizar métodos de determinação da carga viral com a finalidade de avaliar a aplicabilidade no monitoramento da terapia antiviral e como valor preditivo de doença pelo HCMV. Para a genotipagem, 122 amostras clínicas (sangue e urina) de 104 pacientes foram avaliadas retrospectivamente. Os grupos de pacientes, infectados pelo HCMV, eram basicamente os seguintes: recém-nascidos com infecção congênita, transplantados de medula óssea, transplantados hepáticos e renais, e portadores do HIV. Os resultados foram analisados estatisticamente. Para a quantificação, foram avaliadas 2 metodologias: uma baseada no princípio de captura híbrida onde foram analisadas 93 amostras e a outra PCR diluição limitante, alguns exemplares foram avaliados, já que a qualidade do DNA é fundamental para o prosseguimento da metodologia. Como resultados, pudemos caracterizar em nosso grupo de pacientes, os 4 genotipos descritos em literatura. Observamos a maior prevalência do genotipo gB2, embora os subtipos gBI e gB3 estivessem bem representados. Dados estatísticos não comprovaram a associação de uma determinada linhagem do vírus com a gravidade da manifestação clínica, bem como um grupo específico de pacientes. As metodologias de quantificação avaliadas possuem alta sensibilidade e especificidade, compatíveis com a Antigenemia. A principal vantagem das metodologias em relação à essa última, é em relação ao processamento da amostra, que não necessita ser imediata à coleta pois não dependem da viabilidade do vírus. Enfim, acreditamos que a determinação da linhagem do HCMV e da carga viral sejam metodologias complementares e de fundamental importância no entendimento e monitoramento da infecção pelo HCMV em pacientes imunocomprometidos / Abstract: Human Cytomegalovirus (HCMV) is one of the most important infectious agents that attack immunocompromised patients causing significant morbidity and mortality in this group. The detection of the HCMV genome by the PCR (polymerase Chain Reaction) is specific and sensitive; and it can be used as a powerful tool for the early diagnoses of the infection caused by this virus. Variations in functionally relevant areas of the HCMV genome have been used as genetic markers in numerous clinical studies to differentiate the strains and to associate them with the viral pathogenesis and the clinical manifestation in the patient. The glycoproteins of the envelope of the human cytomegalovirus are probably essential to the entrance and the viral dissemination in the host cells; they are also important targets of the human immune response that induce the formation of the antibodies of the virus neutrality. The PCR, combined with the analysis of restriction of the polymorphic areas of the amplified products (PCR-RFLP), is elective for the identification of the HCMV genotypes, becoming possible the distinction ofat least 4 (four) electrophoretic pattems. On the other hand, the determination of the viralload in patients immunologically atlected has been associated as marker or predictor for the development of the organ specific disease by the HCMV, being of fundamental importance to the management of the therapy. Besides, the value of the viral load is related to the group of patients and/or the type of transplant, the pathogenesis of the HCMV, and the levels of the immune-suppression; and it can indicate the beginning of the antiviral therapy. Knowing the importance of the identification of the strains of the HCMV in immunocompromised patients, its possible relation with the infection and clinical presentation, and the relevance of the determination of the viral load in several groups, this study, evaluating different immunocompromised people followed at HC-UNICAMP, had as main targets: to determine the prevalence of the HCMV genotypes and evaluate a possible association of the subtype with the clinical table presented by different groups studied; standardize determination methods of the viral load with the finality of evaluating the applicability in the management of the antiviral therapy, and as predictable value of the disease by the HCMV. A hundred and twenty-two (122) clinical samples (blood and urine) of 104 patients were evaluated retrospectively to the genotipage. The groups of HCMV infected patients were basically the following: newborn children with congenital infection, bone marrow transplanted patients, hepatic and renal transplanted patients, and HIV infected individuals. The results were statistically analyzed. Two methodologies were evaluated for the quantification: one based on the principle of the hybrid capture, where 93 samples were analyzed; and another one on the PCR limiting dilution, where some exemplars were. evaluated, since the quality of the DNA is fundamental to the continuation of the methodology. We could characterize, in our group of patients, the four genotypes described in literature as results. We observed the largest prevalence of the gB2 genotype, although the gB 1 and gB3 genotypes were well represented. Statistical data did not prove the association of a determined strain of the virus with the sevevity of the clinical manifestation, as well as a specific group of patients. The methodologies of quantification evaluated have high sensitivity and specificity, compatible with the Antigenemia. The main advantage of the methodologies regarding the former one is in relation to the processing of the sample that does not need to be just after the collection because it does not depend on the viability of the virus. inally, we believe that the determination of the HCMV strain and viral load are complementary methodologies and of fundamental importance for the understanding and management of the HCMV infection in immunocompromised patients. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Luis Otávio Zanatta Sarian / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paleari_RenataGasparotto_M.pdf: 1524393 bytes, checksum: 5d2b405ce97d9adb743a2ea6763aac00 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Objetivo: Avaliar a prevalência do polimorfismo C825T em mulheres com e sem câncer de mama e associá-lo ao índice de massa corpórea (IMC), ao risco individual para o câncer e características clínicas e reprodutivas. Sujeitos e métodos: Foram incluídas 134 mulheres com câncer de mama e um grupo controle de 129 de mulheres sem a doença. O grupo com câncer de mama respondeu a um questionário sobre estilo de vida, fatores reprodutivos e história familiar. Os dados clínicos do tumor também foram avaliados. A partir destes dados foi calculado o escore de risco individual para câncer de mama com o software IBIS Breast Cancer Risk Evaluation Tool. O DNA das pacientes foi extraído e realizada uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a detecção do polimorfismo C825T. A análise estatística foi realizada através do pacote R Environment, com intervalos de confiança de 95% e nível de significância de 5% (p<0,05). Resultados: A prevalência do genótipo TT se mostrou significativamente maior para as mulheres do grupo controle (30,2%) do que para as mulheres com câncer de mama (14,9%) (p=0,02). O SNP não esteve associado a características clínicas do tumor (tamanho p=0,91, grau histológico p=0,54, receptor de estrógeno p=0,73, receptor de progesterona p=0,46, HER-2 p=0,9, estado da axila p=0,29, estágio da doença p=0,41), a idade ao diagnóstico (p=0,07), idade da menarca (p=0,17) e idade da menopausa p=0,60). O genótipo TT não se mostrou em maior prevalência nas pacientes com alto IMC (p=0,98). O risco para o câncer não mostrou ter relação com a presença do polimorfismo (em 10 anos p=0,72 e durante toda a vida p=0,84). Conclusões: Coletivamente, os nossos dados indicam que o polimorfismo C825T, embora possivelmente associado a diversas vias metabólicas e carcinogênicas, não tem relação importante quer com o risco para o câncer de mama, quer com a apresentação das características da doença. Estes resultados expandem achados anteriores sobre a relação entre o polimorfismo C825T e o câncer de mama / Abstract: Objective: To evaluate the prevalence of the C825T polymorphism in women with and without breast cancer and associate it with the body mass index (BMI), the individual risk for cancer and clinical and reproductive characteristics. Subjects and methods: We included 134 women with breast cancer and a control group of 129 women without the disease. The group with breast cancer responded to a questionnaire on lifestyle, reproductive factors and family history. Clinical data of the tumor were also evaluated. From these data we calculated the score of individual risk for breast cancer with the software IBIS Breast Cancer Risk Evaluation Tool. The DNA was extracted from patients and performed a Polymerase Chain Reaction (PCR) for detection of the C825T polymorphism. Statistical analysis was performed using the package R Environment, with intervals of 95% and a significance level of 5% (p<0.05). Results: The prevalence of TT genotype was significantly greater for women in the control group (30.2%) than for women with breast cancer (14.9%) (p=0.02). The SNP was not associated with clinical features of the tumor (size p=0.91, histologic grade p=0.54, estrogen receptor p=0.73, progesterone receptor p=0.46, HER-2 p=0.90, status of the axilla p=0.29, stage of disease p=0.41), age at diagnosis (p=0.07), age at menarche (p=0.17) and age at menopause (p=0.60). The TT genotype was not at a higher prevalence in patients with high BMI (p=0.98). The risk for cancer showed no correlation with the presence of the polymorphism (in 10 years p=0.72 and for life p=0.84). Conclusions: Collectively, our data indicate that the C825T polymorphism, although possibly associated with various metabolic pathways and carcinogenetics, has no significant relationship with either the risk for breast cancer, or with the presentation of the characteristics of the disease. These findings expand previous findings on the relationship between the C825T polymorphism and breast cancer / Mestrado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Mestre em Ciências da Saúde

Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Endo_MarcosSergio_M.pdf: 2753651 bytes, checksum: 43bc558b5fae49fdc35b6c39ba8cf0c8 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi investigar a microbiota e a presença de endotoxina bacteriana de dentes com insucesso endodôntico antes e após preparo químico-mecânico (PQM) e uso da medicação intracanal (MIC), através do método de cultura microbiana e da reação em cadeia da polimerase (PCR). Este trabalho também se propôs a quantificar endotoxinas e unidades formadoras de colônias (UFCs) dos mesmos dentes, correlacionando seus níveis com aspectos clínicos e radiográficos. Quinze dentes unirradiculares com insucesso endodôntico e lesão periapical foram selecionados. Foram empregados métodos bioquímicos e PCR para identificação dos microrganismos. O teste turbidimétrico LAL (Pyrogent 5000) quantificou a concentração de endotoxina antes e após PQM e MIC. As espécies comumente isoladas pelo método de cultura foram Gemella morbillorum, Haemophilus aphrophilus, Enterococcus faecalis e Actinomyces naeslundii, enquanto que Parvimonas micra, Prevotella nigrescens, Gemella morbillorum e Fusobacterium nucleatum foram detectados frequentemente pelo método de PCR. Foram detectados níveis de endotoxinas e UFCs em todos os casos antes e após PQM. Na coleta inicial foram obtidos valores de endotoxinas e UFCs, mediana - 3,96 EU/mL e 2,57 x 102 UFC/mL - respectivamente. Correlação positiva entre concentração de endotoxina e radioluscência periapical maior que 5 mm foi observada (p<0,05). PQM foi capaz de reduzir UFCs (99,93%) e endotoxinas (60,6%) (ambos, p<0,05), e foi responsável na maior redução microbiana ao comparar com a MIC. Conclui-se que houve prevalência de bactérias Gram-positivas anaeróbias facultativas, embora o método de PCR tenha detectado espécies fastidiosas Gram-negativas. Níveis de endotoxinas de bactérias Gram-negativas estão envolvidos na infecção persistente e mostraram associação com rarefação óssea periapical. Além disso, PQM associado à CLX 2% gel + EDTA 17% foi efetivo na redução de endotoxinas e UFCs presentes na infecção persistente de dentes com insucesso endodôntico, entretanto não promoveu uma completa remoção. / Abstract: This clinical study was conducted to investigate the microbiota and bacteria endotoxin of root canal from teeth with posttreatment apical periodontitis (PAP) by culture and polymerase chain reaction (PCR) before and after chemomechanical preparation (CMP) and after the use of intracanal medications (ICM). Furthermore this work aimed to quantify endotoxin and cultivable bacteria in root canals with PAP correlating their levels with the presence of clinical and radiographic features. Fifteen single root-filled teeth with PAP were sampled. Culture techniques were used to determine the colony-forming unit (CFU). Microrganisms were identified by biochemichal tests and PCR. Limulus amebocyte lysate (LAL, turbidimetric Pyrogent 5000) was used to quantify endotoxins before (S1) and after (S2) CMP and after the use of ICM. The bacterial species most frequently isolated were Gemella morbillorum, Haemophilus aphrophilus, Enterococcus faecalis and Actinomyces naeslundii; while Parvimonas micra, Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum and Gemella morbillorum were frequently detected by PCR. Endotoxin was always detected at S1 and S2. At S1, endotoxin and bacteria were detected in a median value of 3.96 EU/mL and 2.57 x 102 CFU/mL, respectively. A positive correlation was found between the endotoxin and radiolucency area (>5 mm). CMP was effective in reducing bacteria (99.93%) and endotoxin (60.6%) (both p<0.05), and it was responsible for the majority of the microbial reduction when compared with ICM. In conclusion the microbiota of root-filled canals with PAP is predominantly facultative Gram-positive even though fastidious Gram-negative bacteria were detected by PCR. Gram-negative bacterial endotoxins play a role in the PAP and are associated with periapical bone-destruction. Moreover CMP with 2% CHX gel + 17% EDTA was effective in reducing but not complete removing endotoxin and cultivable bacteria from persistent root canal infection. / Mestrado / Endodontia / Mestre em Clínica Odontológica

Orientador: Luis Alexandre Maffei Sartini Paulillo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-05T01:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LeiteJunior_FernaoHeliodeCampos_D.pdf: 1914892 bytes, checksum: 9e016f7a5b89737fc1d4f4114e5ab871 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo desta pesquisa foi avaliar a influência da rugosidade superficial das resinas compostas de diferentes partículas de carga, sobre o acúmulo de placa bacteriana in situ, através da quantificação por meio de espectrofotometria e qualificação para o grupo mutans streptococci pela técnica da reação em cadeia da polimerase (¿polymerase chain reaction¿ - PCR). Assim, foram confeccionados corpos de prova cilíndricos com os compósitos: Durafill VS, Tetric Ceram e Filtek P60, apresentando duas superfícies produzidas pela fotoativação do compósito em contato com a tira matriz de poliéster - superfície lisa e pelos Discos Sof-Lex de granulação grossa - superfície rugosa. Da interação resina composta e textura superficial foram constituídos 6 grupos experimentais: Durafill VS/Superfície Lisa, Durafill VS/Superfície Rugosa, Tetric Ceram/Superfície Lisa, Tetric Ceram/Superfície Rugosa, Filtek P60/Superfície Lisa e Filtek P60/Superfície Rugosa. A rugosidade superficial dos corpos de prova foi avaliada pela leitura em rugosímetro (Ra). Para a avaliação do acúmulo de placa bacteriana in situ, foram selecionados dez voluntários, para os quais foram confeccionados dispositivos palatinos em acrílico, onde foram fixados seis corpos de prova correspondentes a cada grupo experimental. Os voluntários utilizaram o dispositivo com os corpos de prova por três dias na semana. No quarto dia das primeiras seis semanas, a placa formada sobre cada corpo de prova foi extraída em NaOH 1,0M e quantificada em espectrofotômetro. Os corpos de prova com superfície rugosa apresentaram maior acúmulo de placa bacteriana do que aqueles com superfície lisa, independente da resina composta utilizada. Entre os corpos de prova lisos, apesar de haver diferença estatística significativa entre a menor rugosidade superficial da resina composta de micropartículas (Durafill VS) e a maior rugosidade das outras duas resinas compostas (Filtek P60 e Tetric Ceram), não foi observada diferença no acúmulo de placa entre os materiais testados. Na sétima semana, o DNA da placa bacteriana acumulada sobre os corpos de prova foi extraído e comparado através de PCR utilizando primers universais para bactérias do grupo mutans streptococci, que amplificam genes de RNA ribossômico 16S e digestão do produto da amplificação com as enzimas de restrição HaeIII, CfoI e RsaI. Constatou-se a presença de bactérias do grupo mutans streptococci nos corpos de prova confeccionados com as três resinas compostas testadas. Verificou-se semelhança nos perfis gerados pela análise de PCR-RFLP das amostras dos voluntários, indicando que as resinas compostas, Tetric Ceram, Durafill VS ou Filtek P60 e o tipo de superfície, lisa ou rugosa, não afetaram significativamente a composição da placa bacteriana acumulada nos corpos de prova para o grupo mutans streptococci / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of surface roughness of different filled composites on in situ bacterial plaque retention, quantified by spectrophotometry and qualified for mutans streptococci group by polymerase chain reaction (PCR). Specimens were prepared with the composites Durafill VS, Tetric Ceram and Filtek P60, with smooth and rough surfaces, produced by phtotoactivation through Mylar strip or Sof-Lex discs, respectively. The interaction composite x texture surface generated six experimental groups: Durafill VS/smooth surface, Durafill VS/rough surface, Tetric Ceram/smooth surface, Tetric Ceram/rough surface, Filtek P60/smooth surface and Filtek P60/rough surface. Surface roughness of samples was evaluated by profilometer reading (Ra). For in situ experiment, ten subjects were chosen which wore acrylic palatal appliances containing samples of the six experimental groups. All subjects wore the appliances for three days a week. In the fourth day of the first six weeks, the amount of dental plaque formed on the samples were extracted in 1.0M NaOH and analyzed by spectrophotometry. Rough surface samples showed significantly greater amount of bacterial plaque than smooth surface samples, for the three composites tested. For the smooth samples, in spite of the significant difference between the lower roughness of Durafill VS composite and the higher roughness of both Filtek P60 and Tetric Ceram composites, no difference was observed in the amount of bacterial plaque among the tested materials. In the seventh week, DNA of the bacterial plaque formed on the samples was extracted and compared by PCR using universal primers for mutans streptococci group, which amplify ribossomal RNA 16S genes, and digestion of PCR products with the restriction enzymes HaeIII, CfoI e RsaI. Bacteria of mutans streptococci group were found in all composites samples. The profiles generated by the PCR-RFLP analysis of the volunteers' samples were similar, indicating that the composites Tetric Ceram, Durafill VS or Filtek P60 and the smooth or rough surfaces did not affect significantly the composition of the bacterial plate formed on the samples for mutans streptococci grou / Doutorado / Dentística / Doutor em Clínica Odontológica

Orientador: Renata de Oliveira Mattos-Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-06T06:24:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stipp_RafaelNobrega_M.pdf: 1453482 bytes, checksum: 75a8c7b14bc2c1994765a8fd89ae2d9f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Streptococcus mutans são os principais patógenos da cárie dentária, pois são capazes de se acumular no biofilme dentário na presença de sacarose, e sob condições altamente acidogênicas, promovem a desmineralização dentária. As glucosiltransferases B (GtfB) e C (GtfC) produzidas por S. mutans são fundamentais neste processo, porque catalisam a síntese de glucanos extracelulares insolúveis, a partir da sacarose. A proteína ligante de glucano B (GbpB) parece também participar do acúmulo de S. mutans nos biofilmes, embora por processos ainda não compreendidos. Pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam a expressão dos genes que codificam essas proteínas de virulência (gtfB, gtfC e gbpB). Neste sentido, objetivamos caracterizar o padrão de expressão dos genes gtfB, gtfC e gbpB e de seus possíveis genes regulatórios (vicR, comE, ciaR e rr11) em genótipos distintos de S. mutans. Para isso, foram realizadas análises de transcrição reversa-PCR semi-quantitativa (RT-PCR) dos genes alvo em diferentes fases de curvas de crescimento planctônico, em meio Brain Heart Infusion, a 37°C, em condições de anaerobiose. RNAs das células nas diferentes fases de crescimento foram extraídos e submetidos a reações de transcriptase reversa com primers arbitrários, para obtenção dos cDNAs totais. Análises de PCR semi-quantitativas dos cDNAs foram então realizadas com primers específicos e normalizados pela expressão do gene housekeeping 16SRNA, cuja expressão foi constante nas condições experimentais estudas. Os padrões de transcrição de gtfB e gtfC foram específicos ao background genético da cepa estudada. Os níveis de transcritos de gtfB e de gtfC foram coordenados durante fases específicas de crescimento, mas divergências nas curvas expressão dos mesmos ocorreram em grande parte dos genótipos. Os níveis de transcritos de gbpB foram também variáveis entre cepas, mas assumiram padrão independente de genes gtf e foi caracterizado por menores variações entre as diferentes fases de crescimento. Os genes regulatórios demonstraram picos de expressão nas fases log e/ou estacionária de crescimento, de acordo com o genótipo testado. Os resultados indicam que o padrões de expressão dos genes estruturais (gtfB, gtfC e gbpB) e regulatórios são cepa-específicos e que gtfB e gtfC são regulados por sistemas independentes, os quais parecem ser ativados em fases distintas de crescimento / Abstract: Streptococcus mutans, the main pathogen of dental caries, have the capacity to accumulate in the dental biofilm in the presence of sucrose, under highly acidic conditions that are responsible for teeth demineralization. The glucosyltransferases B (GtfB) and C (GtfC) produced by S. mutans are essential in this process, because catalyze the synthesis of water-insoluble from sucrose. The Glucan-binding protein B (GbpB) appears to also participate in S. mutans accumulation, but under processes that are still unclear. Little is known about the mechanisms that regulate expression of genes encoding these proteins (gtfB, gtfC and gbpB). In this sense, we aimed to characterize the patterns of transcription of gtfB, gtfC and gbpB in distinct S. mutans genotypes. For that purpose, semi-quantitative analysis of reverse transcription¿PCR (RT-PCR) were performed in strains at different phases of the growth curves in Brain Heart Infusion broth bath cultures at 37°C, under anaerobiosis. RNAs were extracted from cells at different growth phases, and applied in reactions of reverse transcription with arbitrary primers to yield total cDNAs. Semi-quantitative PCR reactions were then performed with the cDNAs using specific primers to each target gene, and normalized by the expression of the housekeeping gene 16SRNA, whose expression remained constant at the experimental conditions. Patterns of expression of gtfB and gtfC were specific to the strain background. Transcriptions of gtfB e de gtfC were coordinated in specific phases of growth, but the curves of transcription diverged at different phases in the majority of the genotypes studied. The levels of gbpB transcripts were variable between strains and assumed an independent pattern when compared with gtf genes. The levels of gbpB transcripts were characterized by lesser variations between the different phases of growth. The regulatory genes have shown peaks of expression at log and/or stationary phases of growth and the curves of transcript levels were strain-dependent. The results indicate that patterns of expression of gtfB, gtfC and gbpB and regulatory genes are strain-specific, and that gtfB and gtfC are regulated by distinct systems that may be activated at distinct phases of growth / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:58:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aidar_Marisi_M.pdf: 336669 bytes, checksum: 37140ca0e23c258906c1b710bfdb5687 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Células bucais são fontes convenientes de DNA para diagnóstico e estudos epidemiológicos. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um método simples e prático para obter células epiteliais, através de bochechos, a fim de serem usadas como fonte de DNA, avaliar a estabilidade do DNA na solução de bochecho no decorrer do tempo e analisar a eficácia deste método na amplificação por PCR de fragmentos de diferentes comprimentos. Os procedimentos usados neste estudo evitam o uso de solventes orgânicos permitindo uma prática laboratorial mais segura. Isto é alcançado pela remoção das proteínas celulares por desidratação e precipitação com uma solução de acetato de amônio 8 M. Bochechos com 5 mL de dextrose 3% foram coletados de 65 indivíduos. Adicionados a cada amostra 3 mL de solução TNE [17 mM Tris-HCL (pH 8,0), 50 mM NaCl, 7 mM EDTA] diluído em etanol 66%. O conteúdo das amostras de bochechos de 20 indivíduos foi dividido em 4 tubos. Um tubo foi usado para extração imediata (igualmente às demais 45 amostras) e os três tubos restantes foram mantidos em temperatura ambiente por períodos de 2, 15 e 30 dias, seguidos pela extração do DNA. As células bucais foram centrifugadas e ressuspendidas em solução contendo 10 mM Tris (pH 8.0), 0.5% SDS, 5 mM EDTA e proteinase K (20 mg/mL). Após incubação a 55ºC durante toda a noite as proteínas foram removidas pela adição de acetato de amônio 8 M seguida por centrifugação. O DNA foi precipitado com isopropanol e ressuspendido em 10 mM Tris (pH 7.8) e 1 mM EDTA. Foram realizadas reações de PCR com primers específicos para fragmentos dos seguintes genes: PAX9 (202 pb); KLK (555 pb); MMP20 (1434 pb). Nossas análises fornecem evidências consistentes de que o produto de DNA extraído por esta metodologia é suficiente para diversas amplificações por PCR. Fragmentos grandes de DNA (1434 pb) puderam ser obtidos com sucesso. Além disso, com a adição de TNE/Etanol o DNA é eficientemente preservado na solução de bochecho, a qual pode ser estocada em temperatura ambiente por até trinta dias, o que possibilita a coleta em campo e contribui para o aumento da amostragem. Este protocolo permite a extração de maneira rápida, simples, econômica e garante o processamento de várias amostras ao mesmo tempo / Abstract: Buccal cells provide a convenient source of DNA for diagnosis and epidemiological studies. The goal of this study was to develop a convenient method to obtain buccal cells from mouthwash samples to be used as a source of DNA, and to evaluate the stability of the DNA in the mouthwash solution over time. Finally, we analysed if the methodology could be used for PCR amplification of high molecular mass fragments. The procedures used in this paper avoid the use of any organic solvent. This is achieved by salting out the cellular proteins by dehydration and precipitation with a 8 M ammonium acetate solution. A group of 65 consenting subjects undertook a mouthwash containing 5mL of 3% dextrose solution. Three mL of TNE solution [17 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl and 7 mM EDTA] diluted in 66% ethanol, was added to the tube. The mouthwash solution of 20 individuals was divided into 4 tubes. One tube was used for immediate extraction (equally to the others 45 samples) and the three remaining were kept at room temperature for periods of 2, 15 and 30 days, followed by DNA isolation. Buccal cells were pelleted and resuspended in a solution containing 10 mM Tris (pH 8.0), 0.5% SDS, 5 mM EDTA, and proteinase K (20 mg/mL). After overnight incubation at 55°C proteins were removed by adding 8 M ammonium acetate followed by centrifugation. DNA was precipitated with isopropanol and resuspended in 10 mM Tris (pH 7.8) and 1 mM EDTA. PCR amplifications were performed. Three pairs of primers were used: PAX9 (202 pb); KLK (555 pb); MMP20 (1434 pb). Our analyses provided consistent evidences that DNA yield extracted by this methodology is sufficient for several PCR amplifications. Large size products (1434 bp) could be successfully obtained. Additionally, dilution of the mouthwashes in TNE/ethanol prevented DNA degradation at room temperature for periods of up to 30 days, allowing safe storage and transport of field specimens collected in isolated communities, distant from the laboratory. On conclusion, the protocol described here is quick, simple to perform, sensitive, economical and several samples can be processed at the same time / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental